Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 1 plade - 96 test plader test 72558

Transkript

1 Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 1 plade - 96 test plader test SCREENINGSKIT TIL PÅVISNING AF HCV (HEPATITIS C-VIRUS)- INFEKTION I HUMANT SERUM ELLER PLASMA VED HJÆLP AF ENZYMIMMUNANALYSE IVD Til in vitro-diagnostisk brug Producentens kvalitetskontrol Alle producerede og kommercialiserede reagenser er underlagt et komplet kvalitetssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialet til den endelige kommercialisering af produktet. Hvert parti gennemgår en kvalitetskontrol og frigives kun til markedet, hvis det opfylder de fastsatte godkendelseskriterier. Dokumentationen i forbindelse med produktion og kontrol af hvert parti opbevares i virksomheden.

2 INDHOLDSFORTEGNELSE 1 - TILSIGTET ANVENDELSE 2 - TESTPRINCIP 3 - KITTETS SAMMENSÆTNING 4 - NØDVENDIGE MATERIALER, DER IKKE MEDFØLGER 5 - HELBREDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE ANVISNINGER 6 - FORHOLDSREGLER 7 - PRØVER 8 - REKONSTITUTION AF REAGENSERNE - VALIDITET - OPBEVARING 9 - ANALYSEPROCEDURE 10 - SYSTEMTILPASNING 11 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE 12 - SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING 13 - TESTENS YDEEVNE 14 - TESTENS BEGRÆNSNINGER 15 - LITTERATUR 74

3 1 - TILSIGTET ANVENDELSE Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen er en kvalitativ enzymimmunanalyse til påvisning af HCVinfektion, der er baseret på påvisning af capsidantigen og antistoffer, der er forbundet med en infektion af hepatitis C-virus i patientserum eller -plasma. 2 - TESTPRINCIP Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-mikropladens faste fase er coatet med : Monoklonale antistoffer mod capsidprotein på hepatitis C-virus. 2 rekombinante proteiner fremstillet af E. coli fra NS3-området: genotype 1 og 3a. Et rekombinant antigen fra det ikke-strukturelle NS4-område. Et muteret peptid fra capsidet fra det strukturelle område af hepatitis C-virusgenomet. De anvendte konjugater er: Konjugat 1 (R6) : Biotinylerede, monoklonale museantistoffer mod hepatitis C-capsidet. Disse monoklonale antistoffer reagerer ikke med det hepatitis C-capsid-muterede peptid, der er coatet på mikropladen. Konjugat 2 (R7)- : Peroxidasemærkede museantistoffer mod humant IgG og peroxidasemærket strept- avidin. Udførelsen af testen omfatter følgende reaktionstrin : 1) Konjugat 1 og de prøver, der skal testes, samt kontrolsera tilsættes i brøndene. Hvis der findes antistoffer mod HCV, binder de til de antigener, der er fikseret på den faste fase, og hvis der findes hepatitis C-capsidantigen, bindes dette antigen ved hjælp af de monoklonale antistoffer, der er coatet på mikropladen, og ved hjælp af de biotinylerede, monoklonale antistoffer mod hepatitis C- capsidantigen (konjugat 1). 2) Efter inkubation ved 37 C i 90 minutter og et vasketrin tilsættes de peroxidasemærkede antistoffer mod human IgG og streptavidin-peroxidase (konjugat 2). Streptavidin/peroxidase-konjugatet reagerer med biotinylerede, monoklonale antistoffer mod hepatitis C-capsidantigen, hvis det er til stede. Anti- human IgG-konjugat til peroxidase reagerer med anti-hcv-antistoffer, hvis de er til stede. 3) Efter inkubation ved 37 C i 30 minutter fjernes det ubundne enzymatiske konjugat ved vask, og antigen-antistof-komplekset påvises ved tilsætning af substrat. 4) Efter 30 minutter standses reaktionen, og absorbansværdierne aflæses ved hjælp af et spektrofotometer ved 450/ nm. Den målte absorbans for en prøve gør det muligt at påvise forekomst eller fravær af antistof mod og/eller capsidantigen fra HCV. Farveintensiteten er proportional med mængden af antistof mod eller antigen fra HCV, der er bundet på den faste fase. 75

4 3 - KITTETS SAMMENSÆTNING ETIKET REAGENSTYPE PRÆSENTATION 1 plade 5 plader R1 MIKROPLADE teststrimler med 8 brønde, der er coatet med monoklonale antistoffer mod hepatitis C-capsid og oprensede, rekombinante antigener og capsid-muteret peptid, der er specifikt for hepatitis C-virus R2 KONCENTRERET VASKEOPLØSNING (20X) 1 flaske 1 flaske Tris NaCl-buffer, ph 7,4 75 ml 235 ml Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,04 %). R3 NEGATIV KONTROL 1 glas 1 glas Tris HCl-buffer med BSA 1 ml 1 ml Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,1 %) R4 POSITIV KONTROL 1 glas 1 glas Humant serum, der indeholder antistoffer mod HCV, som er 1,5 ml 3 ml negativt for HBs-antigen og for anti-hiv1- og anti-hiv2-antistoffer, der er fortyndet i TrisHCl-buffer med BSA, som er fotokemisk inaktiveret. Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,1 %) R5a ANTIGENPOSITIV KONTROL 1 glas 1 glas Antigenpositiv kontrol (syntetisk,capsidpeptid). Frysetørret nok til 1ml nok til 1ml R5b ANTIGENFORTYNDER 1 flaske 1 flaske Antigenfortynder til R5a. Vand med ProClin 300 (0,5 %) 1ml 1ml R6 KONJUGAT 1 1 glas 2 glas Biotinylerede, monoklonale museantistoffer mod 15 ml 2 x 30 ml Capsid-HCV-antigen Farvet lilla. Konserveringsmiddel : Natriumazid (< 0,1 %), Cosmocil 0,025 % R7 KONJUGAT 2 1 glas 2 glas Museantistof mod human IgG/peroxidase 15 ml 2 x 30 ml og streptavidin/peroxidase. Farvet grøn. Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5 %) R8 PEROXIDASESUBSTRATBUFFER 1 glas 2 glas Citronsyre- og natriumacetatopløsning 60 ml 2 x 60 ml ph 4,0 med H2O2 (0,015 %) og DMSO (4 %) R9 KROMOGEN 1 glas 2 glas Opløsning, der indeholder tetrametylbenzidin (TMB). 5 ml 2 x 5 ml R10 STOPOPLØSNING 1 glas 3 glas 1 N-svovelsyreopløsning 28 ml 3 x 28 ml 4 - NØDVENDIGE MATERIALER, DER IKKE MEDFØLGER Destilleret eller deioniseret vand. Natriumhypochlorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. Sugende papir. Engangshandsker. Beskyttelsesbriller. Engangsglas. Automatiske eller halvautomatiske justerbare eller faste pipetter, der kan levere 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl og 1 ml. Måleglas med en kapacitet på 10 ml, 200 ml og 1000 ml. Vortex-blander. Automatisk*, halvautomatisk* eller manuelt vaskesystem til mikroplader. 76

5 Vandbad eller tør inkubator* med termostatindstilling til 37 C ± 1 C. Beholder til kontamineret affald. Aflæsningsanordning til mikroplader* (forsynet med filtre på 490, 620, 450/620 til 700 nm). (*) Kontakt din repræsentant, hvis du ønsker yderligere oplysninger om det udstyr, som vores tekniske afdeling har valideret. 5 - HELBREDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE ANVISNINGER Alle reagenser i kittet er beregnet til "in vitro"-diagnosticering og til professionel brug. Dette testkit bør kun anvendes af kvalificeret personale, der er uddannet i laboratorieprocedurer og er fortroligt med de potentielle farer. Brug passende beskyttelsesudstyr, herunder kittel, beskyttelses- briller, ansigtsskærm og engangshandsker (syntetiske, non-latexhandsker anbefales) og håndtér rea genser og patientprøver i henhold til reglerne for god laboratoriepraksis. Vask hænderne grundigt efter udførelse af testen. Undlad at pipettere med munden. Den positive kontrol R4 er fotokemisk inaktiveret. Humant kildemateriale, der er brugt til fremstilling af den positive kontrol (R4), er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for hepatitis B-overfladeantigenet (HBs-Ag) og antistoffer mod human immundefekt virus (HIV-1- og HIV-2-Ab). Da ingen kendt testmetode kan give fuldstændig sikkerhed for, at der ingen smitstoffer er til stede, skal reagenser og patientprøver håndteres, som om de kan overføre smitsomme sygdomme. Betragt alt materiale, der har været i direkte kontakt med prøver og reagenser af human oprindelse, samt vaskeopløsninger som smittefarligt materiale. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale. Spildt materiale skal vaskes af med blegemiddel, der er fortyndet til 10 %. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal det spildte materiale først neutraliseres med natriumbikarbonat og derefter rengøres med blegemiddel og tørres op med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal bortskaffes i en beholder til kontamineret affald. Prøver, reagenser af human oprindelse samt kontaminerede materialer og produkter skal bortskaffes efter dekontaminering - enten ved nedsænkning i blegemiddel ved en slutkoncentration på 5 % natriumhypochlorit (1 mængde blegemiddel til 10 mængder kontamineret væske eller vand) i 30 minutter - eller ved autoklavering ved 121 C i mindst to timer. FORSIGTIG! Placer ikke opløsninger, der indeholder natriumhypochlorit, i autoklaven. Undgå, at hud eller slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stopopløsningen. Sikkerhedsdatabladet udleveres efter anmodning. Husk at neutralisere og/eller autoklavere opløsninger, affald fra vasketrin og enhver væske, der indeholder biologisk prøvemateriale, før de hældes i afløbet. Nogle reagenser indeholder natriumazid. Denne forbindelse kan reagere med bly- og kobberrør og dermed danne højeksplosive metalazider. For at undgå ophobning af sådanne azider i rørene skal disse reagenser neutraliseres, når de hældes i vasken, og vasken skal skylles med rigeligt vand. Nogle reagenser indeholder ProClin 300 (0,04 %, 0,1 % og/eller 0,5 %) Lokalirriterende R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden S28-37: Kommer stoffet på huden vaskes straks med store mængder vand. Brug egnede beskyttelseshandsker under arbejdet. Materialesikkerhedsdatabladet (MSDS) udleveres efter anmodning. 77

6 6 - FORHOLDSREGLER Kvaliteten af resultaterne afhænger af følgende regler for god laboratoriepraksis: Testnavnet samt et specifikt identifikationsnummer for testen er skrevet på rammen af hver mikrotiterplade. Dette specifikke identifikationsnummer er desuden angivet på hver teststrimmel. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA: Specifikt ID-nummer = 55 Kontroller det specifikke identifikationsnummer før brug. Hvis identifikationsnummeret mangler eller er forskelligt fra det angivne nummer ovenfor, må teststrimlen ikke bruges. Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Bland ikke reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. BEMÆRK! For vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 20X, farvet grøn), peroxidase-substratbuffer (R8, etiketidentifikation: TMB buf, farvet blå), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB 11X, farvet lilla) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N, farvet rød) er det muligt at bruge andre partier end dem i dette kit, forudsat at samme parti anvendes inden for samme testkørsel. Disse reagenser kan anvendes sammen med en række andre produkter fra vores virksomhed. Desuden kan vaskeopløsningen (R2, etiketidentifikation: 20X, farvet grøn) blandes med de to andre vaskeopløsninger, der er indeholdt i de forskellige Bio-Rad-reagenskit (R2, etiketidentifikation: 10X, farvet blå eller 10X, farvet orange), når de rekonstitueres korrekt, forudsat at der kun bruges én blanding inden for samme testkørsel. Kontakt vores tekniske serviceafdeling for at få yderligere oplysninger. Vent 30 minutter, før reagenserne tages i brug, så de kan stabilisere sig ved stuetemperatur. Rekonstituer reagenserne med omhu for at undgå kontaminering. Undgå at udføre testen i nærvær af reaktive dampe (syreholdige eller alkaliske dampe eller aldehyddampe) eller støv, der kan ændre konjugatets enzymaktivitet. Benyt engangsmateriale eller, hvis dette ikke er muligt, glasvarer, som er vasket grundigt og skyllet med deioniseret vand. Undgå, at mikropladen tørrer mellem afslutningen af vasketrinet og fordelingen af reagens. Den enzymatiske reaktion er meget følsom over for metaller eller metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige opløsninger, der indeholder konjugat- eller substratopløsning. Udviklingsopløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være farvet lyserød. Hvis den lyserøde farve ændrer sig inden for få minutter efter rekonstituering, indikerer dette, at reagenset ikke kan anvendes og skal udskiftes. Forberedelsen af udviklingsopløsningen kan udføres i en ren engangsplastikbakke eller glasbeholder, der først er vasket med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Dette reagens skal opbevares i mørke. Brug en ny fordelingsspids til hvert serum. Grundig vask er et kritisk trin i denne procedure: Overhold det anbefalede antal vaskecykler, og sørg for, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Ukorrekt vask kan medføre unøjagtige resultater. Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat- og udviklingsopløsning. 7 - PRØVER Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis. Testen skal udføres på ufortyndet serum eller plasma (opsamlet i antikoagulanter, der er baseret på EDTA, citrat, ACD). Ekstraher det så hurtigt som muligt for at undgå hæmolyse. Prøver, der indeholder aggregater, skal klares ved hjælp af centrifugering før testen. Opslæmmede fibrinaggregater eller -partikler kan give falske positive resultater. Prøverne skal opbevares ved +2-8 C, hvis screeningen udføres inden for syv dage, eller de kan dybfryses ved -20 C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Hvis prøverne skal sendes, skal de pakkes i overensstemmelse med de gældende bestemmelser angående transport af ætiologiske agenser. Send dem fortrinsvis i frossen tilstand. UNDLAD AT ANVENDE KONTAMINEREDE, HYPERLIPÆMISKE ELLER HYPERHÆMOLYSEREDE SERA. 78

7 BEMÆRK! Prøver, der indeholder op til 90 g/l albumin, 50 µg/l biotin og 100 mg/l bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder mængder op til det, der svarer til 36 g/l triolein, og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 87 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. Negative prøver, HCV-Ab-positive og HCV-antigenpositive prøver blev testet før og efter varmebehandling ved 56 C i 30 minutter og efter 3 fryse/tø-cykler. Ingen af behandlingerne indvirkede på påvisningen af HCV-Ab. Varmebehandlingen viste sig dog i signifikant grad at reducere den målte Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-absorbans til antigenpåvisning. 8 - REKONSTITUTION AF REAGENSERNE - VALIDITET - OPBEVARING Før brug af reagenserne i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysekittet skal de have mulighed for at stabilisere sig ved stuetemperatur i 30 minutter. 1) Brugsklare reagenser Mikroplade (R1) Hver støtteramme, der indeholder 12 teststrimler, er pakket i en forseglet foliepose. Åbn posen med en saks eller skalpel 0,5-1 cm over forseglingen. Åbn posen, og tag rammen ud. Læg de ubrugte strimler tilbage i posen. Luk posen omhyggeligt, og opbevar den ved +2-8 C. Konjugat 1 : Brugsklart (R6) Vend op og ned for at homogenisere før brug. Konjugat 2 : Brugsklart (R7) Vend op og ned for at homogenisere før brug. 2) Reagenser til rekonstituering Koncentreret vaskeopløsning R2 (20X) Fortynd den koncentrerede vaskeopløsning R2 1:20 i destilleret vand. Klargør 800 ml til énn plade med 12 teststrimler. Fortyndet brugssubstratopløsning (R8 + R9) Fortynd reagens (R9) 1:11 med reagens R8 (f.eks. 1 ml R9-reagens i 10 ml R8-reagens). 10 ml er nødvendigt og nok til 1 til 12 teststrimler. Homogeniser. Brugsopløsning af antigenpositiv kontrol (R5a + R5b) Hæld indholdet af R5b-fortynder i glasset med frysetørret Ag R5a. Sæt hætten på igen, og lad glasset stå i 10 minutter, idet det af og til rystes og vendes forsigtigt op og ned for at lette opløsningen. 3) Validitet Kittet skal opbevares ved +2-8 C. Når det opbevares ved denne temperatur, kan hvert reagens, der er indeholdt i kittet, anvendes indtil den anførte udløbsdato på pakken (undtagen ved specifikke instruktioner). R1: Efter åbning af den vakuumforseglede pose kan teststrimlerne med mikrobrønde bruges i en måned, når de opbevares ved +2-8 C i den omhyggeligt forseglede pose. R2: Den fortyndede vaskeopløsning kan opbevares ved C i 2 uger. Den koncentrerede vaskeopløsning (R2) kan opbevares ved C. R5a + R5b: Brugsopløsningen af den antigenpositive kontrol kan opbevares ved +2-8 C i 1 måned og ved -20 C i 2 måneder (optøet op til fem gange efter nedfrysning ved -20 C). R8 + R9 : Efter rekonstitution kan reagenset, når det opbevares i mørke, bruges i 6 timer ved stuetemperatur (18-30 C). 9 - ANALYSEPROCEDURE Følg protokollen nøje. Brug negative og positive kontrolsera til hver test for at validere kvaliteten af testen. Anvend god laboratoriepraksis. 79

8 80 Metoder 1) Fastlæg prøvefordelingen og identifikationsoversigten omhyggeligt. 2) Forbered den fortyndede vaskeopløsning (fortyndet R2) og brugsopløsningen af den antigenpositive kontrol (R5a + R5b). 3) Tag mikropladerammen og strimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen. 4) Tilsæt følgende direkte og i rækkefølge uden forudgående vask af mikropladen : µl konjugat 1 (R6) i hver brønd µl negativt kontrolserum (R3) i brønd A1 50 µl antistofpositivt kontrolserum (R4) i brønd B1, C1, D1 50 µl brugsopløsning af den antigenpositive kontrol (R5a+R5b) i brønd E1 50 µl af den første prøve i brønd F1 50 µl af den anden prøve i brønd G1, osv. Homogeniser reaktionsblandingen (med mindst tre opsugninger eller med mikropladeryster i 5 sekunder). Hvis prøvefordelingen tager mere end 10 minutter, anbefales det at fordele de negative og positive kontroller efter prøverne. Afhængig af det anvendte system er det muligt at ændre placeringen af kontrollerne eller fordelingsrækkefølgen. NB: Efter prøvefordelingen ændres farven i brønden med prøve (eller kontroller) fra lilla til blå. Det er muligt at kontrollere, at prøverne + konjugat 1 findes i brøndene, ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 620 nm (se afsnit 12, SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REA- GENSPIPETTERING). 5) Afdæk brøndene med selvklæbende film, hvis det er muligt, ved at trykke over hele overfladen for at sikre en tæt tillukning. 6) Inkuber mikropladen i et termostatkontrolleret vandbad eller i en tør mikropladeinkubator i 90 ± 5 minutter ved 37 C ± 1 C. 7) Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til flydende affald, og tilsæt mindst 0,370 ml vaskeopløsning til hver brønd. Sug indholdet op igen. Gentag vasketrinet 4 gange (mindst 5 vaske). Restmængden skal være mindre end 10 µl (om nødvendigt kan mikropladen suges tør ved at vende den på hovedet på sugende papir). 8) Fordel hurtigt 100 µl af konjugat 2-opløsningen (R7) i alle brønde. Konjugatet skal rystes forsigtigt før brug. Tildæk om muligt med ny, selvklæbende film og inkubere i 30 ± 5 minutter ved 37 C ± 1 C. NB: Konjugatet er grønt. Det er muligt at kontrollere, at konjugatet findes i brøndene ved hjælp af spektrofotometrisk aflæsning ved 620 nm (se afsnit 12, SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING). 9) Fjern den selvklæbende film, tøm alle brønde ved opsugning, og vask 5 gange som beskrevet ovenfor. 10) Klargør enzymudviklingsopløsningen (se kapitel 8, reagenser R8 + R9). 11) Fordel hurtigt i hver brønd 80 µl klargjort udviklingsopløsning (R8+R9), der friskfremstilles før brug. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 ± 5 minutter ved stuetemperatur (18 30 C). Undlad at bruge selvklæbende film under inkubationen. NB: Fordelingen af udviklingsopløsningen, der er farvet lyserød, kan kontrolleres visuelt på dette trin af processen: Der er en tydelig farveforskel mellem en tom brønd og en brønd, der indeholder den lyserøde substratopløsning (se afsnit 12 om automatisk kontrol: SPEKTRO FOTOMETRISK KON- TROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING). 12) Tilsæt 100 µl stopopløsning (R10) i samme rækkefølge og med samme fordelingsfrekvens som for substratopløsningen. Homogeniser reaktionsblandingen. NB: Fordelingen af stopopløsningen, der er farveløs, kan kontrolleres visuelt på dette trin af processen. Efter tilsætningen af stopopløsningen forsvinder den lyserøde farve af substratet (for de negative prøver), eller farven skifter fra blå til gul (for de positive prøver). 13) Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/ nm ved hjælp af en pladelæser mindst fire minutter efter tilsætning af stopopløsning og inden for 30 minutter efter standsning af reaktionen. 14) Kontroller overensstemmelsen mellem aflæsningen og mikropladen og prøvefordelingen og identifikationsoversigten, før du registrerer resultaterne.

9 10 - SYSTEMTILPASNING VASK : Følg de beskrevne vaskeprocedurer nøje for at opnå de bedst mulige testresultater. Ved anvendelse af nogle apparater kan det være nødvendigt at øge antallet af vasketrin for at få en acceptabel negativ baggrund BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE Tilstedeværelse eller fravær af antistoffer mod HCV og/eller HCV-capsidantigen bestemmes ved at sammenligne den målte absorbans for hver prøve med den beregnede cut-off-værdi. 1. Beregn gennemsnittet af de målte absorbansværdier for det positive kontrol serum (OD R4) Eksempel : Positiv kontrol R4 Prøve Optisk densitet B1 1,636 C1 1,704 D1 1,650 I alt 4,990 Samlet optisk densitet 4,990 Gennemsnitlig = = = 1,663 OD R Beregning af cut-off-værdi (CO) Gennemsnitlig OD R4 CO = Eksempel : Gennemsnitlig OD R4 = 1,663 1,663 CO = = 0, Der gælder følgende valideringskriterier a) For den negative kontrol R3: Den målte absorbansværdi skal være mindre end OD-cut-off x 0,6. b) For den antistofpositive kontrol R4: Gennemsnittet af den målte absorbansværdi skal være større end eller lig med 0,800 og mindre end eller lig med 2,400. Hvis en af de individuelle antistofpositive kontrol R4-værdier afviger med mere end 30 % fra gennemsnitsværdien, skal man se bort fra værdien og udføre beregningen igen med de to resterende positive kontrolværdier. c) For brugsopløsningen af den antigenpositive kontrol (R5a + R5b): Den målte absorbansværdi skal være større end 0,500. Testene er ugyldige, hvis den negative kontrol R3, brugsopløsningen af den antigenpositive kontrol (R5a + R5b), og/eller mere end én positiv kontrol R4 ligger uden for ovennævnte grænser. 4. Fortolkning af resultaterne Prøver med en optisk densitet, der er mindre end cut-off-værdien, betragtes som negative med Monolisa anti-hcv Ag-Ab ULTRA-analysetesten. Resultater lige under cut-off-værdien (C.O -10 % < OD < C.O) bør imidlertid fortolkes med forsigtighed (det anbefales at lave en ny test in duplo af de pågældende prøver, når systemerne og laboratorieprocedurerne tillader det). Prøver med en optisk densitet, der er højere end eller lig med cut-off-værdien, betragtes indledningsvis som positive og skal testes på ny in duplo, før den endelige fortolkning kan foretages. Efter at være blevet testet igen betragtes prøven som positiv med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRAanalysetesten, hvis den anden eller tredje måling er positiv, dvs. højere end eller lig med cut-offværdien. Prøven betragtes som negativ, hvis begge værdier er mindre end cut-off-værdien. 81

10 12 - SPEKTROFOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING (VALGFRI) KONTROL AF DET FØRSTE TRIN: TILSTEDEVÆRELSE AF KONJUGAT 1 (R6) OG PRØVE Tilstedeværelse af konjugat 1 (R6) + prøve i brønden kan kontrolleres ved hjælp af en automatisk aflæsning ved 620 nm. Hver brønd, der indeholder prøve og konjugat 1 (R6), skal have en OD-værdi, der er større end 0,800. BEMÆRK: Efter tilsætning af prøve skifter konjugat 1 (R6) fra lilla til blå. KONTROL AF DET ANDET TRIN: TILSTEDEVÆRELSE AF KONJUGAT 2 (R7) Konjugat 2 (R7) er grønt. Tilstedeværelse af konjugat 2 (R7) i brøndene kan kontrolleres ved hjælp af en automatisk aflæsning ved 620 nm: OD-værdien for hver brønd skal være større end 0,300 (en lavere værdi angiver dårlig fordeling af konjugatet). KONTROL AF PIPETTERING AF UDVIKLINGSOPLØSNING Det er muligt at kontrollere tilstedeværelsen af lyserød udviklingsopløsning i brønden ved hjælp af automatisk aflæsning ved 490 nm: Den optiske densitet for en brønd med udviklingsopløsning skal være større end 0,100 (en lavere OD angiver dårlig fordeling af udviklingsopløsningen). Der forekommer et markant farveskift for de tomme brønde fra ufarvet til pink efter tilsætning af den forberedte substratkromogenopløsning TESTENS YDEEVNE A- SPECIFITETSFORSØG Prøver fra bloddonorer og patienter blev testet med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen samt med den aktuelt benyttede analyse til rutinetestning forskellige steder for at sikre analysens specificitet. Specificitet på bloddonorer Der blev foretaget undersøgelser på tre forskellige steder. Serumprøver fra etablerede eller nye donorer blev testet. Steder Rungis Bordeaux Donorer fra I alt B.B B.B Montpellier Frankrig Frankrig Frankrig Antal testede prøver Antal gentagne reaktive prøver Af disse 7161 prøver fra bloddonorer var 12 prøver gentaget Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-reaktive i overensstemmelse med anbefalingerne i indlægssedlen, men blev ikke bekræftet HCV- positive ved HCV PCR eller HCV PLUS Deciscan -immunoblotting. Specificiteten for bloddonorer er 99,83 % (99,71 % til 99,91 % med et 95 % konfidensinterval). Specificitet for indlagte patienter 469 af de prospektive serumprøver, der blev indsamlet fra indlagte patienter, blev vurderet på to steder. 440 prøver blev testet negative med den rutinemæssige EU-registrerede HCV-Ab-analyse og med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen. 22 blev testet positive med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA og rutineanalyserne. Heraf blev 21 bekræftet positive og 1 sandsynligvis positiv med Deciscan. For 7 prøver stemte resultaterne fra Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen, HCV PLUS Deciscan -immunoblot-analysen og PCR-analysen ikke overens. Disse 7 prøver gav følgende resultater: 2 prøver, der var positive med den rutinemæssige analyse (negative med HCV PCR-analysen og HCV PLUS Deciscan -immunoblotanalysen) og negative med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, blev betragtet som falske positive med rutineanalysen. For 2 af prøverne kan der ikke drages nogen konklusion, da PCR-analysen ikke kunne fortolkes. Disse prøver blev udeladt i den efterfølgende beregning. 82

11 1 prøve blev testet positiv med den rutinemæssige analyse, negativ med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen, ubestemmelig med immunoblot-analysen HCV PLUS Deciscan og negativ med PCR-analysen. Kun 2 prøver, der blev testet positive med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen (med lavt forhold under 1,7) og med den rutinemæssige HCV-Ab-analyse, var negative med PCR-analysen og ubestemmelige med immunoblot-analysen HCV Deciscan (NS4 lavt positivt bånd). Den beregnede specificitet ud fra denne undersøgelse er 99,5 % (443/445), hvis man betragter de 2 sidste prøver som falsk positive, og 100 %, hvis man betragter dem som ægte positive grundet tilstedeværelsen af resterende antistoffer som følge af en tidligere infektion (ubestemmelige data med immunoblot). Specificitet for potentielt interfererende prøver Der blev undersøgt yderligere 429 prøver, der kunne tænkes at fremkalde krydsreaktivitet ved immunanalysetest. De blev indsamlet fra: patienter, der led af forskellige smitsomme sygdomme, f.eks. hepatitis B, A, røde hunde, toksoplasmose, fåresyge, mæslinger, CMV, HSV, EBV, VZV, HTLV I, HIV, Chagas, flavivirus, influenzavaccinerede patienter patienter, der var positive for reumatoid faktor patienter, der led af autoimmunsygdomme (SLE), myelom, HAMA- og ANA-positive prøver gravide kvinder, cirrosepatienter, patienter med kronisk nyresvigt (CRF) og patienter i dialyse Af disse 429 prøver blev 1 fundet gentaget reaktiv med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA og HCVpositiv med en EU-registreret HCV-Ab-analyse. Den efterfølgende analysespecificitet ved test af disse vanskelige prøver var 100 % (428/428). B - SENSITIVITETSFORSØG Analysens sensitivitet blev vurderet ved at teste en stor mængde HCV-positive prøver fra kommercielle serokonversionspaneler, Bio-Rad eller ekspertinstitutioner. De kumulerede resultater er opsummeret herefter: Sensitivitet for HCV-bekræftede positive prøver I alt blev 646 HCV-positive prøver testet, hovedsageligt fra kronisk inficerede patienter (forekomst af anti-hcv-antistoffer), herunder 405 HCV-genotypeprøver. Alle disse 646 prøver var højreaktive med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, hvilket gav en sensitivitet på 100 %. 25 yderligere friske, positive prøver (inden for 1 dag efter blodprøvetagning) blev testet og alle fundet positive. Sensitivitet for positive HCV-genotypeprøver I alt blev 405 genotypeprøver testet, heraf var der 133 genotyper af forskellig oprindelse og 272 genotyper fra hospitalslaboratorier. Fordelingen af de testede genotyper er som følger: Genotype 1a 1b 1c 1d 1a/b 2 2a 2b 2c 2i 2a/c 3 3a 3b Number Genotype 3a/b 4 4a 4c 4d 4h 4k 4f 4c/d 5a 6a 6d 1b, 1a/b, Total 2a/2 2a/c Number Alle disse prøver blev testet positive: 100 % sensitivitet. Prøver fra patienter med akutte infektioner Sensitiviteten blev vurderet på prøver fra HCV-infektionens akutte fase (infektionens indledende fase). I alt 53 serokonversionspaneler svarende til 421 prøver blev testet med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-kittet og sammenlignet med et EU-registreret testkit til påvisning af anti-hcv-antistoffer. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-testkittet påviser infektion tidligere på næsten alle panelerne: 119 yderligere påviste prøver sammenlignet med et kit til påvisning af anti-hcv-antistoffer (anti-hcv-testkit). 83

12 53 serokonversionspaneler Anti-HCV-Kit Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA (421 prøver) Antal positive prøver Blandt disse 53 serokonversionspaneler starter 11 med en ikke-viræmisk prøve, hvilket giver mulighed for en mere præcis vurdering af det serologiske vindue uden anti-hcv antistoffer). Panel Genotype Tidsrum, der er nødvendigt for opnåelse af positivt resultat fra første prøveudtagning (i dage) RNA HCV** anti-hcv-testsæt * Genotype ikke bestemt ** RNA-testresultaterne er de, der er angivet af panelleverandørerne Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA Forskel mellem anti-hcv-kit og Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA kit (i dage) BCP a BCP a BCP a BCP a BCP a BCP a BBI-PHV919 1a BCP a BCP-9055 NG* BCP-6216 NG* NABI-SC90 NG* Gennemsnit i dage Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-kittet påviser i disse 11 paneler en HCV-infektion i gennemsnit 24 dage tidligere i forhold til et anti-hcv-kit. Denne fordel skyldes hovedsageligt påvisningen af HCV-capsidantigenet der anvendes i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-kittet. Sensitivitet for antigen Sensitiviteten ved påvisningen af HCV-Ag blev også hovedsageligt vurderet ved test af en række serokonversionspaneler, f.eks. BBI 917. Nedenstående graf sammenligner sensitiviteten for Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA-analysen med en konkurrerende HCV-Ab-EIA-analyse. 84

13 9 8 HCV RNA HCV-serokonversionspanel BBI PHV Forhold : Prøve OD/cut-off OD HCV Ag-Ab ULTRA HCV Ab EIA Cut-off Prøvetagningsdato (Dage) Undersøgelse af reproducerbarhed Der blev udført undersøgelser af reproducerbarheden inden for en analyse og mellem analyser på 7 prøver: 1 ikke-reaktiv, 3 HCV-Ab-reaktive og 3 antigen-reaktive. Ved undersøgelsen af reproducerbarheden inden for en analyse blev prøverne testet 30 gange i den samme analyse. Ved undersøgelsen af reproducerbarheden mellem analyser blev prøverne testet af to teknikere i 20 dage (i overensstemmelse med NCCLS EP5-proceduren). De gennemsnitlige forhold, standardafvigelserne og variationskoefficienterne blev beregnet og er anført herunder: Tabel 1: Reproducerbarhed inden for en analyse Prøver Gennemsnitsforhold SD CV% Negativ 0,14 0,01 6,1 HCV Ab-lavpositiv 1,12 0,04 3,65 HCV Ab-mellempositiv 2,39 0,08 3,39 HCV Ab-højpositiv 4,88 0,18 3,7 Ag-lavpositiv 1,14 0,03 3,04 Ag-mellemposiiv 1,97 0,06 3,02 Ag-højpositiv 5,86 0,14 2,38 De opnåede CV'er med de 6 positive prøver ligger under 10 %. Tabel 2: Reproducerbarhed mellem analyser Prøve Gennemsnitsforhold SD CV% Negativ 0,16 0,02 12,4 HCV Ab-lavpositiv 1,2 0,08 6,65 HCV Ab-mellempositiv 2,39 0,13 5,38 HCV Ab-højpositiv 4,77 0,17 3,58 Ag-lavpositiv 1,13 0,09 7,97 Ag-mellemposiiv 2,0 0,15 7,73 Ag-højpositiv 5,99 0,37 6,2 De opnåede CV'er med de 6 positive prøver ligger under 15 %. 85

14 14 - TESTENS BEGRÆNSNINGER Grundet forskelligheden af de immunologiske reaktioner hos patienter smittet med hepatitis C- virus (særligt under serokonversioner) kan der observeres forskelle i påvisningen mellem forskellige test, afhængigt af typen af antigene proteiner, der anvendes. Et negativt resultat ved en screeningtest udelukker ikke muligheden for eksponering for eller infektion med hepatitis C-virus. Alle ELISA-teknikker er tilbøjelige til at frembringe falske positive reaktioner. Det anbefales at kontrollere reaktionens specificitet for alle prøver, der ifølge Monolisa HCV Ag-Ab ULTRAtestkittets fortolkningskriterier defineres som gentagne positive, ved hjælp af en passende metode: Anvendelse af en ELISA-anti-HCV-antistofscreeningstest eller med en immunoblot-test til påvisning af anti-hcv-antistoffer for at bevise forekomsten af anti-hcv-antistoffer. Hvis der er behov for det, kan der anvendes en test til påvisning af HCV-virusgenomet eller en specifik HCV- antigentest, efterfulgt af en neutraliseringstest. Den kolorimetriske metode til kontrol af deponering af prøve, konjugat- og udviklingsopløsning kontrollerer ikke nøjagtigheden af de fordelte mængder. Denne metode viser kun forekomsten af prøvemateriale, konjugat og udviklingsopløsning i brønde. Fejlprocenten ved denne metode er tæt forbundet med nøjagtigheden af det anvendte system (en kumuleret variationskoefficient på mere end 10 % for fordeling og aflæsning nedsætter kvaliteten af kontrollen markant). 86

15 5 - LITTERATUR Busch MP, Kleinman SH. Committee report : nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40 : Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289 : Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification : a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36 : Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43 : Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay : Monolisa HCV Ag- Ab ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3) : Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montreuil M, Levayer T, Zappitelli JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes : an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43 : Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion : Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of Medical Virology. 1998, 55 : 1-6. Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36 : Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusion-transmitted viral infections in France between 1992 and Transfusion. 2002, 42 : Simmonds P. HCV heterogeneity : the science and the practice. In Hepatitis C Yanamouchi Europe BV Ed. p Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003, 52 : RR-3. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology. 1999, 30 : NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C : NIH Consensus and State-ofthe-Science Statements. 2002, 19 N 3. 46p. 87

16 (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkning (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - Til in vitro-diagnostik (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchnummer (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

17 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se brugsanvisningen (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

18 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2010 Fax.: Code: