MycAssay Aspergillus Stratagene Mx3000-serien Luftvejsprøver REF 080-045

Til in-vitro-diagnostisk brug: MycAssay Aspergillus Stratagene Mx3000-serien REF 080-045 Tilsigtet anvendelse MycAssay Aspergillus er indiceret til brug af kvalificerede laboratoriemedarbejdere til kvalitativ påvisning af Aspergillus spp. genomisk DNA ekstraheret fra respirationsprøver fra de nedre luftveje (f.eks. bronkiale prøver) som en hjælp for diagnosticering hos voksne patienter, som mistænkes at have Aspergillus-infektion eller - allergi. MycAssay Aspergillus er blevet godkendt til brug med instrumenter i Stratagene Mx3000-serien, enten Mx3000P eller Mx3005P (ved anvendelse af MxPro softwareversion 4.10). Resumé og forklaring Aspergillus spp. er ubikvitære opportunistiske skimmelsvampe, der forårsager både allergiske og invasive syndromer Genusen omfatter ca. 300 arter, hvoraf 41 er blevet sat i forbindelse med menneskelige sygdomme. Majoriteten af infektioner forårsages af A. fumigatus, A. flavus, A. terreus og A. niger; i mindre almindelige tilfælde har, A. nidulans og andre sjældne arter, som f.eks. A. sydowii, A. versicolor, A. lentulus og A. pseudofischeri været impliceret 1. De fleste infektioner og allergier forårsaget af Aspergillus spp. påvirker luftvejene. Allergiske syndromer inkluderer allergisk bronkopulmonal aspergillose (ABPA) og allergisk Aspergillus bihulebetændelse og forårsages normalt af A. fumigatus. Kronisk pulmonal aspergillose omfatter aspergillom, kronisk kaverne pulmonal aspergillose og kronisk fibrøs aspergillose. Invasiv aspergillose (IA) forekommer hos risiko-patientgrupper inklusive dem, der er behandlet med kortikosteroider og dem med neutropeni eller fagocytisk dysfunktion (dvs. kronisk granulomatøs sygdom og HIV-infektion). Omkring 80 % af tilfældene af invasiv aspergillose involverer lungerne 2. Rutinediagnose af invasiv pulmonal aspergillose omfatter CT-scanning (Computed Tomography scanning), bronkoskopi og bronkoalveolær lavage (mikroskopi og podning), Aspergillus antigentest af blod, eller histologisk undersøgelse af kirurgiske biopsiprøver. I dette scenarie er podninger ofte fejlagtigt negative 3. Bronkoalveolær lavage er faktisk kun positiv ved podning i ca. 40% af tilfældene, selv når diagnosen er eftervist med andre metoder 4,5,6,7, hvilket viser den manglende sensitivitet af podning med hensyn til påvisning af invasiv aspergillose og kronisk pulmonal aspergillose. Imidlertid er podninger vigtige, hvis de er positive, fordi mange diagnostiske test ikke indikerer enten den genus eller de arter af fungus, der forårsager sygdommen, eller dispositionsprofilen af den afsondring, der forårsager infektion. Allergisk bronkopulmonal aspergillose giver komplikationer ved astma og cystisk fibrose 8 og viser sig sjældent uden underliggende sygdomme. De fleste tilfælde er associerede med A. fumigatus, i visse tilfælde med andre implicerede fungi. Sygdommens karakteristika er episodisk obstruktiv lungesygdom med sejt opspyt fuldt af Aspergillus hyfe, total serumværdi IgE >1.000 IU/mL og påviselige A. fumigatus-specifikke IgE og IgG antistoffer eller en positiv Aspergillus priktest. Opspyt-podninger kan være positive for A. fumigatus og bronkietasi ses eventuelt på en CT-scanning af brystkassen. Aktuelle metoder til diagnosticering af kronisk pulmonal aspergillose er en blanding af radiologi (som ikke er specifik) 9 og serologi (Aspergillus IgG antistoffer eller præcipitiner) som er positive ved de fleste former for aspergillose (og derfor ikke specifikke for nogen bestem manifestation af aspergillose) 1. Podninger er kun positive i 40-65% af de tilfælde, der er påvist ved radiologi og serologi 10,11. Da differentialdiagnosen er omfattende og inkluderer tuberkulose, atypisk 1 Species Database i www.aspergillus.org.uk 2 Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. (2005). The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp. Medical Mycology: 43 (suppl. 1): S207-38. 3 Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. (2005). Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infectious Diseases: 9: 609-22. 4 Levy H, Horak DA, Tegtmeier BR, Yokota SB, Forman SJ. (1992). The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Respir Med: 86: 243-8. 5 Greub G and Bille J. (1998) Aspergillus species isolated from clinical specimens: suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance. Clin Microbiol Infect 4: 710-716. 6 Perfect JR, Cox GM, Lee JY, Kauffman CA, de Repentigny L,Chapman SW, Morrison VA, Pappas P, Hiemenz JW, Stevens DA, and the Mycoses Study Group. (2001). The impact of culture isolation of Aspergillus species: A hospital-based survey of Aspergillosis. Clinical Infectious Diseases; 33:1824 33. 7 Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J, Verbeken E, Verschakelen J, Boogaerts M. (2002). Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases. 186:1297 306. 8 Tillie-Leblond I, Tonnel AB. (2005). Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy: 60: 1004-13 9 Greene R. (2005). The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis. Med Mycol: 43 (Suppl 1): S147-54. 10 Denning DW, Riniotis K, Dobrashian R, Sambatakou H. (2003). Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis: Case series, proposed nomenclature and review. Clin Infect Dis: 37 (Suppl 3): S265-80. 11 Camuset J, Lavolé A, Wislez M, Khalil A, Bellocq A, Bazelly B, Mayaud C, Cadranel J. (2007). Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non-immunocompromised patient. Rev Pneumol Clin. 63:155-166. Dansk 1

Til in-vitro-diagnostisk brug mykobakteriose, sarkoidose, histoplasmose, coccidioidomykose, pneumokoniose, reumatoid lunge, Bechterew's sygdom og andre, er dokumentation af tilstedeværelsen af Aspergillus spp. i respirationsprøver vigtig for at forhindre forsinkelse af erkendelsen af pulmonal aspergillose og forkert behandling. MycAssay Aspergillus er et molekylært diagnosesæt til påvisning af Aspergillus spp. genomisk DNA ved hjælp af Molecular Beacon 12 Real-Time PCR teknologi. Hele testproceduren, inklusive ekstraktion af DNA fra den kliniske prøve, kan gennemføres i løbet af 4 timer, sammenlignet med svampepodning, hvor det kan tage flere dage at producere positive resultater. Denne analyse giver fordele i forhold til de aktuelt tilgængelige diagnosemetoder for akut invasiv og kronisk pulmonal aspergillose. Disse fordele omfatter hurtigere påvisning af Aspergillus spp. og muligheden for forøget sensitivitet overfor Aspergillus spp. hos kraftigt immunsvækkede patienter, som mistænkes at have invasiv pulmonal aspergillose. Procedurens principper Efter blanding af reagenserne i MycAssay Aspergillus-sættet med en prøve, der indeholder den ønskede Aspergillus DNA-sekvens (en del af Aspergillus ribosomal 18S genet), vil thermocycling resultere i DNA-amplifikation. Analysen indeholder også en Internal Amplification Control (IAC), et DNA-fragment der ikke findes i Aspergillus, andre fungale, bakterielle eller humane genomer, for at påvise PCR-hæmmende substanser og bekræfte funktionen af testreagenserne. De amplificerede DNA-mål påvises ved hjælp af Molecular Beacon teknologi. Molecular Beacons er enkeltstrengede oligonukleotid hybridiseringsprober, som danner en trin-og-spiral struktur. Spiralen indeholder en probesekvens, som er komplementær til en målsekvens, og trinnet dannes af adouceringen af komplementære armsekvenser, som er placeret på hver side af probesekvensen. En fluorofor, som fluorescerer, når den exciteres med lys med den passende bølgelængde, er kovalent bundet til enden af én arm og en slukker, som undertrykker fluorescensen af fluoroforen ved tæt fysisk nærhed, er kovalent bundet til enden af den anden arm. Molecular Beacons fluorescerer ikke, når de befinder sig frit i opløsningen. Når de imidlertid hybridiserer til en nukleinsyrestreng, der indeholder en målsekvens, undergår de en konformationsændring, som fysisk adskiller flouroforen og slukkeren og gør dem i stand til at fluorescere ved excitation. Mængden af fluorescens ved en hvilken som helst given cyklus, eller efter gennemført cyklus, afhænger af mængden af tilstedeværende specifikke amplikoner på det pågældende tidspunkt. Real-Time PCR systemet monitorerer samtidigt fluorescensen, der udsendes af hver beacon. Forholdsregler Sættet er udelukkende beregnet til at blive anvendt af professionelle laboratoriemedarbejdere. Der kræves procedurer til non-aerosol manipulation af prøver. Standardforholdsregler og institutionsretningslinjer skal følges ved enhver håndtering af alle prøver. Et materialesikkerhedsdatablad kan fås hos Myconostica Ltd. Denne test er udelukkende beregnet til in-vitro diagnostisk anvendelse. Denne test er udelukkende beregnet til anvendelse med instrumenter i Stratagene Mx3000 serien, enten Mx3000P eller Mx3005P (ved anvendelse af MxPro softwareversion 4.10). Under valideringsundersøgelser blev følgende bemærket som specifikt for dette instrument: o Hvis instrumentet er blevet brugt umiddelbart inden, skal lampen have tid til at afkøle i mindst 1 time inden klargøring til en -kørsel. Ellers kan der forekomme mindre følsomhed, hvilket kan resultere i falske negativer. o Der er mindre præcision ved lave koncentrationer ved og rundt om den kliniske cut-off i forhold til andre instrumenter, som vi har testet. Brug ikke reagenser eller kontroller, hvis de beskyttende poser er åbne eller gået i stykker ved modtagelsen. Reagenser og kontroller kan ikke ombyttes imellem sæt med forskellige partinumre. Hæld aldrig reagenser eller kontroller sammen fra forskellige glas, selvom de er fra samme parti. Anvend aldrig reagenser eller kontroller efter deres udløbsdato. Reagenser og kontroller må ikke genfryses eller genanvendes efter åbning. Anvend beskyttelsestøj og engangshandsker ved håndtering af kitreagenser. Undgå mikrobiel smitte og kontaminering med deoxyribonuclease (DNAse)-kontaminering af reagenser, når de afmålte mængder hældes ud af glassene. Det anbefales at bruge sterile, DNase-fri, lav-retentions, engangsfilterspidser eller positive fortrængningspipettespidser. Brug en ny spids til hver prøve eller hvert reagens. Bortskaf ubrugte reagenser og affald i overensstemmelse med gældende nationale og lokale love og forskrifter. For at undgå kontaminering med Aspergillus eller IAC-amplikoner må reaktionsglassene ikke åbnes efter amplifikation. 12 Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: 303-308. Dansk 2

Til in-vitro-diagnostisk brug Stratagene Mx3000-serie5 Der kan eventuelt testes yderligere kontroller i overensstemmelse med vejledninger fra nationale, lokale eller akkrediterende organisationer. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i områder, hvor prøver eller sættets reagenser håndteres. Lave koncentrationer af DNA kan være ustabile ved ukorrekt opbevaring. Det anbefales, at ekstraktioner af DNA fra kliniske prøver opbevares ved -80 o C for at bevare deres integritet. Desuden skal gentagne optøninger og genfrysninger altid undgås, når det er muligt. Dette sæt blev godkendt med anvendelse af 0,2 ml, 8-strips PCR-glas med påsatte hætter (Starlab kat. Nr. A1402-3700). Anvendelse af andre plastikkilder/-typer kan ugyldiggøre tærsklerne og derfor kravene i brugsanvisningen. Det anbefales at udføre lokal validering med positive og negative kontrolreaktioner, hvis der bruges en alternativ kilde. Sættets indhold Beskrivelse Sættet består af fem forseglede 3-rums folieposer, som hver kan tages ud af boksen og anvendes separat. Hver pose indeholder tilstrækkeligt reagens til 8 reaktioner. Glas 1 (orange hætte) Glas 2 (grøn hætte) Glas 3 (klar hætte) Glas 4 (sort hætte) dntps MgCl 2 Bufferet opløsning af DNA polymerase kompleks <0,01 % primere <0,01 % Molecular Beacons <0,0001 % Internal Amplification Control (IAC) Internal Amplification Control er et rekombinant DNAplasmid, der indeholder en ikke-infektiøs sekvens uden relation til målsekvensen (Aspergillus) Tris-HCl buffer Negativ kontrol Vand Positiv kontrol <0,0001 % positiv kontrol DNA Det positive kontrolmolekyle er et rekombinant plasmid, der indeholder Aspergillus -målsekvensen Tris-HCl buffer Volumen 66 µl 66 µl 25 µl 25 µl Sættet indeholder desuden: - MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol CD-ROM - Brugsanvisning - Analysecertifikat Opbevaring Sættet skal opbevares i frossen tilstand (-15 til -25 C) indtil udløbsdatoen, der er angivet på etiketten på sættets boks. Derefter skal det kasseres og bortskaffes ifølge lokale forskrifter. Når en pose er blevet åbnet, skal dens indhold anvendes straks og må ikke genfryses eller genanvendes på et senere tidspunkt. Dansk 3

Til in-vitro-diagnostisk brug Nødvendigt udstyr/materiale (medfølger ikke) Stratagene Mx3000 series Real-Time PCR System (inklusive brugervejledning, tilsluttet computer og MxPro softwareversion 4.10) 0,2 ml, 8-strips PCR-glas med påsatte hætter (Starlab kat. nr. A1402-3700). Støttestativ til 0,2 ml glas (strips med 8) Mini-centrifuge tilpasset specielt til 0,2 ml, 8-strips glas Mikrocentrifuge Vortexmixer Mikropipetter (nødvendigt volumen 7,5 µl 20 µl) Sterile lav-retentions filterspidser Engangshandsker, uden pudder Mønsterbeskyttet DNA-dekontamineringsopløsning Permanent markeringspen DNA-isolationssæt (se nedenfor) Prøve Prøven til MycAssay Aspergillus analyse er totalt genomisk DNA ekstraheret fra klinisk BAL og andre prøver fra de nedre luftveje. Det anbefales at anvende følgende isolationssæt og udstyr, der også blev anvendt ved valideringen, til dette formål: - MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt (REF: 080-005, kan fås hos Myconostica) - Vortex-Genie 2 (Scientific Industries Inc., New York, USA) - Vortex Adaptor Plate (REF: 080-015, kan fås hos Myconostica) Bemærkninger til proceduren Læs hele protokollen inden arbejdet påbegyndes. Hele MycAssay Aspergillus processen (eksklusive DNA-ekstraktion) tager ca. 2 timer, afhængigt af antallet af testede prøver. Opsætning af testen skal udføres i en PCR-arbejdsstation eller et præ-pcr laboratorium. Hvis en PCR-arbejdsstation ikke er tilgængelig, skal testen opsættes i et dertil beregnet område af laboratoriet 13, adskilt fra områder der bruges til DNA-ekstraktion, som regelmæssigt rengøres med DNA-dekontamineringsreagenser. Det skal imidlertid undgås at anvende DNA-dekontamineringsreagenser ved opsætning af Real-Time PCR, da de kan hæmme analysen. Brug mikropipetter til overføring af væsker. Mikropipetter, der kun er beregnet til dette formål, skal bruges til opsætning af disse reaktioner og de skal regelmæssigt dekontamineres. Det anbefales at anvende lav-retentions filterspidser for at sikre, at der ikke mistes noget DNA under opsætningsproceduren. Udvis forsigtighed ved håndtering af Glas 4. Dette Glas indeholder DNA-materiale til positiv kontrol og kontaminering kan medføre falsk positive testresultater. Bær altid handsker. Alle reagensglas skal forsynes med hætte efter brug og inden bortskaffelse. Vedrørende Stratagene Mx3000-serien: Nummerér plastikstrips, som fastgør hætten til glasset (ikke selve hætten) og notér hvad hvert nummer svarer til. Lampen skal have mulighed for at afkøle i mindst 1 time inden start af en kørsel for at undgå falske negativer. Efter denne afkølingsperiode skal lampen gennemgå en 20 minutters opvarmningsperiode som angivet i 1.1 herunder 13 Se f.eks. Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. (eds. Dieffenbach og Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USA. Dansk 4

Til in-vitro-diagnostisk brug Anvendelsesprocedure Stratagene Mx3000-serie5 1. Opsætning af Real-Time PCR 1.1 Tænd først for Real-Time PCR systemet (instrument og tilhørende computer) og start den relevante software. Indtast brugernavn og password. Lampen kræver 20 minutters opvarmning. Kørslen må ikke startes, før lampen er parat. 1.2 Kontrollér at arbejdsområdet er blevet rengjort med DNA-dekontamineringsreagenser og at det er helt tørt. Undgå brug under analyse-opsætning, da resterende rengøringsopløsning kan hæmme PCR-reaktionerne. 1.3 En pose indeholder én af hver af Glas 1, Glas 2, Glas 3 og Glas 4. Der er tilstrækkelig mængde reagenser i én pose til gennemføre 8 reaktioner. Der skal udføres mindst én positiv kontrol og én negativ kontrol-reaktion pr. kørsel, hvor reagenserne er fra et enkelt sæt. Derfor kan én pose analysere 6 patientprøver. Hvis der skal testes mere end 6 prøver, kan der bruges mere end én pose, hvis de anvendte poser er fra samme sæt-parti. Der kan testes maksimalt 38 patientprøver med de 5 poser i sættet. 1.4 Beregn antallet af nødvendige reaktioner med reference til nedenstående tabel: Antal poser Maksimalt antal patientprøver 1 6 2 14 3 22 4 30 5 38 1.5 Tag det passende antal poser ud af fryseren. Brug aldrig en pose, der ikke længere er forseglet. Tag også patientprøverne ud af fryseren, hvis de blev frosset efter ekstraktionen. 1.6 Åbn det nødvendige antal poser og tag glassene ud. Hvis der anvendes mere end én pose, men der kun gennemføres ét sæt positive og negative kontroller, er det kun nødvendigt at tage Glas 3 og 4 ud af den ene pose. Udvis forsigtighed ved håndtering af Glas 4. Dette Glas indeholder DNA-materiale til positiv kontrol og kontaminering kan medføre falsk positive testresultater. 1.7 Lad glassenes indhold tø op ved at anbringe dem på laboratoriebænken i 5-10 minutter og sikre, at indholdet af hvert glas er helt optøet inden der fortsættes. Bland glassenes indhold og patientprøverne med Vortex mixer; centrifugér dem derefter kort i en mikrocentrifuge for at sikre samling af alt indholdet i glassenes bund inden anvendelse. Anbring det nødvendige antal 0,2 ml PCR-glas i stativet. Pas på ikke at efterlade mærker på den optiske hætte. 1.8 Opsæt altid først den negative kontrol og derefter patientprøverne. Den positive kontrol skal altid opsættes til sidst. 1.9 Reagens- og DNA-voluminer vises i nedenstående tabel: Reagens Reaktion Negativ kontrol Patientprøve Positiv kontrol Glas 1 (orange hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 2 (grøn hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 3 (klar hætte) 10 µl - - Patientprøve - 10 µl - Glas 4 (sort hætte) - - 10 µl Totalt volumen 25 µl 25 µl 25 µl 1.10 Tilføj reagenser i den rækkefølge, der er vist i ovenstående tabel; Glas 1, derefter Glas 2, fulgt af skabelonen (negativ kontrol, patientprøve eller positiv kontrol). Vær forsigtig ved udtagning af alikvoter fra Glas 1. Væsken er en smule viskøs og kan klæbe til glassets indvendige rand. Hvis dette sker, skal det køre igen i centrifugen for at samle det endelige indhold i bunden af glasset, inden det forsøges at fjerne de endelige alikvoter. 1.11 Brug en ny pipettespids til hver væskeoverføring. Sæt hætten på hvert reagensglas igen efter brug og kassér det straks sammen med det resterende indhold i en lukket beholder til klinisk affald. Ubrugte reagenser kan ikke gemmes til senere brug. Dansk 5

Til in-vitro-diagnostisk brug 1.12 Vær især forsigtig ved udtagning af væsken med pipette fra Glas 4 (DNA til positiv kontrol) for at sikre, at den ikke kontaminerer andre reaktionsglas. Ved at lukke lågene på de andre reaktionsglas inden åbning af Glas 4 reduceres risikoen for krydskontaminering. 1.13 Sørg for at alle reaktionsglaslåg er forsvarligt lukket, men mærk ikke det faktiske låg. Brug i stedet plastikstrippen, der fastgør hver hætte til hvert glas. Lad reaktionsglassene centrifugere ned i 10 sekunder i en minicentrifuge tilpasset 0,2 ml PCR-glas. 1.14 Gå straks videre til Afsnit 2. -reaktioner er stabile på laboratoriebænken i op til 60 minutter. 1.15 Efter PCR-opsætningen skal det sikres, at arbejdsområdet rengøres omhyggeligt med DNAdekontamineringsreagenser. 2. Gennemførelse af kørslen 2.1 Åbn MxPro softwaren, version 4.10. 2.2 Indsæt MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol cd-rom'en. 2.3 I menuen New Options vælges den første valgmulighed: Real Time: Quantitative PCR (Multiple Standards), og klik på OK, som vist: 2.4 Klik på knappen Import til højre i fanen Plate Setup. Vælg MycAssay Asp Myconostica Protocol CD-ROM fra rullelisten i Look-In: og importér dernæst filen MycAssay Aspergillus v2.mxp. Klik på Finish. Når dette er udført, bør Plate Setup ligne dette eksempel: 2.5 Det anbefales at indstille Well Type på <blank> i de brønde, der er tomme, for at forhindre lysbrydning fra plastikken, der interferer med signalerne fra de brønde, som ikke indeholder reaktioner. Dansk 6

Til in-vitro-diagnostisk brug Stratagene Mx3000-serie5 2.6 Gentag importprocessen i fanen Thermal Profile Setup for at importere PCR-programmet for denne analyse. Indstil Thermal Profile Design på Custom og dernæst Import fra den samme fil som beskrevet i 2.4. Når dette er udført, bør Thermal Profile Setup ligne dette eksempel: 2.7 I fanen Plate Setup nanvgives brøndene på passende vis. Højreklik på en fremhævet brønd (eller brøndgruppe, hvis formeringer) og vælg Well Information fra listen med valgmuligheder. Indtast navnet på den prøve, der bruges i denne brønd i Name: -afsnittet. 2.8 Når alle brønde er navngivet korrekt, gemmes kørslen, idet den gives et passende filnavn, der inkluderer datoen og operatørens initialer, og start dernæst kørslen ved at vælge knappen Run øverst til højre på skærmen i fanen Instrument. Sørg for, at afkrydsningsfeltet er krydset af for at slukke lampen, efter kørslen er afsluttet, og klik til slut på knappen Start i nederste, højre hjørne. 2.9 Husk at lade instrumentet afkøle i mindst 1 time, inden der startes med trin 1.1 igen. 3. Dataanalyse og fortolkning 3.1 Når kørslen er færdig, kan resultaterne ses ved at vælge knappen Analysis øverst til højre på skærmen, efterfulgt af fanen Results. 3.2 Vælg Amplification Plots analysis area, indstil tærsklerne for hver kanal som følger, og lås ved at klikke på hængelåsikonet; ASP = 1000 IAC = 100 3.3 Adaptive Baseline skal også vælges. Det er sædvanligvis standardindstillingen for denne software. 3.4 Gem ændringerne. Hver kanal kan ses separat ved at klikke på felterne i sektionen Assays Shown nederst til venstre på skærmen ved hhv. at aktivere og deaktivere dem. 3.5 Data kan eksporteres mhp. yderligere behandling i Excel på følgende måde:file>export Text Report>Export Text Report to Excel. Kun de brønde/farvestoffer, som er blevet fremhævet, bliver eksporteret, så det skal sikres, at alle relevante/påkrævede brønde/farvestoffer er valgt. 3.6 Åbn den gemte.csv file med Excel eller et lignende regnearksprogram. 3.7 Analysér hver prøve ved at starte med kontrollerne, som vist i nedenstående flowskema (detaljer findes også i tabellen under flowskemaet): Dansk 7

Til in-vitro-diagnostisk brug NEJ Kontrollér den negative kontrol Er ASP Ct 37.0 or registreret som No Ct? JA Kørslen er kontamineret HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den negative kontrol Er IAC Ct 28.4-35.0? Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen JA Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den positive kontrol Er ASP Ct 15.0-20.0? JA Positiv for Aspergillus DNA HANDLING: Rapportér Resultat 2 JA Kontrollér patientprøven Er ASP Ct 36.0 NEJ Negativ for Aspergillus DNA HANDLING: Rapportér Resultat 1 JA Kontrollér patientprøven Er IAC Ct 28.4-35.0? NEJ IAC fejl HANDLING: Gentag prøven. Hvis det samme resultat opnås igen Rapportér Resultat 3 Prøve ASP MycAssay Ct IAC MycAssay Ct Fortolkning Negativ kontrol 37,0 eller upåvist Inden for 28,4-35,0 Negativ kontrol acceptabel Yderligere handling Patientresultater er gyldige Negativ kontrol 37,0 eller upåvist <28,4 eller >35,0 Fejl i negativ kontrol Gentag hele kørslen Negativ kontrol <37,0 Inden for 28,4-35,0 Kontaminering Gentag hele kørslen Positiv kontrol Inden for 15,0-20,0 Ikke relevant Positiv kontrol acceptabel Patientresultater er gyldige Positiv kontrol <15,0 eller >20,0 Ikke relevant Fejl i positiv kontrol Gentag hele kørslen Patient >36,0 Inden for 28,4-35,0 Negativ for Aspergillus ved CCO* Patient 36,0 Ikke relevant Positiv for Aspergillus ved CCO* Rapportér resultat: Resultat 1 Rapportér resultat: Resultat 2 Patient 37,0 eller upåvist <28,4 eller >35,0 IAC fejl i prøve Gentag prøve: Resultat 3 *CCO = clinical cut-off. Alle resultater på eller under dette niveau betragtes som klinisk positive. Andre prøver rapporterer eventuelt Ct-værdier >36,0, men disse afspejler normale eller baggrundsniveauer af Aspergillus-indholdet i luftvejsprøven. Se klinisk rapport (Resultat 1, 2 eller 3) Dansk 8

Til in-vitro-diagnostisk brug 4. Fejlfinding 4.1 Den negative kontrol har genereret et positivt signal i FAM-kanalen: Stratagene Mx3000-serie5 Der opstod kontaminering under opsætningen. Resultater fra hele kørslen er ikke pålidelige og kan ikke betragtes som nøjagtige. Gentag hele kørslen og vær meget omhyggelig ved tilføjelse af skabelonerne, især den positive kontrol (Glas 4), for at sikre, at der ikke sker krydskontaminering. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne bliver korrekt dekontamineret før og efter brug. Den negative kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg for, at reaktionsglassene anbringes på de tildelte steder ELLER at brøndene annoteres korrekt i softwaren. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Tærskler er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede Starlab glas med hætter (Kat. nr. A1402-3700). 4.2 Den negative kontrol IAC Ct-værdi ligger ikke inden for det acceptable område: PCR er blevet hæmmet. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne er helt tørre efter brug af dekontamineringsmidler inden PCRopsætning. Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Reagens fra enten Glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til PCR-reaktionen, eller der blev tilsat den dobbelte mængde fra Glas 2. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis det observeres, at væskeniveauet er højere eller lavere i ét reaktionsglas i forhold til andre. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Tærskler er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede Starlab glas med hætter (Kar. nr. A1402-3700). 4.3 Den positive kontrol er negativ: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Der opstod en fejl under trin 1.10 eller 1.12 og den positive kontrolskabelon (Glas 4) blev anbragt i det forkerte reaktionsglas. Gentag kørslen idet der udvises stor forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis der observeres et højere væskeniveau i et reaktionsglas og et lavere niveau i et andet, i forhold til normalt niveau. Reagenset fra enten Glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til reaktionen. Gentag kørslen, idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis der observeres et lavere væskeniveau i denne reaktion sammenlignet med andre. Den positive kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg for, at reaktionsglassene anbringes på de tildelte steder ELLER at brøndene annoteres korrekt i softwaren. Der blev anvendt ikke-anbefalede glas eller plader. Tærskler er kun gyldige, hvis der anvendes de anbefalede Starlab glas med hætter (Kat. nr. A1402-3700). 4.4 Patientprøve(r) giver Resultat 3 - Invalid (ugyldig): Det er sandsynligt, at den/de ekstraherede kliniske prøve(r) indeholder PCR-hæmmere. Vi anbefaler, at DNA fra kliniske prøver ekstraheres ved hjælp af MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt. Dansk 9

4.5 Der findes ingen resultater for nogen kanal med nogen prøver eller kontroller: Til in-vitro-diagnostisk brug Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om Opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Det anvendte udstyr fungerer ikke optimalt. Kontrollér, at dit Real-Time PCR-instrument er blevet serviceret korrekt og er up-to-date, samt at det er blevet fuldt kalibreret som beskrevet i denne installations- og vedligeholdelsesvejledning. Der blev brugt en ukorrekt protokolfil under opsætning af softwaren. Referér venligst til Afsnit 2 og vælg den korrekte protokolfil, som specificeret for hver softwaretype/-version, fra Myconostica Protocol CD-ROM'en. Det er kun muligt at finde den fil, der passer til softwaren. Gentag kørslen ved hjælp af den korrekte protokolfil. Hvis du har yderligere spørgsmål, eller hvis du får problemer, bedes du kontakte vores tekniske support (productsupport@lab21.com) Præstationskarakteristika og -begrænsninger Mx3000 seriens analysepræstationsdata Sættet blev indledningsvist valideret med Cepheid SmartCycler. Visse af disse analysepræstationskrav blev genvalideret på Mx3005P platformen med 0,2 ml 8-strips PCR-glas med påsatte hætter (Star Lab kat. nr. A1402-3700), og rapporteres herunder. Analytisk sensitivitet Ved hjælp af Mx3000-serienss protokol beskrevet ovenfor og PCR-skabeloner genereret hos Myconostica, blev Limit of Blank (LoB) for MycAssay Aspergillus bestemt til at være en Ct-værdi på 37,0, mens Limit of Detection (LoD) blev bestemt til at være <25 kopier af mål-dna med AF293-stammen sf A. fumigatus. Reproducerbarhed og repeterbarhed Repeterbarheden og reproducerbarheden blev bestemt af 6 forskellige operatører (OP1-6), der testede et panel med 7 forskellige skabeloner, i tre eksemplarer, ved i alt 252 analyser. Der blev gennemført eksperimenter ved hjælp af 1 fremstillet portion af sæt, på 2 forskellige instrumenter, der var placeret forskellige 2 steder. Resultaterne blev analyseret i forhold til Limit of Blank (LoB) og clinical cut-off (CCO). Ved en koncentration på ~6 gange Limit of Detection (LoD), var resultaterne fra 75 % af alle testede prøver overensstemmende (positive) for LoB, og 67 % af prøverne var overensstemmende ved CCO. Ved en koncentration på 20 gange LoD (~ 500 kopier) var 92 % af de testede prøver positive ved CCO. Ved koncentrationer højere end 3 x LoD var resultaterne fra 100 % af alle prøver positive ved både CCO og LoB. For negative skabeloner var alle testede prøver negative ved CCO. Skabelon OP1 OP2 OP3 OP4 OP5 OP6 Kombineret 0 Ingen CT Ingen CT Ingen CT Ingen CT Ingen CT Ingen CT Ingen CT 150 35,9 ± 1,0 35,9 ± 0,7 34,7 ± 0,9 34,9 ± 0,7 36,3 ± 1,1 36,2 ± 0,8 35,7 ± 1,0 500 34,6 ± 0,5 34,7 ± 0,9 33,5 ± 0,7 33,8 ± 0,8 34,9 ± 1,5 34,9 ± 0,4 34,4 ± 1,0 1000 32,5 ± 0,4 32,4 ± 0,4 31,6 ± 0,4 31,9 ± 0,5 32,9 ± 0,6 33,0 ± 0,4 32,4 ± 0,6 1875 31,6 ± 0,3 32,0 ± 0,3 30,8 ± 0,4 31,0 ± 0,6 31,6 ± 0,9 32,7 ± 0,3 31,6 ± 0,8 3750 30,7 ± 0,3 31,1 ± 0,5 29,9 ± 0,2 30,3 ± 0,7 30,6 ± 0,5 31,4 ± 0,3 30,7 ± 0,7 7500 29,7 ± 0,4 29,9 ± 0,4 29,1 ± 0,4 29,5 ± 0,4 29,9 ± 0,8 30,3 ± 0,3 29,7 ± 0,6 Resultater af reproducerbarhedstestning for 6 brugerere vist via skabelonens kopiantal. Panelstammer (kolonnetal er en tilnærmelse til Aspergillus DNA-kopier/skabelon panelstammer) varierede fra 0 til 7500 kopier/reaktion. For hver bruger repræsenterer dataene gennemsnitsresultatet og standarddeviationen for seks kørsler / panelstamme. Standarddeviationen er større på tværs af alle brugerere og indenfor hver brugers kørsler for panelstammer med den lavere skabelons kopiantal. Dansk 10

Til in-vitro-diagnostisk brug Overførsel af Clinical Cut-Off Stratagene Mx3000-serie5 Clinical cut-off-værdien på 36,0 var blevet fastslået på SmartCycler. Denne cut-off-værdi blev overført analytisk til Mx3000 serie-platformen ved hjælp af en skabelon med en Aspergillus-koncentration, der var blevet påvist at give 95 % positive resultater ved CCO på SmartCycle. Der blev konstateret en Ct-værdi på 36,0, som derefter blev bekræftet ved hjælp af skabeloner med 3 forskellige koncentrationer. Følgende præstationskrav blev fastlagt ved brug af Cepheid SmartCycler Analytisk specificitet og selektivitet Analytisk specificitet blev testet ved hjælp af DNA ekstraheret fra 15 forskellige Aspergilli-arter, inklusive adskillige stammer af hver af A. fumigatus, A. niger, A. terreus, og A. nidulans. Signaler detekteret over LoB blev angivet som positivt resultat. Alle de testede 15 Aspergillus spp. var positive med analysen. Ud over de tidligere nævnte omfatter dette A. flavus, A. versicolor, A. glaucus, A. sclerotiorum, A. niveus, A. lentulus, A. unguis, A. candidus, A. wentii, A. tubingensis og A. foetidus. Genomisk DNA ekstraheret fra Penicillium spp. genererede også positive resultater. Dette skyldes det faktum, at sekvenserne af de molekylære mål i stor udstrækning bevares mellem Aspergillus og Penicillium. Det skal derfor bemærkes, at et positivt resultat med denne analyse kan være et resultat af infektion med Penicillium, i stedet for Aspergillus. Analytisk selektivitet blev testet ved hjælp af DNA ekstraheret fra flere forskellige fungale og ikke-fungale arter. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende arter: Alternaria alternata Blastomyces capitatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus, Fusarium solani, Histoplasma capsulatum Pneumocystis jirovecii, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospernum, S. prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatum. Der blev ikke rapporteret et positivt resultat med følgende bakteriearter:bordetella pertussi, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius. Humant genomisk DNA giver ikke et positivt resultat med denne analyse. Påvirkende substanser (kontraindikationer for brug) Følgende forbindelser blev testet i klinisk relevante koncentrationer og det blev konstateret, at de ikke hæmmede analysen: acteylcystein, amphotericin, beclometasondipropionat, budesonid, colistimethatnatrium, fluticasonpropionat, formoterolfumaratdihydrat, ipratropiumbromid, lidocain, mannitol, salbutamolsulfat, salmerterol, natriumklorid, natriumcromoglicat, terbutalin, tobramycin. Præstationsevaluering Respirationsprøver (BAL), der var blevet indsamlet fra 2 hospitaler, ekstraheret ved hjælp af MycXtra sættet og opbevaret, blev brugt til at evaluere præstationen af sættet med kliniske prøver. Der blev foretaget sammenligninger af både klinisk diagnose og podning. Cut-off-værdien med en Ct-værdi på 36.0 blev fastslået efter en gennemgang af et datasæt fra prøver, der var indhentet fra forskellige steder og forskellige patientpopulationer. Forskellige cut-off-værdier blev evalueret for sandsynligheden for differentiering mellem sygdomstilstand og ikke-sygdomstilstand. Dansk 11

PCR v klinisk diagnose Klinisk positiv Klinisk negativ PCR positiv 31 1 0,97 PPV (positiv prædiktiv værdi ) Til in-vitro-diagnostisk brug PCR negativ 2 10 0,83 NPV (negativ prædiktiv værdi ) PCR v Aspergillus podning 0,94 0,91 Sensitivitet Dyrkning positiv Specificitet Dyrkning negativ PCR positiv 29 3 0,91 PPV (positiv prædiktiv værdi ) PCR negativ 2 10 0,83 NPV (negativ prædiktiv værdi ) 0,94 0,77 Sensitivitet Specificitet Af de testede prøver indeholdt 0,8 % PCR-hæmmere som rapporteret af IAC, efter ekstraktion ved hjælp af MycXtra sættet. Klinisk rapportering MycAssay Aspergillus-sættet er beregnet til at fungere som en hjælp ved diagnosticering. Resultaterne skal vurderes i sammenhæng med patientens kliniske tilstand og andre diagnostiske testresultater. I det følgende er angivet anbefalede rapporter, hver afhængig af fortolkningen af analyseresultatet: Resultat nr. 1 Aspergillus spp. ikke påvist. Resultat nr. 2 Aspergillus spp. påvist; positivt resultat. Denne analyse påviser også Penicillium spp. Resultat nr. 3 Test mislykket; hæmmere eller andre ukendte substanser tilstede. Procedurens begrænsninger Den grundlæggende begrænsning af denne procedure relaterer til kvaliteten af den primære prøve: - Hvis prøven er meget lille eller ikke er hentet fra det påvirkede område af lungen, vil testen være mindre følsom og kan være fejlagtigt negativ. - BAL-prøver skal centrifugeres inden DNA-ekstraktion fra tabletten. - Data har også vist, at en reduktion af volumenet af supernatant, der buges i ekstraktionsprocessen, opnået ved centrifugeringen, reducerer andelen af hæmmere, der trænger ind i systemet. Falske positive resultater er mulige, hvis det inficerende stof er Penicillium spp. som ikke kan differentieres fra Aspergillus spp. ved hjælp af dette sæt. Klinisk præstationsevaluering er ikke blevet bekræftet med brug af MX3005P instrumentet. Selvom MycXtra Fungal DNA ekstraktionsproceduren er beregnet til at fjerne PCR-hæmmere, er der ikke foretaget evaluering af alle lægemidler eller patientpopulationer. Proceduren er ikke blevet fuldt vurderet med spyt og er heller ikke blevet vurderet med inducerede saltvandsprøver eller på prøver fra børn. Falske positive resultater kan være forårsaget af ekstern kontaminering af den originale prøve eller test. En sådan kontaminering kan forårsages af Aspergillus-kontamineret luft, ringe eksperimentalteknik med hensyn til positiv kontrol eller ekstern (især via pipette) kontaminering med Aspergillus DNA. Da et sandt positivt resultat kan opnås fra patienter, som forbigående eller vedvarende er koloniseret af Aspergillus spp., kræves der klinisk vurdering ved fortolkning af testresultaterne, i sammenhæng med sygdom. Dansk 12

Til in-vitro-diagnostisk brug Stratagene Mx3000-serie5 LICENSER TopTaq TM Hot Start leveres af QIAGEN. QIAGEN er et registreret varemærke tilhørende Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland. Dette produkt sælges under licens fra Public Health Research Institute, Newark, New Jersey, USA og må kun bruges under PHRI-patentrettigheder til human in vitro-diagnose. SmartCycler er et registreret varemærke tilhørende Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA. En del af dette produkt er dækket af en eksklusiv licens til en patentansøgning ejet af Fred Hutchinson Cancer Centre, Seattle, USA. Mx3000P og Mx3005P er registrerede varemærker tilhørende Stratagene. MxProTM er et varemærke tilhørende Stratagene. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375 Email: productsupport@lab21.com Dansk 13