Kvantitativ bestemmelse af glukose Baggrund: Det viser sig at en del af de sukkerarter, vi indtager med vores mad, er, hvad man i fagsproget kalder reducerende sukkerarter. Disse vil i en stærk basisk opløsning reducere den gule forbindelse 2-hydroxy,3,5- dinitrobenzoesyre til et rødorange stof. Det viser sig heldigt, at det gule og det rødorange stof absorberer lys af forskellig bølgelængde. Hvor meget lys, der absorberes måles med et spektrofotometer (på apparatet kan opløsningens absorbans aflæses). Absorbansen er altså et mål for hvor kraftig (intens) farven er. Læskedrikkens klargøring: En læskedrik indeholder normalt meget mere glukose end vores standardopløsninger, så vi må fortynde læskedrikken inden analysen. For at kunne udtage et præcist volumen af læskedrikken må denne afbruses først. Herefter tages med finnpipette 2,00 ml læskedrik, der kommes i en 100 ml målekolbe - der fyldes op med vand og kolben rystes godt. Læskedrikke er nu fortyndet 50 gange. Der laves nu analyse med den fortyndede opløsning præcist som angivet i resultatskema afslut med at måle absorbansen. målekolbe Stam-glucoseopløsning: En glukoseopløsning indeholdende 1000 mg glukose/l laves ved at opløse 1,000 g glukose i en 1000 ml målekolbe op fylde op med destilleret vand. Denne stamopløsning bruges til at lave de andre standardopløsninger. Standardopløsninger/resultatskema: Af glukosestamopløsningen skal der laves fortyndinger så man får opløsninger med mindre, men kendte indhold af glukose (man kalder sådanne opløsninger standardopløsninger). Til alle forsøg skal der bruges 2 ml
glukoseopløsning det er vigtigt, at du senere i forsøget husker dette. En opløsning, hvor du tager 0,5 ml af stamopløsningen og 1,5 ml vand, vil således 0,5 have indholdet i1000 mg / L 0,5 + 1,5 Til 5 nummererede rene reagensglas tilsættes opløsninger efter skemaet nedenfor Resultatskema: 1 2 3 4 5 læskedrik bemærkning Glukoseopløsning 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,0 0,5 ml finnpipette Afioniseret vand 2,0 1,5 1,0 0,5 0 0 0,5 ml finnpipette glukoseindhold 0 mg/l Salicylatreagens 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2 ml finnpipette Reagensglassene placeres nu i et vandbad med kogende vand. De skal stå her i mindst 5 minutter for at reaktionen forløber fuldstændig Afioniseret vand til 10 10 10 10 10 10 5 ml finnpipette fortynding Målt absorbans Der skulle nu gerne være lige meget væske i alle glas. Glassene omrystes godt. Herefter afkøles glassene til stuetemperatur og absorbansen måles. Måling af absorbans: I forvejen er I blevet instrueret i brugen af spektrofotometeret. Apparatet indstilles på bølgelængden 540 nm og nulstilles med opløsning fra glas 1 i kuvetten. Kuvetten skylles med lidt af indholdet fra glas 2 og fyldes derefter med prøven fra glas 2 absorbansen måles og noteres i resultatskemaet. Der fortsættes på samme måde med de øvrige opløsninger. Fremstilling af standardkurve: I et regneark laves en XY-punktgraf med det kendte glukoseindhold som serie 1 og absorbansen som serie 2. Punkterne skulle gerne se ud til at ligge på en ret linje. Lav derfor tendenslinjen som en ret linje, der går gennem (0,0) og få vist ligningen i diagrammet- I har nu lavet en standardkurve. Den rette linje eller forskriften for denne kan bruges til at oversætte en målt absorbans til et glukoseindhold, hvilket skal udnyttes når I måler på prøver fra læskedrikken.
Beregning af læskedrikkens glukoseindhold: I kan nu på standardkurven aflæse, hvilket glukoseindhold jeres absorbans svarer til. Mere præcist vil det dog være, hvis I udnytter kendskabet til ligningen for tendenslinjen! Når I skal angive læskedrikkens glukoseindhold, skal I huske på, at læskedrikken blev fortyndet 50 gange.
Kemikalier: Salicylatreagens: 5 g 2-hydroxy,3,5-dinitrobenzoesyre opløses under opvarmning i 100 ml 4M NaOH (16 g NaOH i 100 ml). Desuden opløses under opvarmning 150 g kaliumnatriumtartrat i 250 ml vand. De to opløsninger blandes og fortyndes til 500 ml. Opløsningen er i køleskab holdbar i længere tid. Lidt om målingerne Spektre af glas 1 og 5 Absorbans 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00 bølgelængde i nm gul glas 1 rødorange glas 5 Nedenfor er spektrene af standardopløsningerne 1 og 5 vist. Som man kan se er der et delvist sammenfald mellem absorbansen af den gule og rødorange opløsning dog således at hvis man går til bølgelængder større end 530 nm er absorbansen af det gule stof stort set 0, så man vil ved bølgelængden 540 nm og lave koncentrationer forvente at absorbans og koncentration er proportionale Måleresultater fra et forsøg med glukose 1 2 3 4 5 læskedrik bemærkning Glukoseopløsning 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,0 0,5 ml finnpipette Afioniseret vand 2,0 1,5 1,0 0,5 0 0 0,5 ml finnpipette Glukoseindhold 0 mg/l Salicylatreagens 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2 ml finnpipette Afioniseret vand 10 10 10 10 10 10 5 ml finnpipette Målt absorbans 0 0,163 0,414 0,634 0,814 0,531
absorbans 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 glukosestandardkurve y = 0,00082x 0 500 1000 1500 Løsning af ligningen 0,531 = 0,00082i x Giver x=648 mg/l og husker man fortyndingen på 50 gange er indholdet af glukose i læskedrikken 32 g/l indhold(mg/l)