I N D L Æ G S S E D D E L

Transkript

1 Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902; USA Tlf.: eller (i USA og Canada), Fax: Produktdokumentation og oversættelser kan hentes på: LIFECODES HLA Null Allele SSO TYPING KIT Til in vitro-diagnostik. INDHOLDSFORTEGNELSE Definition af symboler... 1 Retningslinjer for brug... 4 Kit/Reagenser efter katalognummer... 2 A. Oprens genomisk DNA... 4 Tilsigtet brug... 2 B. DNA-amplifikation (PCR)... 4 Oversigt og forklaring... 2 C. Hybridisering... 5 Principper for proceduren... 2 D. Analyse med Luminex-instrumentet... 5 Reagenser... 3 Resultater... 6 A. Identifikation... 3 Kvalitetskontrol... 6 B. Advarsler og forholdsregler... 3 Procedurens begrænsninger... 6 C. Opbevaringsinstruktioner... 3 Fejlfinding... 7 D. Oprensning eller behandling til brug.. 3 Forventede værdier... 7 E. Indikationer for ustabilitet... 3 Specifikke performanceegenskaber... 7 Instrumentkrav... 3 Referencer... 7 Prøvetagning og forberedelse... 3 Begrænsede licenser... 7 Procedure... 3 Producentinformation... 7 A. Medfølgende materialer... 3 Anvendte varemærker... 8 B. Nødvendige, men ikke medfølgende materialer, reagenser og udstyr... 3 C. Yderligere materialer, som skal forsynes af brugeren... 3 I N D L Æ G S S E D D E L DEFINITION AF SYMBOLER (Produktetiketter og supplerende dokumenter) Bilag A... 8 Gel-elektroforese... 8 Gel-fortolkning... 8 Lotnummer Katalognummer Temperaturbegrænsninger Øvre temperaturgrænse Holdbar til Skal beskyttes mod lys Tilstrækkeligt til N tests Må ikke nedfryses Forsigtig! Se brugervejledningen Se brugsanvisning Producent Repræsentant i det Europæiske Fællesskab Fare Side 1 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

2 REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER LCT -N LIFECODES HLA-Null Allele SSO Typing Kit, Produktnr LC-N LIFECODES HLA-Null Allele Typing Kit til brug med Luminex Produktnr Reagens Produktnr. Volumen Opbevaring MX-N1 MX-N2 LIFECODES Null Allele Class 1 Master Mix LIFECODES Null Allele Class 2 Master Mix µl 2-8 C µl 2-8 C BM-N LIFECODES Null Allele Probe Mix µl x 2 2-8ºC Beskyttes mod lys DS Fortyndingsopløsning ml 18-30ºC 50 Tilstrækkeligt til 50 prøver TAQ LIFECODES Taq Polymerase µl x 2-10ºC til -30ºC Probe Mix-opløsninger er lysfølsomme; hold lyspåvirkningen nede på et minimum FORSIGTIG: Brug ikke komponenter udover deres udløbsdato.. FORSIGTIG:Afvigelser fra anbefalet protokol og påkrævet materiale, deriblandt LIFECODES Taq Polymerase, er ikke blevet godkendt.. TILSIGTET BRUG DNA-typebestemmelse af alleler, klasse I og II sammen med LIFECODES HLA SSO Typing Kits. OVERSIGT OG FORKLARING DNA-baseret HLA-typebestemmelse ved hjælp af PCR-amplificeret DNA er en almindelig laboratorieprocedure. PCR-amplifikation af DNA anvendes som metode til at berige en udvalgt DNA-region. Ved HLA-typebestemmelse anvendes en efterfølgende analyse til at bestemme egenskaberne i det amplificerede DNA. Flere analysetyper, f.eks. SSP (1), direkte SSOP (2), RFLP (3) og revers SSOP dot blot-teknologier (4), har været anvendt ved HLA-typebestemmelse. Som ved SSOP- og revers dot blot-metoderne anvender LIFECODES HLA-SSO Typing kits sekvensspecifikke oligonukleotider (SSO'er) til at identificere, hvilke HLA-alleler der er til stede i en PCR-amplificeret prøve. Det er de anvendte SSO'er, og ikke metoderne, der bestemmer evnen til at skelne mellem de forskellige alleler, der er til stede i PCR-amplifikationen. Mens revers dot blot- og SSOP-metoderne anvender enzymmærkning og kolorimetriske substrater, der kræver en efterfølgende fremkaldelse, er LIFECODES-analysen et homogent multiplex-system. Dvs. at alle SSO'er analyseres samtidigt, og hele analysen foregår i en enkelt reaktionsbeholder med tilsætning af et enkelt reagens. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN Proceduren ved LIFECODES HLA-SSO-typebestemmelsen er baseret på hybridiseringen af et mærket enkeltstrenget PCR-produkt til SSO-prober. Amplificeringen af DNA med PCR anvender typisk ækvimolære mængder af både fremadrettet og revers primer for at danne et dobbeltstrenget DNA-produkt. Hvis mængden af én primer imidlertid er relativt større end den anden, danner reaktionen noget enkeltstrenget DNA-produkt ud over det dobbeltstrengede produkt. Under de første cyklusser i LIFECODES-amplifikationen dannes dobbeltstrenget DNA. Når den begrænsende primer er opbrugt, bruger den resterende primer det dobbeltstrengede produkt som en skabelon for dannelsen af enkeltstrenget DNA. Denne metode danner både dobbeltstrengede og enkeltstrengede produkter, som begge efter denaturering deltager i hybridiseringsreaktionen. De forskellige prober kan svare til en sekvens i det amplificerede DNA, der er unik for en allel eller en gruppe af alleler. Disse prober er med andre ord designet, så hver probe har præference for at hybridisere sig til en komplementær region, der muligvis er eller ikke er til stede i det amplificerede DNA. Desuden hybridiseres det amplificerede DNA til én elle flere konsensusprober, der svarer til sekvenser, som er til stede i alle alleler på et locus. SSO-typebestemmelsen kan påvirkes af den biologiske materialetype, oprensningsmetoden, samt mængden og integriteten af genomisk DNA. Det opnåede s ignal for konsensusproben eller -proberne kan derfor fungere som en indikator for, om amplifikationen og hybridiseringen lykkedes. Signalet, der blev opnået med konsensusproben, kan også bruges til at normalisere signalet fra de allelspecifikke prober og korrigere for variationer i mængden af amplificeret produkt i hybridiseringsreaktionen. Analysen af de resultater, der blev genereret fra SSO-typebestemmelsen, kan bruges til at bestemme forekomsten eller fraværet af bestemte DNA-sekvenser i amplificeret DNA og identificere de mulige alleler i prøven. Til LIFECODES HLA-SSO-typebestemmelsesproceduren kobles prober til Luminex-mikrosfærer, der er udviklet til brug med Luminex-instrumentet. Op til 100 forskellige populationer af Luminex-mikrosfærer kan blandes og analyseres med Luminex-instrumentet, da de enkelte populationer af mikrosfærer kan genkendes ved hjælp af deres unikke fluorescenssignatur eller farve. Forskellige SSO-prober kan kobles til hver mikrosfærefarve. En blanding af flere prober kan derfor skelnes fra hinanden i kraft af deres tilknytning til bestemte mikrosfærefarver. Luminex-instrumentet kan også kvantificere de relative mængder af mærket PCR-produkt, som hybridiserer til hver Luminex-mikrosfære. Det relative signal, der opnås med SSO-proberne i LIFECODES-analysen, kan derfor, som med andre SSOP-metoder, bruges til at fastlægge probernes positive eller negative reaktivitet med den amplificerede DNA-prøve (se afsnittet Resultater). Dette giver således de nødvendige oplysninger til at bestemme prøvens HLA-fænotype. Null 1 anvendes som en komplementæranalyse til at forøge opløsningerne af LIFECODES HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-analyserne, og løse den allele tvetydighed mellem A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N og C*04:01/04:09N. Null 2 anvendes som en komplementæranalyse til at forøge opløsningen af LIFECODES HLA- DRB3,4,5-analysen, og løse den allele tvetydighed mellem DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N og DRB5*01:02/DRB5*01:08N Sammenfletning af oplysningerne fra Null 1- eller 2-analyserne med resultaterne for den tilsvarende locus-specifikke LIFECODES SSO Typing Kit-analyse, så der kan dannes en foreslået typebestemmelse af en prøve, kan foretages via en manuel analyse eller en softwareanalyse. For den manuelle analyse identificerer outputtet af Null 1- eller 2-analyserne tilstedeværelse eller fravær af specifikke Null-alleler. Resultatet fra de tilsvarende locus-specifikke LIFECODES SSO typing kits kan involvere tvetydigheder for disse nul-alleler (f.eks. A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N, C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N eller DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Hvis nul-allelet er identificeret med Null-produktet, kan alle allelkombinationer, der ikke omfatter nul-allelet, elimineres fra de resultater, der fås fra det tilsvarende locus-specifikke LIFECODES SSO typing kit. Hvis nul-allelet er fraværende baseret på Null-produktets resultat, kan alle allelkombinationer, der omfatter nul-allelet, elimineres fra de resultater, der fås fra det tilsvarende locus-specifikke LIFECODES SSO typing kit. Denne proces, der kombinerer resultaterne af de to produkter, kaldes i produktets indlægsseddel og i softwaren for sammenfletning af resultaterne. Side 2 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

3 REAGENSER A. Identifikation Se tabellerne i afsnittet KIT/REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER for at få en komplet liste over katalognumre. B. Advarsler eller forholdsregler 1. Til in vitro-diagnostik. 2. Der skal angives separate pipetter til præ-pcr-håndtering samt til post-pcr-håndtering. 3. Biologisk farligt materiale: Alle biologiske prøver og blodprøver skal håndteres som potentielt smittefarligt materiale. Der skal træffes generelle sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering. 4. Fortyndingsopløsning, Probe mix-opløsninger, TAQ-polymerase og R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat indeholder farlige stoffer. Undgå kontakt med hud og øjne, og bortskaffelse af alle brugte materialer skal ske i overensstemmelse med de lokale bestemmelser. Se sikkerhedsdatabladet for at få yderligere oplysninger. C. Opbevaringsinstruktioner 1. Se mærkaten på pakken med kitkomponenterne for at få oplysninger om de korrekte opbevaringstemperaturer. 2. Probe mix-opløsninger og R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat er lysfølsomme, SKAL BESKYTTES MOD LYS. MÅ IKKE NEDFRYSES. 3. Brug ikke komponenter efter udløbsdatoen. D. Oprensning eller nødvendig behandling til brug Se "Prøvetagning og forberedelse" E. Indikationer for ustabilitet 1. Hvis der er udfældet salt fra opløsningen under transport/opbevaring, skal det opløses helt før brug på vortex-mixer ved stuetemperatur (18 til 30 C). 2. Undgå at anvende R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat, der har været nedfrosset under transport eller opbevaring. INSTRUMENTKRAV 1. Luminex-instrumentet og XY-platform (produktnummer , ) 2. Følgende thermocykler er blevet bekræftet: 96-Well GeneAmp PCR system 9700 indstillet til MAX tilstand (Base kat. nr. N , Gold Block kat. nr ), Veriti 96-Well Thermocykler indstillet til 9700 MAX tilstand ( kat. nr ). Jævnfør tabel 2 for maksimale rampetider. Forsigtig: Andre thermocykler og rampetider er ikke blevet godkendt. PRØVETAGNING OG FORBEREDELSE A. Humant DNA kan oprenses fra fuldblod, buffy coats og kindskrab under anvendelse af en valideret metode, der opfylder nedenstående kriterier. DNA, der er ekstraheret fra blod opbevaret i EDTA og ACD (syre-citrat-dextrose), er blevet testet og har vist sig at give forventet performance i denne analyse. B. DNA, der er ekstraheret fra blod opbevaret i heparin, må ikke bruges i denne analyse. Andre konserveringsmidler er ikke blevet testet. C. Det isolerede DNA skal være i 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 eller i nukleasefrit vand. Hvis et chelaterende middel som f.eks. EDTA er til stede, må slutkoncentrationen i det chelaterende middel ikke overstige 0,5 mm. D. Tilstedeværelsen af alkohol, opløsningsmidler eller salte kan påvirke DNA-amplifikationen negativt. E. DNA-slutkoncentrationen skal være ng/µl. F. Absorbansmålinger af DNA-prøven ved 260 og 280 nm skal give forholdet 1,65 til 2,0. G. DNA'et kan bruges straks efter isoleringen eller opbevares ved 20 C i op til 1 år. Gentagne nedfrysninger/optøninger skal undgås, da dette kan nedbryde DNA'et. PROCEDURE Forsigtig: Afvigelser fra anbefalet protokol og påkrævet materiale er ikke blevet godkendt.. A. Medfølgende materialer (se tabellerne i afsnittet KITS/REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER forat få specifikke oplysninger) Korrekt Master Mix (MX) Korrekt Probe Mix/Mix er (BM) Fortyndingsopløsning (DS) B. Nødvendige, men ikke medfølgende materialer Følgende materialer blev brugt til at validere kittet: Grænsetabel, Probe Hit-diagrammer LIFECODES tag Polymerase* (LIFECODES kat. nr ) x 2 Luminex Sheath-væske (1x Lifecodes, kat. nr ) Nukleasefrit vand (Lifecodes, kat. nr , 20 ml) PCR-rør og hætter - Corning Thermowell Tube Strips (Costar kat. nr. 6542, LIFECODES kat. nr ) eller Corning Thermowell PCR 96 brøndplader (kat. nr. CLS6551) eller Themoscientific AB Gene Superplate 96-brønd PCR plade (kat. nr. AB-2100) Costar plade (Costar kat. nr. 6509, LIFECODES kat. nr ) Thermowell klar polyethylentape (Costar nr (LIFECODES kat. nr ) R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat (SA-PE), 1mg/mL (LIFECODES kat. nr ) Luminex kalibreringskit (Luminex 100/200 kalibreringskit, Luminex 100/200 Præstationsgodkendelseskit, LIFECODES kat. nr og henholdsvist) C. Yderligere materialer, som brugeren selv skal forsyne Vortex-mixer Silikonekompressionsmåtte Axygen Scientific nr. CM-FLAT eller tilsvarende Sonikator Mikrocentrifuge Barrierefilterspidser Pipetter, multikanal-pipetter og -spidser (1-20 µl, µl, 1000 µl) Regnearksanalysesoftware Varmeblok 70 % isopropanol eller 20 % blegemiddel Fastholdelsesbakke Applied Biosystems nr (kun til brug med en thermocykler 9700) Side 3 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

4 RETNINGSLINJER FOR BRUG BEMÆRKNINGER: Probe mix-opløsninger og SA-PE er lysfølsomme: Skal beskyttes mod lys og må ikke nedfryses. Perler opvarmes ved C i mindst 5-10 minutter for at opløse komponenterne i probe-blandingen grundigt. Soniker kortvarigt (ca. 15 sek.), og bland derefter probe mix-opløsningen på vortex-mixer i ca. 15 sekunder for at opløse perler. Udvis meget forsigtighed ved afmålingen, og brug kalibrerede pipetter. I modsat fald kan det føre til tab af reagens og fejl i prøven. Alle temperaturer skal holdes nøjagtigt. Udsving på kun +/- 0,5 C kan påvirke resultaterne. Under hybridiseringen må prøverne ikke være i fortyndet tilstand ved 56 C i mere end 5 minutter (se afsnittet Resultater). Det anbefales at analysere de amplificerede prøver så hurtigt som muligt. Hvis prøverne ikke kan køres på Luminex-instrumentet den samme dag, kan det amplificerede produkt opbevares i op til 3 dage ved 2-8 C før brug Ved opbevaring i længere tid skal prøverne opbevares ved 20 ºC i op til en uge, indtil de kan analyseres. Det amplificerede produkt må kun nedfryses/optøs én gang. Flere nedfrysninger/optøninger medfører nedbrydning af de amplificerede prøver og dårlige analyseresultater. A. Oprens genomisk DNA ved hjælp af valgt metode. Slutkoncentrationen skal være ng/µl. Juster om nødvendigt med nukleasefrit vand. Sørg for, at alle prøver har tilsvarende koncentrationer. B. DNA-amplifikation (PCR) 1. Lad Master Mix (MX) blive opvarmet til stuetemperatur (18 til 30 C). 2. Bland forsigtigt reagenserne på vortex-mixer i ca. 10 sekunder. Dette sikrer, at saltene opløses. Centrifuger kortvarigt (5-10 sekunder) i mikrocentrifuge for at bringe indholdet til bunden af røret. 3. Forbered ved hjælp af tabel 1 nedenfor komponenterne til amplifikation til n+1 reaktioner med den angivne mængde af hver komponent pr. reaktion (bortset fra DNA). Tilsæt nukleasefrit vand for at opnå en slutvolumen på 20 µl pr. reaktion.. Bland forsigtigt på vortex-mixer. 4. Afpipetter den rette mængde genomisk DNA (40 til 120 ng) i PCR-rørene. 5. Afmål amplifikationsblandingen i PCR-rørene indeholdende genomisk DNA (den samlede mængde master mix og genomisk DNA skal være 20 µl for hver prøvereaktion). 6. Sæt låg på rørene for at undgå fordampning under PCR. 7. Anbring prøverne i thermocykleren, og kør programmet. Se tabel 2 og tabel 3. Tabel 1. Reaktionskomponenter til amplifikation Komponent Mængde pr. PCRprøvereaktion LIFECODES Master Mix 6 µl Genomisk DNA ng/µl I alt ~80 ng Taq-polymerase 0,2 µl (1 U) Nukleasefrit vand Til slutvolumen 20 µl Tabel 2. Thermocyklerbetingelser for amplifikation Thermocykler Tilstand (rampetid) GeneAmp PCR System 9700 MAX tilstand (3,9 C/sek) Veriti 96-Well Thermal Cycler 9700 MAX tilstand (3,9 C/sek) Tabel 3. Thermocyklerbetingelser for amplifikation Trin Temperatur og inkubationstid antal cyklusser 1 95 ºC i 3 min ºC i 15 sek 60 ºC i 30 sek 72 ºC i 30 sek 95 ºC i 10 sek 63 ºC i 30 sek 72 ºC i 30 sek 4 72 ºC i 2 min ºC for evigt 1 Bemærk!: Se produktets gel-elektroforese (bilag A) for at kontrollere, at prøveamplifikationen er korrekt Side 4 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

5 C. Hybridisering Kontroller, at hybridiseringsbufferkomponenterne i LIFECODES probe mix-opløsningen er opløst, og at perler er grundigt opslæmmet. Tænd for Luminex-instrumentet og XY-platformen, og lad dem varme op i 30 minutter. 1. Probe mix-opløsningen opvarmes i en varmeblok ved C i mindst 5-10 minutter for at opløse komponenterne i probeblandingen grundigt. 2. Soniker kortvarigt (ca. 15 sek.), og bland derefter probe mix-opløsningen på vortex-mixer i ca. 15 sekunder for at opslæmme perler. 3. Kombiner 15 µl af det korrekte probe mix med 5 µl af det locus-specifikke PCR-produkt i hver brøndplade på thermocykler 96 brøndplade (Costar nr. 6509). Ved afmåling af probe mix til mere end 10 brønde skal probe mix blandes forsigtigt på vortex-mixer efter hvert sæt på ti. Forsegl pladen med polyethylentape (Costar nr. 6524). 4. Placer silikonekompressionsmåtte oven på pladen før hybridisering. 5. Hybridiser prøverne under følgende inkubationsforhold: Tabel 4. Thermocyklertilstande til hybridisering 97 C i 2 minutter 47 C i 10 minutter 56 C i 8 minutter 56 C HOLD Sørg for, at der tændes for detektionslaseren på Luminex-instrumentet mindst 30 minutter inden hybridiseringen afsluttes. 6. Forbered en 1:200 SA-PE-blanding/fortyndingsopløsning, mens prøverne hybridiseres. Kombiner 170 µl fortyndingsopløsning (DS) og 0,85 µl 1mg/ml SA-PE pr. prøve. Det anbefales at fremstille nok fortyndingsopløsning til n+1 prøver for at indregne eventuelt spild ved pipettering. (Se tabel 5) 7. Fortyndingsopløsningen/SA-PE-blandingen skal opbevares mørkt ved stuetemperatur. SA-PE er lysfølsom! Fortyndingsopløsningen kan opvarmes ved 45 C i 5 minutter og blandes på vortex-mixer ved ankomst for at sikre, at alle komponenter er opløst. Fortyndingsopløsningen skal have opnået stuetemperatur (18-30 C), før blandingen fremstilles. Forbered blandingen før brug, og bortskaf eventuelt overskydende materiale. Tabel 5. Forberedelse af fortyndings- opløsningsmængder Antal prøver Fortyndingsopløsning (DS) SA-PE µl 0,85 µl µl 4,25 µl µl 8,5 µl µl 17 µl µl 42,5 µl Bemærk! HYBRIDISERINGSPROGRAMMET MÅ IKKE ANNULLERES FØR BAKKEN FJERNES FRA THERMOCYKLEREN! 8. Ved 56 C hold-programmet, mens bakken er i thermocykleren, fortyndes hver prøve med 170 µl af den forberedte fortyndingsopløsning/sa-pe-blanding. Det er kritisk, at alle prøver fortyndes inden 5 minutter (efter HOLD-trinnet på 8 minutter ved 56 C) 9. Fjern prøvebakken fra thermocykleren, og anbring den i Luminex-instrumentet. D. Analyse af prøver ved hjælp af Luminex-instrumentet* Analyser straks prøverne på Luminex-instrumentet for at opnå de bedste resultater. 1. Tænd for Luminex-instrumentet fra 30 minutter til 4 timer, før prøverne analyseres. 2. Opret en batchkørsel, som prøverne analyseres efter, før de analyseres på Luminex-instrumentet. a) Vælg Create a New Batch i menuen File. Hvis der analyseres for Null Class I, tilføjes f.eks. Batch for Null Class I. Batchskabelonen hentes på websiden og kaldes i dette tilfælde Null1 xxxxxx (partinr.). Bemærk, at skabelonversionerne er partinummerspecifikke og svarer til partinumrene på de aktuelle probe mixes. Følg den trinvise vejledning på skærmen for oprettelse af batches. Når batchen navngives, må der ikke medtages kommaer i navnet, da oplysninger efter et komma mistes ved eksport af dataene. Se brugermanualen til Luminex for at få yderligere oplysninger om oprettelse af batches og multibatches. b) Klik på skub ud-ikonet for at skubbe pladeholderen ud. Anbring 96-brønds thermocykler-pladen med prøverne i XYP-varmeblokken på pladeholderen. c) Klik på ikonet Retract. Prøverne er nu klar til at blive analyseret. Der skal foretages en priming, før kørslen startes. d) Når prøverne er kørt igennem instrumentet, skal der udføres et rengøringstrin med 70 % isopropanol eller 20 % alm. blegemiddel efterfulgt af to vasketrin. Der kan slukkes for instrumentet på dette tidspunkt, hvis det ikke skal bruges mere i løbet af dagen. 3. Når batchen er fuldført, eksporteres dataene som kommaseparerede fildata (.csv). Disse filer navngives 'OUTPUT.CSV' og gemmes i en mappe med det batchnavn, der er indtastet i Luminex. IS Dataene er herefter tilgængelige for oprettelse af typebestemmelsesopgaver som beskrevet nedenfor. *Se brugermanualen til Luminex IS for at få oplysninger om procedurer til instrumentets betjening, herunder den daglige opstart, kalibrering, vedligeholdelse og nedlukning. Side 5 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

6 RESULTATER Prøvetypebestemmelsen kan udføres på følgende måde: De genererede CSV-filer kan åbnes og data behandles med et almindeligt regnearksprogram, f.eks. Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro eller lignende software. Analysen består af følgende trin: 1) Kontroller, at Number of Events (antal hændelser) for hver SSO i hver prøve er mindst 60. Disse oplysninger findes i afsnittet DataType: Count i CSV-filen. 2) Kontroller, at værdierne for konsensusproberne for hver prøve er over deres minimale gennemsnitlige fluorescensintensitet eller MFI (Median Fluorescent Intensity). Minimumsgrænserne er partispecifikke og kan findes i grænsetabellen. Forsigtig! For at opnå pålidelige resultater skal Luminex-instrumentet have indhentet tilstrækkelige data. Der skal indsamles mindst 60 hændelser for hver SSO. 3) Fratræk værdien Background Control for hver probe fra de prøveværdier, der danner det datasæt, der er korrigeret for baggrundsværdier. Værdierne Background Control findes i grænsetabellen og er partispecifikke. Baggrundsværdierne er gennemsnitlige MFI-værdier for hver perle, som kompenserer for den baggrundsstøj, der er forårsaget af variationer i perler. 4) For hver prøve divideres de baggrundskorrigerede data for hver probe med den baggrundskorrigerede værdi for den tilsvarende konsensusprobe, der genererer det normaliserede datasæt. MFI (probe) MFI (kontrolblank for probe) MFI (konsensus) MFI (kontrolblank for konsensus) 5) Noter den normaliserede værdi i grænsetabelregnearket for hver probe. 6) Når alle værdierne er tildelt, kan probe hit-mønsteret (dvs. kombinationen af alle positive og negative tildelinger for en given prøve) sammenlignes med probe hit-tabellen (LC1024) på websiden. Forsigtig! Der findes en separat grænsetabel for hvert locus. Disse grænsetabeller er partispecifikke. Kontroller, at partinummeret i grænsetabellen svarer til partinummeret på typebestemmelseskittet. Hvis en normaliseret værdi for en bestemt probe er over den maksimale grænse for en negativ tildeling og under minimumsværdien for en positiv tildeling, skal prøven betragtes som ubestemt for den pågældende probe. Prøven skal typebestemmes, hvor værdien antages at være negativ og igen, hvor værdien antages at være positiv. Se afsnittet FORVENTEDE VÆRDIER for at få yderligere oplysninger om grænseværdier. KVALITETSKONTROL Det anbefales at køre en negativ og en positiv kontrol med hver test, som fx. henholdsvist en vandblindprøve og en tidligere bestemt prøve. Consensus sekvens-specifikke oligonucleotid (SSO) prober, angivet i tærskeltabellen, hybridiserer til deres respektive lokusspecifikke alleler. Værdier, der opnås med Consensus SSO'er fra positive kontroller, bør overstige tærskelværdien for SSO'en, som angivet i tærskeltabellens arbejdsskema. LIFECODES probe mix -opløsning(er) indeholder en eller flere Consensus SSO prober, der er identificeret i arbejdsskemaerne til typebestemmelser. Consensus-proberne hybridiseres til alle alleler og fungerer som interne kontroller for at bekræfte amplifikation og for at bekræfte at der forekom hybridiseringer. Hvis minimumsværdien ikke opnås for disse SSO'er, kan prøven muligvis ikke frembringe den korrekte bestemmelse, og prøvetesten bør gentages. Analysen skal køres som anbefalet i indlægssedlen, og skal udføres med enhver anden kvalitetskontrolsprocedure, der er i overensstemmelse med gældende retningslinjer eller akkrediteringskrav. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER De beskrevne PCR-forhold og analyseforhold kræver nøje kontrollerede forhold. Afvigelser fra disse parametre kan medføre produktfejl. Alle instrumenter skal kalibreres i overensstemmelse med producentens anbefalinger og betjenes inden for producentens foreskr evne parametre. 1) Perler skal forvarmes og opslæmmes grundigt før brug. Dette sikrer, at hybridiseringsbufferkomponenterne er i opløsningen. 2) Inkubationerne ved 47 C og 56 C kræver en stor nøjagtighed (+/- 0,5 C). Der skal anvendes en thermocykler. Temperaturen skal kontrolleres i brøndene i 96-brønds thermocykler-pladen ved hjælp af et termoelement (f.eks. BioRad, model VPT-0300 eller tilsvarende). Temperaturen i og omkring brøndene må ikke variere mere end +/- 0,5 C. 3) Tiden ved 56 C er kritisk og må ikke vare mere end i alt 13 minutter. Dette inkluderer inkubationen på 8 minutter plus højst 5 minutter til fortynding af alle prøverne med fortyndingsopløsning/sa-pe-blanding. 4) Når prøverne er fortyndet, skal analysen være afsluttet inden 1 time (beskyttes mod lys). 5) Komponenter fra forskellige kits og partier må ikke blandes. På grund af HLA-typebestemmelsens indviklede beskaffenhed skal kvalificeret personale gennemse fortolkningen af data og typebestemmelsen. Side 6 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

7 FEJLFINDING PROBLEM MULIG ÅRSAG LØSNING Lave resultater af perlemåling Probe mix er ikke helt opslæmmet Forvarm, soniker og bland probe mix-opløsningen på vortex-mixer, og gentag analysen. Instrumentet fungerer ikke korrekt Forkert kalibrering Kalibrer instrumentet (se brugermanualen til Luminex IS). Prøvestrømmen er blokeret Fjern og soniker nålen. Foretag en tilbageskylning. Kontakt ImmucorImmucor Transplant Diagnostics, Inc. hvis problemet fortsætter. +1-(888) Fejl i CON-grænse Prøven blev ikke amplificeret eller blev amplificeret dårligt* Lav DNA-mængde Kontroller DNA-koncentrationen og -renheden. Saltene i Master Mix er ikke opløst Opvarm Master Mix ved 37 C i 5 minutter, bland forsigtigt på vortex-mixer og centrifuger kortvarigt. Flere SSO-fejl, eller prøven giver ikke en HLAtypebestemmelse Dårlig Taq-polymerase Amplifikationsforholdene er ikke inden for de angivne parametre Lav MFI-værdi (Median Fluorescent Intensity) Allelspecifik amplifikation DNA-prøven er kontamineret DNA'et er delvist nedbrudt Amplifikationsforholdene er ikke inden for de angivne parametre Der er sket en fordampning under hybridiseringen. * PCR-amplifikationen kan kontrolleres ved gel-elektroforese (se bilag A). Anvend valideret LIFECODES tag Polymerase, kat. nr Kør thermocykler-profilen på thermocykleren for at kontrollere, om parametrene er inden for de angivne parametre. Opvarm fortyndingsopløsningen ved 45 C i 5 minutter før brug, og bland på vortex-mixer. Opbevar opløsningen ved stuetemperatur. Udskift R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugatet. Kør thermo cykler-profilen på thermo cykleren for at kontrollere, om parametrene er inden for de angivne parametre. Isoler DNA fra blodprøven igen. Hvis der ikke bruges en hel plade, kan én række stå tom på hver side af de prøver, der skal analyseres, så pladen bedre kan forsegles. FORVENTEDE VÆRDIER Hvert locus har en CON-probe og to SSO-prober. Hvis en prøve indeholder en af de loci, der analyseres, skal konsensusproben og mindst en af SSO-proberne for det locus være positive. Probeværdier kan normalt bestemmes som positive eller negative. I sjældne tilfælde kan en værdi ligge mellem de positive og negative skæringsværdier og betragtes derfor som ubestemmelig. Hvis en prøve indeholder ubestemte værdier for en bestemt SSO-probe, skal prøven typebestemmes, hvor proben antages at være negativ og igen, hvor proben antages at være positiv. Hvis to SSO-prober for et locus er ubestemmeligt, kan prøven kan ikke typebestemmes og skal analyseres igen. Som angivet i afsnittet Procedurens begrænsninger er det vigtigt at følge protokollen nøje. Enhver afvigelse kan medføre fejl i typebestemmelsen af prøven. SPECIFIKKE EGENSKABER FOR PERFORMANCE Når LIFECODES HLA SSO Null Allele Typing Kits anvendes ifølge den procedure, der beskrives i produktets indlægsseddel, kan klasse I og klasse II HLA-typer i DNA-prøverne bestemmes. HLA -Null Allele Class 1 (Null1) analyser viser 100 % overensstemmelse (97,4 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for A locus, 100 % overensstemmelse (97,4 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for B locus og 100 % overensstemmelse (97,4 % nedre græns e ved 95 % konfidensinterval) for C locus i 139 evaluerede prøver ved sammenligning med resultater, der blev opnået med bidirektionel sekventering. HLA -Null Allele Class 2 (Null2) analyser viser 97,1 % overensstemmelse (92,7 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for DRB 4 locus og 98,5 % overensstemmelse (94,8 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for DRB 5 locus i 137 evaluerede prøver ved sammenligning med resultater, der blev opnået med bidirektionel sekventering. REFERENCER 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39: Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 BEGRÆNSEDE LICENSER Taq-polymerase produceres for Immucor Transplant Diagnostics af Promega Corp. Det er udliciteret til Promega under US-patenter nr og og deres korresponderende patenter udenlands. Køb af dette produkt omfatter en begrænset licens, der ikke kan overdrages, under US-patentet 5,981,180 eller tilsvarende patent i andre lande tilhørende Luminex Corporation, til at udføre multiplex-analyse af kliniske prøver til HLA-typebestemmelse. Producent: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, CT USA. Tlf.: , ; Fax: Autoriseret repræsentant: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322, Germany Phone: (+49) , Fax: (+49) Teknisk service i Europa: Tlf.: +32/ Dette dokument blev sidst revideret og udgivet: Rev 3; Side 7 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)

8 ANVENDTE VAREMÆRKER AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. BILAG A Gel-elektroforese PCR-reaktionerne, der udføres i LIFECODES HLA-SSO Typing Kits, er udviklet til at danne både dobbelt- og enkeltstrengede produkter, som er de overvejende produkter, der hybridiseres til SSO'erne. Af hensyn til kvalitetssikring eller for at foretage fejlfinding i et forsøg kan det være nødvendigt at foretage gelelektroforese for at undersøge PCR-reaktionen for tilstedeværelse af amplificeret DNA. Nødvendige materialer (som angivet på listen eller tilsvarende) Electrophoresis Grade Agarose (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose nr ) Elektroforeseapparat/strømforsyning 1X gelbuffer (40xTAE, Promega No. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. nr ) UV-transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc., model TM36) Fotografisk billedsystem Den relative vandring af det enkeltstrengede produkt afhænger af gelkoncentrationen og det anvendte buffersystem. Omtrentlige vandringer for hver amplifikation vises på listen nedenfor for prøver kørt i en 2 % agarosegel i 1X TAE-buffer. Elektroforeseforhold 1. Tag GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. nr ) ud af fryseren til optøning. Opbevar den mørkt. 2. Gelen, der bruges til denne procedure, skal være 2 %, dvs. til et gelkar på 200 ml skal der bruges 4 g agarose til 200 ml 1X TAE (fortyndes fra 40X TAE). Tilsæt 10 µl GelStar Nucleic Acid Stain til den smeltede agarose. Sørg for, at der er tilstrækkelig plads til, at DNA'et kan vandre 3-5 cm, når gelen hældes op. FORSIGTIG! GelStar er et potentielt karcinogen. BEMÆRK! Det er muligt at køre geler med 20 µl af 10 mg/ml ethidiumbromid i stedet for GelStar Nucleic Acid Stain. Produktets båndintensitet vil være mindre i geler, der indeholder ethidiumbromid end i geler, der indeholder GelStar. FORSIGTIG! Ethidiumbromid er et kendt karcinogen. 3. Opbevar gelen mørkt, og lad den størkne. 4. Tilsæt en blanding af 2,5 µl af hvert PCR-produkt og 2,5 µl 2X loadingbuffer med synligt farvestof, pr. prøve, pr. amplifikation. Lad gelen vandre i mørke ved ca. 160 V i 45 minutter, eller indtil prøverne har vandret længe nok til, at der kan observeres bånd for enkelt- og dobbeltstrenget produkt (bromphenolblåt bånd eller anden synlig markør, der vandrer 3-5 cm fra brøndene). 5. Tag et foto ved hjælp af UV-transilluminatoren med et gult GelStar -fotofilter (Lonza Group, Ltd. nr ). FORSIGTIG! Anvend beskyttelsesudstyr ved håndtering af GelStar Nucleic Acid Stain eller ethidiumbromid og ved fotografering af gelen med UVtransilluminatoren. 6. Gel-analyse Null Class1 Null Class2 Dobbeltstreng(e) (bp) ~210, ~180, ~280 ~280 Enkeltstreng(e) (bp) ~150,~180 ~140,~180 Gel-fortolkning Brønd Dobbeltstrenget DNA Enkeltstrenget DNA Primerbånd Amplifikation (lys) (mindre lys) Ikke-amplifikation Side 8 af 8 LC1437CEDA.3 (05/15)