Mercodia Adiponectin ELISA

Mercodia Adiponectin ELISA Brugsanvisning 10-1193-01 REAGENSER TIL 96 BESTEMMELSER Til in vitro diagnostisk brug Regulerende status i USA: Kun til forskningsbrug Ikke til brug til diagnostiske procedurer. Fremstillet af Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE-754 50 Uppsala, Sverige

FORKLARING AF SYMBOLER, DER ANVENDES PÅ ETIKETTER = 96 Reagenser til 96 analyser Udløbsdato Opbevar ved 2-8 C Lotnr. Til in vitro diagnostisk brug Mercodia 2009, 2011

TILSIGTET BRUG Mercodia Adiponectin ELISA er en metode til kvantitativ bestemmelse af humant adiponectin i serum eller plasma. RESUMÉ OG FORKLARING AF ANALYSEN Adiponectin kaldes også Acrp30 (30 kda adipocyte complement-related protein), GBP28 (Gelatin-binding protein), adipoq, apm1 (Adipose most abundant gene transcript 1) [1, 2]. Adiponectin er et adipocytsecerneret hormon, der består af 244 aminosyrer med en molekylvægt på ca. 30 kda (28-30 kda). Det er et af de mest talrige proteiner i humant blod med cirkulerende koncentrationer på 0.5-30 μg/ml, hvilket udgør ca. 0.01 % af totalt plasmaprotein [2]. Proteinet består af fire domæner: én globulær C-terminal, én kollagenlignende N-terminal, ét signalpeptid og ét hypervariabelt domæne. Det globulære domæne har signifikante ligheder i sekvens og struktur med komplementfaktoren C1q [2,3]. Det globulære domæne har også strukturelle ligheder med TNF-α [3-5]. Adiponectin-koncentrationer er omvendt forbundet med type 2-diabetes, koronararteriesygdom og obesitas, som til sammen kaldes det metaboliske syndrom. Adiponectin nedsætter serumkoncentrationerne af blodglukose og frie fedtsyrer og forøger insulinfølsomheden [7]. Adiponectin har også vist sig at have antiinflammatoriske effekter [2]. Det er blevet antydet, at adiponectin findes i forskellige former i kredsløbet: monomerer, isolerede globulære former (de globulære domæner), trimerer, hexamerer og større oligomerer [8-11]. Monomerer menes at samles i kredsløbet til trimerer via de globulære domæner. Trimerer samles til større oligomerer via det kollagenlignende domæne [7]. Nyere undersøgelser indikerer imidlertid, at adiponectin muligvis ikke er til stede i kredsløbet som monomerer eller isolerede globulære former, men snarere i multimere strukturer. Undersøgelserne har vist, at de dominerende former af adiponectin, der cirkulerer i humant blod, er hexamerer (LMW) og større oligomerer (HMW) [6, 12-14]. Niveauerne af LMW-adiponectin synes ikke at være forskellig mellem insulinfølsomme og insulinresistente personer, ej heller er der forskel i LMW-adiponectin mellem mænd og kvinder. De forhøjede niveauer af total adiponectin hos insulinfølsomme personer og kvinder skyldtes forøgede mængder af HMW-adiponectin. Både total og HMW-adiponectin viste signifikante forskelle mellem de insulinfølsomme og insulinresistente personer ifølge Lara-Castro et al. 2006 [6]. Adskillige isoformer af adiponectin cirkulerer i blodet. Det mangler stadigt at blive fastlagt, om alle isoformer secerneres af adipocytterne, om der finder en posttranskriptionel samling af HMW-adiponectin sted i blodet, eller om HMW-formen secerneres og degraderes i blodet. Den individuelle metaboliske betydning af hver isoform af adiponectin er endvidere fortsat uklar [6]. 3

PRINCIP FOR PROCEDUREN Mercodia Adiponectin ELISA er en fastfase-enzymimmunanalyse og er baseret på sandwichteknikken, hvor to monoklonale antistoffer er rettet mod separate antigene determinanter på adiponectin-molekylet. Under inkubation reagerer adiponectin i prøven med anti-adiponectinantistoffer, der er bundet til mikrotiterpladebrønde. Efter vask tilsættes peroxidasekonjugerede anti-adiponectin-antistoffer, og efter den anden inkubation og et simpelt vasketrin, der fjerner ubundet enzymmærket antistof, detekteres bundet konjugat ved hjælp af reaktion med 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (TMB). Reaktionen stoppes ved tilsætning af syre til opnåelse af et kolorimetrisk slutpunkt, der aflæses spektrofotometrisk. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro diagnostisk brug. I USA: Kun til forskningsbrug. Ikke til brug til diagnostiske procedurer. Indholdet i dette kit og rester deraf må ikke komme i kontakt med drøvtyggende dyr eller svin. Stop Solution i dette kit indeholder 0.5 M H 2 SO 4. Overhold almindelige forholdsregle for håndtering af farlige kemikalier. Alle patientprøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Pipetter til 20, 25, 50, 100, 200 og 1000 μl (repetitionspipetter foretrækkes til tilsning af enzyme conjugate 1X-opløsning, Substrate TMB og Stop Solution) Bægerglas og målebægre til klargøring af reagenser Redestilleret vand Mikropladeaflæser (450 nm filter) Rystebord (den anbefalede hastighed er 700-900 rpm, orbital bevægelse) Vaskeanordning til mikroplade 4

REAGENSER Hvert Mercodia Adiponectin ELISA-kit (10-1193-01) indeholder reagenser til 96 brønde, hvilket er tilstrækkeligt til 42 prøver og én kalibratorkurve in duplo. Til større analyseserier bruges puljede reagenser fra pakker med samme lotnummer. Udløbsdatoen for hele kittet er angivet på den yderste etiket. Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2-8 C. Coated Plate 1 plade 96 brønde Klar til brug Murint monoklonalt antihumant adiponectin Strimler med 8 brønde Ved ubrugte mikrotiterpladestrimler skal posen genforsegles med klæbebånd, opbevares ved 2-8 C og bruges inden for 8 uger. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 hætteglas 1000 µl Klar til brug Rekombinant humant adiponectin Farvekodet gul Koncentration angivet på hætteglassets etiket. Calibrator 0 1 hætteglas 5 ml Klar til brug Farvekodet gul Assay Buffer 1 hætteglas 12 ml Klar til brug Farvekodet rød Sample Buffer 2X 1 flaske 50 ml Fortynd med 50 ml Farvekodet gul redestilleret vand til Opbevaring efter fortynding: 2-8 C i 8 uger. fremstilling af sample buffer 1X-opløsning. Enzyme Conjugate 11X 1 hætteglas 1.3 ml Klargøring, Peroxidasekonjugeret murint monoklonalt antihumant adiponectin se nedenfor Enzyme Conjugate Buffer 1 hætteglas 13 ml Klar til brug Farvekodet blå Wash Buffer 21X 1 flaske 50 ml Fortynd med 1000 ml Opbevaring efter fortynding: redestilleret vand til 2-8 C i 8 uger. fremstilling af wash buffer 1X-opløsning. Substrate TMB 1 flaske 22 ml Klar til brug Farveløs opløsning Obs! Lysfølsom! Stop Solution 1 hætteglas 7 ml Klar til brug 0.5 M H 2 SO 4 5

Klargøring af enzyme conjugate 1X-opløsning Klargør den påkrævede mængde enzyme conjugate 1X-opløsning ved at fortynde Enzyme Conjugate 11X (1+10) i Enzyme Conjugate Buffer i henhold til nedenstående tabel. Bland forsigtigt. Ved klargøring af enzyme conjugate 1X-opløsning til hele pladen, eller hvis reagenserne skal anvendes inden for 8 uger, hældes alt Enzyme Conjugate Buffer i Enzyme Conjugate 11X-hætteglasset. Antal strimler 12 strimler 6 strimler 4 strimler Enzyme Conjugate 11X 1 hætteglas 600 μl 400 μl Enzyme Conjugate Buffer 1 hætteglas 6.0 ml 4.0 ml Opbevaring efter fortynding: 2-8 C i 8 uger. UDTAGNING OG HÅNDTERING AF PRØVER Serum Udtag blod ved hjælp af venepunktur, og lad det koagulere. Separér serummet ved hjælp af centrifugering ved 4 300 g i 15 minutter ved 2-8 C. Prøverne kan opbevares ved 2-8 C i op til 14 dage. Længere opbevaring skal ske ved -20 C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Plasma Udtag blod ved hjælp af venepunktur i rør, der indeholder heparin, citrat eller EDTA som antikoagulant, og separér plasmafraktionen. Prøverne kan opbevares ved 2-8 C i op til 14 dage. Længere opbevaring skal ske ved -20 C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. KLARGØRING AF PRØVER Prøver skal fortyndes 1/101 v/v med sample buffer 1X-opløsning (20 μl prøve + 2.0 ml sample buffer 1X-opløsning). Fortyndede prøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 14 dage. Obs! Buffere, der indeholder natriumazid (NaN 3 ), kan ikke anvendes til prøvefortynding. 6

TESTPROCEDURE Alle reagenser og prøver skal bringes til stuetemperatur før brug. Lav en kalibratorkurve for hver analysekørsel. 1. Klargør enzyme conjugate 1X-opløsning (ifølge tabellen på foregående side), sample buffer 1X-opløsning, wash buffer 1X-opløsning og prøver. 2. Klargør tilstrækkeligt med mikropladebrønde til Calibrators og prøver in duplo. 3. Pipettér 25 µl af hver af Calibrators og prøver i de relevante brønde. 4. Tilsæt 100 µl Assay Buffer i hver brønd. 5. Inkubér på et rystebord (700-900 rpm) i 1 time ved stuetemperatur (18-25 C). 6. Vask 6 gange med 700 μl wash buffer 1X-opløsning pr. brønd ved brug af en automatisk plade vasker med overflow-vaskefunktion. Efter den sidste vask vendes pladen om og bankes mod absorberende papir. Benyt ikke iblødlægning i vaskeproceduren. Eller manuelt, fjern reaktionsvolumenet ved at vende mikropladen på hovedet over en vask. Tilsæt 350 μl wash buffer 1X-opløsning til hver brønd. Hæld wash buffer 1X-opløsningen ud og bank adskillige gange mod absorberende papir for at fjerne overskydende væske. Gentag 5 gange. Undgå længerevarende iblødlægning under vaskeproceduren. 7. Tilsæt 100 µl enzyme conjugate 1X-opløsning i hver brønd. 8. Inkubér på et rystebord (700-900 rpm) i 1 time ved stuetemperatur (18-25 C). 9. Vask som beskrevet under pkt. 6. 10. Tilsæt 200 µl Substrate TMB i hver brønd. 11. Inkubér i 15 minutter ved stuetemperatur (18-25 C). 12. Tilsæt 50 µl Stop Solution i hver brønd. Placér pladen på rystebordet i ca. 5 sekunder for at sikre opblanding. 13. Aflæs optisk densitet ved 450 nm, og beregn resultaterne. Aflæs inden for 30 minutter. Obs! For at forhindre kontaminering mellem konjugatet og substratet anbefales det at anvende separate pipetter. INTERN KVALITETSKONTROL Kommercielle kontroller, som f.eks. Mercodia Obesity Control kit (10-1241-01), og/eller interne serumpuljer med lave, mellem og høje adiponectin-koncentrationer skal analyseres rutinemæssigt som prøver og resultaterne kortlægges fra dag til dag. Det er god laboratoriepraksis at registrere følgende data for hver analyse: kittets lotnummer, fortyndings- og/eller rekonstitutionsdatoer for kittets komponenter, OD-værdier for den blanke, Calibrators og kontroller. 7

0,01 BEREGNING AF RESULTATER Computerbaseret beregning Koncentrationen af adiponectin opnås ved hjælp af computerbaseret datareduktion af absorbansen for Calibrators 1-5 i forhold til koncentrationen ved brug af kubisk spline-regression. Manuel beregning 1. Indtegn absorbansværdierne, der er opnået for Calibrators 1-5, mod adiponectin koncentrationen på dobbeltlogaritmisk papir og konstruér en kalibratorkurve. 2. Aflæs koncentrationen for prøverne fra kalibratorkurven. 3. Gang koncentrationen med fortyndingsfaktoren. Eksempel på resultater Brønde Identitet A 450 Gennemsnitlig konc. ng/ml x101 μg/ml 1A B 1C D 1E F 1G H 2A B 2C D 2E F 2G H 3A B Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Calibrator 5* Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 0.059/0.056 0.106/0.102 0.207/0.216 0.563/0.559 1.477/1.567 2.602/2.681 0.374/0.367 0.754/0.758 1.385/1.373 29.825 67.178 133.340 3.012 6.785 13.467 *Nøjagtig koncentration angivet på hætteglassets etiket Eksempel på kalibratorkurve En typisk kalibratorkurve er vist her. Anvend ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyseresultater. 10 1 OD (450 nm) OD (450 nm) 0,1 1 10 100 1000 Koncentration Concentration (ng/ml) (ng/ml) 8

PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Som ved alle diagnostiske test må en definitiv diagnose ikke baseres på resultaterne af en enkelt test, men skal stilles af en læge efter en evaluering af alle kliniske fund. Stærkt lipemiske, ikteriske eller hæmolyserede prøver påvirker ikke analysen. FORVENTEDE VÆRDIER Det er god praksis, at hvert laboratorium fastlægger sine egne intervaller for forventede værdier. Mercodia Adiponectin ELISA detekterer LMW (hexamer 230 kda) og HMW (oligomer >420 kda) adiponectin, som bestemmes ved hjælp af størrelseseksklusions-gelkromatografi. De forskellige multimere former af endogent adiponectin blev undersøgt og separeret i serum fra en rask person ved hjælp af en tretrinsmetode: ammoniumsulfat-fældning, efterfulgt af ionbytnings- og gelfiltreringskromatografi. Ved ionbytningskromatografi binder proteiner til matrixen med elektrostatiske kræfter, hvilket medfører separering, da forskellige proteiner/isoformer har forskellige totale nettoladninger eller isoelektriske punkter. Den anvendte ionbytningssøjle var Mono Q 10/100GL (GE Healthcare). Triethanolaminbuffer blev anvendt til eluering af proteinerne. Isoformerne af adiponectin har vist sig at have forskellige isoelektriske punkter og posttranslationelle mønstre [15]. Prolinhydroxylering og lysinhydroxylering/glycosylering menes at have stor betydning for samlingen af oligomererne [12,15]. Der fremkom fem klart adskilte toppe ved separering af serum-adiponectin ved hjælp af ionbytningskromatografi, hvilket indikerer, at det analyserede serum-adiponectin repræsenterer mindst fem forskellige posttranslationelle mønstre, der giver forskellige isoelektriske punkter, se figur 1 nedenfor. Puljerne A-E blev yderligere analyseret ved hjælp af størrelseseksklusionsgelkromatografi til bestemmelse af den tilsyneladende størrelse af de multimere adiponectinformer. 500 Målt koncentration Measured concentration af adiponectin of Adiponectin (ng/ml) (ng/ml) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A B C D E Pool - Fraction number Fraktionsnummer Figur 1. Elueringsprofil for serum-adiponectin fra ionbytningskromatografi og identificeret ved hjælp af Mercodia Adiponectin ELISA. Topfraktionerne blev puljet til A, B, C, D og E. 9

Størrelseseksklusions-gelfiltreringskromatografi separerer proteiner efter tilsyneladende globulær størrelse. Den gelfiltreringssøjle, der blev anvendt, var HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare). PBS blev anvendt til eluering af proteinerne. Der blev påvist tre dominerende multimere former, når serum-adiponectin blev separeret ved hjælp af størrelseseksklusions-gelkromatografi, med tilsyneladende størrelser på henholdsvis 230 kda, 420 kda og > 600 kda. De blev fastlagt som LMW (hexamer 230 kda) og HMW (420 kda og >600 kda), se figur 2 nedenfor. 900 420kDa Målt koncentration Measured concentration af adiponectin of Adiponectin (ng/ml) (ng/ml) 800 700 600 500 400 300 200 100 >600kDa E Pool D C B A 230kDa 0 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 Fraktionsnummer Fraction number Figur 2. Elueringsprofil for serum-adiponectin fra størrelseseksklusions-gelfiltreringskromatografi og identificeret ved hjælp af Mercodia Adiponectin ELISA. Hver pulje (A,B, C, D og E) blev analyseret separat og samlet som én pulje (Pulje). Sammenfattende fremviste det analyserede serum-adiponectin tre dominerende multimere former på baggrund af størrelse, og fem forskellige former på baggrund af isoelektriske punkter eller totale nettoladninger. YDEEVNE Detektionsgrænse Detektionsgrænse defineres som detektionsevnen i henhold til ISO11843-Part 1. Detektionsevnen skal betragtes som en del af metodevalideringen snarere end den laveste målbare koncentration. Detektionsgrænsen er 1.25 (ng/ml) bestemt ved hjælp af metodikken, der er beskrevet i ISO11843- Part 4. Koncentrationen af prøver med en absorbans, der ligger under Calibrator 1, skal ikke beregnes, men istedet udtrykkes som mindre end eller lig med ( ) koncentrationen, der er angivet på hætteglasset med Calibrator 1. 10

Genfinding Genfinding efter tilsætning er 92-109% (gennemsnit 101%) Genfinding efter fortynding er 89-111% (gennemsnit 98%) Hook-effekt Der er ingen hook-effekt. Præcision 1,2 Hver prøve blev analyseret 4 gange ved 39 forskellige lejligheder. Analyserne blev udført på ét laboratorium med ét kitlot og af 4 teknikere. Prøve 1 2 3 Middelværdi ng/ml 29.7 65.9 130 1 ISO 5725-1, 2 EP-5A inden for analyse % 3.0 2.7 3.0 Variationskoefficient mellem analyser % 5.3 5.0 5.8 samlet analyse % 5.5 5.2 6.0 Reproducérbarhed 1,2 Hver prøve blev analyseret 4 gange ved 90 forskellige lejligheder. Analyserne blev udført på to laboratorier med 5 kitlots og af 9 teknikere. Prøve 1 2 3 Middelværdi ng/ml 30.2 67.3 139 1 ISO 5725-1, 2 EP-5A inden for analyse % 2.3 2.2 2.2 Variationskoefficient mellem analyser % 5.4 6.0 6.0 samlet analyse % 5.5 6.1 6.1 Specificitet Følgende krydsreaktioner er blevet påvist: C1q 0.007% TNF-α n.s 11

KALIBRERING Adiponectin ELISA er kalibreret mod et stærkt oprenset, fuldt valideret, kommercielt adiponectin-præparat. GARANTI Ydeevnedataene, der præsenteres her, blev opnået ved brug af den angivne fremgangsmåde. Enhver ændring eller modificering af fremgangsmåden, der ikke er anbefalet af Mercodia AB, kan påvirke resultaterne. I tilfælde heraf ophæver Mercodia AB alle garantier, det være sig udtrykkelige, underforståede eller lovbefalede, herunder den underforståede garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt formål. I et sådant tilfælde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distributører ikke drages til ansvar for indirekte skader eller følgeskader. REFERENCER [1] PDB, Protein Data Bank: www.expasy.org, adiponectin: Q 15848 (21 oct.2005) [2] Meier U and Gressner AM (2004) Endocrine Regulation of Energy Metabolism: Review of Pathobiochemical and Clinical Aspects of Leptin, Ghrelin, Adiponectin, and Resistin. Clin Chem 50:1511-1525 [3] Tsao TS, Lodish HF and Fruebis J (2002) ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose metabolism. Eur J Pharmacol 440:213-221 [4] Shapiro L and Scherer PE (1998) The crystal structure of a complement-1q family protein suggests an evolutionary link to tumor necrosis factor. Curr Biol 12:335-338 [5] Bobbert T, Rochlitz H, Wegewitz U, Akpulat S, Mai K, Weickert MO, Mohlig M, Pfeiffer AF and Spranger J (2005) Changes of adiponectin oligomer composition by moderate weight reduction. Diabetes 54:2712-2719 [6] Lara-Castro C, Luo N, Wallace P, Klein RL and Garvey T (2006) Adiponectin Multimeric Complexes and the Metabolic Syndrome Trait Cluster. Diabetes 55: 249-259 [7] Duntas LH, Popovic V and Panotopoulos G (2004) Adiponectin: Novelties in Metabolism and Hormonal Regulation. Nutr Neurosci 7:195-200 [8] Tsao TS, Lodish HF and Fruebis J (2002) ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose metabolism. J Biol Chem 50:50810-50817 [9] Nakashima R, Kamei N, Yamane K, Nakanishi S, Nakashima A and Kohno N (2006) Decreased Total and High Molecular Weight Adiponectin Are Independent Risk Factors for the Development of Type 2 Diabetes in Japanese-Americans. Clin Endocrinol Metab 91:3873-3877 [10] Hara K, Horikoshi M, Yamauchi T, Yago H, Miyazaki O, Ebinuma H, Imai Y, Nagai R, and Kadowaki T (2006) Measurement of the High-Molecular Weight Form of Adiponectin in Plasma Is Useful for the Prediction of Insulin Resistance and Metabolic Syndrome. Diabetes Care 29:1357-1362 [11] Nakano Y, Tobe T, Choi-Miura NH, Mazda T and Tomita M (1996) Isolation and Charactri- 12

zation of GBP28, a Novel Gelatin-Binding Protein Purified from Human Plasma. J Biol Chem 120:803-812 [12] Bodles AM, Banga A, Rasouli N, Ono F, Kern PA and Owens RJ (2006) Pioglitazone increases secretion of high-molecular-weight adiponectin from adipocytes. Am J Physiol Endocrinol Metab 291:E1100-E1105 [13] Halperin F, Beckman JA, Patti ME, Trujillo ME, Garvin M, Creager MA, Scherer PE and Goldfine AB (2005) The role of total and high-molecular-weight complex of adiponectin in vascular function in offspring whose partents both had type 2 diabetes. Diabetologia 48:2147-2154 [14] Fisher FF, Trujillo ME, Hanif W, Barnett AH, McTernan PG, Scherer PE, and Kumar S (2005) Serum high molecular weight complex of adiponectin correlates better with glucose tolerance than total serum adiponectin in Indo-Asian males. Diabetologia 48:1084-1087 [15] Wang Y, Lu G, Wong WP, Vliegenthart JF, Gerwig GJ, Lam KS, Cooper GJ and Xu A (2004) Proteomic and functional characterization of endogenous adiponectin purified from fetal bovine serum. Proteomics 4:3933-3942 13

SAMMENFATNINGSPROTOKOL Mercodia Adipnectin ELISA X-O Graf Tryckeri AB Tilsæt Calibrators og prøver 25 μl Tilsæt Assay Buffer 100 μl Inkubér Vask plade med wash buffer 1Xopløsning Tilsæt enzyme conjugate 1X-opløsning 1 time ved 18-25 C på et rystebord 6 gange 100 μl Inkubér Vask plade med wash buffer 1Xopløsning Tilsæt Substrate TMB 1 time ved 18-25 C på et rystebord 6 gange 200 μl Inkubér 15 minutter ved 18-25 C Tilsæt Stop Solution Avlæs A 450 50 μl Ryst i 5 sekunder for at sikre opblanding Evaluér resultater 31-3157 Version 4.0