BRUGSANVISNING PLADEMEDIER KLAR TIL BRUG PA-254032.07 Rev.: April 2013 BD Mueller Hinton II Agar BD Mueller Hinton II Agar 150 mm BD Mueller Hinton II Agar, Square TILSIGTET BRUG BD Mueller Hinton II Agar, som leveres i forskellige pladeformater, anvendes i den standardiserede diskdiffusionsprocedure til at bestemme følsomheden i kliniske isolater af hurtigt voksende aerobe organismer over for antimikrobielle stoffer, som det er standardiseret af Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1 PROCEDURENS PRINCIPPER OG FORKLARING Mikrobiologisk metode. Da kliniske, mikrobiologiske laboratorier i starten af 1960'erne anvendte mange forskellige procedurer for at bestemme bakteriers følsomhed for antibiotiske og kemoterapeutiske stoffer, udviklede Bauer, Kirby og andre en standardiseret procedure, i hvilken Mueller Hinton II Agar, et medium der oprindeligt var tiltænkt til isolation af gonokokker, blev udvalgt som analysemedium. 1-4 En efterfølgende international samlet undersøgelse bekræftede værdien af Mueller Hinton Agar til dette formål pga. mediets relativt gode reproducerbarhed, dets simple formel samt det væld af eksperimentelle data, der eksisterede fra brug af dette medium. 5 CLSI har skrevet en præstationsstandard for Bauer-Kirby-proceduren, og dette dokument bør konsulteres for yderligere oplysninger. 6 Andre nationale standarder er udviklet for antimikrobiel følsomhedstestning ifølge Bauer-Kirby-proceduren. I de standarder kan inokulatets densitet, inokuleringsmetoden, zonestørrelserne og tolkningsmetoden afvige fra CLSI-standarden. Selvom der findes almindelige europæiske standarder for følsomhedstestning, bør lokale, nationale standarder konsulteres, hvis CLSI-retningslinjerne ikke kræves anvendt. Bauer-Kirby proceduren er baseret på diffusion gennem en agargel af antimikrobielle substanser, som er imprægneret på papirskiver. 7 Til forskel fra tidligere metoder, som anvendte skiver med høje og lave antimikrobielle koncentrationer, og som anvendte tilstedeværelsen eller fraværet af hæmningszoner til deres tolkning, benytter denne metode sig af skiver med en enkelt koncentration antimikrobielt stof, og zonediametrene korreleres med et minimum af inhibitoriske koncentrationer (MIC). 1,2,6,7 I denne testprocedure udstryges en standardiseret suspension af organismen over hele overfladen på mediet. Papirskiver imprægneret med specificerede mængder antibiotiske eller andre antimikrobielle stoffer anbringes dernæst på mediets overflade, pladen inkuberes, og hæmningszonerne om hver skive måles. Bestemmelsen af, om organismen er følsom, intermediær eller resistent for et stof, afgøres ved at sammenligne zonestørrelserne med dem, der findes i tabellerne 2A og 2D i CLSI Document M100 (M2). 6 Forskellige faktorer er blevet identificeret som værende påvirkelige på følsomhedstestning med skivediffusion. Disse inkluderer mediet, overskydende overfladefugt på mediet, agardybde, skivestyrke, inokulatkoncentration, ph og testorganismernes produktion af ß-lactamase. 5-8 BD Mueller Hinton II Agar fremstilles med lave niveauer af thymin og thymidin, 9.10 samt kontrollerede niveauer af kalcium og magnesium. 11-13 Thymin- og thymidin-niveauer i råmaterialer bestemmes med skivediffusionsproceduren med trimethoprim-sulfamethoxazol (SXT) skiver og Enterococcus faecalis ATCC 33186 og/eller 29212. Kalcium- og magnesiumniveauerne kontrolleres ved at teste råmaterialerne og supplere med kalcium- og/eller magnesiumkilder efter behov for at producere korrekte zonediametre med aminoglycosid antibiotika og Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. PA-254032.07-1 -
REAGENSER BD Mueller Hinton II Agar Formel* pr. liter renset vand Oksekødesekstrakt 2,0 g Surt hydrolysat af kasein 17,5 Stivelse 1,5 Agar 17,0 ph 7,3 ± 0,2 * Justeret og/eller suppleret som påkrævet for at leve op til funktionskriterier. FORHOLDSREGLER. Kun til professionel brug. Pladerne må ikke anvendes, hvis de viser tegn på mikrobiel kontaminering, misfarvning, udtørring, brud eller andre tegn på forringelse. Overdreven skrumpning af dette medium på grund af udtørring kan føre til falske følsomhedstestresultater. Læs dokumentet GENEREL BRUGSANVISNING for procedurer om aseptisk håndtering, biologisk risiko og bortskaffelse af det brugte produkt. OPBEVARING OG HOLDBARHED Pladerne opbevares efter modtagelse i mørke ved 2 8 C i deres originale hylsterindpakning, lige indtil de skal bruges. Undgå nedfrysning og overophedning. Pladerne kan inokuleres op til udløbsdatoen (se etiketten på pakken) og inkuberes i de anbefalede inkubationstider. Plader fra åbnede stabler med 10 plader kan bruges i en uge, når de opbevares i et rent område ved 2 8 C. BRUGERKVALITETSKONTROL Se CLSI 6 eller, hvis det er relevant, nationale standarder for oplysninger om brugerkvalitetskontrol. I princippet skal procedurerne, der er beskrevet nedenfor i afsnittet Testprocedure, følges, inklusive for kontrolstammerne, der nævnes i Materialer, som ikke er vedlagt. Mueller Hinton II Agar plader og de antimikrobielle skiver, der anvendes, skal testes mindst to gange om ugen for korrekt præstation. Ikke-inokuleret mediums udseende: farveløs til svagt ravgul. PROCEDURE Vedlagte materialer BD Mueller Hinton II Agar (leveres i forskellige pladeformater, se Emballering/udvalg). Mikrobiologisk kontrolleret. Materialer, der ikke er vedlagt 1. Inokulatbouillon i rør, såsom BD Trypticase Soy Broth (sojabønne-kaseinfordøjelsesbouillon) eller Mueller Hinton II Broth (kationjusteret), til klargøring af et standardinokulat, samt steril bouillon eller saltvand til fortynding af inokulat. 2. Bariumsulfat-sammenligningsstandard (0,5 ml af 0,048 M BaCl 2 [1,175 % w/v BaCl 2. 2H 2O] til 99,5 ml af 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1 % v/v]). 3. Et fotometrisk apparat til justering af inokulatopløsningens klarhed svarende til en McFarland 0,5 standard. 4. Som alternativ til ovenstående materialer (1-3) kan BD Prompt Inoculation System (volumetrisk inokulat-klargøringsudstyr) anvendes. 6,18 5. Kontrolkulterer Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (kun til hæmningskombinationerne ß-lactam-ß-lactamase), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, og Enterococcus faecalis ATCC 33186 eller ATCC 29212. 6 6. Papirskiver, imprægneret med specifikke mængder antimikrobielle stoffer 6, såsom BD Sensi-Disc skiver til følsomhedstestning. 7. Dispenseringsudstyr såsom BD Sensi-Disc 6-, 8- eller 12-pladsdispenser. En passende dispenser kan også fås til Mueller Hinton II Agar Square plader. 8. Lineal eller andet udstyr til at måle zonestørrelse i millimeter. PA-254032.07-2 -
9. Hjælpedyrkningsmedier, reagenser og laboratorieudstyr som påkrævet. Prøvetyper Dette produkt anvendes til følsomhedstestning af rene kulturer, som er isoleret fra kliniske præparater (se også FUNKTIONSDATA OG PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER). Det er blevet foreslået, at direkte antimikrobiel følsomhedstestning kan udføres på blod- og urinkulturer. Disse test skal dog gentages og bekræftes med rene kulturer. 14-17 Testprocedure Beskrivelse af den direkte kolonisuspensionsmetode 6. 1. Sørg for, at en ren, frisk (= natten over) kultur fra et ikke-selektivt medium, såsom blodagar, er tilgængelig. 2. Til rutinemæssige følsomhedstest, kan inokulatet klargøres ved at lave en direkte saltvands- eller bouillonsuspension af kolonierne. 6 Justér straks denne suspension til samme klarhed som bariumsulfatstandarden (McFarland 0,5 standard) uden inkubation. Standardens og testinokulatets klarhed sammenlignes ved at holde begge rør op foran en hvid baggrund med tynde, sorte linjer, eller der kan benyttes et fotometrisk apparat. 3. Alternative metoder til klargøring af inokulat anvender anordninger, der muliggør direkte standardisering af inokulat uden justering af klarheden, såsom BD Prompt Inoculation System. Disse anordninger er fundet at være acceptable til rutinemæssige analyser. 18 4. Højst 15 minutter efter justering af inokulatets klarhed, stikkes en steril vatpind ned i det korrekt fortyndede inokulat og drejes flere gange kraftigt rundt mod glassets øvre inderside for at presse overskydende væske ud. 5. Hele pladens agaroverflade inokuleres tre gange, idet pladen drejes 60 mellem strygninger for at opnå jævn inokulering. 6. Låget må stå på klem i 3-5 minutter, men højst i 15 minutter, så en eventuel overfladefugt kan absorberes, inden skiverne imprægneret med antimikrobielle stoffer påføres. 7. Påfør skiverne vha. en antimikrobiel skivedispenser og anvend aseptiske forholdsregler. Anbring skiverne, så deres midte er mindst 24 mm fra hinanden. Når skiverne er placeret på agaren, skal de trykkes ned med en steril kanyle eller pincet, så de får fuldstændig kontakt med mediets overflade. Dette trin er ikke nødvendigt, hvis skiverne er påsat med en BD Sensi-Disc Self-Tamping dispenser. 8. Højst 15 minutter efter skiverne er påført, inverteres pladerne og placeres i en inkubator på 35 C. Pladerne må ikke inkuberes under forøget koncentration af kuldioxid. 9. Inkubér pladerne i16-18 timer. En hel 24-timers inkubationsperiode er nødvendig for Staphylococcus aureus med oxacillin til påvisning af methicillin-resistent S. aureus (MRSA) 19 og for Enterococcus-arter, når de testes med vancomycin for at påvise vancomycin-resistente stammer. Vækst indenfor den synlige hæmningszone indikerer resistens. 20 Resultater 1. Efter inkubation bør konfluent "plæne"-vækst være synlig. Hvis kun de isolerede kolonier vokser, var inokulatet for tyndt, og testen skal gentages. 2. Mål zonediametrene for fuldstændig hæmning (som vurderet med det blotte øje), inklusive diameteren på skiverne, til nærmeste hele millimeter vha. en passer, en lineal eller skabelon forberedt til dette formål. Måleanordningen holdes mod bunden af den inverterede plade over en sort, ikke-reflekterende baggrund, og belyses ovenfra. 3. Endepunktet skal være det område, der ikke viser vækst, der kan ses med det blotte øje. Se bort fra svag vækst af meget små kolonier, der kun vanskeligt kan ses nær kanten af den synlige hæmningszone. Staphylococcus aureus er en undtagelse, når den testes med oxacillin-skiver, og det samme er enterokokker, når de testes med vancomycin. I disse tilfælde skal transmitteret lys anvendes for at påvise en tåge af vækst om skiven, hvilket vises af "okkult-resistente" MRSA stammer 19 eller vancomycin-resistente enterokokker. 6 Med Proteus arter ses bort fra enhver form for sværm indeni zonen, hvis hæmningszonen er tydelig nok til at kunne måles. Med trimethoprim og sulfonamider, kan antagonisterne i mediet tillade let vækst. Derfor ses bort fra let vækst (20 % eller mindre af vækst-"plænen"), og den mere synlige margin måles for at bestemme zonediameteren. PA-254032.07-3 -
Beregning og tolkning af resultater Zonediametre målt rundt om skiverne skal sammenlignes med dem, der findes i tabellerne 2A til 2D i CLSI Document M100 (M2). 6 Resultaterne fra de specifikke organismer kan så rapporteres som resistente, intermediære eller følsomme. Bemærk: Informative supplementer til CLSI Document M2 eller reviderede versioner, der indeholder reviderede tabeller over antimikrobielle skiver og tolkningsstandarder, udgives jævnligt. De nyeste tabeller bør konsulteres for aktuelle anbefalinger. De komplette standard- og informative supplementer kan bestilles fra Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 USA. Telefon: +1-610-688-1100. FUNKTIONSDATA OG PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Mueller Hinton Agar er det standardmedium, der anvendes til følsomhedstestning af hurtigtvoksende aerobe eller fakultativt anaerobt bakterielle bakterier, såsom stafylokokker, enterokokker, medlemmer af Enterobacteriaceae samt aerobe gramnegative stave (f.eks. Pseudomonas-arter). Forskellige procedurer samt andre medier og tilstande er udviklet til analyse af kræsne arter, dvs. Haemophilus-arter, Neisseria-arter. og S. pneumoniae samt streptokokker. Den CLSI-standardiserede procedure anvendes ikke til analyse af obligat anaerobe organismer, organismer, der udviser dårlig eller langsom vækst på Mueller Hinton Agar, eller organismer, der udviser markeret stamme-til-stamme variation mht. vækstrate. 6 Kræsne organismer (f.eks. Haemophilus influenzae) skal analyseres som anvist i CLSI Document M2. 6 Med visse kombinationer af organismer og antimikrobielle stoffer har hæmningszonen måske ikke en skarpt afgrænset kant, hvilket kan føre til forkert tolkning. Ukorrekt inokulatkoncentration kan medføre ukorrekte resultater. Hæmningszonerne kan være for små, hvis inokulatet er for kraftigt, og de kan være for store og vanskelige at måle, hvis inokulatet er for tyndt. Ukorrekt opbevaring af antimikrobielle skiver kan forårsage styrketab og et falskt-resistent resultat. Overdreven skrumpning af mediet pga. ukorrekt opbevaring kan føre til falskt følsomme resultater. En organismes in vitro-følsomhed for et specifikt antimikrobielt stof betyder ikke nødvendigvis, at stoffet er effektivt in vivo. Se referencematerialet for hjælp til tolkning af resultater. 7,8 Bakterier, der kræver thymin eller thymidin, kan forekomme. 20,21 Disse organismer vokser måske ikke tilfredsstillende på Mueller Hinton Agar, der indeholder lave niveauer af thymin eller thymidin. Nye procedurer er blevet udviklet med brug af skiver med højt indhold af gentamicin (120 mg) og streptomycin (300 mg) til screening for resistens på højt niveau mod aminoglycosider som indikation for, at et enterokok-isolat ikke påvirkes synergistisk ved en kombination af et penicillin eller glycopeptid plus et aminoglycosid. 6,21,22 Se CLSI Document M2 og M7 for en fuldstændig diskussion af påvisning af MRSA, resistente enterokokker, ß-lactamase-producerende, gramnegative baciller med udvidet spektrum og andre testbegrænsninger. 23 Mueller Hinton II Agar er blevet vist som værende pålideligt til påvisning af MRSA, som producerer en tåget hæmningszone om oxacillin-skiver. 19 I tvivlstilfælde skal en ekstra metode, såsom BD Oxacillin Screen Agar, anvendes. Inokulationsmetoden, tolkning samt zonestørrelsernes grænser, der findes i dette dokument og 6, 24 i CLSI-standarden, kan afvige fra nationale standarder. LITTERATUR 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496. 2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5:91-100. PA-254032.07-4 -
3. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53:149-158. 4. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48:330-333. 5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.C. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC. 8. Thornsberry, C., T.L. Gavan, and E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society of Microbiology, Washington, DC. 9. Koch, A.E., and J.J. Burchall. 1971. Reversal of the antimicrobial activity of trimethoprim by thymidine in commercially prepared media. Appl. Microbiol. 22:812-817. 10. Ferone, R., S.R.M. Bushby, J.J. Burchall, W.D. Moore, and D. Smith. 1975. Identification of Harper-Cawston factor as thymidine phosphorylase and removal from media of substances interfering with susceptibility testing to sulfonamides and diaminopyrimidines. Antimicrob. Agents Chemother. 7:91-98. 11. Reller, L.G., F.D. Schoenknecht, M.A. Kenny, and J.C. Sherris. 1974. Antibiotic susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa: selection of a control strain and criteria for magnesium and calcium content in media. J. Infect. Dis. 130:454-463. 12. Pollock, H.M., B.H. Minshew, M.A. Kenny, and F.D. Schoenknecht. 1978. Effect of different lots of Mueller-Hinton Agar on the interpretation of the gentamicin susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 14:360-367. 13. D'Amato, R.F., and C. Thornsberry. 1979. Calcium and magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion susceptibility results. Current Microbiol. 2:135-138. 14. Wegner, D.L., C.R. Mathis, and T.R. Neblett. 1976. Direct method to determine the antibiotic susceptibility of rapidly growing blood pathogens. Antimicrob. Agents Chemother. 9:861-862. 15. Johnson, J.E., and J.A. Washington II. 1976. Comparison of direct and standardized antimicrobial susceptibility testing of positive blood cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 10:211-214. 16. Waterworth, P.M., and M. Del Piano. 1976. Dependability of sensitivity tests in primary culture. J. Clin. Pathol. 29:179-184. 17. Hollick, G.E., and J.A. Washington II. 1976. Comparison of direct and standardized disk diffusion susceptibility testing of urine cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 9:804-809. 18. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 19. Hindler, J.A., and C.B. Anderbied. 1985. Effect of the source of Mueller-Hinton agar and resistance frequency on the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 21:205-210. 20. Maskell, R., O.A. Okubadejo, R.H. Payne, and L. Pead. 1977. Human infections with thymine-requiring bacteria. J. Med. Microbiol, 11:33-45. 21. Haltiner, R.C., P.C. Migneault, and R.G. Robertson. 1980. Incidence of thymidinedependent enterococci detected on Mueller-Hinton agar with low thymidine content. Antimicrob. Agents Chemother. 18:365-368. 22. Murray, B.E. 1990. The life and times of the Enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 3:46-65. 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 24. Jorgensen, J.H., and J.D. Turnidge. 2003. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. PA-254032.07-5 -
Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. EMBALLERING/BESTILLING BD Mueller Hinton II Agar (Stacker 90 mm plates; [Standard size]) Kat. nr. 254032 Plademedier klar til brug, 20 plader Kat. nr. 254081 Plademedier klar til brug, 120 plader BD Mueller Hinton II Agar (150 mm) Kat. nr. 254062 Plademedier klar til brug, 20 plader BD Mueller Hinton II Agar, Square (120 x 120 mm) Kat. nr. 254518 Plademedier klar til brug, 20 plader YTTERLIGARE INFORMATION Kontakta närmaste BD-representant för ytterligare information. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD PA-254032.07-6 -