Bioraffinering og Enzymer. Mette Lübeck

Transkript

1 Bioraffinering og Enzymer Mette Lübeck

2 Plantebiomasse til bioraffinering Fotosyntese = lysenergi bundet i biomasse Lys 6 H 2 O + 6 CO 2 -> C 6 H 12 O O 2 Glukose Stivelse cellulose hemicellulose lignin

3 Bioethanol sukker platform 1. generations teknologi Stivelsesbaseret ethanol Biomasse: Majs, korn, sukkerrør 2. generations teknologi Ethanol fra planterester (lignocellulose) Biomasse: Majsstængler, halm, udpressede sukkerrør, træ Mette Lübeck 3

4 2. generations teknologi Udnyttelse af rester fra fødevareproduktion og græsser lignocellulosen På nuværende tidspunkt produceres 2. generations bio-ethanol kun begrænset på kommerciel basis. Mette Lübeck 4

5 Biomasse til 2.-generations teknologi Hvede halm Pil Kaffe planter Majs stængler Eukalyptus træ Ris Halm Udpressede sukkerrør Etc

6 Lignocellulose omdannelse

7

8

9 De 3 nødvendige procestrin i bioraffinering 1. Forbehandling for at nedbryde plantecellevægs strukturen 2. Enzym hydrolyse, hvor enzymer nedbryder kemiske bindinger mellem cellevægskomponenterne for at danne monomer sukre 3. Fermentering hvor monomer sukker er omdannet af mikroorganismer til produkter, f.eks. bioethanol Jeres forsøg involverer enzym hydrolyse af forbehandlet hvedehalm og bestemmelse af de frigivne sukre

10 Plantecellevægsnedbrydende enzymer Der er behov for forskellige enzymtyper, der arbejder synergistisk sammen for fundstændig nedbrydning af plantecellevæggen: Cellulaser Hemicellulaser Ligninaser Forbehandling vha. vådoxidation af hvedehalm fjerner lignin og hemicellulose fra cellulose og nedbryder hemicellulosen til monomerer Hvedehalm indeholder ca. 41 % cellulose, 32 % hemicellulose, 18,5% lignin!

11

12 Hvor får vi enzymer fra?

13

14 Plantenedbrydende mikroorganismer Nedbryder organisk materiale i naturen Cellerne udskiller fordøjelses -enzymer, der nedbryder det organiske materiale til simple forbindelser (sukre), som de derefter kan optage Derfor rig kilde til enzymer, der kan anvendes i bioraffinaderiet!!!

15 Enzymer som Industrielle Produkter Exoenzymer Enzymer, der bliver udskilt af cellerne Kan fordøje uopløselige polymerer som f.eks. cellulose, proteiner, og stivelse Enzymer er nyttige som industrielle katalysatorer: bio-katalysatorer Høj substrat specificitet

16 Enzymer som Industrielle Produkter Enzymer produceres i svampe og bakterier Bakterielle proteaser bliver brugt i vaskepulver er isoleret fra alikaliske bakterier Vaskepulver indeholder også amylaser, lipaser, og reduktaser Amylaser og glucoamylaser bruges også i 1. generation bioethanol (stivelses baseret ethanol) Isoleres fra skimmelsvampe Cellulaser, der bruges i 2. generation bioethanol Isoleres fra skimmelsvampe

17 Biodiversitet Pektinaser Cellulaser Hemicellulaser Amylaser Proteaser Lipaser Peroxidaser

18 Mikrobiel Biodiversitet Kun toppen af isbjerget er kendt 1 g jord indeholder > 4000 forskellige genomer kun 1-5 % af alle mikroorganismer er blevet dyrket 3,5 millioner års evolution Alle økologiske nicher indeholder mikroorganismer Er adaptateret til alle miljømæssige udfordringer enormt potentiale for uopdagede fysiologiske & biokemiske egenskaber Described Species Estimated Species Bacteria Fungi

19 Skreening for hydrolytiske enzymer i skimmelsvampe Enzymer, der kan nedbryde plantedele cellulaser og xylanaser Enzym produktion ved at dyrke svampene på et substrat, hvor de skal bruge plantedele som næring (f.eks. Hvedeklid) Test for enzym produktion på AZCL medium cellulose

20 Skreening for beta-glucosidase enzym - Svampen på toiletbrættet

21 Taksonomi af sorte Aspergillus arter

22 DNA sekventering

23 Idenfikation af en ny Aspergillus art RT 30 C 33 C 36 C 40 C

24 Konklusion Muligt at bevise at det er en ny art, der ikke tidligere er beskrevet Navngivning af Aspergillus saccharolyticus som en ny art Normalt skal der findes adskillige isolater før man kan beskrive en ny art Kun isolatet fra toiletbrættet blev fundet MEN nu er der fundet ét mere eksemplar I et myreløvehul i Australien

25 Klassisk screening og metagenom screening

26 Hvorfor bruge gensplejsning til enzym produktion? Mange enzymer kan ikke produceres i tilstrækkelig mængde ved klassiske metoder Mange donor organismer er ikke ideelle til produktion i ståltanke Ved at benytte nogle få udvalgte produktionsorganismer, kan der udvikles stor ekspertise i håndtering af disse sådan at de er effektive til industriel produktion af enzymer Produktionsstammen kan ændres til at kun det ønskede produkt produceres

27 Kloning af gener Grow culture Ligate into plasmid vector Restriction enzyme digest Isolate DNA Transformation of host bacterium Transformation of fungal host 27

28 Screening for vækst og højt udbytte hos transformanter assay growth i microtiter plates test i pilot / production isolation of good transformants test i lab.tanks test in shake kolbs

29 Diagram for industriel enzym produktion

30 Bæredygtig Bioteknologi Biokemi og genetik Cellebiologi Mikrobiologi Bæredygtighed, bioenergi, ingeniørfærdigheder Procesbioteknologi Bioteknologi

31 BIOREF: Et Aalborg Universitet styret Bioraffinaderi koncept Biomedicin Forbehandling Lucerne Proteiner Lignocellulose Foder Enzymer Sukre kompost Fødevarer Biobrændstoffer Biokemikalier SUPRABIO: Et EU finansieret Bioraffinaderi projekt hvor Aalborg Universitet deltager

32 Cellefabrikker Biomass Enzymatic Digestion Fungal cell High enzyme production Sugars Fungal cell or Bacterial cell Glucose/xylose Biofuels Biochemicals 32

33 Fungal strains Engineering of central pathways for high metabolic flux Metabolic flux analysis Fungal Cell Factories Antimicrobial peptides Polyketides Enzymes Hydrocarbons Chemical building blocks Biomedicin, Anti-microbial compounds Healthy Food/Feed additives Better enzymatic processes Fuels Chemicals, plastics, rubber, dyes

34 P Glucose Cytosol Phosphoenolpyruvate MDH Malate Glucose Pyruvate Succinate Fumarate Malate Oxaloacetate Pyruvate Oxaloacetate Glycolysis Mitochondria TCA Krebs Cyclus Malic acid Nucleus Skimmelsvamp Citrate Citrate Citric acid Glucose transporter Gluconic acid Malate/Citrate Antiport Acid Transporter Acid Transporter Xylose Xylose transporter Xylose Xylitol Fumarate Succinate PEPCK PPC PYC FR GOX FUM SXR PFK MAE

35 Svampe til biomasse omsætning Skimmelsvampe/gær Kommercielle enzymer er baseret på skimmelsvampe Biobrændstoffer Biologisk forbehandling: Hvid og brunrådssvampe Biokemikalier 35

36 Metabolic Engineering Metabolic Engineering FUNGAL CELLS Fungal cell factory: Bio-fuels Fungal cell factory: Enzymes Glycolysis Fungal cell factory: Bio-chemicals Mycobooster Lignocellulases Cellulases Small molecules Organic acids Hydrocarbons Garden refuse & household waste

37 Introduktion til dagens øvelser Enzym hydrolyse Beta-glucosidase assay

38 Typisk indhold af en lignocellulose-indeholdende biomasse Lignin 5-35% 35-45% Cellulose glucose Hemicellulose 25-40% primær C5 sukker C6 sukker Gær, BG1 Ethanol BG1 xylose, arabinose, galactose, mannose, glucose.

39 Lignocellulose-indeholdende biomasse Hydrolyse (Forbehandling, enzymer) Monosaccharider C6 fermentering (Gær) Glucose (C6) Ethanol Pentose (C5) Ethanol C5 Fermentation (Specific bacteria, other yeast species)

40 1 kg hvedehalm (410 g cellulose, 320 g hemicellulose, 185 g lignin) Forbehandling: 95% cellulose tilbage 85% omdannelse af hemicellulose til pentose Enzym hydrolyse: 85% omdannelse af cellulose til glucose Monosaccharider 390 g glucose (C6) 270 g pentose (C5) C6 Fermentering 0,45 g-ethanol/g-glucose C5 Fermentering 0,4 g-ethanol/g-xylose 176 g ethanol 108 g ethanol 0,22 L ethanol 0,14 L ethanol Total: 0,36 L ethanol

41 Laboratorieøvelse: Enzym hydrolyse af en forbehandlet biomasse (hvedehalm). Tilsætning af 3 forskellige kommercielle enzymer (cellulase blandinger) til forbehandlet hvedehalm: Novozym188 - primær beta-glucosidase aktivitet Celluclast - primær cellobiohydrolase og endocellulase aktivitet CellicCTec2 primær cellobiohydrolase, endocellulase og beta-glucosidase aktivitet Efter hydrolysen (2 dages inkubering ved 50 o C), vil prøverne blive testet for frigivne sukre (glucose, cellobiose, xylose og arabinose) vha. HPLC analyse Efter øvelsen: Udlevering af et sæt resultater til beregning af hydrolyse effektivitet

42 Enzym assays Semi-kvantitative assays for high-through-put screening Kvantitative assays Enzymer kan enten blive udtrykt som mol mængde eller bestemt vha. deres aktivitet, i enzyme units

43 AZCL-substrater AZurine-Cross Linked Polysaccharider - Hvordan virker de? Remazolbrilliant Blue R

44 Sammenligning af forskellige enzym profiler cellulose xylan arabinan galactan

45 Beta-glucosidase assay 2,5 standard curve Abs 2,0 1,5 1,0 y = 0,001x + 0,1335 R² = 0,999 0,5 p-nitrophenyl-beta-d-1,4-glucopyranoside (yellow) 0, PNG)

46 Section for Sustainable Biotechnology Lab øvelse 50 ul prøve 5 µl 50 µl Stop reagent PNP fortynding Inkuber 10 min, 50 C Mål ved 400 nm i spectrofotometer A Std A Std B Std C Std D Std E Std F Std G Std H Std I X1 X2 X3 B Std A Std B Std C Std D Std E Std F Std G Std H Std I X1 X2 X3 C Std A Std B Std C Std D Std E Std F Std G Std H Std I X1 X2 X3 D X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 E X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 F X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 G X16 X16 X16 X18 X18 X18 X20 X20 X20 X22 X22 X22 H X17 X17 X17 X19 X19 X19 X21 X21 X21 X23 X23 X Course: Microbiological Diversity 46