ProSpecT TM Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay

ProSpecT TM Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay R2474048...48 tests R2474096...96 tests 1 TILSIGTET ANVENDELSE ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay er beregnet til kvalitativ påvisning af Shiga Toxins (Stx1 og Stx2) i vandige ekstrakter af fæcesprøver og bouillonberigede fæceskulturer. Testen er beregnet til brug som en hjælp til diagnosticering af enterohæmoragisk E. coli infektioner. 2 RESUMÉ Shiga toksinproducerende E. coli (STEC) er anerkendt som vigtige ætiologiske årsagsorganismer til diarré og alvorlige udbrud samt sporadiske tilfælde af livstruende hæmoragisk colitis og hæmolytisk uræmisk syndrom (HUS 2,3,13,14 ). Stammer af E. coli, der frembringer disse virkninger, blev første gang beskrevet af Konowalchuk et al., som identificerede et cytotoksin, der var cytopatisk over for Vero-celler og blev kaldt Verotoxin, VT 6,7,8. Cytotoksinet er tæt knyttet til Shiga toksin, som det blev påvist af O Brien et al. 9, der omtalte toksinet som Shiga- Like toxin (SLT). Der er identificeret to former af toksinet, Stx1 og Stx2 9, og Shiga toksinproducerende E. coli (STEC) isolater er påvist at producere et eller begge cytotoksiner 15,16. E. coli O157:H7 er den hyppigst identificerede EHEC serotype og kan isoleres samt identificeres af de fleste kliniske laboratorier 1,10,12,14. Imidlertid er mindst 50 serotyper af E. coli blevet forbundet med produktion af cytotoksiner og udvikling af HUS og/eller hæmoragisk colitis 5,11. Karmali 4 beskrev et cytotoksin-assay for påvisning af toksin, men assayet kræver megen tid og ekspertise for bekræftelse af tilstedeværelse af cytotoksin. ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay er et enzymimmunoassay, som muliggør direkte påvisning af Stx1 og Stx2 toksin i afføringsprøver eller i bouillonberigede fæceskulturer. 3 TESTPRINCIP ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay er et fastfase immunoassay til påvisning af Shiga toksiner. Fortyndede afføringsprøver anbringes i mikrobrønde, der kan brækkes af, og på hvilke der er bundet kaninpolyklonalt anti-shiga toksin 1 og 2. Hvis der findes toksin, indfanges det af det bundne antistof. Mikrobrøndene inkuberes og vaskes for at fjerne ubundet materiale. Enzymkonjugatet (monoklonalt muse-anti-shiga toksin 1 og 2 mærket med peberrodsperoxidaseenzym) tilsættes. Mikrobrøndene inkuberes og vaskes derefter for at fjerne ubundet enzymkonjugat. I en positiv reaktion binder toksinet enzymkonjugatet til brønden. Substratet for enzymet, 3,3,5,5 - tetrametylbenzidin (TMB), tilsættes. I en positiv reaktion konverterer det enzym, der er bundet til brønden af toksinet, substratet til et farvet reaktionsprodukt. Farvningen kan aflæses visuelt eller med spektrofotometri. I en negativ reaktion er der intet toksin, eller der er et utilstrækkeligt niveau af toksin til at binde enzymkonjugatet, og der udvikles ikke noget farvet reaktionsprodukt. 4 SYMBOLFORKLARING Katalognummer In vitro diagnostisk medicinsk udstyr Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests Se brugsanvisningen Opbevaringstemperatur Batchnummer (partinummer) Anvendes senest (udløbsdato) Producent Fortyndet prøve DA 5 KITTETS INDHOLD, KLARGØRING TIL BRUG SAMT OPBEVARING ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay indeholder tilstrækkeligt med reagenser til udførelse af 48 eller 96 tests. Se også Forholdsregler, afsnit 6. Udløbsdatoen for det enkelte kit er angivet på emballagens mærkat. Opbevar alle dele ved 2 til 8 C. Inden brug skal alle reagenser bringes til stuetemperatur (20-25 C) og blandes forsigtigt. Stil ubrugte reagenser tilbage i køleskab efter brug. Alle reagenser med undtagelse af vaskebufferen leveres i brugskoncentration. Reagenser kan dispenseres direkte fra dråbeflaskerne eller hældes ud til brug sammen med multikanalspipetter. Hvis der er hældt for meget reagens op, skal det overskydende reagens kasseres. Overskydende reagens må ikke hældes tilbage i flasken. Brugsanvisning Overførselspipetter Holder og låg til mikropladestrimler Procedurekort Mikroplade* (8 brønde/strimmel) 6 strimler (R2474048) eller 12 strimler (R2474096) belagt med polyklonalt kaninanti- Shiga toksin 1 og 2 antistof. Ubrugte mikropladestrimler skal opbevares i folieposen, som indeholder tørremiddel, for at undgå fugt. Enzymkonjugat* Én dråbeflaske med 12 ml (R2474048) eller 25 ml (R2474096) peberrodsperoxidase mærket med monoklonalt museanti-shiga toksin 1 og 2 med bovint serum og antimikrobielt stof. Positiv kontrol Én dråbeflaske med 4 ml E. coli kultursupernatant indeholdende Shiga toksin 1 og 2 med føtalt bovinserum, kaninserum og antimikrobielt stof. Negativ kontrol Én dråbeflaske med 4 ml bufferopløsning med kaninserum, et rødt farvestof og antimikrobielt stof. Bakteriel prøvediluent Én flaske med 120 ml bufferopløsning med kaninserum, et rødt farvestof og antimikrobielt stof. Vaskebuffer Én flaske med 120 ml (x10) koncentreret bufferopløsning med antimikrobielt stof. Fortynd (x10) vaskebufferkoncentrat til (x1) ved at tilsætte 1 del koncentrat til 9 dele destilleret eller deioniseret vand. Fortyndet vaskebuffer er stabil i op til 1 måned, når den opbevares ved 2-8 C. Farvestof Én dråbeflaske med 12 ml (R2474048) eller 25 ml (R2474096) 3,3,5,5 -tetrametylbenzidin (TMB) i buffer. Farvestoffet bør opbevares i og anvendes fra den lysbeskyttende flaske, som det leveres i. Hvis en afmålt portion fjernes fra den oprindelige flaske af en eller anden grund, må ubenyttet farvestof ikke hældes tilbage i den oprindelige flaske. Stopopløsning Én dråbeflaske med 12 ml 0,46 mol/l svovlsyre. *Bemærk: Bland ikke reagenser fra kit med forskellige partinumre. 1

6 FORHOLDSREGLER Reagenserne er kun til in vitro diagnostik. Må kun anvendes af uddannet personale. Se sikkerhedsdatabladet og produktmærkningen vedrørende oplysninger om potentielt farlige komponenter. OPLYSNINGER OM SUNDHED OG SIKKERHED 6.1 Reagenser er fremstillet af biologisk materiale og skal håndteres som potentielt smittefarligt materiale. Skal bortskaffes som smittefarligt materiale. 6.2 Pipettér ikke materialer med munden. Brug engangshandsker og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og udførelse af assay. Vask hænderne grundigt, når arbejdet er færdigt. 6.3 Prøver kan indeholde potentielt smittefarlige materialer og skal håndteres i overensstemmelse hermed, se f.eks. anbefalingerne vedrørende Biosafety Level 2 i CDC/NIH manualen Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. 6.4 Vaskebuffer indeholder potentielt hudirriterende stof (< 1% v/v). Undgå kontakt med huden. Brug engangshandsker af vinyl eller nitril. 6.5 Bortskaf brugt vaskebuffer i passende beholdere til hospitalsaffald. ANALYTISKE FORHOLDSREGLER 6.6 Alle anvisninger i nærværende brugsanvisning skal læses og følges omhyggeligt. 6.7 Reagenser leveres i den nødvendige brugskoncentration med undtagelse af vaskebufferkoncentratet. Undlad at fortynde reagenser undtagen i tilfælde, hvor instruktionerne angiver fortynding. 6.8 Reagenser må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Udløbsdatoen er angivet på etiketten på det enkelte reagens. Det kan påvirke resultaternes nøjagtighed, hvis reagenser bruges efter udløbsdatoen. 6.9 Følgende almindelige reagenser kan bruges sammen med hele ProSpecT produktserien: vaskebuffer, farvestof og stopopløsning. 6.10 Mikrobiel kontaminering af reagenser kan give nedsat assaynøjagtighed. Undgå mikrobiel kontaminering af reagenser ved at bruge sterile engangspipetter, når afmålte portioner tages fra flasker med reagens. 6.11 Reagenser og prøver skal bringes til stuetemperatur (20-25 C) inden brug. 6.12 Mikropladestrimler skal opbevares i den genlukkelige foliepose med tørremiddel, så de beskyttes mod fugt. 6.13 Afføringsprøver skal blandes grundigt før behandling af prøven for at sikre, at prøven er repræsentativ for materialet. UNDLAD AT KONCENTRERE PRØVER FØR ANALYSE. 6.14 Farvestoffet er lysfølsomt. Hvis reagenset udsættes for lys og udvikler farvning, skal det kasseres. 6.15 Personer, der er farveblinde eller har nedsat syn, kan muligvis ikke aflæse testresultatet visuelt og bør derfor benytte spektrofotometriske målinger ved tolkning af resultater. 6.16 Reagenserne skal tilsættes til testbrøndene i samme rækkefølge under hele proceduren. For at undgå kontaminering må flaskens spids ikke komme i berøring med væsken i brøndene. 6.17 Der skal omhyggeligt tages tid på hver inkubation. Start tidtagningen, når der er tilsat reagens til den sidste brønd på hver mikroplade, der testes. For at opnå nøjagtig tidtagning må der ikke arbejdes med mere end tre 96-brøndsplader ad gangen. Manglende overholdelse af den fastlagte procedure kan ændre assay-kvaliteten. 6.18 Det er vigtigt at holde dråbeflaskerne lodret og at dråben dannes ved dysens spids. Hvis dysen bliver våd, vil der blive dannet en dråbe med forkert volumen omkring enden og ikke ved spidsen. Hvis dette sker, skal dysen tørres, før arbejdet fortsættes. 6.19 Shiga toksin 1 og det toksin, der produceres af Shigella dysenteriae type 1 stammer (Shiga toksin), er næsten identiske. Derfor kan ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay være positiv, hvis der i prøven er en tilstrækkelig mængde Shiga toksin, til at det kan påvises. 2 7 INDSAMLING AF FÆCESPRØVER Der opnås optimale resultater ved direkte analyse af fæcesprøver, hvis prøverne analyseres straks efter modtagelsen i laboratoriet. Hvis testning kan udføres inden for 48 timer efter indsamlingen for friske prøver eller inden for 7 dage for prøver i Cary Blairs transportmedium, kan prøver opbevares ved 2-8 C, ellers skal prøver opbevares ved -20 C eller koldere. FRISK Ukonserverede prøver (eller prøver i Cary Blairs transportmedium) skal opbevares ved 2-8 C eller nedfryses til -20 C eller koldere straks efter indsamlingen. Prøver til kultur skal anbringes i bouillon inden for en eller to timer efter modtagelsen i laboratoriet. Prøver i fortyndet bakteriel prøvefortynder kan opbevares ved 2-8 C i op til 48 timer før testning. FROSSEN Hvis kultur ikke kan udføres inden for 1-2 timer, skal friske prøver eller prøver i Cary Blairs transportmedium nedfryses til -20 C eller koldere. Gentagen nedfrysning og optøning kan medføre nedbrydning af toksinet. 8 TESTPROCEDURE MEDFØLGENDE NØDVENDIGE MATERIALER Se Kittets indhold, afsnit 5 NØDVENDIGE MATERIALER, DER IKKE MEDFØLGER Beholdere til indsamling af afføringsprøver Stopur, der måler i minutter Vaskeflaske til vaskebuffer Destilleret eller deioniseret vand VALGFRI MATERIALER, DER IKKE MEDFØLGER Mikropladelæser, der kan aflæse 450 nm eller 450/620 til 650 nm Applikatorpinde med bomulds- eller rayonspids Mikropipette til afgivelse af volumener op til 200 µl Engangstestrør i plast eller glas Hvirvelmikser med pladeadapter eller pladeryster PROCEDURE 8.1 Klargøring af prøve: Prøver i Cary Blairs transportmedium kan tilsættes direkte til mikrobrøndene for testning (se Trin 8.4 herunder). Sørg for at blande prøverne i transportmedie, før de overføres til mikrobrøndene. Friske afføringsprøver eller bouillonberigede kulturer skal fortyndes (se Boks A eller B herunder). A Direkte afføringstest 1 Tilsæt 0,6 ml bakteriel prøvediluent til et rent 12 x 75 mm rør. 2 Bland afføring så grundigt som muligt, og fortynd som følger: a Flydende eller halvfast afføring: Tilsæt 0,3 ml (tredje mærke fra spidsen på den medfølgende pipette) ved brug af en overførselspipette. Bland afføringen grundigt med den bakterielle prøvefortynder, og lad overførselspipetten blive i røret. b Fast afføring: Tilsæt 0,3 g (ca. 6 mm i diameter) ved brug af en applikatorpind. Afføringen skal emulgeres i den bakterielle prøvefortynder, og der skal anbringes en overførselspipette i røret. c Afføring i Cary Blairs transportmedium skal tilsættes direkte i mikrobrønden uden yderligere fortynding. d Brug en hvirvelmikser til suspension af afføringen. 3 GÅ TIL TRIN 8.2 B Bouillonmetode 1 Pod 50 µl eller 50 µg (størrelse som en lille ært) frisk afføring eller afføring i Cary Blairs transportmedium i 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB), modificeret Tryptic Soy Broth (mtsb) eller MacConkey Broth. 2 Inkuber ved 37 C i 18-24 timer. 3 Tilsæt 0,6 ml bakteriel prøvediluent til et rent 12 x 75 mm rør. 4 Overfør 0,3 ml bouillonkultur til 0,6 ml bakteriel prøvediluent ved hjælp af en overførselspipette. Lad overførselspipetten blive i røret. 5 GÅ TIL TRIN 8.2 8.2 Åbn folieposen, tag det ønskede antal mikropladestrimler ud, og sæt dem i en holder til mikropladestrimler. Brug én brønd til den negative kontrol og én til den positive kontrol. Hvis der anvendes

mindre end 8 brønde, skal det nødvendige antal brønde brækkes af en strimmel. Læg de ubrugte brønde i folieposen med tørremiddel. LUK POSEN OMHYGGELIGT FOR AT HINDRE FUGT, OG LÆG DEN TILBAGE I KØLESKABET. 8.3 Tilsæt 4 dråber (200 µl) negativ kontrol til brønd A1. Tilsæt 4 dråber (200 µl) positiv kontrol til brønd B1. 8.4 Tilsæt ved brug af en overførselspipette 4 dråber (200 µl) fortyndet prøve eller ufortyndet afføring i Cary Blairs transportmedium til hver brønd. Bemærk: Anbring overførselspipettens åbning et lille stykke inde i brøndene for at undgå at stænke i tilstødende brønde. 8.5 Dæk mikropladen og inkubér ved stuetemperatur (20-25 C) i 60 minutter. Start tidtagningen efter tilsætning af sidste prøve. 8.6 Ryst eller aspirér indholdet ud af brøndene. Vask brøndene ved at fylde hver brønd med fortyndet vaskebuffer (~350-400 µl/ brønd). Ryst eller aspirér al væske ud af brøndene efter hver vask. Brøndene skal vaskes i alt 3 gange. Efter den sidste vask fjernes indholdet, og pladen aspireres eller bankes på rene papirhåndklæder. Fjern så meget vaskebuffer som muligt, men lad ikke brøndene tørre ud på noget tidspunkt. 8.7 Tilsæt 4 dråber (200 µl) enzymkonjugat til hver brønd. 8.8 Dæk mikropladen og inkubér ved stuetemperatur (20-25 C) i 30 minutter. 8.9 Udryst eller aspirér og vask hver brønd 5 gange som i Trin 8,6. 8.10 Tilsæt 4 dråber (200 µl) farvestof til hver brønd. 8.11 Dæk mikropladen og inkubér ved stuetemperatur (20-25 C) i 10 minutter. 8.12 Tilsæt 1 dråbe (50 µl) stopopløsning til hver brønd. Knips forsigtigt på brøndene, eller brug en hvirvelmikser, indtil den gule farve er ensartet. Aflæs reaktionerne inden for 10 minutter efter tilsætning af stopopløsningen. 8.13 Aflæs visuelt eller med spektrofotometer ved 450 nm (én bølgelængde) eller 450/620 til 650 nm (to bølgelængder). 9 KVALITETSKONTROL Positiv og negativ kontrol skal gennemføres, hver gang testen udføres. De positive og negative kontroller fungerer som både reagens- og procedurekontroller. Hensigten med kontrollerne er at monitorere for væsentlige reagensfejl. Den positive kontrol vil ikke sikre nøjagtighed ved assay-cut-off. Den optiske densitet (O.D.) af den negative kontrol skal være < 0,100 ved 450 nm eller < 0,070 ved 450/620 til 650 nm. Den negative kontrol skal være farveløs ved visuel aflæsning. Hvis der i den negative kontrol er gul farve svarende til 1+ eller mere på procedurekortet, skal testen gentages med stor omhyggelighed ved vaskeproceduren. Den positive kontrols O.D. skal være > 0,500 ved 450 nm eller 450/620 til 650 nm, og den skal være lig med eller større end 2+ reaktionen ved visuel aflæsning. Hvis den gule farve i den positive kontrol er svagere end 2+ på procedurekortet, skal teknisk assistance tilkaldes. 10 RESULTATER Se vedlagte procedurekort vedrørende tolkning af farver. VISUEL 10.1 Aflæs testresultaterne ved at sammenligne med reaktionsfarverne på procedurekortet. Positiv: gul farve med mindst 1+ intensitet. Negativ: farveløs. Ubestemmelig: svag gul farve, mindre end 1+ reaktionen. 10.2 Tolkning af visuelle resultater: Positiv: Hvis der udvikles gul farve med mindst 1+ intensitet i prøvebrønden, indeholder prøven Stx1 eller Stx2 eller begge, og testen er positiv. Negativ: En farveløs reaktion er et negativt resultat og indikerer, at der ikke er Stx1 eller Stx2 i den testede prøve, eller at niveauet for toksin i prøven er for lavt til at kunne påvises. Ubestemmelig: Hvis der udvikles en svag gul farve, der er mindre end 1+ reaktionen, er prøven ubestemmelig. Ved ubestemmeligt resultat skal analysen gentages. Hvis resultatet ved gentagelse af analysen er positivt, er prøven positiv. Hvis resultatet ved gentagelse af analysen er negativt, er prøven negativ. Hvis resultatet ved gentagelse af analysen stadig er ubestemmeligt, skal der skaffes og analyseres endnu en prøve. 3 SPEKTROFOTOMETRI 10.3 Aflæs resultaterne ved én (450 nm) eller to (450/620 til 650 nm) bølgelængder. 10.4 Aflæs testresultaterne: A. Én bølgelængde Positiv: O.D. > 0,150 Negativ: O.D. < 0,100 Ubestemmelig: O.D. 0,100-0,150. B. To bølgelængder Positiv: O.D. > 0,100 Negativ: O.D. < 0,070 Ubestemmelig: O.D. 0,070-0,100 10.5 Tolkning af spektrofotometriske resultater: Positiv: En O.D. aflæsning, der er større end 0,150 (én bølgelængde) eller større end 0,100 (to bølgelængder), er positiv og indikerer tilstedeværelse af Stx1 og/eller Stx2. Negativ: En O.D. aflæsning, der er mindre end 0,100 (én bølgelængde) eller mindre end 0,070 (to bølgelængder), er et negativt resultat og indikerer, at der ikke er Stx1 eller Stx2 eller begge i prøven, eller at toksinniveauet i den målte prøve er for lavt til at kunne påvises. Ubestemmelig: O.D. aflæsninger på 0,100-0,150 (én bølgelængde) eller 0,070-0,100 (to bølgelængder) er ubestemmelige. Ved ubestemmeligt resultat skal analysen gentages. Hvis resultatet ved gentagelse af analysen er positivt, er prøven positiv. Hvis resultatet ved gentagelse af analysen er negativt, er prøven negativ. Hvis resultatet ved gentagelse af analysen stadig er ubestemmeligt, skal der skaffes og analyseres endnu en prøve. Bemærk: Brønde, der måtte være visuelt klare, men giver en O.D. aflæsning, der ikke stemmer med den visuelle tolkning, skal betragtes som en afvigelse og undersøges for forekomsten af bobler, småpartikler i brønden eller en uigennemsigtig film på brøndens bund. Filmen kan fjernes ved at aftørre undersiden af brønden, hvorefter O.D. skal aflæses igen. Hvis afvigelsen mellem visuel aflæsning og O.D. aflæsning varer ved, skal testen gentages. 11 TESTENS BEGRÆNSNINGER Gyldigheden af de resultater, der opnås med ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay afhænger af, at kontrolreaktionen finder sted som ventet. Se Kvalitetskontrol, afsnit 9. Et negativt testresultat udelukker ikke muligheden for tilstedeværelse af Shiga toksiner og kan forekomme, når antigenniveauet i prøven er under testens niveau for påvisning. Korrelation mellem mængden af antigen i en prøve og den kliniske præsentation er ikke blevet påvist. Som det gælder for alle IN VITRO diagnostiske tests, skal resultaterne tolkes af klinikeren sammen med kliniske fund og/eller andre laboratorieresultater. Korrekt indsamling og håndtering af prøver er af afgørende betydning for at opnå optimal assay-ydelse. Optimale testresultater opnås med prøver, der testes så hurtigt efter indsamlingen som muligt. Se Indsamling af fæcesprøver afsnit 7. ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay er klassificeret som meget kompleks. 12 FORVENTEDE VÆRDIER Mindst 50 forskellige serotyper af Shiga toksinproducerende E. coli (STEC) er blevet forbundet med produktion af cytotoksiner og udvikling af livstruende hæmoragisk colitis og hæmolytisk uræmisk syndrom (HUS) - en væsentlig komplikation, der fører til nyresvigt, thrombocytopeni og anæmi. Skønt små børn er i høj risiko for at udvikle HUS som resultat af en Shiga toksinproducerende E. coli infektion, kan andre udvalgte underpolulationer også være udsat for risiko fra en STEC infektion, det gælder f.eks. ældre og immunsvækkede patienter. Som det ses af resultaterne i kliniske forsøg med ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay var der en række forskellige serotyper til stede i den testede population. Testning for STEC infektioner må ikke begrænses til tests, der er specifikke for O157:H7 alene. Det bør også bemærkes, at der ikke altid er en direkte korrelation mellem resultaterne af direkte testning og bouillonberiget testning. Dette kan skyldes, men er ikke begrænset til, følgende: a.) toksin kan være til stede i afføringen på et niveau, der kan påvises, men STEC celler er ikke længere levedygtige nok til at kunne kultiveres, b.) isolerede E. coli O157 stammer fra afføringskultur fra patienter er inverst relateret til intervallet mellem starten af diarré og den mikrobiologiske kultur 17, c.) toksin kan være til

stede i afføringen på et niveau, der ikke kan påvises af assayet, men der kan stadig være STEC celler, der er levedygtige nok til kultivering og d.) antimikrobiel behandling kan påvirke muligheden for at kultivere STEC celler. 13 PRÆSTATIONSKARAKTERISTIKA SENSITIVITET OG SPECIFICITET ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay blev evalueret i tre geografisk adskilte kliniske institutioner i USA, Canada og Tyskland. Det skete på et storbyhospital i Virginia, USA, et børnehospital i Toronto, Canada, og en stor mikrobiologiinstitution i Tyskland. Patientpopulationerne, som var repræsenteret i prøvemængden, var symptomatiske patienter i voksne og pædiatriske populationer med normal prævalens. Prøverne blev indsendt ukonserverede og blev testet i ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay som friske prøver og som berigede kulturer dagen efter. Alle prøver blev også testet med et cytotoksin-assay (CTA) for tilstedeværelsen af Shiga toksiner. Shiga toksin positive prøver blev isoleret og serotypet (se Tabel 3). Der blev anvendt Polymerase Chain Reaction (PCR) forstærknings-assay alene til undersøgelsesformål for tilstedeværelse af Shiga toksin-genet på alle positive og afvigende resultater. Resultaterne fra de enkelte testinstitutioner vises i Tabel 1 og 2. I direkte test-metoden var der 20 positive prøver (EIA+, CTA+, PCR+). Der var 3 EIA-, CTA+, PCR+ prøver. Der var 5 EIA+, CTA-, PCR- prøver. Alle ubestemmelige resultater blev afklaret som sand negative. 354 prøver var negative ifølge begge metoder (EIA-, CTA-). De samlede indledende og afklarede resultater for ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay vises herunder i Tabel 1. Tabel 1. ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay sammenlignet med et cytotoksin-assay ved direkte afføringsprøver. Direkte prøvetestning Indledende resultater Afklarede resultater* 1 + - Ind. + - Ind. + 12 2 0 + 12 2 0-1 156 4-1 161 0 Ind. 0 1 0 Ind. 0 0 0 Totalt for prøver: 176 176 Sensitivitet: 92,3% 92,3% Specificitet: 98,7% 98,7% 2 + - Ind. + - Ind. + 8 3 0 + 8 3 0-2 186 6-2 193 0 Ind. 0 0 1 Ind. 0 0 0 Totalt for prøver: 206 206 Sensitivitet: 80,0% 80,0% Specificitet: 98,4% 98,5% Kombineret + - Ind. + - Ind. + 20 5 0 + 20 5 0-3 342 10-3 354 0 Ind. 0 1 1 Ind. 0 0 0 Totalt for prøver: 382 382 Sensitivitet: 87,0% (66,4-97,2) 87,0% (66,4-97,2) Specificitet: 98,6% (96,7-99,5) 98,6% (96,6-99,5) Korrelation: 95,0% (92,3-97,0) 97,9% (95,9-99,1) Tal i parentes er 95% konfidensintervaller. *Tabellen for afklarede resultater viser resultaterne for gentagen EIAtestning på prøver, der indledningsvis var ubestemmelige. Som vist i Tabel 1 er der 97,9% korrelation ved metoden med direkte prøvetestning for afklarede data mellem ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay og cytotoksin-assayet, når resultaterne fra begge institutioner kombineres. I metoden med bouillonberiget kultur var der 63 positive prøver (EIA+, CTA+, PCR+). Der var 3 EIA-, CTA+, PCR- prøver. Ved gentagen CTAtestning blev 2 af 3 afklaret som sand negative. Der var 10 EIA+, CTA-, PCR- prøver. Alle ubestemmelige resultater blev afklaret som sand negative efter gentagen testning. 771 prøver var negative ifølge begge metoder (EIA-, CTA-). De samlede indledende og afklarede resultater for ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay vises herunder i Tabel 2. Tabel 2. ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay sammenlignet med et cytotoksin-assay ved bouillonberiget kultur -prøver. Bouillonberigede kulturer Indledende resultater Afklarede resultater* 1 + - Ind. + - Ind. + 12 1 0 + 12 1 0-0 160 3-0 163 0 Totalt for prøver: 176 176 Sensitivitet: 100% 100% Specificitet: 99,4% 99,4% 2 + - Ind. + - Ind. + 9 0 0 + 9 0 0-1 192 4-1 196 0 Totalt for prøver: 206 206 Sensitivitet: 90,0% 90,0% Specificitet: 100% 100% 3 + - Ind. + - Ind. + 42 9 0 + 42 9 0-2** 410 0-0 412 0 Totalt for prøver: 463 463 Sensitivitet: 95,5% 100% Specificitet: 97,9% 97,9% Kombineret + - Ind. + - Ind. + 63 10 0 + 63 10 0-3 762 7-1 771 0 Totalt for prøver: 845 845 Sensitivitet: 95,5% (87,3-99,1) 98,4% (91,6-100) Specificitet: 98,7% (97,6-99,4) 98,7% (97,7-99,4) Korrelation: 97,6% (96,4-98,5) 98,7% (97,7-99,3) Tal i parentes er 95% konfidensintervaller. *Tabellen for afklarede resultater viser resultaterne for gentagen EIAtestning på prøver, der indledningsvis var ubestemmelige. ** Bemærk, at i undersøgelses-institution 3 var der 2 indledende CTA falsk positive resultater, der blev negative ved gentagen CTA-testning. Som vist i Tabel 2 var der 98,7% korrelation ved metoden med bouillonberiget kultur for afklarede data mellem ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay og cytotoksin-assayet, når resultaterne fra alle institutioner blev kombineret. Forskellige serotyper af Shiga toksinproducerende E. coli stammer er blevet testet i ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay og konstateret reaktive enten ved direkte afføringstestning eller ved bouillonberiget testning. Herunder vises en liste over testede serotyper, antallet af serotypespecifikke prøver og typen af produceret toksin for hver enkelt stamme, hvor dette er kendt. 4

Tabel 3. Antal forskellige serotyper af Shiga toksinproducerende E. coli stammer, der blev isoleret fra positive prøver. Serotype Antal isolerede stammer Serotyper Stx1 Stx2 Stx1&2 Stx2c Ukendt I alt O8:H9 1 1 O26:H11 7 2 1 3 13 O30 1 1 O88:H5 1 1 O91 2 1 3 O103:H2 1 1 O111:NM 2 1 3 O118 2 2 O128 2 2 O145 1 1 2 O153:H2 1 1 2 O157:H7 7 9 2 18 O166 1 1 Toksintyper i alt 19 16 10 2 3 50 Tabel 4. Shiga toksin-positive tests ifølge afføringskonsistens Afføringskonsistens Vandig Blød Slimet Vandig/ Blød/ Blodig slimet slimet Antal afføringer 119 134 41 17 50 30 Shiga toksin + 8 5 5 0 2 7 Cytotoksin + 10 5 5 1 3 7 ANALYTISK SENSITIVITET ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay påviser ca. 52 pg/ml Stx1 og 126 pg/ml Stx2. REPRODUCERBARHED Inter-assay eller kørsel-til-kørsel koefficienten for variation (CV) for ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay blev vurderet ved at vælge én negativ og tre positive prøver med varierende aflæst optisk densitet. Hver prøve blev analyseret i 24 brønde/kørsel i tre på hinanden følgende kørsler. Den gennemsnitlige inter-assay CV var 8,69%. Prøve Gennemsnitlig O.D. Standardafvigelse %CV 1 0,065 0,0101 15,61% 2 0,264 0,0176 6,67% 3 0,675 0,0270 4,00% 4 0,830 0,0703 8,48% Intra-assay eller inden-for-kørsel CV blev evalueret ved at teste 24 brønde med hver 4 prøver. Den gennemsnitlige intra-assay CV var 4,59%. Prøve Gennemsnitlig O.D. Standardafvigelse %CV 1 0,069 0,0055 8,01% 2 0,274 0,0134 4,90% 3 0,563 0,1490 2,65% 4 1,226 0,0340 2,78% KRYDSREAKTIVITET Der var ingen krydsreaktion, når et bredt udvalg af organismer fra den menneskelige tarms mikroflora blev analyseret med ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) Microplate Assay. Analyserne blev udført ved at pode de herunder nævnte organismer i Shiga toksin-negativ og -positiv afføring. Bakterier blev podet i koncentrationer > 1 x 10 7 CFU/ml afføring. Ikke Shiga toksinproducerende E. coli patogene stammer (EPEC, ETEC, EIEC) blev også testet i ProSpecT assayet og var negative. Campylobacter jejuni ATCC 29428 Citrobacter braakii ATCC 43162 Enterobacter cloacae ATCC 13047 Escherichia coli ATCC 33660 Escherichia coli, EIEC, ATCC 43893 (O124:NM) Escherichia coli, EPEC, ATCC 12014 (O55:NM) Escherichia coli, EPEC, ATCC 33780 (O111:NM) Escherichia coli, ETEC/EPEC, ATCC 43887 (O111:NM) Escherichia coli, VT negative, ATCC 25922 Enterococcus faecalis ATCC 49149 Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 Proteus vulgarus, ATCC 33420 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella typhimurium, SA972229 Serratia liquefacians ATCC 27592 Shigella dysenteriae ATCC 49347 Shigella flexneri ATCC 25929 Shigella sonnei, ATCC 25931 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Yersinia enterocolitica ATCC 23715 14 LITTERATURLISTE 1. Johnson, W.M., H. Lior, and G.S. Bezanson, 1983. Cytotoxic Escherichia coli O157:H7 Associated with Haemorrhagic Colitis in Canada. Lancet pp. 76. 2. Karmali, M.A., B.T. Steele, M. Petric, and C. Lim, 1983. Sporadic Cases of Haemolytic Uraemic Syndrome Associated with Faecal Cytotoxin and Cytotoxin-Producing Escherichia coli. Lancet pp.619-620. 3. Karmali, M.A., M. Petric, C. Lim, P.C. Fleming, G.S. Arbus, and H. Lior, 1985. The Association Between Haemolytic Uraemic Syndrome and Infection by Verotoxin-Producing Escherichia coli. J. Infect. Dis. 151(5): 775-782. 4. Karmali, M.B., 1987. Laboratory Diagnosis of Verotoxin-Producing Escherichia coli Infections. Clin. Microbiol. Newsletter. 9(9): 65-70. 5. Kleanthous, H., H.R. Smith, S. M. Scotland, R.J. Gross, B. Rowe, C. M. Taylor, and D.V. Milford. 1990. Haemolytic uraemic syndrome in the British Isles, 1985-8: association with Verocytotoxin producing Escherichia coli. Part 2. Microbiological aspects. Am. J. Dis. Child. 65:722-727. 6. Konowalchuk, J., I. Speirs, and S. Stavric. 1977. Vero Response to a Cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18(3): 775-779. 7. Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs. 1978, Properties of an Escherichia coli Cytotoxin. Infect. Immun. 20: 575-577. 8. Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs, 1978. Comparative Studies of Five Heat-labile Toxic Products of Escherichia coli. Infect. Immun. 22:644-648. 9. O Brien, A.D., G.D. LaVeck, M.R. Thompson, and S.B. Formal, 1982. Production of Shigella dysenteriae type 1-like Cytotoxin by Escherichia coli. J. Infect. Dis. 144(6):763-769. 10. O Brien, A.D., T.A. Lively, M.E. Chen, S.W. Rothman, and S.B. Formal, 1983. Escherichia coli O157:H7 Strains Associated with Haemorrhagic Colitis in the United States Produce a Shigella dysenteriae I (Shiga)-like Cytotoxin. Lancet pp.702. 11. O Brien, A.D. and R.K. Holmes. 1987. Shiga and Shiga-like Toxins. Microbiol. Rev. 51(2): 206-220. 12. Pai, C.H., R. Gordon, H.Y. Sims, and L.E. Bryan, 1984. Sporadic Cases of Haemorrhagic Colitis Associated with Escherichia coli O157:H7. Ann. Intern. Med. 101: 738-742. 13. Pai, C. H., N. Ahmed, H. Lior, W.M, Johnson, H.V. Sims, and D.E. Woods, 1988. Epidemiology of Sporadic Diarrhea Due to Verocytotoxin-Producing Escherichia coli; A Two-year Prospective Study. J. Infect. Dis. 157(5):1054-1057. 14. Riley, L.W., R.S. Remis, S.D. Helgerson, H.B. McGee, J.G. Wells, B.R. Davis, R.J. Hebert, E.S. Olcott, L.M. Johnson, N.T. Hargrett, P.A. Blake, and M.L. Cohen, 1983. Haemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype. N. Engl. J. Med. 308(12): 681-685. 15. Scotland, S.M., H.R. Smith, and B. Rowe, 1985. Two Distinct Toxins Active on Vero Cells from Escherichia coli O157. Lancet. pp.885-886. 16. Strockbine, N., L. Marques, J. Newland, H. Williams Smith, R.K. Holmes, and A.D. O Brien, 1986. Two Toxin-Producing Phages from Escherichia coli O157:H7 Strain 933 Encode Antigenically Distinct Toxins with Similar Biologic Activities. Infect. Immun. 53(1):135-140. 17. Karch, H., et al., 1996. Isolation of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157 Strains from Patients with Haemolytic-Uraemic Syndrome by Using Immunomagnetic Separation, DNA-Based Methods, and Direct Culture. JCM, March 1996, 34(3):516-519. 5

ProSpecT TM er et registreret varemærke. ATCC er et registreret varemærke tilhørende American Type Culture Collection Oxoid Ltd Wade Road Basingstoke Hants, RG24 8PW UK For teknisk assistance kontakt den lokale distributør. IFU X7594, revideret 27. oktober 2008 Trykt i Storbritannien 6