ASPERGILLUS-ANTIGENER

Transkript

1 ASPERGILLUS-ANTIGENER Aspergillus antigens Aspergillus fumigatus antigens Aspergillus fumigatus positive control serum Aspergillus positive control sera SERODIAGNOSTICERING AF ASPERGILLOSE VED IMMUNPRÆCIPITATIONSREAKTION IVD

2 1- KLINISK VÆRDI Bio-Rad producerer forskellige Aspergillus-antigener til serodiagnosticering af aspergillose ved immunpræcipitationsreaktion. Diagnosticeringen af aspergillose ved påvisning af specifikke antistoffer i sera fra patienter er ofte lettere end diagnosticering ved direkte identifikation af svampen. 2- PRINCIP Bio-Rad-antigenerne kan benyttes i forskellige immunpræcipitationsreaktioner. Følgende to teknikker er specielt anbefalet: IEP (IMMUNOELEKTROFORESE) ES (ELEKTROSYNERESE) Immunpræcipitationsteknikkerne øger præcisionen for diagnosen af aspergillose yderligere ved identifikation af specifikke antistoffer for to enzymer, chymotrypsin og katalase, der findes i antigenetiske ekstrakter. Deres enzymatiske aktivitet vises i form af buede udfældninger. 3- PRÆSENTATION 72 Aspergillus fumigatus antigens (Aspergillus fumigatus-antigener), kode flasker frysetørrede antigener, der skal rekonstitueres i 1 ml sterilt destilleret vand (ca. 10 reaktioner). - Aspergillus fumigatus metabolic antigen - Aspergillus fumigatus somatic antigen Aspergillus antigens (Aspergillus-antigener), kode flasker frysetørrede antigener, der skal rekonstitueres i 1 ml sterilt destilleret vand (ca. 10 reaktioner). - Aspergillus flavus metabolic antigen - Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen - Aspergillus terreus metabolic antigen Aspergillus fumigatus positive control serum (Aspergillus fumigatus positivt kontrolserum), kode flaske frysetørret anti-aspergillus fumigatus-kanin-serum, der skal rekonstitueres i 1 ml sterilt destilleret vand. Aspergillus positive control sera (Aspergillus positive kontrolsera), kode flasker frysetørret anti-aspergillus-kanin-serum, der skal rekonstitueres i 1 ml sterilt destilleret vand.

3 - Aspergillus flavus positive control serum - Aspergillus nidulans positive control serum - Aspergillus niger positive control serum - Aspergillus terreus positive control serum 4- SAMMENSÆTNING Antigener (to typer): Stofskifteantigen, indsamlet ved filtrering af kulturer efter 10 dages inkubation ved 30 C. Somatisk eller cellulært antigen, indsamlet fra unge myceliekulturer (3 dage, uden sporer), der knuses og rystes ved 30 C. 5- OPBEVARING I frysetørret form er reagenser, der opbevares ved +2-8 C på et tørt sted, holdbare indtil den udløbsdato, der er angivet på sættet. Efter rekonstituering kan reagenser opbevares i flere måneder ved -20 C i inddelte aliquoter. Optø/aftø ikke reagenser flere gange. 6- PRØVER 1. Testene bør kun udføres på serumprøver fra tørre rør. 2. Følg nedenstående anbefalinger for håndtering, behandling og opbevaring af serumprøver: - Indsaml alle serumprøver under overholdelse af de generelle forholdsregler. - Lad prøverne koagulere helt, før de centrifugeres. - Sørg for, at rørene altid er lukkede. - Efter centrifugeringen adskilles serummet. Opbevar det i et tæt tillukket opbevaringsrør. - Prøverne kan opbevares ved +2-8 C, hvis screeningen udføres inden for 24 timer. Hvis analysen ikke udføres inden for 24 timer, eller prøverne skal sendes, skal de nedfryses til mindst -20 C. - Det foretrækkes, at prøverne kun optøs en enkelt gang. Tidligere nedfrosne prøver skal blandes grundigt efter optøning, før testen udføres. 3. Interferenser på grund af høje niveauer af albumin eller bilirubin, lipider og hæmoglobin er ikke blevet testet. 4. Undgå at opvarme prøverne. 73

4 7- PROCEDURE A) KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER Natriumbarbital Saltsyre Destilleret vand Barbital Glycin Tris-buffer 0,05M ph7 Agarose 30% H 2 O 2 N-acetyl-DL-fenylalanin-naphtyl-ester Dimethylformamid Diazoblue B B) IMMUNELEKTROFORESE (foto 1) Immunelektroforese (Grabar) kan udføres på glasplader ved mikroskopisk undersøgelse. Forbered en gel ved hjælp af renset agar eller agarose på 1% blandet med barbital-bufferopløsning med ph 8,2 (ved at tilføje mertiolat 1:10.000). Skær en grøft i gelen, der er 60 mm lang og 2 mm bred med to huller på 2 mm i diameter på hver side af grøften med en afstand på 4 mm (se diagram). Kom 20 µl ufortyndet antigen i de to lodrette huller. Tilfør en effekt på 5 volt/centimeter til pladens sider i 1 time og 30 minutter. Kom serummet i den centrale grøft, og lad det diffundere i 48 timer i en fugtig atmosfære ved stuetemperatur (18-30 C). På tredjedagen skal du nedsænke pladerne i en vaskeopløsning i 24 timer. Aflæs pladen på fjerdedagen. Det kan være nødvendigt med en Coomassie Blue-farvning for at aflæse specielt fine linjer. 74

5 C) ELEKTROSYNERESE (fig. 1) Elektrosynerese (Bussard) eller modstrømselektroforese kan udføres ved hjælp af agarose-gel eller celluloseacetat. Det er en simpel teknik, der både er meget følsom og hurtig, og samtidig nyttig i forbindelse med screening af et stort antal sera. Ved anvendelse af agarose-gel og mikroskopplader kan hullerne skæres som vist på diagrammet: antigener placeret på katodesiden (-), sera placeret på anodesiden (+). Hullerne på 2 mm i diameter er adskilt med 6 mm. Fyld antigenhullerne med rene opløsninger fortyndet i forholdet 1:2 og 1:4. Fyld serahullerne med 20 mikrolitre. Tilfør en effekt på 5 volt/centimeter i 1 time og 30 minutter. Reaktionen skal normalt aflæses umiddelbart efter migrationen. Når det er nødvendigt at farve med Coomassie Blue, skal der først foretages to på hinanden følgende afvaskninger: først i fysiologisk serum (i 1 nat), og derefter i destilleret vand (i 24 timer) efterfulgt af tørring. Det anbefales at teste positive kontroller parallelt ved overholdelse af samme procedure som for antigenerne. D) IDENTIFIKATION AF ENZYMATISK AKTIVITET I BESTEMTE BUEDE UDFÆLDNINGER De buede udfældninger, der oftest observeres efter immunelektroforese, angives som C og j (se diagram) og indikerer enzymatisk aktivitet (C: chymotripsin og J: katalase). Yderligere beviser på forekomsten af disse enzymer fås ved specifikke reaktioner (BIGUET og al.) (se bilag). E) REAGENSFORBEREDELSE 1) BUFFERE - VERONAL ph 8,2 Natriumbarbital 15,85 g HCl 1N 23 ml H 2 O q.s.p ml - BARBITAL- NATRIUMBARBITAL TRIS-GLYCIN (BBNa TG) ph 8,8 A. Natriumbarbital 65 g Barbital 10,35 g H 2O q.s.p ml 75

6 B. Glycin 281 g Tris 226 g H 2O q.s.p ml Efter blanding af lige dele a- og b-opløsning fås en buffer med en ph-værdi på 8,8 og en osmolaritet på 0,08. 2) 1% AGAROSE (VÆGT/VOLUMEN) Agarose 10 g H 2 O 500 ml Bringes i kog, og nedkøles derefter (til omkring 60 C.) Tilføj: Barbital-buffer ph 8,2 500 ml Eller BBNa TG-buffer ph 8,8 500 ml (fortyndet 50% med destilleret vand). 3) KATALASE 30% H 2 O 2, fortyndet i TRIS 0,05M ph7-buffer (0,3 ml H 2 O ml buffer) på immunelektroforese-agarose. Positiv reaktion: bobler rundt om den specifikke bue. 4) CHYMOTRYPSIN - OPLØSNING A N-acetyl-DL-fenylalanin-naphtyl-ester 5 mg Dimethylformamid 2 ml - OPLØSNING B Diazoblue B 10 mg Tris-buffer 0,05 M ph 7,4 18 ml Bland opløsning A* & B* før brug, og inkubér elektrosyneresemembranen i 30 minutter ved 37 C i denne blanding. Fjern blandingen. Inkubér natten over ved 37 C i 18 ml B-reagens. Vask membranerne med vand. Positiv reaktion: lilla-farvede buer angiver chymotrypsisk aktivitet. 76

7 F) OVERSIGTSTABEL P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS, FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. REDIGERET AF: EXELSEN KROLL-WEEXE. Analyse af ASPERGILLUS-ANTIGENER (Tabel). Buffere Spænding Varighed Farvning Immunelektroforese Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Veronal-buffer ph 8,2 Foto 1 Agarose 1%/ BBNa-TG-buffer ph 8,8 25 V / cm 60 mn Coomassie Blue Elektrosynerese Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Pur O O O O O O Veronal-buffer ph 8,2 1/2 O O O O O O 1/4 O O O O O O 1 S 2 S 1 ou 2 Sr Agarose 1%/ 10 V / cm 60 mn 1 et 2 : S : Antigener Serum Fig. 1 BBNa-TG-buffer ph 8,8 Sr : Kontrolserum * Se 6 - Procedure (E-reagensforberedelse) Coomassie Katalase Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Fortyndet H 2 O 2 * Veronal-buffer ph 8,2 Positiv reaktion: Foto 2 Agarose 1%/ BBNa-TG-buffer ph 8,8 25 V / cm 60 mn 8- FORTOLKNING Forekomsten af buede udfældninger ved anvendelse af immunpræcipitations teknikker på aspergillus-antigen indikerer en aspergillose-infektion. Da elektrosynerese er hurtigere end immunelektroforese, er elektrosynerese at foretrække til screening. Sera, der viser sig positivt ved anvendelse af denne teknik, skal dog bekræftes ved anvendelse af immunelektroforese. Enzymatisk chymotripsin- og katalaseaktivitet for bestemte buede udfældninger giver yderligere bevis på deres specificitet. Ved bronko-pulmonal eller diffus aspergillosis er testene positive i 80-90% af tilfældene, og der kan almindeligvis observeres specifikke buer. Blue bobler rundt om specifik j-bue Chymotrypsin Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn A*- og B*-reagenser Veronal-buffer 8,2 Positiv reaktion: Foto 3 Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn lilla farve på BBNa-TG-buffer ph 8,8 specifik C-bue 77

8 For aspergilloma er reaktionerne markant positive: der kan normalt observeres 5 til 10 buer og en C-bue. For allergisk aspergillus-bronkitis er reaktionen positiv i 50% af tilfældene. Præcipiterende antistoffer viser sig senere i infektionsforløbet: i nogle tilfælde opdages de på tidspunktet for den anden screening, en måned efter den første undersøgelse. 9- YDEEVNE/KVALITETSKONTROL AF TESTEN A) PÅVISNING AF BUEDE UDFÆLDNINGER Ydeevnen for Aspergillus-antigener kontrolleres ved anvendelse af positive aspergillose-kontrolsera (anti-aspergillus-kanin-serum, der indsamles ved immunisering af dyret med blandede, standardiserede A. fumigatus-antigener og med stofskifte-standardiserede A. flavus-, A. niger-, A. nidulans- og A. terreus-antigener). Påvisning af buede udfældninger ved immunelektroforese (ph = 8,2) Positivt kontrolserum Anti- A. fumigatus Anti- A. flavus Anti- A. nidulans Anti- A. niger Anti- A. terreus A. fumigatus + somatisk Ag 4 til 8 buer A. fumigatus + stofskifte-ag 3 til 5 buer A. flavus stofskifte-ag 3 til 5 buer A. nidulans + stofskifte-ag 3 til 5 buer - - A. niger stofskifte-ag 3 til 5 buer A. terreus stofskifte-ag 3 til 5 buer 78

9 B) PÅVISNING AF ENZYMATISK AKTIVITET AF BUEDE UDFÆLDNINGER Immunelektroforese (ph = 8,2) Elektrosynerese (ph = 8,2) Påvisning af enzymatisk + katalase-aktivitet efter tilsættelse af H2O 2, bobler rundt om j-bue, understøttelse af katalase-aktivitet Påvisning af enzymatisk + chymotrypsin-aktivitet efter inkubation med reagens A og B, lilla-farvet C-bue, understøttelse af chymotrypsin-aktivitet 10- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles i overensstemmelse med vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for Bio-Rad. 11- BEGRÆNSNINGER FOR BRUG Diagnosticeringen af aspergillose kan kun foretages efter overvejelsen af kliniske, radiologiske og biologiske (mikrobiologiske, histologiske og serologiske) aspekter, idet hvert enkelte element skal fortolkes med forsigtighed. 79

10 12- REFERENCER 1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification d une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l extrait antigénique d Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967) 31, pp DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l immunoprécipitation et de l immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses bronchopulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, pp LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150 pages. 80

11 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug 82

12 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2003 Fax.: +33 (0) code: