Opgave 1 Spm. A: Spm. B:

Transkript

1 Opgave 1 Familien af TM7 receptorer (receptorer med 7 transmembrane segmenter) udgør ud fra genomsekvensen den største proteinfamile i C. elegans. Det samme må forventes at gælde i pattedyr. Imidlertid er den tredimesionelle struktur kun kendt for én eukaryot TM7 receptor; bovin rhodopsin. Dette skyldes i første omgang, at der ikke findes noget naturligt forekommende væv, hvorfra det er muligt at oprense de forskellige kendte receptorer. Receptorer er oftest blevet fundet ved, at der er blevet syntetiseret et lille organisk molekyle eller peptid, der har evnen til at binde receptoren og dermed udløse et cellulært respons. Vasopressin receptorer, som er udtrykt i nyre, binder således vasopressin med høj affinitet. Til bindingsstudier kan anvendes [ 3 H]-mærket vasopressin. Spm. A: Beskriv i hovedtræk en strategi til kloning af fuldlængde vasopressin receptor cdna fra rottenyre. Det antages at sekvensen af vasopressin receptor cdna ikke er kendt fra nogen organisme. Nukleotidsekvensen af fuldlængde vasopressin receptor cdna og den tilhørende primær struktur er vist i Figur 1. En student får til opgave at konstruere et ekspressionssystem til vasopressin receptoren og har derfor brug for en cdna klon. Studenten kan nu enten skrive til de, som har klonet receptoren, eller gå ind i sekvensdatabasen, finde den nukleotidsekvens der er vist i Figur 1 og med den viden til rådighed selv hurtigt klone det ønskede cdna. Spm. B: Beskriv hvoledes du med kendskab til sekvensen i Figur 1 vil klone cdna for vasopressin receptoren fra rottenyre. Sekvensen og orienteringen af anvendte oligonukleotider skal angives. Studenten vælger at forsøge at producere vasopressin receptoren i gæren S. cerevisiae. Da receptoren er et membranprotein, skal det transporteres til plasmamembranen via endoplasmisk reticulum. For at sikre targeting til ER ønskes vasopressin receptoren påsat et gær signalpeptid. Her anvendes pre-proregionen af gærens alfa-faktor, som er et secerneret protein i gær. Denne pre-pro region har tidligere vist sig effektiv til at guide heterologe proteiner til ER. Nukleotid- og aminosyresekvensen af alfa-faktor pre-pro regionen er angivet i Figur 2.

2 atgctcctggtgtctaccgtgtccgctgtgcctgggctcttttcaccccctagctctccc M L L V S T V S A V P G L F S P P S S P agcaacagcagccaggaggaactactggatgatcgagacccgctgctagtccgggctgaa S N S S Q E E L L D D R D P L L V R A E ctggccctgctatctacaatttttgtggctgtggccttgagcaatggcctagtgctgggg L A L L S T I F V A V A L S N G L V L G gccctaatacggcggggccggcgtggacgctgggcacccatgcatgtcttcatcagtcat A L I R R G R R G R W A P M H V F I S H ttgtgcctggctgacctggctgtggctctgtttcaagtgctaccccagctggcttgggat L C L A D L A V A L F Q V L P Q L A W D gccactgaccgcttccatggccctgatgccctgtgtcgggccgtcaagtacctgcagatg A T D R F H G P D A L C R A V K Y L Q M gtgggcatgtatgcctcctcctacatgatcctggccatgacactagaccgccatcgtgcc V G M Y A S S Y M I L A M T L D R H R A atctgccgccctatgctagcataccgccatggaggtggggctcgctggaacaggccagtg I C R P M L A Y R H G G G A R W N R P V ctggtggcctgggccttctcactccttctcagcctgcctcagctcttcatctttgctcag L V A W A F S L L L S L P Q L F I F A Q cgtgatgtgggaaatggcagtggggtgtttgattgctgggcccgatttgcagaaccatgg R D V G N G S G V F D C W A R F A E P W ggccttcgtgcctatgtcacctggattgccttgatggtgtttgtggcacctgccctaggc G L R A Y V T W I A L M V F V A P A L G attgctgcctgtcaggttcttatcttccgggagatacacgccagtctggtgccagggcca I A A C Q V L I F R E I H A S L V P G P tccgagagggcagggacgccgcagagggcgccggacagaagccccagcgagggagcacat S E R A G T P Q R A P D R S P S E G A H gtatcagcagccatggccaagaccgtgaggatgacactggtgattgtgattgtctacgtg V S A A M A K T V R M T L V I V I V Y V ctatgctgggcacccttcttcctcgtgcagctgtgggcagcgtgggatccggaagctcct L C W A P F F L V Q L W A A W D P E A P ctggaaagacccccctttgtgttgctcatgctgctggctagccttaacagctgtaccaac L E R P P F V L L M L L A S L N S C T N ccttggatctatgcttccttcagtagcagtgtctcctcggagttgcgtagcctgctttgc P W I Y A S F S S S V S S E L R S L L C tgtgctcagaggcacaccacacacagcctgggtcctcaagatgaatcctgtgccacagcc C A Q R H T T H S L G P Q D E S C A T A agctcctctttgatgaaggatacaccctcctga S S S L M K D T P S - Figur 1: Nukleotid sekvensen af fuldlængde vasopressin cdna og den tilhørende amino syresekvens. Den primære struktur er angivet i enkelt-bogstavkode.

3 caagaagattacaaactatcaatttcatacacaatataaacgaccaaaagaatgagattt M R F ccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaac P S I F T A V L F A A S S A L A A P V N actacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagat T T T E D E T A Q I P A E A V I G Y S D ttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggtta L E G D F D V A V L P F S N S T N N G L ttgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggat L F I N T T I A S I A A K E E G V S L D aaaagagaggctgaagcttggcattggttgcaactaaaacctggccaaccaatgtacaag K R E A E A W H W L Q L K P G Q P M Y K agagaagccgaagctgaagcttggcattggctgcaactaaagcctggccaaccaatgtac R E A E A E A W H W L Q L K P G Q P M Y aaaagagaagccgacgctgaagcttggcattggctgcaactaaagcctggccaaccaatg K R E A D A E A W H W L Q L K P G Q P M tacaaaagagaagccgacgctgaagcttggcattggttgcagttaaaacccggccaacca Y K R E A D A E A W H W L Q L K P G Q P atgtactaagcccgactgataacaacagtgtagatgtaacaaagtcgactttgttcccac M Y tgtacttttagctcgtacaaaatacaatatacttttcatttctccgtaaacaacctgttt tcccatgtaatatccttttctatttttcgtttcgttaccaactttacacatactttatat agctat Figur 2: Nukleotid sekvensen af en del af alfafaktor genet fra S. cerevisiae samt den tilhørende amino syre sekvens angivet i enkelt-bogstavkode. Pilen angiver hvor i peptidkæden fraspaltning af prepro delen foregår i S. cerevisiae. Spm. C: Beskriv, hvorledes du vil fremstille et cdna fragment, der koder for en inframe fusion mellem pre-pro-delen af alfa faktor og vasopressin receptoren. Sekvensen og orienteringen af anvendte oligonukleotider skal angives.

4 Studenten fremstiller det ekspressionsplasmid, der er vist i Figur 3 og sekventerer konstruktionen. Nukelotidsekvensen viser sig at være som forventet. α-faktor-vasopressin 2μ URA3 leu2-d P15A bla Figur 3: Kort over det af studenten konstruerede ekspressionsplasmid. Den sorte kasse angiver α- faktor-vasopressin fusionen. Pilen angiver transkriptionsretningen for fusionen.ura3, orotitin-5 -P decarboxylase genet med promoter fra gær; leu2-d, en dårlig udtrykt allel af β-isopropylmalate dehydrogenase genet fra gær; 2μ, replikationsorigin fra gærplasmidet 2μ; CYC-GAL, galaktose reguleret promotor; p15a, E. coli replikations origin; bla, gen kodende for β-lactamase aktivitet. Spm. D: Beskriv funktionen af hvert enkelt element i ekspressionsvektoren i Figur 3. Studenten finder efter dyrkning af transformerede gærceller og induktion af promotoren med galaktose, at der kun kan påvises meget lidt receptor protein i gærens membraner både ved bindingsforsøg med radioaktiv mærket vasopressin og ved western blotting med receptor specifikke antistoffer. Spm. E: Beskriv og begrund hvilke to forsøg du synes studenten først bør udføre for, at belyse årsagen til den manglende akkumulering af receptor protein i gærens membraner.

5 Studenten beslutter at udføre et pulse-chase forsøg for at bestemme halveringstiden af receptor protein i gær. Spm. F: Beskriv de enkelte trin i et pulse-chase forsøg. Data i Tabel 1 viser, hvorledes receptor proteinmængden forsvinder som funktion af tiden efter, at der er indledt et chase. Tid (minutter efter start af chase) Residual mængde receptor protein (%) Tabel 1: Residual mængde receptor protein efter der er indledt et chase. Mængden af receptor protein er angivet i procent af den mængde, der var tilstede ved indledningen af chaset. Spm. G: Bestem ud fra data i Tabel 1 halveringstiden for vasopressin recptorprotein i gær.

6 Opgave 1 Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) tilhører familien af kemokiner. MCP-1 er en specifik chemoattractant som under bestemte fysiologiske forhold tiltrækker monocytter. Membranreceptoren (hccr2) for MCP-1 fungerer udover receptor for MCP-1 som en essentiel co-receptor for invasion af HIV virus. MCP-1 spiller også en rolle i væksten af tumorer, idet makrofager tiltrukket af MCP-1 forhindrer vækst af tumorer in vivo. Der er isoleret en cdna klon for hccr2. For at undersøge den transkriptionelle regulation af hccr2 genet blev der fremstillet et humant genombibliotek i vektoren λ-dash II, som er vist i Figur 1. Figur 1: Strukturelt kort over vektoren λ-dash II der anvendes til konstruktion af et humant genombibliotek. Spm. A: Beskriv kort hvorledes du vil fremstille et humant genombibliotek i λ- DASH II, samt hvorledes du vil screene biblioteket for kloner indeholdende hccr2 sekvenser. Spm. B: Hvilken genotype er det hensigtsmæssig, at den bakteriestamme, der skal tjene som vært for dit λ-dash II-bibliotek, har? Figur 2 viser et northern blot af total RNA isoleret fra tre forskellige cellelinjer benævnt THP-1, J-111 og U-251MG. Som probe er anvendt radioaktivt mærket hccr2 cdna eller 28S DNA.

7 A B Figur 2: Northern blots af total RNA fra THP-1, J-111 eller U-251MG celler probet med henholdsvis hccr2 cdna (A) og en 28S specifik probe (B). Spm. C: Begrund relevansen af det i Figur 2 viste forsøg med henblik på karakteriseringen af hccr2 promotoren? Ved screening af genombiblioteket blev der isoleret en λ-klon, der indeholder hele den kodende region af hccr2 samt 5,0 kb opstrøms fra translations-startsitet. Sekvensen af en del af regionen omkring transkriptions-startsitet er angivet i Figur 3. Figur 4 viser resultatet af primerekstension analyse udført med primer PE på hccr2 mrna samt en sekvensereaktion på en hccr2 genomklon med primer PE. Spm. D: Bestem ud fra Figur 3 og Figur 4 hvor transkriptions-startsitet er i hccr2 genet.

8 5 TTCTGTTGTGCTCATATCATGCAAATTATCACTAGTAGGAGAGCAGAGAGT GGAAATGTTCCAGGTATAAAGACCCACAAGATAAAGAAGCTCAGAGTCG TTAGAAACAGGAGCAGATGTACAGGGTTTGCCTGACTCACACTCAAGGTT GCATAAGCAAGATTTCAAAATTAATCCTATTCTGGAGACCTCAACCC 3 Figur 3: Nukleotid sekvensen af en del af regionen opstrøms og nedenstrøms for transkriptionsstartsitet i hccr2 genet. Primer, PE, anvendt til primerekstension analyse på hccr2 mrna og til sekventering af hccr2 genom DNA er komplementær til den understregede sekvens. Det vides, at der ingen introns er mellem den understregede sekvens og det opstrømsbeliggende transkriptions-startsite Figur 4: Resultatet af primer-ekstensionanalyse på hccr2 mrna med primer PE og en sekvensreaktion på en hccr2 genomklon med samme primer. P, angiver den lane hvor primerekstention produktet er applikeret; G,A,T,C angiver sekvensreaktionerne på en hccr2 klon med primer PE.

9 Komponenterne i Figur 5 indgår i en alternativ metode til bestemmelse af transkriptions-startsitet. Figur 5: Komponenter, der indgår i en alternativ metode, til fastlæggelse af transkriptions-startsitet. Strukturen af et mrna molekyle er angivet sammen med lokaliseringen af primer P. Spm. E: Redegør for, hvorledes det med komponenterne i Figur 5 er muligt at bestemme transkriptions-startsitet i hccr2 genet på en alternativ måde til den, der er anvendt i Figur 3 og Figur 4. For at analysere hccr2 promotoren blev 1,7 kb af regionen opstrøms for transkriptions-startsitet og 118 nukleotider nedenstrøms for transkriptions-startsitet klonet i vektoren pgl3-basic som et KpnI-HindIII fragment. Strukturen af pgl3- Basic er vist i Figur 6.

10 Figur 6: Strukturen af plasmidet pgl3-basic til konstruktion af fusioner mellem promotorer og et luciferase reportergen (luc + ). Figur 7 viser strukturen af en række hccr2 promotor konstruktioner, der er anvendt til transiente transfektionsstudier i cellelinjen THP-1. Endvidere er vist de normerede luciferase aktiviteter fra reporterfusionerne. De normerede luciferase aktiviteter er bestemt som forholdet mellem luciferase-aktivitet fra reporterfusionerne divideret med luciferase-aktiviteten fra et kontrolplasmid, som er co-transfekteret med hvert enkelt af de viste reporterfusioner. Kontrolplasmidets luciferase-aktivitet kan skelnes fra luciferase-aktiviteten fra reporterfusionerne da de måles ved forskellige bølgelængder.

11 Figur 7: Restriktionskort over en del af den isolerede hccr2 genomklon samt strukturen af hccr2 promotor-fusioner og de tilhørende normerede luciferase aktiviter i TPH-1 celler. Positionen af enkelte potentielle transkriptions-regulerende bokse er angivet. Placeringen af den utranslaterede exon 1 er angivet som en skraveret boks. Luciferase cdnaet er fusioneret til nukleotid i forhold til transkriptionsstart-sitet. Spm F: Hvad viser Figur 7 omkring aktiviteten af hccr2 promotoren? Figur 8 viser nukleotidsekvensen af tre oligonuleotider fremstillet ud fra sekvensen af hccr2 promotoren og to EMSA assays udført med disse oligoer. Oligoerne indeholder et potentielt Oct-1 bindingssite.

12 Figur 8: EMSA assay udført med kerneekstrakt fra THP-1 celler og 32 P mærkede O1 oligonukleotider. Øverst er vist en del af sekvensen opstrøms for TATA boksen, hvor et potentielt Oct- 1 bindingssite er lokaliseret. Kompetitor, - angiver, at der ikke er tilsat overskud af umærket oligonukleotid, O1, OC og NT angiver, at der er tilsat et hundrede gange molært overskud af umærket oligonukleotid; kerneekstrakt, +/- angiver, hvorvidt der er tilsat kerneekstrakt eller ej; antistof, - angiver, at der ikke er tilsat antistof til EMSA assayet; αoct1, αoct2 og αc/ebpβ, at der er tilsat antistof mod enten trankriptionsfaktoren Oct1, Oct2 eller C/EBPβ. De nøgne oligonulkleotider er kørt ud af de i figuren viste EMSA geler og ses derfor ikke. Spm.G: Hvad viser Figur 8 omkring Oct-1 bindingssitets potentielle rolle i regulering af hccr2 promotoren?