Monolisa HBe Ag-Ab PLUS tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab

Transkript

1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS tests HBe Ag - 96 tests HBe Ab SÆT TIL KONSTATERING AF HBBe Ag OG HBe Ab VED ENZYMATISK IMMUNTEKNIK IVD Producentens kvalitetskontrol Alle producerede og kommercialiserede reagenser er underlagt et komplet kvalitetssystem lige fra modtagelsen af råmaterialet til den endelige kommercialisering af produktet. Hvert parti sendes til kvalitetskontrol og frigives kun til markedet, hvis det opfylder de fastsatte godkendelseskriterier. Dokumentationen i forbindelse med produktion og kontrol af hvert parti opbevares i virksomheden.

2 1. FORMÅL INDHOLDSFORTEGNELSE 2. KLINISK INTERESSE 3. TESTPRINCIP 4. SÆTTETS SAMMENSÆTNING 5. NØDVENDIGT UDSTYR; DER IKKE MEDFØLGER 6. FORHOLDSREGLER 7. SUNDHEDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER 8. REKONSTITUERING AF REAGENSERNE 9. HOLDBARHED OPBEVARING 10. PRØVER 11. ANALYSEPROCEDURE 12. BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATER 13. SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING 14. TESTRESULTATER 15. REFERENCER 72

3 1 - FORMÅL Monolisa HBe Ag-Ab PLUS er en enzymimmunanalyse til kvalitativ bestemmelse af hepatitis Beantigen (HBe Ag) eller antistof til Be-antigen (Anti-HBe) i humant serum eller plasma. 2 - KLINISK VÆRDI Forekomsten af HBe Ag afspejler normalt aktiv viral replikation hos patienten og angiver smittetilstanden i en serumprøve. HBe Ag viser sig tidligt under hepatitis B-infektion, og dens persistens (over én måned) er et tegn på risiko for forhøjet leverpatologi, ved replikation af virussen. Tilstedeværelsen af antistof mod HBe Ag angiver en reduceret viral replikation og repræsenterer normalt en god klinisk prognose. 3 - TESTPRINCIP a) Bestemmelse af HBe-antigen Konstateringen af HBe Ag er baseret på en 2-trins "sandwich"-enzymimmunanalyse, der anvender et humant anti-hbe-antistof og to peroxidasemærkede murine, monoklonale anti-hbe-antistoffer (mab 1 og mab 2) mod forskellige epitoper. Den faste fase består af teststrimler med 8 polystyrenbrønde dækket med humant anti-hbe-antistof. Analysen omfatter følgende trin: 1. Inkubation af kontrol og ukendte prøver med anti-hbe-antistoffet fæstnet til den faste fase. 2. Vask, inkubation af immobiliserede komplekser med de peroxidasemærkede, monoklonale antistoffer. 3. Eliminering af fri konjugat ved afvaskning og derefter udvikling af enzymaktivitet, som er bundet til den faste fase, ved tilsætning af substrat. 4. Standsning af farveudviklingsreaktionen, aflæsning af absorbans ved 450/620 nm og fortolkning af resultaterne. b) Bestemmelse af anti-hbe-antistoffer Til konstatering af anti-hbe anvendes den samme faste fase som til HBe Ag. Testen er baseret på konkurrence mellem det immobiliserede antistof og det antistof, der er til stede i prøven, med sigte mod at begrænse den mængde HBe Ag, der bruges som et neutraliserende reagens. Konstatering opnås herefter ved hjælp af en ny blanding af peroxidasemærkede, monoklonale antistoffer (mab 1 og mab 2). Analysen omfatter følgende trin : 1. Inkubation af kontrolprøve og ukendte prøver med anti-hbe-antistoffet fæstnet til den faste fase og det neutraliserende reagens. 2. Afvaskning og dernæst inkubation af immobiliserede komplekser med peroxidasemærkede, monoklonale antistoffer. 3. Eliminering ved afvaskning af ubundet konjugat og derefter udvikling af enzymaktivitet, som er bundet til den faste fase, ved tilsætning af substrat. 4. Standsning af farveudviklingsreaktionen, aflæsning af absorbans ved 450/620 nm samt fortolkning af resultaterne. 4 - SAMMENSÆTNING AF TESTEN Alle reagenser anvendes udelukkende til in vitro-diagnosticering. Reagenserne leveres i tilstrækkelige mængder til 2 x 96 bestemmelser i 1-12 uafhængige kørsler og i henhold til følgende kombinationer: enten 96 HBe Ag-bestemmelser og 96 anti-hbe-bestemmelser eller 2 x 48 HBe Ag-bestemmelser og 2 x 48 anti-hbe-bestemmelser samtidigt. 73

4 ETIKET REAGENSSAMMENSÆTNING PRÆSENTATION R1 MIKROPLADE : 12 teststrimler à 8 brønde dækket med humane 2 plader anti-hbe-antistoffer fra plasma, der er positivt for HBs Ag, inaktiveret. R2 KONCENTRERET VASKEOPLØSNING (20X) 1 flaske Tris NaCl-buffer ph 7,4 235 ml Konserveringsmiddel : ProClin TM 300 (0,04 %) R3 NEGATIV KONTROL 1 flaske fælles for HBe Ag- og anti-hbe-testen Humant serum, 8 ml der er negativt for HBs Ag, anti-hiv1- og HIV2- samt anti-hcv-antistoffer Konserveringsmiddel : 0,1% natriumazid R4 HBe Ab-POSITIVT KONTROLSERUM 1 flaske Defibrineret anti-hbe-positivt humant plasma, potentielt positivt 1,5 ml for HBs Ag og negativt for anti-hiv1, anti-hiv2 samt anti-hcv-antistoffer, inaktiveret Konserveringsmiddel : 0,1% natriumazid R5 HBe Ag-POSITIVT KONTROLSERUM 1 flaske Defibrineret HBe Ag og HBs Ag-positivt humant plasma, 1,5 ml negativt for anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv, inaktiveret Konserveringsmiddel : 0,1% natriumazid R6 NEUTRALISEREDNE HBe-ANTIGEN 1 flaske Defibrineret HBe Ag og HBs Ag-positivt humant plasma, 8 ml negativt for anti-hiv1, anti-hiv2 samt anti-hcv-antistoffer, inaktiveret Konserveringsmiddel : 0,1% natriumazid R7a KONCENTRERET ANTI HBe-TESTKONJUGAT (5X) 1 flaske To monoklonale anti-hbe-antistoffer (mab1 og mab2)* 3 ml mærket med peroxidase R7b KONCENTRERET Ag HBe-KONJUGAT (5X) 1 flaske To monoklonale anti-hbe-antistoffer (mab1 og mab2)* 3 ml mærket med peroxidase R8 PEROXIDASESUBSTRATBUFFER 1 flaske Citronsyre- og natriumacetat-opløsning ph 4,0 med H 2 O 2 60 ml (0,015%) og DMSO (4%) R9 KROMOGEN 1 flaske Opløsning, der indeholder tetrametylbenzidin (TMB) 5 ml R10 STOPREAGENS 1 flaske 1 N-svovlsyre 28 ml TOM FLASKE TIL FORTYNDET REAGENS 1 flaske 25 ml * mab 1/mab 2-forholdet er forskelligt for R7a- og R7b-konjugaterne. De 2 konjugater må ikke ombyttes. 5 - NØDVENDIGT UDSTYR; DER IKKE MEDFØLGER Destilleret eller fuldstændigt demineraliseret vand. Natriumhypochlorit (alm. blegemiddel) og natriumbikarbonat. Sugende papir. Engangshandsker. Engangsrør af polystyren (12 x 75 mm). 74

5 Manuelle eller halvautomatiske, justerbare eller forindstillede pipetter, som kan afmåle og afpipettere 50 µl, 100 µl, 200 µl og 1 ml. Graduerede cylindre : 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml. Vortex-mixer. Beholdere til biologisk farligt affald. Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikropladevasker*. Vandbad med termostatstyring ved 40 ±1 C eller tilsvarende varmeskab til pladeopvarmning*. Mikropladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm*. * Spørg den tekniske afdeling efter oplysninger om det anbefalede udstyr. 6 - FORHOLDSREGLER Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis : Bland ikke reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. BEMÆRK! Det gælder for vaskeopløsning (R2 identificeret 20X med grøn skrift på etiketten), peroxidase substratbuffer (R8, etiketidentifikation : TMB buf., farvet blå), kromogen (R9, etiketidentifikation : TMB 11X, farvet lilla) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation : 1N farvet rød). Det er muligt at bruge andre partier end dem i dette kit under forudsætning af, at samme parti anvendes i hele testforløbet. Disse reagenser kan anvendes sammen med andre Bio-Radprodukter. Desuden kan vaskeopløsningen (R2 identificeret 20X med grøn skrift på etiketten) blandes med en af de to andre vaskeopløsninger indeholdt i de forskellige Bio-Rad reagenskit (R2 identificeret 10X med blå skrift eller 10X med orange skrift på etiketten), når de rekonstitueres korrekt og på betingelse af at der kun bruges én blanding til et bestemt testforløb. Kontakt vores tekniske serviceafdeling for at få yderligere oplysninger. Testnavnet samt et specifikt identifikationsnummer på testen er skrevet på rammen på hver mikrotiterplade. Dette specifikke identifikationsnummer er desuden angivet på hver teststrimmel. Monolisa HBe Ag-Ab PLUS : Specifikt id-nummer = 56. Kontroller det specifikke identifikationsnummer før enhver brug. Hvis identifikationsnummeret mangler eller er forskelligt fra det angivne nummer ovenfor, må teststrimlen ikke bruges. Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Det er nødvendigt at vente 30 minutter før brug, så reagenserne kan stabilisere sig ved stuetemperatur. Ved vaskebufferen R2 skal der ventes i en time. Rekonstituer reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan ændre enzymaktiviteten i konjugaterne. Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket grundigt og skyllet med demineraliseret vand. Undgå, at mikropladen tørrer i tiden mellem rengøringen og fordelingen af reagensstoffet. Brug en ny fordelingsspids til hver prøve. Grundig rengøring er et afgørende punkt i denne procedure : Overhold det anbefalede antal afvaskninger, og kontrollér, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Forkert rengøring kan medføre unøjagtige resultater. Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat- og udviklingsopløsning. Kontrollér, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt. Analyseproceduren må ikke ændres. Udviklingsopløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være farvet lyserød. Hvis den lyserøde farvning ændrer sig nogle få minutter efter rekonstitueringen, kan reagenset ikke anvendes og skal udskiftes. Forberedelsen af udviklingsopløsningen kan udføres i en ny engangsplastikbakke eller en glasbeholder, der først er vasket med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Dette reagens skal opbevares i mørke. 7 - SUNDHEDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER Alle reagenser i sættet er beregnet til "in vitro-diagnosticering". 75

6 Benyt engangshandsker ved håndtering af reagenser og prøver, og vask hænderne grundigt efter håndteringen. Undgå at pipettere med munden. Humant kildemateriale, der er brugt ved forberedelsen af reagenset R3 (negativ kontrol), er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag) og antistoffer mod HIV (anti- HIV-1 og anti-hiv-2). Humant kildemateriale, der er brugt til klargøring af reagens R1 (sensibiliseret mikroplade), er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for antistoffer mod HIV 1 og HIV 2 (Human Immunodeficiency Virus) og for antistoffer mod hepatitis C-virus (HCV). Det er reaktivt for hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag). Det er blevet fotokemisk deaktiveret. Humant kildemateriale, der er brugt ved forberedelse af R4 (anti-hbe-positiv kontrol), R5 (HBe Agpositiv kontrol) og R6 (neutraliserende HBe Ag), er blevet testet og fundet ikke reaktivt for antistoffer mod HIV (anti-hiv-1 og anti-hiv-2) samt antistoffer mod hepatitis C-virus (anti-hcv). R5 og R6 blev fundet reaktivt for hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag), R4 er potentielt reaktivt for HBs Ag. Det er blevet fotokemisk deaktiveret. Eftersom der ikke er kendskab til en testmetode, der med garanti kan sikre, at der ingen smitstoffer forekommer, skal du håndtere reagenserne og patientprøverne som potentielle smittebærere. Alt udstyr, der er i direkte kontakt med såvel prøvemateriale og reagenser som vaskeopløsninger, skal betragtes som kontaminerede produkter og håndteres derefter. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale. Ved spild af materiale skal der renses efter med blegemiddel i en 10%-opløsning. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal det spildte materiale først neutraliseres med natriumbikarbonat og tørres op med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres og placeres i en beskyttet affaldsbeholder. Såvel prøver og reagens af human oprindelse som kontamineret materiale og kontaminerede produkter skal kasseres efter desinficeringen : - enten ved nedsænkning i blegemiddel med en slutkoncentration på 5% natriumhypochlorit (1 del blegemiddel til 10 dele kontamineret væske eller vand) i 30 minutter - eller ved autoklavering ved 121 C i mindst 2 timer. Autoklavering er den bedste metode til at deaktivere HIV- og HBV-viraene. UNDGÅ AT PLACERE OPLØSNINGER, DER INDEHOLDER NATRIUMHYPOCHLORIT, I AUTOKLAVEN. Husk at neutralisere og/eller autoklavere opløsningerne eller brugt rengøringsmateriale eller enhver væske, der indeholder biologiske prøver, før de hældes i afløbet. Sikkerhedsdataarket udleveres ved henvendelse. Kemikalier skal håndteres og bortskaffes i overensstemmelse med god laboratoriepraksis. Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stopopløsningen (fare for forgiftning, irritation eller forbrændinger). Natriumazid medfølger som konserveringsmiddel i flere sætkomponenter. Natriumazid kan reagere med laboratoriets rørføring og danne bly- eller kobberazider. Disse azider er eksplosive. Undgå dannelse af azider ved at skylle rørene med store mængder vand, hvis opløsninger med azidindhold hældes i afløbet efter deaktivering. Nogle reagenser indeholder ProClin 300 (0.04%, 0.1 % og/eller 0,5%). Xi Lokalirriterende R43 : Mulighed for irritation ved hudkontakt S28-37 : Kommer stoffet på huden vaskes straks med store mængder vand. Brug egnede beskyttelseshandsker. 8 - REKONSTITUERING AF REAGENSERNE BEMÆRK! Lad reagenserne opnå stuetemperatur (18-30 C), før de anvendes. Mikroplade (R1) Hver støtteramme indeholder 12 teststrimler, der er pakket i en forseglet foliepose. Åbn posen med en saks eller skalpel 0,5-1 cm over forseglingen. Åbn posen, og tag rammen ud. Læg de ubrugte strimler tilbage i posen. Luk posen omhyggeligt, og opbevar den ved +2-8 C. 76

7 Koncentreret Vaskeopløsning (20X) : R2 Opløs reagensen 1:20 i destilleret vand for at få en brugsklar vaskeopløsning. Blandes. Der skal bruges 75 ml brugsklar vaskeopløsning til én teststrimmel. Koncentreret anti-hbe-konjugat (R7a) Fortynd R7a i forholdet 1:5 med den forberedte R2-opløsning i overensstemmelse med det antal teststrimler, der skal anvendes : Antal anvendte teststrimler Mængde R7a (ml) Fyld op med forberedt R2 op til (ml) 1 0, , , , , , , , , ,4 12 Blandes. Konjugatet R7a kan bruges, som det er, uden yderligere fortynding efter den angivne procedure : Tilsæt 80 µl fortyndet vaskeopløsning (R2) til 20 µl anti-hbe-konjugat R7a. Blandes. Koncentreret Ag HBe-konjugat-test (R7b) Brug den samme protokol som til R7a-konjugatet. Farveudviklingsopløsning (R8 + R9) Fortynd reagenset (R9) 1:11 med reagens R8 (f.eks. 1 ml R9-reagens i 10 ml R8-reagens). Homogeniseres. Der skal bruges 10 ml til mellem 1 og 10 teststrimler. 9 - HOLDBARHED OPBEVARING Kittet skal opbevares ved +2-8 C. Når det opbevares ved denne temperatur, kan hver reagens anvendes indtil den anførte udløbsdato på pakken (undtagen forbestemte instruktioner). R1 : Når du har åbnet den vakuum-forseglede pose, kan teststrimlerne med mikropladebrønde bruges i en måned, når de opbevares ved +2-8 C i den omhyggeligt forseglede pose. R2 : Den fortyndede vaskeopløsning kan opbevares ved stuetemperatur (2-30 C) i 2 uger. Den koncentrerede vaskeopløsning (R2) kan opbevares ved C. R7a : Det fortyndede konjugat til HBe Ag test kan opbevares 8 timer ved stuetemperatur (18-30 C). Konjugatopløsning bør beskyttes mod lys, ved stuetemperatur (18-30 C). R7b : Det fortyndede konjugat til anti-hbe test kan opbevares 8 timer ved stuetemperatur (18-30 C). Konjugatopløsning bør beskyttes mod lys, ved stuetemperatur (18-30 C). R8 + R9 : Efter rekonstitution kan reagenset, når det opbevares i mørke, bruges i 6 timer ved stuetemperatur (18-30 C) PRØVER Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis. Testen skal udføres på ufortyndet serum eller plasma (indsamlet i EDTA-, citrat- og ACD-baserede antikoagulerende stoffer). Træk det ud så hurtigt som muligt for at undgå hæmolyse. Prøver med aggregater skal renses ved centrifugering forud for testen. Opslæmmede fibrinaggregater eller -partikler kan give falsk-positive resultater. Prøverne skal opbevares ved +2-8 C, hvis screeningen udføres inden for syv dage, eller dybfryses ved -20 C. Undgå gentagen nedfrysning/optøning. 77

8 Hvis prøverne skal sendes, skal de pakkes i overensstemmelse med de gældende bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer. De skal helst sendes frosne. UNDGÅ AT ANVENDE KONTAMINERET, HYPERLIPÆMISK ELLER HYPERHÆMOLYSERET SERUM. BEMÆRK! Prøver, der indeholder op til 100 mg/l bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder mængder op til det, der svarer til 36 g/l triolein, og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 2,5 mg/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. En reduktion i forholdet blev observeret for negative prøver, der var opspædet med 45 mg/ml albumin ANALYSEPROCEDURE Følg det angivne pladeskema ved samtidige anti-hbe- og HBe Ag-testprocedurer på samme plade: Anti-HBe-test : række 1-6 HBe Ag-test: række 7-12 a) Anti-HBe-testprocedure 1. Forbered vaskeopløsningen. 2. Tag en eller flere teststrimler ud af den beskyttende emballage. Læg ubrugte teststrimler tilbage i pakken, og forsegl den. 3. Fordel følgende mængder i hver brønd : A1, B1, C1 : 100 µl negativ kontrol (R3). D1 : 100 µl positiv kontrol (R4). E1, F1, G1 : 100 µl prøvemateriale. Afhængig af det anvendte system er det muligt at ændre placering af kontrollerne ellerdistribueringsrækkefølgen. NB : Der er en tydelig farveforskel på en tom brønd og en brønd, der indeholder prøvemateriale (gult). Tilstedeværelse af prøve i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 490 nm (enkelt bølgelængde). Se afsnit 13: SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING. 4. Tilsæt hurtigt 50 µl neutraliserende HBe-antigen R6 i hver brønd. Homogenisér. Tildæk med selvklæbende film, og inkuber i 3 timer ± 10 minutter ved 37 C ± 1 C. NB! Fordelingen af neutraliserende HBe-antigen (R6), der er lyserød, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i manipulationen. Tilstedeværelse af neutraliserende HBe-antigen i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 490 nm (enkelt bølgelængde). Se afsnit 13 : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING. 5. Forbered den fortyndede konjugatopløsning R7a, før trin 4 er afsluttet. 6. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet fra hver brønd op i beholderen til biologisk farligt affald. Vask derefter fire gange. 7. Fordel hurtigt 100 µl fortyndet konjugatopløsning R7a (se afsnit 8: REKONSTITUERING AF REAGENSERNE) til hver brønd, eller R7a-konjugat kan bruges, som det er, ved at følge den angivne procedure : Tilsæt først 80 µl fortyndet vaskeopløsning (R2) til hver brønd, derefter 20 µl anti-hbe-konjugat R7a (5X). Homogenisér. Tildæk med selvklæbende film, og inkuber i 30 minutter ved 37 C ± 1 C (mindst 25 minutter, højst 40 minutter). Fjern den selvklæbende film, sug indholdet af hver brønd op i beholderen til biologisk farligt affald, og afvask fem gange. NB! Fordelingen af den fortyndede konjugatopløsning R7a, der er farvet violet, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i manipulationen. Tilstedeværelse af den fortyndede konjugatopløsning R7a i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 620 nm (enkelt bølgelængde). Se afsnit 13 : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING. 8. Klargør farveudviklingsopløsningen (R8 + R9), umiddelbart før den skal bruges. Se afsnit 8 : REKONSTITUERING AF REAGENSERNE. 9. Fordel hurtigt 80 µl farveudviklingsopløsning i hver brønd. Placer pladen i mørke i 30 minutter ± 5 minutter ved stuetemperatur ( C). NB! Fordelingen af udviklingsopløsningen, der er farvet lyserød, kan kontrolleres visuelt på dette 78

9 stadium i manipulationen : Der er en tydelig farveforskel på en tom brønd og en brønd, der indeholder den lyserøde opløsning. Se afsnit 13: SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING. 10.Tilsæt hurtigt 100 µl stopopløsning (R10) til hver brønd. NB : Fordelingen af stopopløsningen, der er farveløs, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i manipulationen. Efter tilsætning af stopopløsningen skifter det lyserøde substrat til ufarvet for negative prøver, mens det blå substrat skifter til gult for positive prøver. 11.Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af pladelæseren mindst 4 minutter efter tilsætningen af stopopløsningen og inden 30 minutter efter afbrydelse af reaktionen. b) HBe Ag-testprocedure: 1. Forbered vaskeopløsningen. 2. Tag en eller flere teststrimler ud af den beskyttende emballage. Læg ubrugte teststrimler tilbage i pakken, og forsegl den. 3. Fordel følgende mængder i hver brønd : A1, B1, C1 : 100 µl negativ kontrol (R3). D 1 : 100 µl positiv kontrol (R5). E1, F1, G1 : 100 µl prøvemateriale Afhængig af det anvendte system er det muligt at ændre placering af kontrollerne ellerdistribueringsrækkefølgen. NB : Der er en tydelig farveforskel på en tom brønd og en brønd, der indeholder prøvemateriale (gult). Tilstedeværelse af prøvemateriale i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 490 nm (enkelt bølgelængde). Se afsnit 13 : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING. 4. Tildæk med selvklæbende film, og inkuber i 3 timer ± 10 minutter ved 37 C ± 1 C. 5. Forbered konjugatopløsningen R7b, før trin 4 er afsluttet. 6. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet fra hver brønd op i beholderen til biologisk farligt affald. Vask derefter fire gange. 7. Fordel hurtigt 100 µl fortyndet konjugatopløsning (R7b) til hver brønd, eller R7b-konjugat kan bruges, som det er, ved at følge den angivne procedure: Tilsæt først 80 µl fortyndet vaskeopløsning (R2) til hver brønd, derefter 20 µl anti-hbe-konjugat R7b (5X). Homogenisér. Tildæk med selvklæbende film, og inkuber i 30 minutter ved 37 C ± 1 C (mindst 25 minutter, højst 40 minutter). Fjern den selvklæbende film, sug indholdet af hver brønd op i beholderen til biologisk farligt affald, og afvask fem gange. NB! Fordelingen af den fortyndede konjugatopløsning R7b, der er turkisfarvet, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i manipulationen. Tilstedeværelse af den fortyndede konjugatopløsning R7a i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 620 nm (enkelt bølgelængde). Se afsnit 13 : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENS-PIPETTERING. 8. Klargør farveudviklingsopløsningen (R8 + R9), umiddelbart før den skal bruges. 9. Fordel hurtigt 80 µl farveudviklingsopløsning (R8 + R9) i hver brønd. Placer pladen i mørke i 30 minutter ± 5 minutter ved stuetemperatur ( C). NB! Fordelingen af udviklingsopløsningen, der er farvet lyserød, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i manipulationen: Der er en tydelig farveforskel på en tom brønd og en brønd, der indeholder den lyserøde opløsning. Se afsnit 13 : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING. 10.Tilsæt 100 µl stopopløsning (R10) til hver brønd. NB : Fordelingen af stopopløsningen, der er farveløs, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i manipulationen. Efter tilsætning af stopopløsningen skifter det lyserøde substrat til ufarvet for negative prøver, mens det blå substrat skifter til gult for positive prøver. 11.Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af pladelæseren mindst 4 minutter efter tilsætningen af stopopløsningen og inden 30 minutter efter afbrydelse af reaktionen. 79

10 c) Procedurer for samtidige anti-hbe- og HBe Ag-test (på samme plade) Procedurens trin er de samme som de tidligere beskrevne trin. Kun prøvefordelingsskemaet er ændret og ser ud som følger : Anti-HBe-test : række 1-6 HBe Ag-test : række BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATER a) Anti-HBe-test 1. Beregn den gennemsnitlige absorbans (= optisk densitet - O.D.) i de negative kontrolbestemmelser : Gennemsnit (OD R3) Eksempel : Negativ kontrolprøve R3 OD 1 1, , ,552 OD i alt = 4,569 Gennemsnit (OD R3) = OD i alt/3 = 4,569/3 = 1,523 Kun én R3-absorbansværdi kan udelukkes, når den afviger mere end 25% i forhold til gennemsnittet. Genberegn derefter den gennemsnitlige absorbans med de to andre værdier. 2. Beregning af cut-off-værdi Cut-off-værdien for hver plade beregnes i henhold til følgende formel : Cut-off-værdi = Gennemsnit (OD R3) x 0,4 Eksempel : Gennemsnit (OD R3) = 1,523 Cut-off-værdi = 1,523 x 0,4 = 0, Validering af analyse af anti-hbe-test Gennemsnit (OD R3) > 0,900 OD R4 < Beregning af forhold Forholdet for hver prøve beregnes i henhold til følgende formel : Forhold = OD-prøve/cut-off-værdi 5. Fortolkning af resultaterne Prøver anses som : positive, hvis forholdsværdien er mindre end eller lig med 0,9 (forhold 0,9) negative, hvis forholdsværdien er større end 1,1 (forhold > 1,1) Hvis et resultat imidlertid ligger mellem 0,9 og 1,1, anbefales det at foretage en ny anti-hbe-søgning i en efterfølgende prøveanalyse. Det anbefales at teste oprindeligt positive prøver i dobbelt bestemmelse. Hvis mindst én værdi er positiv efter en ny test, anses prøven som positiv. b) HBe Ag-test 1. Beregn den gennemsnitlige absorbans (= optisk densitet O.D.) i de negative kontrolbestemmelser : Gennemsnit (OD R3) Eksempel : Negativ kontrolprøve R3 OD 1 0, , ,026 OD i alt = 0,071 Gennemsnit (OD R3) = OD i alt/3 = 0,071/3 = 0,024 Kun én R3-absorbansværdi kan udelukkes, når den afviger mere end 25% i forhold til gennemsnittet. Genberegn derefter den gennemsnitlige absorbans med de to andre værdier. 2. Beregning af cut-off-værdi Cut-off-værdien for hver plade beregnes i henhold til følgende formel: Cut-off-værdi = Gennemsnit (OD R3) + 0,025 Eksempel: Gennemsnit (OD R3) = 0,024 Cut-off-værdi = 0, ,025 = 0,049 80

11 3. Validering af analyse af Ag HBe-test Gennemsnit (OD R3) < 0,060 OD R5 > 0, Beregning af forhold Forholdet for hver prøve beregnes i henhold til følgende formel : Forhold = OD-prøve/cut-off-værdi 5. Fortolkning af resultaterne Prøver anses som : negative, hvis forholdsværdien er mindre end 1 (forhold < 1) positive, hvis forholdsværdien er større end eller lig med 1 (forhold 1) Det anbefales at teste oprindeligt positive prøver i dobbelt bestemmelse. Hvis mindst én værdi er positiv efter en ny test, anses prøven som positiv SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING 1 - Anti-HBe-TEST Forekomst af prøve og kontrol Det kan kontrolleres, om prøven og kontrollen findes i brøndene, med en automatisk aflæsning ved 490 nm. Hver brønd, der indeholder prøvekontrol, skal have en OD, der er større end 0,050. Forekomst af neutraliserende HBe-antigen (R6) Tilstedeværelsen af neutraliserende HBe-antigen i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af automatisk aflæsning ved 490 nm ved at beregne OD-delta. OD-delta = (OD490 prøve (eller kontrol) med R6) (OD490 prøve (eller kontrol) alene) OD-delta skal være større end 0,150. Forekomst af koncentreret anti-hbe-testkonjugat (R7a) Det kan kontrolleres, om fortyndet R7a findes i brønden, med en automatisk aflæsning ved 620 nm. OD-værdien for hver brønd skal være større end eller lig med 0,070 og mindre end eller lig med 0,200. Forekomst af farveudviklingsopløsning (R8 + R9) Det kan kontrolleres, om farveudviklingsopløsningen findes i brøndene, med en automatisk aflæsning ved 490 nm. OD-værdien for hver brønd skal være større end 0, HBe Ag-TEST Forekomst af prøve og kontrol Det kan kontrolleres, om prøven og kontrollen findes i brøndene, med en automatisk aflæsning ved 490 nm : Hver brønd, der indeholder prøvekontrol, skal have en OD, der er større end 0,050. Forekomst af koncentreret Ag HBe-konjugat (R7b) Det kan kontrolleres, om fortyndet R7b findes i brønden, med en automatisk aflæsning ved 620 nm. OD-værdien for hver brønd skal være større end 0,210. Forekomst af farveudviklingsopløsning (R8 + R9) Det kan kontrolleres, om farveudviklingsopløsningen findes i brøndene, med en automatisk aflæsning ved 490 nm. OD-værdien for hver brønd skal være større end 0, TESTRESULTATER Funktionsevnen af Monolisa HBE Ag-Ab PLUS-testen, der vises i sammendrag nedenfor, er blevet evalueret på 2 laboratorier ved hjælp af prøver fra bloddonorer, patienter og serokonvertante paneler. 1 - HBe Ag-test Specificitet Specificiteten for i alt 200 prøver fra tilfældige bloddonorer var 100% [98,51-100%], (IC95). Specificiteten blev yderligere evalueret for patientprøver og var 100% [99,28-100%] (IC95, 416/416 prøver). Analyserne af de 195 patienter viste forskellige patologier eller statusser, der ikke var forbundet med hepatitis B (gravide kvinder, rheumatoid faktor, antinukleare antistoffer, anti-ig fra mus eller andre virale eller bakterielle infektioner), og viste en specificitet på 99,49% [97,18-99,99%] (IC 95, 194/195 negative fundne prøver). 81

12 Analytisk sensitivitet Sensitivitetsgrænsen for testen blev estimeret til mindre end 0,64 U/ml [0,49-0,84] (IC 95) under evalueringen med PEI-standarden. Sensitivitet Sensitiviteten blev testet på 203 positive prøver fra opfølgning på patienter med kronisk HBVinfektion og på kommercielle serokonvertante paneler. Sensitiviteten for disse prøver var 99,51% [97,29-99,99%] (IC 95, 202/203 prøver). Analysens reproducerbarhed Reproducerbarheden for Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (HBe Ag)-testen blev bestemt ved analyse af 4 prøver : 1 negativ prøve, 1 lav HBe Ag-positiv prøve, 1 høj HBe Ag-positiv prøve og 1 middel HBe Ag-positiv prøve. Reproducerbarheden inden for analysen blev evalueret ved at teste disse 4 prøver 30 gange i samme kørsel. Reproducerbarheden for den krydskontrollerede analyse blev evalueret ved at teste disse 4 prøver i dobbelt bestemmelse i løbet af 20 dage med 2 analyser pr. dag. Resultaterne vises i følgende tabeller : Tabel 1 : Reproducerbarhed inden for analysen n = 30 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Gennemsnitsforhold 3,56 5,29 27,24 45,56 Standardafvigelse (SD - Standard Deviation) 0,05 0,35 0,63 2,88 CV (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 Tabel 2 : Reproducerbarhed for krydskontrolleret analyse n = 80 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Gennemsnitsforhold 0,51 8,19 27,33 46,35 Standardafvigelse (SD - Standard Deviation) 0,12 1,17 3,26 4,98 CV (%) 23,86 14,27 11,92 10, HBe Ag-test Specificitet Specificiteten for i alt 200 prøver fra tilfældige bloddonorer var 100% [98,51-100%], (IC95). Specificiteten blev yderligere evalueret for 206 patientprøver og var 98,54% [95,80-99,70%], IC95 (203/206). 198 patienter viste forskellige patologier eller statusser, der ikke var forbundet med hepatitis B (gravide kvinder, rheumatoid faktor, antinukleare antistoffer, anti-ig fra mus eller andre virale eller bakterielle infektioner. 3 prøver blev fundet positive (2 HCV-prøver og 1 rheumatoid faktor-prøve). Specificiteten for denne population var 98,48% [95,64-99,69%] (IC 95, 195/198 negative fundne prøver). Disse prøver blev testet igen. Prøven med rheumatoid faktor blev fundet reaktiv ved gentagelsen. De to HCV-prøver var enten negative eller usikre. Sensitivitet Der blev foretaget sensitivitetsundersøgelse af 220 positive prøver fra opfølgning på patienter med kronisk HBV-infektion og på kommercielle paneler. Sensitiviteten var 98,64% [96,07-99,72%] (IC 95, 217/220 prøver). Analysens reproducerbarhed Reproducerbarheden for Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (anti-hbe Ac)-testen blev bestemt ved analyse af 4 prøver : 1 negativ prøve, 1 lav HBe Ac-positiv prøve, 1 høj HBe Ac-positiv prøve og 1 middel HBe Ac-positiv prøve. Reproducerbarheden inden for analysen blev evalueret ved at teste disse 4 prøver 30 gange i samme kørsel. Reproducerbarheden for den krydskontrollerede analyse blev evalueret ved at teste disse 4 prøver i dobbelt bestemmelse i løbet af 20 dage med 2 analyser pr. dag. 82

13 Resultaterne vises i følgende tabeller : Tabel 1 : Reproducerbarhed inden for analysen n = 30 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Gennemsnitsforhold 3,15 0,69 0,42 0,03 Standardafvigelse (SD - Standard Deviation) 0,05 0,04 0,04 0,00 CV (%) 1,7 5,7 10,5 6,6 Tabel 2 : Reproducerbarhed for krydskontrolleret analyse n = 80 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Gennemsnitsforhold 2,39 0,81 0,59 0,3 Standardafvigelse (SD - Standard Deviation) 0,23 0,077 0,09 0,01 CV (%) 9,6 9,5 14,5 39, REFERENCER 1-MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L ADN du virus de l hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l antigène HBe et l anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1);

14 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

15 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

16 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: