Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere:
Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil B. Adenin, Gytosin, Caranin, Thymil C. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin D. Aranin, Guamil, Catamil, Uranin 3 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil B. Adenin, Gytosin, Caranin, Thymil C. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin D. Aranin, Guamil, Catamil, Uranin 4 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvilken er den komplementære streng til denne DNA streng? 3 CTACTA 5 A. 5 CGTAAG 3 B. 5 GATGAT 3 C. 3 GATGAT 5 D. 5 TGTGCA 3 5 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvilken er den komplementære streng til denne DNA streng? 3 CTACTA 5 A. 5 CGTAAG 3 B. 5 GATGAT 3 C. 3 GATGAT 5 D. 5 TGTGCA 3 6 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Dagens program 9:00 9:30 Introduktion udtagning af celler 9:30 11:30 Vi går i lab. Start af PCR reaktion/støbning af geler 11:30 12:45 Vi går sammen til frokost og ser lidt af DTU 12:45 13:00 At studere på DTU 13:00 13:30 Loading af agarosegeler 13:30 14:30 Foredrag i Biotéket 14:30 15:00 Resultater 15:00 15:30 Evaluering og afslutning Ca. 15:30 Tak for i dag 7 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Dagens øvelse Ekstrahere Amplificere Visualisere DNA 8 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
DNA og gener 9 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Transposoner ALU transposon Cirka 300 basepar lang Findes i hver af jer 500-2.000 gange Vi undersøger jeres kromosom 16, lokus PV-92 10 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Alu transposoner hos en kvinde Grøn (probe) = Alu sekvenser Rød (TOPRO-3) = andet DNA 11 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvorfor transposoner? Hvorfor tror I, der findes transposoner? 12 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Transposoner og essentielle gener Hvad tror i der sker hvis et transposon ødelægger et essentielt gen i en celle? Brystkræft Hæmofili Alzheimer s 13 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
1. trin ekstraktion af cellemateriale Celler fra jer ekstraheres fra mundhulen Saltvand skylles rundt i munden (kraftigt) i 30 sek. og spyttes ud i kop 1 ml overføres til eppendorfrør med pipette og tages med i lab NaCl 14 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
30 sekunders nedtælling Spyt 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 98 76 54 32 1 ud i koppen igen 15 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Pipette indstilling 16 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Ekstraktion af DNA 17 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Master-Mix til 3 PCR-reaktioner 66 µl H 2 O 40 µl Primermix (PM) 16 µl dntp 32 µl GC buffer 2 µl Phusion DNA polymerase(enzym) 156 µl i alt dvs. mere end 3 gange 39 µl 18 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Amplifikation af DNA 39 µl MasterMix og 1 µl DNA fra jer blandes i PCR-rør Blandingen sættes i PCR-maskinen DNA MasterMix 19 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Støbning af agarosegel 0,4 g agarose 50 ml TAE-buffer Blandningen koges i microovn Flasken køles til ca. 60 ºC SYBR-Safe tilsættes (HUSK HANDSKER) Gelen hældes i kar 20 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Regler i laboratoriet Brug jeres fornuft Husk at vaske hænder Bær kittel hele tiden Ingen mobil, smykker, mad og drikke Læs og forstå, hvad I skal først Spørg hvis du er i tvivl 1 Det er ikke altid bedst, at blive færdig først Ind i laboratoriet!!! 21 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er DNA? DNA DeoxyRibonucleic Acid 5 Adenin - A Guanin - G Puriner Rygrad/Backbone Cytosin - C Thymin - T Pyrimidiner 3 22 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er DNA? Baseparring 5 3 23 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er DNA? Retning af DNA P i P i P i P i P i P i P i P i P i P i 24 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvor findes DNA? Prokaryoter (Bakterier) Eukaryoter (Dyr og planter) DNA Cellekerne Cytoplasma Mitokondrion/grønkorn 25 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er rækkefølgen i det centrale dogme? 1 DNA RNA 2 3 PROTEIN A. 1. Translation 2. Replikation 3. Transkription B. 1. Replikation 2. Translation 3. Transkription C. 1. Transkription 2. Replikation 3. Translation D. 1. Replikation 2. Transkription 3. Translation 26 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er rækkefølgen i det centrale dogme? 1 DNA RNA 2 3 PROTEIN A. 1. Translation 2. Replikation 3. Transkription B. 1. Replikation 2. Translation 3. Transkription C. 1. Transkription 2. Replikation 3. Translation D. 1. Replikation 2. Transkription 3. Translation 27 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er et gen? Et gen er den basale enhed af arvelighed i en levende organisme 28 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er DNA replikation? DNA replikation er kopiering af DNA før celledeling 29 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Den genetiske kode DNA 5 A T G A A A C T C T A T C C G A G T T A A 3 Transkription RNA 5 A U G A A A C U C U A U C C G A G U U A A 3 Peptid sekvens Methionin O N Lysin Leucin Tyrosin Prolin Serin N O Stop Translation (Start codon) O N N O 30 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad er PCR? Polymerase Chain Reaction PCR er en metode til opformering af DNA ved brug af en termostabil DNA polymerase Thermus aquaticus PCR blev opfundet af Kary Banks Mullis i 1983 Han blev tildelt Nobelprisen i kemi for sin opfindelse i 1993 31 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad skal der bruges i en PCR? Primere DNA polymerase dntp - Nukleotider T G C T 5 G C 3 5 DNA template PCR fragment - produkt 32 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad laver PCR maskinen? Tid 33 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Området der ønskes ampliciceret
Eksponentiel stigning i antal kopier 35 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
PCR Polymerase Chain Reaction 36 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Det humane genom 23 kromosom-par Hele det haploide humane genom fylder over 3 milliarder basepar med ca. 22.000 gener 1.5% af DNA et koder for proteiner E. colis genom er på ca. 4.6 mio. basepar og med ca. 4.400 gener 37 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvad kræver en PCR af et nyt gen? Kendte sekvenser til primere Template DNA Over 1.000 organismers totale DNA (genom) findes på nettet! Find DNA et på en netdatabase, fx GenBank og bestil passende primers 40 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
PCR i den virkelige verden Amplicering af DNA er meget anvendt: Faderskabstest Retsmedicin Artsbestemme bakterier Gensplejsning 41 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Gelelektroferese Brønde til PCR produkter DNA-ladder 1 2 3 1000 900 800 700 Størrelse i bp 600 500 400 300 200 100 Agarose gel Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 42 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
PCR-produkter Kromosom 16 415 bp Transposon 715 bp Genotype: + +, - -, + - 44 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Diskuter med din sidemand Tegn på det udleverede billede hvordan båndet for de tre genotyper vil se ud. Husk: Regel 1: DNA løber fra - + Regel 2: Store DNA fragmenter løber langsommer end små DNA fragmenter Fragmentlængder: Transposon: 300bp Gen: 415bp 45 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Gelelektroferese Brønde til PCR produkter DNA-ladder +- ++ -- 1000 900 800 700 Størrelse i bp 600 500 400 300 200 100 Agarose gel Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 46 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Resultater - diskussion PCR produkter DNA-ladder +- ++ -- Størrelse i bp 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 Genotype + + 715 bp Genotype - - 415 bp Agarose gel Genotype + - 715bp + 415 bp Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 47 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Resultater M 1 2 3 Homozygot Homozygot Heterozygot 48 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Resultater og evaluering 49 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Fejlkilder Ekstraktion af DNA Ingen eller for få celler intet eller for lidt template DNA Ineffektiv lysering af celler Amplifikation af gen Manglende komponenter i PCR mix - intet kan undværes Denatureret DNA polymerase ingen opformering Gelelektroforese Viskositet af gel Loading af brønde hvis ladder er fin Hvis der ses primer skyldes det formentlig mislykket PCR reaktion Manglende SybrSafe ingen visualisering 50 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvem er morderen? 51 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet
Hvem er faderen? 52 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet