MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet December 2009 Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen BIOKEMI MED KEMI Å B O G A D E 34 OG W I L L E M O E S G A D E 15 Onsdag den 2. december 2009, kl. 09:00-15:00 Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner m/tom hukommelse. Metabolic Pathways, 22nd Edition, Sigma-Aldrich, 2003, udleveres. På eksamensbordet er fremlagt kuverter til aflevering samt gult kladdepapir og trefarvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det trefarvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Der udleveres 2 kuverter. Originalbesvarelsen puttes i kuverten med SORT påskrift og lukkes. Besvarelsen på gennemslagspapir puttes i kuverten med RØD påskrift og lukkes. Begge kuverter afleveres lukket med det indhold, som eksaminanden ønsker bedømt. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 2 Essayopgave Insulin og glukagon 1) Angiv, hvordan aktivt insulin er opbygget, og hvordan det dannes ud fra sit primære translationsprodukt (brug gerne en figur). Angiv, på baggrund af svaret, hvordan man med en blodprøvemåling kan bestemme frigivelse af insulin fra pankreas uden at måle koncentrationen af selve det aktive hormon. 2a) Angiv, hvordan binding af insulin til insulinreceptoren fører til intracellulær signalering. 2b) Stimulering af insulinreceptoren fører til øget optagelse af glukose i en række væv. Angiv mekanismen og angiv 3 væv, hvor glukoseoptagelsen er uafhængig af insulin. 3) Angiv insulins effekter på omsætning af glukose, fedt og aminosyrer i henholdsvis (i) lever-, (ii) muskel- og (iii) fedtvæv, og angiv de vigtigste regulerede enzymer. 4) Angiv, hvordan glukagon via glukagonreceptoren medfører fosforylering af fosforylasekinase og glykogensyntase, og redegør kort for hvilken betydning dette har i leverceller.
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 3 Opgave 1 1) Beskriv opbygningen og funktionen af et nukleosom. 2) Hvordan hjælper histon acetylerende transferaser (HAT) med at øge tilgængeligheden for de generelle transkriptionsfaktorer i det pakkede nukleosom?
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 4 Opgave 2 Aminosyrestofskifte 1) Hvad forstår man ved, at en person er i kvælstofbalance? Angiv en persontype som typisk er i positiv kvælstofbalance, og en persontype som typisk er i negativ kvælstofbalance. 2) Skitser, hvordan glutamat kan omdannes til glucose. 3) Phenylketonuri er et af de hyppigst forekommende eksempler på en medfødt stofskiftefejl. Hvad er årsagen til sygdommen? Hvilke signalmolekyler kan forekomme i nedsat mængde ved denne sygdom?
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 5 Opgave 3 β-galaktosidase, der følger Michaelis-Menten kinetik, er under bestemte laboratoriebetingelser karakteriseret ved parametrene K M = 1 mm og V max = 10 mm/min for spaltningen af laktose. a) Skitsér og forklar forløbet af en kurve der viser omsætningshastigheden af laktose katalyseret af β-galaktosidase som funktion af laktosekoncentrationen. Angiv K M og V max på kurven. b) Phenylethyl β-d-thiogalactopyranosid (PETG) er en kompetitiv inhibitor af β- galaktosidase. Tegn i samme koordinatsystem som ovenstående en kurve, der kvalitativt viser forløbet af spaltningen af laktose under indflydelse af inhibitoren. c) Definér, hvad der forstås ved en kompetitiv inhibitor, og skitsér en mulig model for hvordan inhibitoren binder sig til enzymet.
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 6 Opgave 4 von Willebrand faktor (vwf) spiller en central rolle for hæmostasen, og mangel på vwf kan derfor føre til alvorlig blødningstendens. Angiv og beskriv kort vwf s centrale funktion i: a) Den primære hæmostase (pladeaggregering) b) Den sekundære hæmostase (koagulationsfaktorkaskaden)
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 7 Opgave 5 Kokain (benzoylmethyleconine, C 17 H 21 NO 4 ) er et alkaloid isoleret fra bladene af kokabusken, Erythroxylon coca, der vokser i Sydamerika. Kokain stimulerer centralnervesystemet, undertrykker appetitten og skaber, hvad der er blevet beskrevet som en euforisk lykkefølelse og forøget energi. Skønt mest brugt som rusmiddel virker kokain også som bedøvelsesmiddel, hvortil det blev anvendt til øjen- og halskirurgi i 1800-tallet og tidligt i 1900-tallet. Strukturen af kokain er angivet nedenfor. 1) Identificer de funktionelle grupper i kokain. 2) Angiv strukturen af alle produkterne ved basisk hydrolyse af kokain. 3) Hvor mange asymmetriske kulstofatomer findes der i kokain? Angiv disse med en cirkel eller en stjerne.
Bilag. Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 8
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 9 Svar til essayopgave 1) Insulin dannes som præproinsulin i pankreas -celler. I ER omdannes præproinsulin til proinsulin ved enzymatisk fraspaltning af signalpeptidet (de 24 N-terminale aminosyrer). Efter foldning og dannelse af stabiliserende disulfidbroer overføres proteinet til Golgi-apparatet. I den distale del af Golgi (trans-golgi netværket, TGN) fraspaltes yderligere et internt peptidsegment, det såkaldte C-peptid eller connecting peptide, og derved opstår det færdige aktive insulin bestående af en - og en -kæde forbundet af to disulfidbroer. I forbindelse med insulins syntese dannes ækvimolære mængder af insulin og C-peptid, som begge kan måles i en blodprøve. Bestemmelse af C-peptidets blodkoncentrationen kan således anvendes som et mål for pankreas frigivelse af insulin; også når det drejer sig om patienter i behandling med eksogent insulin. 2a) Binding af insulin trækker insulinreceptordimerens to cytosolære -kæder (som er aktive tyrosinkinaser) tættere sammen, med det resultat at de fosforylerer hinanden (autofosforylering). Fosforyleringen skaber nye sites, som binder forskellige cytosolære (effektor) proteiner, der så igen fosforyleres (af -kæderne) med en signaleringskaskade som resultat. 2b) Den insulinmedierede glukoseoptagelse (her tænkes især på optagelse af glukose i muskelog fedtvæv) skyldes primært, at aktivering af insulinreceptoren fører til en translokation af den insulin-sensitive GLUT4-type glukosetransportør fra intracellulære vesikler til plasmamembranen, hvor de kan facilitere transport af glukose fra ekstracellulærrummet til cytosolen. Glukosetransportørerne i hepatocytter, erythrocytter og i hjerneceller er insulin-uafhængige. 3) Insulin er et hormon, der overvejende stimulerer anaboliske processer som fører til deponering af glykogen og fedt. Desuden stimulerer insulin indirekte proteinsyntese ved at øge optaget af aminosyrer i vævene. (i) Lever: Insulin fremmer glukoseoptagelse og lagring af glukoseenheder. Stimulation af insulinreceptoren aktiverer enzymer, som fremmer optagelse og lagring af glukose, glykolyse samt syntese af fedtsyrer og triglycerider, mens modsatrettede enzymer hæmmes. Insulin stimulerer endvidere de nævnte processer ved at øge transkriptionen af en række gener, som koder for centrale enzymer: For optag og lagring af glukose gælder det glukokinase, fosfofruktokinase-1 og pyruvat kinase; i glykolysen opreguleres syntesen af fruktose-2,6- bisfosfat, som aktiverer fosfofruktokinase-1, men hæmmer den glukoneogenesefremmende fruktose-1,6-bisfosfatase; og endelig fremmes fedtsyresyntese fra glukose gennem aktivering af acetyl CoA karboxylase (defosforylering af enzymet fører til aktivering) og opregulering af fedtsyresyntase enzymet. Carnitin-slusen hæmmes af malonyl-coa, og -oxidationen hæmmes, mens eksport af nysyntetiserede fedtsyrer i VLDL-partikler favoriseres. (ii) Muskelvæv: Insulin stimulerer optagelsen af glukose og har samme effekt på glukosemetabolismen og glykogensyntesen som i lever. Insulin øger det cellulære optag af aminosyrer, hvorved opbygning af protein stimuleres. Fedtsyreoptagelsen stimuleres ved aktivering af lipoproteinlipasen. (iii) Fedtvæv: I fedtvæv stimulerer insulin lipoproteinlipasen (endothelceller) og derved optagelsen af fedtsyrer fra blodet. Samtidig mindskes glukagons aktivering af den hormonsensitive fedtvævslipase, og lipolyse hæmmes. Endelig stimuleres glukoseoptagelsen, glykolysen og dermed dannelsen af glycerolfosfat, der er nødvendig i forbindelse med dannelse af triglycerider. 4) Glukagon er et hormon, der overvejende stimulerer kataboliske processer. Sekretionen af glukagon fra pankreas -celler øges som respons på faldende koncentration af glukose i blodet. Hensigten er at signalere til leveren, at glukose skal frigives til blodbanen for at
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 10 genoprette normalt blodsukker. Glukagon binder på overfladen af hepatocytter til en transmembran glukagonreceptor. Glukagonreceptorer er på intracellulær side af plasmamembranen koblet til G-proteiner. I resting state er G koblet til GDP. Idet glukagon bindes til receptoren, udbyttes GDP med GTP, og G -subunit-gtp løsrives. G -subunit-gtp aktiverer nu enzymet adenylyl-cyklase, der er associeret med plasmamembranen. Aktiv adenylyl-cyklase kan omdanne ATP til cyklisk AMP (camp) under fraspaltning af pyrofosfat. Herefter aktiveres Protein Kinase A (PKA) enzym, ved at camp binder til de regulatoriske enheder i enzymet, hvorefter de katalytiske enheder frigives som aktive enzymenheder. Aktivt PKA enzym kan herefter gå i gang med at fosforylere forskellige proteiner under forbrug af ATP, heriblandt fosforylasekinase (aktiv i fosforyleret tilstand) og glykogen syntase (inaktiv i fosforyleret tilstand). Fosforylasekinase kan i aktiv (fosforyleret) tilstand fosforylere glykogenfosforylase, hvorefter glykogenolysen sættes i gang. Glukoseenheder frigives ved glykogenolyse fra leveres glykogenlager til blodbanen. OBS: Hvis angivet med kursiv, kræves informationen ikke i den fuldstændige besvarelse
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 11 Svar til opgave 1 1) Nukleosomets centrale enhed består af histonproteinerne kaldet H2A, H2B, H3 og H4. Der er to af hver. Heromkring er der viklet ca. 200 DNA basepar, svarende til 2 omgange (coils). Histonproteinet H1 stabiliserer komplekset ved at binde sig på ydersiden af nukleosomet. DNA's pakning omkring nukleosomer øger DNA's pakningstæthed med ca. syv gange og muliggør, at den regelmæssige kromatinstruktur i de enkelte kromosomer kan dannes. 2) Histoner består af ca. 20 % basiske aminosyrer, hvilket formidler den effektive tætte pakning med det polynegative DNA. HAT's kan acetylere sidekæden på lysiner og argininer, hvorved sidekædens positive ladning neutraliseres. Herefter "løsnes grebet" om det bundne DNA og der bliver adgang til promoterregioner for de generelle transkriptionsfaktorer.
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 12 Svar til opgave 2 1. Ved kvælstofbalance er den mængde kvælstof, der indtages med kostens proteiner, den samme, som den mængde kvælstof der udskilles fra kroppen. Positiv balance ses hos børn i vækst og hos rekonvalescenter. Negativ balance ses hos fastende, sultende og hos dårligt kontrollerede diabetikere. (Et eksempel på hver type balance er tilstrækkelig besvarelse.) 2. Glutamat omdannes først til α-ketoglutarat I citratcyclus (TCA cyclus) omdannes α-ketoglutarat til oxaloacetat Oxaloacetat omdannes til malat, som transporteres ud af mitochondrierne I cytosol omdannes malat tilbage til oxaloacetat, som igen omdannes til PEP PEP gluconeogeneres til glucose (2 PEP-molekyler bliver til 1 glucosemolekyle) 3. Sygdommen skyldes nedsat aktivitet af enzymet phenylalanin hydroxylase. Enzymet katalyserer omdannelsen af phenylalanin til tyrosin, hvorfor der vil blive dannet meget mindre tyrosin, som er nødvendig for syntese af catecholaminerne (dopamin, noradrenalin og adrenalin).
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 13 a) Reaktionshastigheden af en enzymkatalyseret proces, der følger Michaelis-Menten kinetik, afhænger af substratkoncentrationen og nærmer sig V max når substratkoncentrationen bliver høj (hyperbolsk kurve). Ved meget høje substrat koncentrationer er reaktionen 0. orden dvs. den er konstant og uafhængig af substratkoncentrationen idet enzymet er mættet. Vi har her maksimal reaktionshastighed = V max. Ved meget lave substratkoncentrationer er reaktionen 1. orden dvs. hastigheden er proportional med substratkoncentrationen. Her er mængden af substrat begrænsende for katalysehastigheden og der er proportionalitet mellem substratkoncentration og hastighed. K M er substratkoncentrationen hvor hastigheden er V max /2, dvs. hvor enzymet er halvt mættet. (K M er et mål for enzymets affinitet for substratet.) a) og b) V (mm/min) V max = 10 mm/min + PETG (kompetitiv inhibitor) Begge kurver nærmer sig asymptotisk V max (K M ) K M = 1 mm [Laktose] (mm) b) Forløbet af spaltningen af laktose under indflydelse af PETG inhibitoren er vist med en stiplet kurve i ovenstående figur. For en kompetitiv inhibitor er V max uændret mens K M øges. c) Et enzym kan inhiberes kompetitivt af molekyler der i kemisk struktur er meget lig substratet (substratanaloger). Disse vil konkurrere med substratet om at binde i enzymets substratbindende site (active site). Den kompetitive reversible hæmmer udelukker altså substratet fra det active site og dermed vil den tilsyneladende K M for reaktionen med inhibitor øges, idet der skal flere substratmolekyler til for at opnå en halvmætning af enzymet - dvs. enzymet har tilsyneladende lavere affinitet for substratet. Substrat Kompetitiv inhibitor
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 14 Svar til opgave 4 a) Når der opstår skade på et blodkar, blottes det subendoteliale væv, som cirkulerende vwf derefter binder til. vwf binder samtidigt til et protein på thrombocytmembranen (gpib/ix) og denne binding fungerer som et anker, der er afgørende for at thrombocytten ikke bliver revet med af blodstrømmen. Uden vwf bliver den primære hæmostase altså væsentligt svækket. b) En meget stor del af Faktor VIII er i blodet bundet til vwf. Når vwf, som beskrevet ovenfor, bindes til det subendoteliale væv, følger Faktor VIII altså med og bliver på den måde opkoncentreret på skadestedet, hvor den spiller en altafgørende rolle som accelerator for dannelsen af Faktor Xa. Mangel på vwf kan af samme årsag nærmest få karakter af Faktor VIII mangel.
Eksamen i Biokemi med kemi december 2009 side 15 Svar til opgave 5 1) 1 amin, 1 aromatisk ring og 2 estre 2) 3) Der er 4 (fire) asymmetriske kulstofatomer i kokain.