BILAG 1: Standardkontrol i Human angiogenesis/growth Factor Magnetic Bead Panel 1

BILAG 1: Standardkontrol i Human angiogenesis/growth Factor Magnetic Bead Panel 1 I kittet indgår én standardkontrol (standard 7), som fortyndes i 7 koncentrationer. Nedenstående figur, viser koncentrationen for hver vækstfaktorer ved standard 1-7.

BILAG 2: Protokol for MyStromalCellTrial Formål: Isolation og opformering af mesenkymale stromale celler fra fedtvæv i en sådan kvalitet, at cellerne kan gives tilbage til patienten. Gyldighedsområde: Isolering og opformering af celler fra fedtvæv med henblik på tilbageførsel i patient efter differentiering af cellerne i retning af endothel. Isolering og opformering finder sted i Klinisk Immunologisk afdelings vævscenter, afsnit 2033.Er der tale om en placebopatient opformeres celler i afsnit 9302 efter laboratorieprotokol: 05.03.05.001 Placeboceller; Isolering og dyrkning af fedtvævsderiverede stromale celler. Generelt: Det har vist sig, at der i fedtvæv findes stamceller (fedtvævsderiverede stromale celler, ADSC), der tilsyneladende er identiske med mesenkymale stromale celler (MSC) fra knoglemarv. Udbyttet af stamceller fra fedtvæv er op til 500 gange større end udbyttet fra knoglemarv. Fedtvæv kan fås i relativt store mængder vha. en fedtsugning udført af en plastik-kirurg. De fedtvævsderiverede stromale celler synes at kunne stimuleres til at differentiere i de samme retninger som MSCer fra knoglemarv. I lokalanæstesi aspireres 150 ml fedtvæv fra abdomen med 4-6 stk. 60 ml sprøjter. Dette finder sted på afsnit 3004 på Rigshospitalet og foregår efter afdelingens procedurebeskrivelse. Fedtvævsaspiratet overføres til en kolbe. Der dannes 2 faser: en væskefase og en fedtvævsfase. De to faser tilsammen kaldes for fedtvævsapirat. Volumen af det totale fedtvævsaspirat samt fedtvævsfasen noteres på gældende version af bilag, dokumentnr. 05.03.01 Patientidentifikation. Samtidig dokumenterer lægen og sygeplejersken, der har forestået udtagningen af fedtvævsaspiratet, overensstemmelse mellem patientens navn og CPR-nr. og navn og CPR-nr. på etiketten, som er påklistret kolben. Derudover anføres der både dato og klokkeslæt for udtagningen. Personalet på Kardiologisk Stamcellelaboratorium (5-9640) modtager kolben med fedt aspirat sammen med det udfyldte bilag, dokumentnr. 05.03.01 Patientidentifikation. Fedtvævet består af modne adipocytter og en mononukleær cellefraktion, som kan isoleres fra fedtvæv vha. collagenasebaseret enzymatisk nedbrydning og differentialcentrifugering. Den mononukleære cellefraktion isoleres fra de umodne og modne adipocytter gennem et filtreringstrin. Collagenasen er calciumafhængig, og skal derfor opløses i en buffer indeholdende 2 mm Ca2+. Collagenasen nedbryder bindevævet, hvorved stamcellerne frigives fra vævet. Da collagenasen først er aktiv ved 37 C, foregår collagenasebehandlingen ved 37 C. For at opnå den bedste nedbrydning af vævet, kræves en enzymatisk aktivitet på 0,3 PZ-U/ml. Dvs. arbejdsopløsningen, som fortyndes 1+1, skal have en aktivitet på 0,6 PZ-U/ml. Den molekylærbiologiske forskning har påvist, at der eksisterer adskillige familier af angiogenetiske faktorer, der har betydning for dannelsen af nye blodkar. Her har specielt vascular endothelial growth factor (VEGF) vist sig at være meget vigtig for differentiering af stamceller i retning af endothel. Derfor stimuleres ADSC en uge med VEGF, før cellerne gives tilbage til patienten. Samtidig med udtagelse af fedtvæv udtages blodprøver til smittescreening. Blodprøverne sendes til Blodbanken 2034, Rigshospitalet til undersøgelse for HBV, HCV, HIV og syfilis. På tilbagegivelsesdagen tages fra patienten 2 blodprøver; henholdsvis et Heparin / EDTA glas ( grønt / lilla ) og et serumglas ( rødt ). Blodprøver hentes af personalet fra Kardiologisk stamcellelaboratorium på Kardiologisk Laboratorium 2012 rum 3, hvorefter det grønne/lilla glas afleveres i Vævscenteret, Blodbanken 2033, hvor det bruges til fremstilling af en eventuel placebosprøjte. Det røde glas afleveres på afsnit 9302, hvor det behandles efter protokol 05.03.05.005 Håndtering af rød blodprøve til cytokinanalyser.

Materialer: DMEM Low glucose 1 g/l med glutamin og 25 mm HEPES (PAA, Cat.No E15-808) Penicillin-streptomycin (1000 units/ml peniclllin G sodium, 10.000g/ml streptomycin sulfate) (GIBCO, Cat. No 15140-122) Føtal Bovin Serum, Pharma Grade Gamma Irradiated AUS Origin (PAA, Cat.No A15-512) Collagenase NB 6 GMP Grade (cat. no. 1745803, SERVA electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) o Fortyndes til arbejdsopløsning 0,6 PZ U/ml, med HBSS. Phosphate-buffered saline uden magnesium og kalcium (PBS) (Gibco, 10010-015) Serres sugesystem 50 ml Falcon-rør Celleskraber (TPP, vwr, cat. No. 99002) miniinkubator (Labnet, In Vitro) 100.m filter (Steriflip, cat. no SCNY00100, Millipore) Nucleocounter NC-100 (Chemometec, Allerød Denmark) PBS (Gibco ca. no. 10010-015) T 75 kulturflasker CO 2 inkubator Tryple Select (Gibco, cat. no. 12563029) Fremstilling af standarddyrkningsmedie (DMEM, 10 % FBS og 1 % pen-strep): 500 ml DMEM Low glucose 1 g/l med glutamin og 25 mm HEPES (PAA, Cat.No E15-808) tilsættes 5 ml penicillin-streptomycin (1000 units/ml peniclllin G sodium, 10000 g/ml streptomycin sulfate) (GIBCO, Cat. No 15140-122) og 50 ml Føtal Bovin Serum, Pharma Grade Gamma Irradiated AUS Origin (PAA, Cat.No A15-512). Fremstilling af stimuleringsmedie (DMEM, 1% Pen-strep, 2% FBS og 50 ng/ml rhvegf): l DMEM med 1 % pen-strep tilsættes 2 ml FBS Pharma Grade Gamma Irradiated AUS Origin (PAA cat.no. A15-512) og 50 µl 100 µg/ml rhvegf i PBS + 0,1 % HA. Fremstilles inden brug. Evt. rest kasseres. Isolering og dyrkning af mononucleære celler fra fedtvæv: Fremgangsmåde: 1. Overensstemmelse mellem navn og CPR-nr. på den modtagne fedtaspirat og navn og CPR nr. på medfølgende patientidentifikations bilag kontrolleres og dokumenteres. 2. Fedtvævsaspirat danner to faser: væskefase og fedtvævsfase. Volumen af det totale fedtvævsaspirat og fedtvævsfasen alene noteres. 3. Tilsæt PBS ca. 1+1 til plastikkolben og ryst kolben grundigt. Vent et par minutter indtil fedtvævet adskiller sig fra væsken, og flyder ovenpå. Sug væsken fra med glas pasteurpipette forbundet til Serres sugesystem. 4. Fedtvævet vaskes med PBS 2-4 gange indtil fedtvævet ikke er blodtilblandet 5. Fedtvævet overføres til 50 ml Falcon-rør og centrifugeres i 5 min ved 300 g, stuetemperatur (21 ºC), acc. 9, bremse 5. 6. Efter centrifugering vil fedtvævet flyde ovenpå væskefasen. Med en celleskraber overføres 25 ml fedtvæv til et passende antal 50 ml Falcon-rør. 7. Beregn og fremstil collagenasearbejdsopløsning. Tilsæt collagenasearbejdsopløsningen til fedtvævet 1+1 (25 ml fedtvæv + 25 ml collagenasearbejdsopløsning). 8. Inkubér ved 37 C i ca. 45 min i miniinkubator under rotering 9. Del det enzymatisk nedbrudte væv i 50 ml Falcon-rør (25 ml per rør). Neutraliser collagenasen ved at tilsætte dyrkningsmedie 1+1 (25 ml nedbrudt væv + 25 ml dyrkningsmedie). 10. Filtrér gennem et 100.m filter. 11. Centrifugér i 10 min ved 1200 g og stuetemperatur (21 ºC), acc. 9, bremse 5. 12. Hæld supernatanten fra (fedtcellerne fjernes herved, idet disse flyder ovenpå det vandige medie).

13. Resuspendér pellet i 5 ml dyrkningsmedie per rør og saml cellerne i et 50 ml Falcon-rør. Skyl herefter rørene med passende antal ml dyrkningsmedie, så der er 50 ml i alt. 14. Centrifugér i 10 min ved 1200 g, stue temperatur (21 ºC), acc. 9, bremse 5. 15. Hæld supernatanten fra og resuspender cellepellet i et kendt volumen dyrkningsmedie. 16. Udfør celletælling på Nucleocounter (se bilag) 17. De mononuklære celler udsås i en tæthed på 4,5 x 10 6 celler i 15 ml dyrkningsmedie pr. T75 dyrkningsflaske og inkuberes ved 37 C og 5% CO 2. 18. Efter 3-4 dage suges alt medie fra, for at fjerne ikke-adhærende celler. Cellerne vaskes med 15-20 ml PBS. PBS suges fra (serres sugesystem) og hver T 75 flaske tilsættes 15-20 ml dyrkningsmedie. 19. Mediet skiftes hver 3-4 dag, indtil cellerne har opnået en konfluens på 80%. 1. Passage Fremgangsmåde: 1. Når cellekolonierne er blevet 80 % konfluente, vaskes cellerne a. Sug flaskerne tomme for medie (Serres sugesystem). b. Tilsæt 10 ml PBS pr. T75 flaske. c. Flaskerne vippes et par gange d. Sug flaskerne tomme for PBS 2. Cellerne høstes ved inkubation i 5 10 min ved 37 ºC med 3 ml Tryple Select pr. T 75 flaske. 3. Når cellerne har løsnet sig (vurderes ved mikroskopi), tilsættes 7 ml dyrkningsmedie for at neutralisere/inaktivere Tryple Select. 4. Med en 10 ml stangpipette overføres cellerne til 50 ml centrifugerør. 5. Rørene centrifugeres 5 min, ved 300g, stuetemp, acc.9, bremse 5. 6. Supernatanten hældes fra og opsamles i 50 ml centrifugerør eller T75 flasker. 7. Cellerne resuspenderes i et kendt volumen (afhænger af pellets størrelse) dyrkningsmedie. 8. Celletælling: Cellerne tælles på Nucleocounter (se protokol for Nucleocounter). 9. Antallet af levende celler anvendes til beregning. Der udsås 1,17 105 ADSC i pr. T 25 dyrkningsflasker med 15 ml medium i hver. 10. Mediet skiftes efterfølgende hver 3-4 dag, til cellerne har opnået en konfluens på 80%. 2. Passage Fremgangsmåde: 1. Når cellekolonierne er blevet 80% konfluente, vaskes cellerne a. Sug flaskerne tomme for medie (Serres sugesystem). b. Tilsæt 150 ml PBS per T1000 flaske (90ml per T600 flaske). Til T75 flaskerne tilsættes 10 ml PBS. c. Flaskerne vippes et par gange d. Sug flaskerne tomme for PBS 2. Cellerne høstes ved inkubation i 5 10 min ved 37 oc med 50 ml Tryple Select per T1000 (30 ml per T600 flaske). De 4 T75 flasker tilsættes 3 ml hver. 3. Når cellerne har løsnet sig (vurderet ved mikroskopi), tilsættes 100ml dyrkningsmedie per T1000 (60ml per T600 flaske) og 7 ml per T75 flaske for at neutralisere/ inaktivere Tryple Select. 4. Med en stangpipette overføres cellerne til 50 ml centrifugerør. 5. Rørene centrifugeres 5 min, ved 300g, stuetemp, acc.9, bremse 5. 6. Supernatanten hældes fra og opsamles i 50 ml centrifugerør eller T75 flasker. Husk at afspritte mundingen på rørene med en spritserviet, inden supernantanten hældes fra. 7. Cellerne resuspenderes i et kendt volumen (afhænger af pellets størrelse) dyrkningsmedium. 8. Celletælling: Cellerne tælles på Nucleocounte 9. Der udsås 3,5 105 ADSC i 4 T75 dyrkningsflasker med 15 ml medium i hver. Resten af cellerne sås ud i T1000/T600 flasker (en eventuel rest sættes i supplerende T75 flasker). Der sås ud med en tæthed på 4,7 106 celler og 250 ml medium per T1000 flaske (2,8 106 celler og 150 ml medium per T600 flaske). Husk at stille T1000/T600 flasker på højkant inden de lægges ned i inkubatoren, så mediet fordeles jævnt på alle lag. Derefter placeres de i inkubatoren med mundingen indad. Initialer og dato for passering af celler samt fremstilling af medie anføres på Bilag 3. 10. Mediet skiftes efterfølgende hver 3-4 dag. Initialer og dato for medieskift samt fremstilling af medie

anføres på bilag 3. 11. Hvis der er mindre end 5 stk. T1000 flasker (8 stk. T600) fortsættes til passage 3. I passage 3 påbegyndes VEGF stimulering ved 80% konfluens uagtet antal. 12. Når cellerne i de 4 stk T75 flasker er 80% konfluente startes stimuleringen med VEGF. Der udtages samtidig prøver til undersøgelse for bakterier, svampe og mykoplasma DNA som beskrevet i afsnittet Udtagning af prøver til undersøgelse for bakterier, svampe og mykoplasma DNA. De stimuleres i en uge, hvorefter cellerne høstes som beskrevet i afsnittet afsnittet Høst af celler. Stimulering med VEGF Fremgangsmåde: 1. Når cellerne i de 4 T75 flasker er 80% konfluente påbegyndes 1 uges stimulering med VEGF. 2. Fra én af de 4 T75 flasker høstes supernatant over i et 50ml centrifugerør. Røret mærkes supernatant, patient nr. samt hvor mange ml der er taget fra til dyrkning og T75 flasken mærkes supernatant. Røret sættes til side og håndteres efterfølgende som beskrevet for supernatanter i protokol 05.03.05.004 Celletælling, høst af supernatant og flowcytometri. 3. De resterende flasker suges helt tomme for dyrkningsmedie (Serres sugesystem). 4. Hver T1000 flaske tilsættes 200 ml stimuleringsmedie (T600 tilsættes 120 ml). T75 flaskerne tilsættes 15ml stimuleringsmedie. Initialer og dato for medieskift samt oplysninger om mediefremstilling anføres på bilag 4. 5. Efter 2-3 dage skiftes stimuleringsmediet i T1000 flasker ved at fjerne 175ml konditioneret stimuleringsmedie (fra T600 fjernes 100ml) (Serres sugesystem) og derefter tilsætte 175 ml/100 ml frisk-fremstillet stimuleringsmedie. T75 flaskerne skiftes med 14 ml stimuleringsmedie. Initialer og dato for medieskift samt fremstilling af medie anføres på bilag 4. 6. Efter yderligere 2 3 dage skiftes stimuleringsmediet i T1000 flasker ved at fjerne 175ml konditioneret stimuleringsmedie (fra T600 fjernes 100ml) (Serres sugesystem) og derefter tilsætte 175 ml/100 ml frisk-fremstillet stimuleringsmedie. T75 flaskerne skiftes med 14 ml stimuleringsmedie. Initialer og dato for medieskift samt fremstilling af medie anføres på bilag 4 7. Når cellerne er stimuleret i en uge høstes de som beskrevet i afsnit Høst af celler.

BILAG 3: Protokol for nedfrysning af mesenkymale stromale celler Materialer: Serres sugesystem PBS (Gibco 10019-015) Tryple Select (Gibco ca. no. 12563029) DMEM Low glucose 1 g/l med glutamin og 25 mm HEPES (PAA, Cat.No E15-808) Penicillin-streptomycin (1000 units/ml peniclllin G sodium, 10.000g/ml streptomycin sulfate) (GIBCO, Cat. No 15140-122) Føtal Bovin Serum, Pharma Grade Gamma Irradiated AUS Origin (PAA, Cat.No A15-512) Fremstilling af standarddyrkningsmedie (DMEM, 10 % FBS og 1 % pen-strep): 500 ml DMEM tilsættes 50 ml FBS og 5 ml pen-strep Frysemedie (FBS, 5 % DMSO): Der fremstilles 1 ml frysemedie pr. 1 x 106 celler, svarende til 950 µl FBS og 50 µl DMSO. Eksempel: Der skal fryses 5 x 106 celler. Der fremstilles til et cryorør mere end der skal bruges, altså 6 ml frysemedie: 5,7 ml FBS tilsættes 300 µl DMSO Høst og nedfrysning af MSC: 1. Når MSC er klar til nedfrysning (~ 80 % konfluente) vaskes cellerne: a. Sug flaskerne tomme for medie (Serres sugesystem). b. Tilsæt 10 ml PBS pr. T 75 flaske. c. Flaskerne vippes et par gange. d. Sug flaskerne tomme for PBS. 2. Cellerne høstes ved inkubation i 5-10 min. ved 37 C med 3 ml Tryple pr. T75 flaske. 3. Når cellerne har løsnet sig (vurderes ved mikroskopi) tilsættes 7 ml standarddyrkningsmedie med en 10 ml stangpipette for at neutralisere/inaktivere den enzymatiske reaktion (Tryple). 4. Skyl bunden af T75 flasken, og overfør cellerne til et 10 ml centrifugerør (1 rør pr. flaske). 5. Rørerne centrifugeres 5 min. Ved 300 g, acc. 9, bremse 5 (program 1). 6. Supernatanten hældes fra og opsamles i 50 ml centrifugerør eller T75 flaske. 7. Cellerne resuspenderes i et kendt volumen (afhængig af pellets størrelse) dyrkningsmedie. 8. Cellerne tælles på NucleoCounter. Antallet af levende celler anvendes til beregning af hvor mange cryorør cellerne skal nedfryses i. Der skal være ca. 1 x 10 6 MSC p.r rør i 1 ml frysemedie. 9. En passende mængde frysemedie fremstilles svarende til antallet af cryorør plus et ekstra 10. Cellerne centrifugeres igen i 5 min. Ved 300 g, acc. 9, bremse 5 (program 1). Imens mærkes 1,8 ml cryorør med donor, passage, antal celler, dato samt initialer. 11. Supernatanten hældes fra og opsamles i 50 ml centrifugerør eller T75 flaske. 12. Cellepellet resuspenderes i den beregnede mængde frysemedie og fordeles i mærkede cryorør med 1 ml i hver. Herefter henstår cellerne ved stuetemperatur i 10 (maksimalt 15 min). 13. Cryorørerne anbringes derpå i en nedfrysningsboks med isopropanol ( Mr. Frosty ), som placeres i -80 C fryser i et døgn. 14. Efter minimum 24 timer ved -80 C, overflyttes cryorørene til beholder med flydende nitrogen. 15. Det noteres i mappen Oversigt over celler i N2, hvor cellerne er placeret.

BILAG 4: Protokol for optøning og udsåning af mesenkymale stromale celler Materialer: DMEM, Low Glucose (1g/l) w/ L-Glutamine w/ 25 Mm HEPES (PAA, cat. no. E15-808) FBS: Fetal Bovin Serum, Pharma Grade (PAA, cat. no. A15-512) Pen-strep: Penicillin (10.000 U/ml) Streptomycin (10.000 µg/ml) (Gibco, cat. no. 15140) T 75 kulturflasker CO 2 inkubator Serror sugesystem Fremstilling af standarddyrkningsmedie (DMEM, 10 % FBS og 1 % pen-strep): 500 ml DMEM tilsættes 50 ml FBS og 5 ml pen-strep Metode: 1. Tilsæt 15 ml dyrkningsmedie til et passende antal T75 flasker, afhængig af hvor mange celler der skal optøs. 2. Anbring T75 flaskerne i CO2-inkubatoren for at opvarme dyrkningsmediet til 37 C. 3. I mappen Oversigt over celler i N2 lokaliseres de celler, som ønskes optøet. Husk at strege de cryorør, som fjernes fra beholderen ud i loggen. 4. Iført blå termohandsker og beskyttelsesskærm, tages låget af beholderen med flydende nitrogen. 5. Løft det relevante rack ind til midten af beholderen og derefter op. Lad nitrogenen løbe fra æskerne inden racket løftes helt op og stilles på gulvet. 6. Tag de relevante prøver ud af æsken og opbevar dem i blå fryseboks med låg, indtil optønings-proceduren påbegyndes. Rack sættes tilbage i beholderen med flydende nitrogen, og låget lægges på. 7. Cellerne optøs ved at holde cryorøret neddyppet i 37 C varmt vand (vandbad) indtil ca. 95 % af cellerne er optøet. Der må max. optøs 7-10 ampuller ad gangen. 8. Cellerne overføres til T 75 flasken med 15 ml 37 C varmt standarddyrkningsmedie, ved først at tilsætte ca. 500 µl medie til cellerne, bland forsigtigt, og overfør derefter cellesuspensionen til flasken. 9. Skyl cryorøret en enkelt gang med medie for at få alle cellerne med. 10. Placer T 75 flasken med de optøede celler i CO2-inkubatoren natten over. 11. Dagen efter optøning, afsuges (Serres sugesystem) alt mediet for at fjerne DMSO fra frysemediet og hver T 75 flaske tilsættes 15-20 ml frisk standarddyrkningsmedie. 12. Mediet skiftes efterfølgende hver 3-4 dag ved at fjerne 13-18 ml dyrkningsmedie og derefter tilsættes 13-18 ml frisk dyrkningsmedie.

BILAG 5: Protokol for anvendelse af NucleoCounter-100 fra Chemometec Materialer: Nucleocounter NC-100 (Chemometec, Allerød Denmark) NucleoCassette (941-0002) Reagens A, Lyseringsbuffer (910-0001) Reagens B, Stabiliseringsbuffer (910-0002) Celletælling: 1. Den totale volumen af cellesuspension noteres (V). 2. Udtag ca. 100 µl celler fra cellesuspensionen og kom det i eppendorfrøret. Non-viabel cellekoncentration: a) Udtag en prøve af cellesuspension ved at stikke spidsen af NucleoCassetten helt ned i bunden af eppendorfrøret. b) Tryk stemplet på NucleoCassetten i bund, hvorved prøven suges op i kassetten. c) Indsæt kassetten i NC-100. d) Tryk på RUN. e) Koncentrationen af non-viable celler vil vise sig i displayet og angives i antal celler/ml. f) Værdien noteres ned (Cnv). g) Eventuel fortyndingsfaktor (F) noteres ligeledes ned. Total cellekoncentration: a) Mix 100 µl cellesuspension med 100 µl Reagens A. b) Cellerne blandes godt med pipette ved at resuspendere min. 5 gange for at sikre at alle celler lyseres. c) Tilsæt 100 µl Reagens B. d) Cellerne blandes godt med pipette ved at resuspendere min. 5 gange. e) Udtag en prøve af den lyserede cellesuspension ved at stikke spidsen af NucleoCassetten helt ned i bunden af eppendorfrøret. f) Tryk stemplet på NucleoCassetten i bund, hvorved prøven suges op i kassetten. g) Indsæt kassetten i NC-100. h) Tryk på RUN. i) Koncentrationen af de totale celler vil vise sig i displayet og angives i antal celler/ml. j) Værdien noteres ned (Ct). k) Fortyndingsfaktoren noteres ligeledes ned (F) Fortyndingsfaktoren vil altid være min. 3 pga. fortynding med lyserings- og stabiliseringsbuffer. Beregning: V: volumen Ct: total cellekoncentration Cnv: koncentration af non-viable celler F: fortyndingsfaktor Total antal celler = Antal døde celler = Ct F V Cnv F V Antal levende celler = ((Ct 3) Cnv) F V) ~ total antal celler antal døde celler Viabilitet % = Antal levende celler / Total antal celler 100

BILAG 6: Nedfrysning af supernatant Mailkorrespondance med Nili Naftali, PhD stud. Supernatant i dette projekt, nedfryses på tilsvarende måde, som beskrevet i nedenstående mail.

BILAG 7: Protokol for fremstilling og opsætning af 96 mikrotiterplade til Luminex 200 TM Ved Millipore MILLIPLEX Human Angiogenesis / Growth Factor Magnetic Bead Panel 1 Fremstilling af reagenser Alle medier og reagenser skal have stuetemperatur (20-25 o C) når proceduren påbegyndes. Antibody-Immobilized Beads Ved anvendelse af individuelle beads, vortex hvert rør indeholdende antistof-beads i 1 minut før brug. 1. Tilsæt 150 µl af hvert antistof-bead i flasken markeret Mixing Bottle. 2. Tilsæt Assay Buffer til et totalvolumen af 3,0 ml. 3. Vortex blandingen grundigt. Kvalitetskontroller 1. Tilsæt 250 µl deioniseret vand til kvalitetskontrol 1 og kvalitetskontrol 2. 2. Bland indholdet ved at vende hver reagensflaske adskillige gange og vortex til blandingen er opløst. 3. Lad reagensflaskerne stå i 5-10 minutter og overfør dernæst kontrollerne til to eppendorf rør, mærket med hhv. kvalitetskontrol 1 og 2, samt dags dato. Vaskebuffer 1. Ryst flasken med 10X Wash Buffer, for at opløse indholdet af salt. 2. Fortynd 60 ml 10X Wash Buffer (to flasker) med 540 ml deioniseret vand i en passende beholder. Serum Matrix Dette trin er kun nødvendigt ved analyse af serum eller plasma prøver. 1. Tilsæt 1,0 ml deioniseret vand til flasken indeholdende Serum Matrix og bland grundigt. Lad blandingen stå i 10 minutter. 2. Tilsæt dernæst 2,0 ml Assay Buffer til flasken med Serum Matrix og bland grundigt. Holdbarhed: 1 måned ved -20 o C. Human Angiogenesis/Growth Factor Panel 1 Standard Tilsæt 250 µl deioniseret vand til flasken med Human Angiogenesis/Growth Factor Panel 1 Standard. Vend flasken for at blande indholdet og vortex i 10 sekunder. Lad blandingen stå i 5-10 minutter og overfør dernæst blandingen til et eppendorf rør mærket med standard 7. Mærk 6 eppendorf rør med standard 1, standard 2, standard 3, standard 4, standard 5 og standard 6. Tilsæt 200 µl Assay buffer til hvert eppendorf rør. Overfør 100 µl fra standard 7 til standard 6 og resuspender. Overfør 100 µl fra standard 6 til standard 5 og resuspender. Fortsæt proceduren rækken ud (se figur, næste side). Mærk et eppendorf rør med standard baggrund og tilsæt Assay Buffer. Holdbarhed: Standard 7 kan opbevares 1 måned ved -20 o C.

Opsætning af 96 brøndplade Alle medier og reagenser skal have stuetemperatur (20-25 o C) når proceduren påbegyndes. Antibody-Immobilized Beads er lys sensitive og skal beskyttes mod lys. Alle reagenser skal opbevares i eppendorf rør (ikke glas!!) Design plade opsætning, hvor i der skal indgå dobbeltbestemmelse af standarder, kontroller samt prøver. Hvis pladen ikke bliver analyseret umiddelbart efter opdrypning af reagenser, kan pladen opbevares i op til 24 timer ved 2-8 o C. Pladen skal tildækkes med plast og folie. Før analyse af pladen, blandes reagenserne ved at anbringe pladen på en plate shaker i 10 minutter. Vær opmærksom på at den senere analyse, kan føre til nedsat sensitivitet af cytokiner og vækstfaktorer. Plate shakeren skal indstilles til 500-800 rpm, for at sikre maksimum opblanding af reagenserne. Udførsel 1. Tilsæt 200 µl Assay Buffer til hver brønd i pladen. Tildæk pladen med plast og placer den på en plate shaker i 10 minutter ved stuetemperatur. 2. Fjern Assay Buffer fra brøndene ved at vende pladen over et absorberende papir. Bank forsigtigt pladen mod underlaget for at fjerne rester af Assay Buffer. 3. Tilsæt 25 µl af baggrunds- og standard prøverne, samt kontrollerne i hver sin brønd. Assay Buffer anvendes som baggrundsprøve (0 pg/ml standard). 4. Tilsæt 25 µl Assay Buffer til de brønde, hvori prøverne skal tilsættes. 5. Tilsæt 25 µl Matrix Solution til brøndene med baggrundsprøve, standarder og kontroller. Ved analyse af serum eller plasma anvendes Serum Matrix, som medfølger i kittet. Ved analyse af vævskulturer eller supernatant anvendes dyrkningsmedie i stedet for Serum Matrix. 6. Tilsæt 25 µl prøvemateriale til de respektive brønde. Ved analyse af serum eller plasma, fortyndes prøven med Assay Buffer i koncentrationen 1:2. 7. Vortex Mixing Bottle og tilsæt 25 µl til alle brønde. 8. Tildæk pladen med plast og anbring den på en plate shaker. For at beskytte antistof beads mod lys tildækkes pladen yderligere med folie. Inkuber pladen natten over (16-20 timer) ved 2-8 o C. 9. Vask pladen 3 gange ved at følge instruktionen Vask af 96 brøndplade. Se nedenstående. 10. Tilsæt 25 µl Detection Antibodies til alle brønde. 11. Tildæk pladen med plast og anbring den på en plate shaker. Tildæk yderligere med folie og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. 12. FJERN IKKE indholdet i brøndene. Tilsæt 25 µl Streptavidin-Phycoerythin til alle brønde. 13. Tildæk pladen med plast og anbring den på en plate shaker. Tildæk yderligere med folie og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. 14. Vask pladen 3 gange ved at følge instruktionen Vask af 96 brøndplade. Se på næste side. 15. Tilsæt 100 µl Sheat Fluid til alle brønde. Anbring pladen på en plate shaker i 5 minutter. 16. Kør pladen på Luminex 200. Følg protokol Luminex 200 TM.

Vask af 96 brøndplade Anbring pladen på en håndholdt magnet og låst pladen fast ved at skubbe metalhæfterne ind mod hinanden. Lad pladen sidde i 60 sekunder, for at de magnetiske beads kan nå at sætte sig. Vend herefter pladen over et absorberende papir for at fjerne indholdet. Tag pladen af magneten og tilsæt 200 µl Wash Buffer i alle brønde. Herefter anbringes pladen på plate shaker i 30 sekunder. Sæt pladen tilbage på den håndholdte magnet og lad den sidde i 60 sekunder. Vend pladen igen over et absorberende papir for at fjerne indholdet og gentag vaske proceduren. 96 brøndplade plan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 QC-1 Etc Control. A 0 pg/ml Standard 4 Standard (Background) B 0 pg/ml Standard 4 Standard (Background) C Standard 1 Standard 5 QC-1 Control QC-2 Control D E F G H Standard 1 Standard 5 Standard 2 Standard 6 Standard 2 Standard 6 Standard 3 Standard 7 Standard 3 Standard 7 QC-2 Control Sample 1 Sample 1 Sample 2 Sample 2

BILAG 8: Software manual til xponent Luminex 200 TM Opstart af Luminex 200 1. Tjek om der er tilstrækkelig Sheat Fluid og stram kapselen på flasken. 2. Tjek om flasken med Waste Fluid skal tømmes inden opstart. 3. Opstart Luminex apparatet ved at tænde for to knapper bag på selve apparatet, og én knap bag på den tilhørende primer station. 4. Tænd for computeren og åben programmet Luminex xponent. For at logge ind, tryk blot Log In uden at skrive noget i User ID feltet. Laseren på Luminex apparatet skal varme op inden brug. Det sker automatisk ved opstart af apparatet og tager ca. 20 minutter. Kalibrering og daglig vedligeholdelse 1. På startsiden (Home) vælges System initialization. 2. Under reagenser, vælg lot nr på det anvendte calibration kit og performance verification kit. En oversigt over maintenancepladen viser i hvilke brønde de anvendte reagenser skal afdryppes i. 3. Vortex reagenserne i 30 sekunder og dryp 5 dråber af hver reagens i de anviste brønde på maintenancepladen. 4. Tilsæt ethanol og destilliseret vand i de anviste brønde på maintenancepladen. 5. Klik på Eject på skærmen og sæt maintenancepladen på pladeholderen, klik på Retract. 6. Klik på Run En dialog boks vil fortælle når kørslen er Completet. Ved en eventuel fejlmelding, start med at prime apparaturet ved at klikke på Maintence i topfanen. Under Commands klik på ikonet Prime. Klik på RUN. Når kørslen er færdig, kør en ny maintenanceplade ved at gentage punkt 1-6. Husk at vortex reagenserne i 30 sekunder. Analyse af mikrotiterplade 1. På startsiden (Home) markeres den protokol, du vil anvende i din analyse. 2. Klik herefter på Click to create a new batch using the highlighted protocol below. 3. Skriv dags dato (dd/mm/åååå) efterfulgt af dine initialer under Batch name og klik herefter Next. 4. Klik på Apply Std/Ctrl Kit og vælg STD protokollen tilsvarende den protokol du anvender i din analyse. 5. Klik Next. 6. Aftegn din pladeopsætning på skærmen. Dette gøres ved at markere de ønskede brønde og dernæst vælge brøndenes indhold ved at klikke på nedenstående ikoner. Da man ikke kan vælge Control i pladeopsætningen markeres kvalitets kontrol 1 og 2 som Unknown. Husk at slette den forgående pladeopsætning hvis denne fremgår anderledes. 7. Klik på Eject, sæt mikrotiterpladen på pladeholderen og klik Retract. 8. Klik Run Batch for at starte analysen. Nedlukning af Luminex 200 1. På startsiden (Home) vælges Shutdown. 2. Tilsæt deioniseret vand og 10 % klor i de anviste brønde på maintenancepladen. 3. Klik på Eject, sæt maintenancepladen på pladeholderen og klik Retract. 4. Klik Run. 5. Efter programmet er færdig, fjernes pladen fra pladeholderen. 6. Klik Log ud, efterfulgt af Exit. 7. Luk ned for computeren samt sluk for apperatet og vaske station. Importering Protokollerne vil enten medfølge i det pågældende analysekit eller på producentens hjemmeside. Kopier protokollerne over på et USB stik, for at overfører den til Luminex xponent.

Importering af protokol 1. Åben Protocols i topfanen og vælg Protocols i venste sidefane. 2. Klik på Import. 3. Find den ønskede fil og klik Open. 4. Den importerede protokol vil nu ligge i listen over installerede protokoller. Valg af cytokiner i en protokol 1. Åben Protocols i topfanen og vælg Protocols i venstre sidefane. 2. Markerer den protokol der skal redigeres og klik på Edit. 3. I Version feltet, nummeres den nye version. 4. Klik på Next. 5. Vælg hvilke cytokiner/vækstfaktorer, der skal indgå i analysen. 6. Klik på Next. 7. Under Plate Layout opsættes en standard pladeopsætning. I pladeopsætningen skal baggrundsprøve, standardkontroller, kvalitetskontroller og prøver indgå. 8. Klik Save. Importering af STD protokol 1. Åben Protocols i topfanen og vælg Stds & Ctrls i venstre sidefane. 2. Klik på Import. 3. Find den ønskede fil og klik Open. 4. Den importerede protokol vil nu ligge i listen over installerede protokoller. Tilføj Stds/Ctrl til protokollen 1. Åben Protocols i topfanen og vælg Stds & Ctrl i venstre sidefane. 2. Marker den protokol, som du ønsker at tilføje et Stds/Ctrl lot til. 3. Klik på Create New Std/Ctrl Lots og vælg en protokol fra listen, klik dernæst OK. 4. Klik på Apply Std/Ctrl Kit, marker den ønskede protokol og klik OK. 5. Klik Save. Tilføj CAl eller VER kit (Bead lot information) Det er nødvendig at tilføje informationer om xmap kalibrations og verifikations bead lot, før systemet kan kalibreres. Disse informationer findes på den medfølgende cd i kittet. 1. På startsiden (Home) vælges System initialization. 2. Klik Import Kit. 3. Find informationsfilen til xmap kalibrations eller verifikations kit og klik Open. 4. Den importerede protokol vil nu ligge i listen over installerede kits og lots. Importer CAL eller VER kit 1. Åben Maintenance i topfanen og vælg Lot Management i venstre sidefane. 2. Klik på Import kit. 3. Find det ønskede kit og klik på Open. 4. Kittet vil nu findes i listen over installeret. Resultat Overførsel af resultater til excel ark 1. Åben Results i topfanen og vælg Saved Batches i venstre sidefane. 2. Markerer den ønskede analyse kørsel og klik på Exp Results. 3. Vælg hvor resultaterne skal gemmes.

BILAG 9: Data brugt til fastlæggelse af standardkurver Resultater fra præstudie af standardkurver for VEGF-A. Oversigt over resultaterne af VEGF-A, anvendt til at fastlægge standardkurver for henholdsvis DMEM tilsat 2 % FCS, DMEM tilsat 10 % FCS samt DMEM uden FCS. Alle enheder er i pg/ml. Standarder DMEM + 2 % FCS Std 1 13,50 Forventet DMEM +10 % FCS DMEM koncentration af standarder Std er ikke blevet målt 14,91 13,70 Std 2 39,24 39,58 35,84 41,20 Std 3 125,74 124,76 132,99 123,50 Std 4 377,23 392,31 359,68 370,40 Std 5 1028,36 1058,01 1094,52 1111,10 Std 6 3760,57 3296,76 3226,03 3333,30 Std 7 9615,31 10278,27 9453,38 10000,00

Alle enheder er i pg/ml BILAG 10: Kvalitetskontrol 1 og 2 (Q1 og Q2) Q1: Kvalitetskontrol Lav ANG-2 G-CSF FGF-1 HGF FGF-2 VEGF-A QC1 258,69 415,78 377,91 692,37 388,12 440,73 QC1 252,45 297,27 304,53 717,72 339,56 331,04 QC1 246,79 288,28 279,50 567,45 308,73 256,10 QC1 390,19 267,70 376,27 697,30 321,35 301,25 QC1 337,70 375,98 402,00 883,96 435,32 495,72 QC1 254,61 474,80 571,90 1013,06 485,28 458,09 QC1 207,13 429,06 511,12 758,19 365,71 411,88 Acceptinterval 246-511 266-552 275-572 488-1013 241-501 256-532 209 150 210 131 213 214 Extra Pladen Q2: Kvalitetskontrol - Høj ANG-2 G-CSF FGF-1 HGF FGF-2 VEGF-A QC2 1538,68 1939,79 1816,08 3348,94 1775,34 1799,36 QC2 1257,86 1372,14 1813,81 2745,41 1303,26 1355,10 QC2 1053,55 1244,91 1329,13 2068,95 1081,90 1259,34 QC2 1370,96 1264,44 2010,82 3135,23 1278,14 1431,03 QC2 2112,26 1914,71 2017,03 3991,77 1715,72 1882,79 QC2 1789,11 2124,37 2352,35 3475,70 2110,21 2246,78 QC2 936,31 1874,20 2115,43 2426,44 1252,98 1507,29 Acceptinterval 1021-2121 1169-2428 1164-2417 2098-4356 1017-2112 1106-2297 209 150 210 131 213 214 Extra Pladen Ekstrapladen: Inkluderer 48 og 72 timer efter serum seponering af medie, samt analysering af 10% FCS uden celler.