Biologisk vækstregulering af potteplanter

Biologisk vækstregulering af potteplanter Potteplanter kan ikke sælges, hvis de er høje og ranglede. Derfor behandles de med vækstregulerende sprøjtemidler i gartnerierne. Disse sprøjtemidler udfases, så der er behov for et alternativ. En bakterie, som lever sammen med planter i naturen, indeholder gener, som kan regulere strækningsvæksten hos Kalanchoë. Af Renate Müller, Brian Christensen, Henrik Lütken og Inga Christensen Bach Danmark er et af de lande i verden, der producerer flest potteplanter. Størstedelen af produktionen eksporteres, og ifølge brancheorganisationen Dansk Gartneri udgjorde værdien af denne eksport ca. 2,7 milliarder kroner i 2012. Der produceres mange forskellige slags potteplanter i danske væksthuse, men Kalanchoë blossfeldiana, også kaldet Koraltop, Brændende Kærlighed eller bare Kalanchoë er den potteplante, der produceres flest af i danmark - omkring 40 millioner potter om året (Figur 1). I danske væksthusgartnerier tilstræbes miljøvenlig produktion, hvor der spares så meget som muligt på ressourcer, der koster dyrt og sætter miljømæssige fodaftryk (Figur 2). Den perfekte potteplante - Kort er godt Der er én type sprøjtemidler, som gartnerne har meget svært ved at undvære i produktionen af potteplanter. Det er kemiske vækstreguleringsmidler, populært kaldet stråforkortere, og af gartnere kaldet kemiske retarderingsmidler. De aktive stoffer i disse sprøjtemidler er analoger eller inhibitorer til naturlige plantehormoner, som regulerer strækningsvækst. Et stort forbrug af kemiske vækstreguleringsmidler belaster miljø og arbejdsmiljø, og indenfor ganske få år forventes det, at mange af de vækstregulerende sprøjtemidler mister godkendelse og forsvinder fra markedet. En anden negativ effekt er, at potteplanter, der er sprøjtet med kemiske vækstreguleringsmidler, ofte har dårligere holdbarhed end usprøjtede planter. Figur 1. En forædlet sort af Kalanchoë blossfeldiana - et resultat af krydsning og udvælgelse. Arten har normalt kun fire kronblade, men denne sort har fyldte blomster. Foto: Knud Jepsen a/s 1 Januar 2014

Figur 2. Potteplanteproduktion i moderne væksthus. I danske produktionsvæksthuse er der avancerede gardinsystemer for at spare på den fossile energi, og både vand og næringsstoffer recirkuleres for at undgå spild. Så vidt muligt, bruges biologisk bekæmpelse af skadedyr, og svampesygdomme forebygges bl.a. ved at styre luftfugtighed og temperatur optimalt og ved omhyggelig hygiejne. Forbruget af pesticider er derfor lavere end i væksthusgartnerier i mange andre lande. Foto: Knud Jepsen a/s. Det danske gartnerierhverv søger med lys og lygte efter alternativer til kemisk vækstretardering, for forbrugere og distributører kræver potteplanter med lang holdbarhed, kompakt vækst og mange sidegrene. Det miljøvenlige alternativ For at opretholde og sikre det danske gartnerierhvervs konkurrencedygtighed er det nødvendigt at udvikle nye metoder som alternativer til kemisk vækstregulering. Der er udført mange forsøg på at regulere potteplanternes strækningsvækst ved hjælp af klimastyring, mv., men metoderne virker ikke lige godt for alle plantearter. Der er også lavet forsøg med mekanisk vækstregulering, hvor væksthusgartnere forsøger at efterligne miljøet udendørs. I naturen påvirkes planter af vind og vejr, og især vindens rusken får planter til at forstærke cellevæggene, så de bliver lavere og mere robuste. Ved at ryste planterne eller udsætte dem for berøring - i praksis ved sætte en maskine til at trække en dug af gummi, fiber eller tekstil henover planterne adskillige gange i døgnet - kan man i nogen grad reducere potteplanters strækningsvækst, men ikke nok og ikke uden slidskader på blade og knopper. Den optimale løsning er at udvikle nye sorter, hvor planterne har en genetisk betinget vækstregulering, eller med andre ord, arveanlæg, som gør, at planterne ikke bliver lange og ranglede. Det har også den fordel at planterne forbliver kompakte hos forbrugeren, og ikke bliver lange og ranklede i vindueskarmen eller i krukkerne på terrassen. Spørgsmålet er om den fornødne kompakthed er til stede i det naturlige reservoir af genetiske anlæg i vores populære prydplanter, den såkaldte genpool. For mange plantearter er der endnu ikke fundet gener, som svarer til de dværggener, som findes i moderne kortstråede sorter af hvede, byg og andre kornarter. Hvis der ikke findes dværggener i de plantearter, som vi dyrker som potteplanter, kan vi så finde gener, der giver kompakt plantevækst i andre organismer? Kan vi få hjælp fra bakterier? Planters vækst og udvikling styres af plantehormoner - lavmolekylære organiske forbindelser, der har stor effekt selv i meget lave koncentrationer. Det er især forholdet mellem cytokininer og auxiner, der er involveret i dannelse af sideskud og rødder, og gibberelliner, der styrer strækningsvækst, mens ethylen får blomster til at visne og blade til at falde af. Figur 3. Planter inficeret med bakterien Agrobacterium rhizogenes udviser en typisk respons, som kaldes forskere kalder for hairy root phenotype. Disse rødder vokser kraftigt, kan dyrkes uafhængigt fra planten i sterilkultur. 2 Januar 2014

Figur 4. Naturlig transformering i Kalanchoe. Billedserien viser processen fra dyrkning af bladvæv, som er podet med Agrobacterium rhizogenes, til slutresultatet - en hel plante med gener fra bakterien. Bladstykker, som er blevet podet med Agrobacterium rhizogenes, danner hairy roots fra de bladceller, som bakterien har inficeret. Disse rødder flyttes til et andet dyrkningsmedium, som får rodcellerne til at danner små grønne grønne skud. Skudene flyttes til nyt dyrkningsmedium, hvor de vokser videre og danner rødder. Når planterne har fået en vis størrelse, tages de ud af det sterile miljø og plantes i pottemuld. Derefter kan deres vækst sammenlignes med tilsvarende planter med samme genotype bortset fra de gener, som bakterien har sat ind. På det sidste billede ses en plante med rol-gener (til venstre) og en kontrolplante uden rol-gener. (til højre.) Galler på egeblade og heksekoste i birketræer er eksempler på, at andre organismer, her et insekt og en svamp, kan påvirke hormonbalancen i plantevæv, så vækstformen ændres. De naturligt forekommende jordbakterier af slægten Agrobacterium kan inficere planteceller og fremkalde svulster (galler) på stængler og rødder hos nogle plantearter (Figur 3). Det særlige ved disse bakterier er, at de påvirker plantecellernes hormonbalance ved at indsætte gener, som koder for hormonlignende stoffer, i plantens kromosomer. Infektion med Agrobacterium tumefaciens er årsag til plantesygdommen rodhalsgalle, mens Agrobacterium rhizogenes kan inficere planterødder og forårsage vækst af såkaldte hairy roots ved infektionsstedet. Ændring i røddernes morfologi efter infektion med Agrobacterium rhizogenes skyldes især fire gener, som bakterien sætter ind i plantecellernes arvemasse. Disse gener kaldes for rol-gener, og rol står for root loci. Desuden bliver der overført to gener, som er involveret i auxinmetabolisme og gener som har indflydelse på, hvordan planterne reagerer på plantehormoner og dermed på planternes morfologi på celleniveau. De gener, som Agrobacterium rhizogenes kan overføre til planter, kan være placeret i to separate T-DNA (Transfer-DNA) på bakteriens Ri-plasmid og kan sætte sig ind i uafhængigt af hinanden i plantens DNA. På Københavns Universitet arbejder vi med en udgave af den naturligt forekommende stamme af Agrobacterium rhizogenes. Vi skaber optimale betingelser for bakteriens vækst og understøtter demed, at bakterien kan overføre rol-gener til planteceller i laboratoriet. Ligesom i naturen resulterer infektionen med bakterien og integration af de nye gener i dannelse af hairy roots. Ved at dyrke planteceller i vævskultur (in vitro) under sterile forhold og med tilføjelse af de fornødne hormoner på det rigtige tidspunkt kan vi regenerere hele planter fra enkeltceller. Anderledes sagt er man nødt til at få disse rødder til at danne hele planter. Agrobacterium rhizogenes kan inficere mange forskellige plantearter, men det kan være en stor udfordring at regenerere hele planter fra f.eks. træagtige planter. Effekt af rol-gener i planter Kalanchoë blossfeldiana med rol-gener udviser ændringer i mange egenskaber (Figur 4). Vi har observeret store forskelle mellem de producerede linier, men generelt er de mest markante ændringer, at planterne har korte internodier, øget forgrening og forbedret roddannelse. Spørgsmålet er, om vi kan bruge nogle af de ændringer, som rol-generne 3 Januar 2014

planter, for at finde de planter, som har fået overført de nye gener. Transformerede planter selekteres ved at tilsætte antibiotika til dyrkningsmediet, så kun transformere planter med selektionsgen og de øvrige indsatte gener kan vokse. Når vi benytter den naturligt forekommende stamme af Agrobacterium rhizogenes er der ikke behov for antibiotikaresistensgener, fordi celler, som har fået indsat rol-gener, danner de karakteristiske hairy roots som nemt kan udvælges på grund af deres udseende. Alle planterne, der regenereres fra hairy roots, har fået de ønskede rolgener, så derfor er der ikke behov for at selektere ved hjælp af antibiotikaresistensgener eller andre selektionsgener. Figur 5. Kalanchoë indeholdende rol-gener fra Agrobacterium rhizogenes kan udvise forskellige grader af kompakthed. Mens planten til højre er meget hæmmet i sin vækst - for meget til at være attraktiv for forbrugeren og for langsomt voksende for producenterne - er planten i midten tættere på at være fremtidens potteplante, der kan produceres uden kemisk vækstregulering. forårsager, til at forbedre kvaliteten af potteplanter. Nogle af de nye linier af Kalanchoë blossfeldiana med rol-gener med korte internodier og kompakt vækst ser meget lovede ud. Afkomsanalyser har vist, at egenskaben kompakt vækst kan overføres til næste generation. Analyserne viste også, at effekten af de indsatte gener kan fortyndes ved at krydse med udgangsformen uden rolgener, så for kraftig effekt af rol-generne kan reduceres i næste generation. Effekten af de indsatte gener afhænger bl.a. af deres placering i plantens genom og af antallet af indsatte T-DNA. Bakterien kan indsætte det ene eller begge T-DNA fra bakteriens plasmid, og der kan indsættes flere kopier af samme T-DNA. De regenererede planter er altid heterozygote mht. de indsatte gener, og ligesom for plantens egne gener, sker der udspaltning af indsat T-DNA i afkomsgenerationerne efter Mendels principper. Ved at krydse og selektere ønskede fænotyper i flere omgange, opstår der en mangfoldighed mht. egenskaber. På denne måde er det muligt at få lige præcis så kompakt vækst, som man ønsker (Figur 5). Kompakte genotyper af Kalanchoë blossfeldiana med rol-gener indgår nu i konventionelle forædlingsprogrammer. Det er et stort skridt mod produktion af potteplanter uden kemisk vækstregulering og dermed et sundere arbejdsmiljø for gartnerne og reduceret miljøbelastning. Selektion af transformanter Selv om de kompakte Kalanchoë med rol-gener er frembragt ved en genetisk transformation, indeholder de ikke de såkaldte selektionsgener. Ofte indsættes der antibiotikaresistensgener, når der fremstilles gensplejsede Forbedret holdbarhed Potteplanter, der er behandlet med kemiske vækstreguleringsmidler, har ofte dårligere holdbarhed end usprøjtede planter. Man kunne frygte, at det samme gør sig gældende for transformerede planter med kompakt vækst, som vores Kalanchoë indeholdende de nye rol-gener. Holdbarhedstesten med Kalanchoë linierne indeholdende rol-gener overraskede imidlertid med det modsatte. De enkelte blomster havde en bedre holdbarhed, og planter holdt sig pæne i længere tid. Det var en stor overraskelse, at planterne, som indeholdt de nye rol-gener, udviste en nedsat følsomhed overfor ethylen. Det er en egenskab, som alle forædlere ønsker sig for deres sorter. Den forbedrede holdbarhed og den nedsatte følsomhed overfor ethylen antages at skyldes ændringerne i planternes hormonbalance. Nærmere undersøgelser af effekten af de individuelle rol-gener og deres effekt på plantens hormonbalance er i gang. Vi arbejder desuden på andre plantearter, for at kunne udnytte denne lovende metode. En øget viden om de mekanismerne, der ligger bag den forbedrede holdbarhed i planter med rol-gener, kan bidrage til forædlingen af planter med bedre kvalitet. Denne viden kan gavne både traditionel og molekylær forædling. Perspektiver Da planter med rol-gener fra den naturligt forekommende jordbakterie Agrobacterium rhizogenes udviser både kompakt vækst og øget holdbarhed, kan indsættelse af rol-gener i planternes arvemasse være et alternativ til både kemiske vækstreguleringsmidler og holdbarhedsmidler. Vores Kalanchoë med rol-gener er fremkommet ved en naturlig proces. De falder derfor udenfor definitionen på GMO i EU s udsætningsdirektiv, der regulerer godkendelsen af gensplejsede planter. Dermed begrænses teknologiens anvendelse ikke af en meget omkostningstung godkendelsesprocedure. Vi forventer at lignende gode resultater kan opnås ved at indsætte rol-gener i andre økonomisk vigtige prydplanter. Denne metode har dermed potentiale til at blive fremtidens alternativ til at regulere potteplanters vækst med kemiske vækstreguleringsmidler. 4 Januar 2014

Referencer og videre læsning Lütken, HV, Wallström, SV, Jensen, EB, Christensen, B & Müller, R (2012) Inheritance of rol-genes from Agrobacterium rhizogenes through two generations in Kalanchoë. Euphytica vol 188, nr. 3, s. 397-407. Lütken, HV, Clarke, JL & Müller, R (2012) Genetic engineering and sustainable production of ornamentals: current status and future directions. Plant Cell Reports vol 31, nr. 7, s. 1141-1157. Christensen, B, Sriskandarajah, S & Müller, R (2009) Biomass distribution in Kalanchoe blossfeldiana transformed with rol-genes from Agrobacterium rhizogenes. HortScience vol 44, nr. 5, s. 1233-1237. Christensen, B, Sriskandarajah, S, Serek, M & Müller, RPB (2008) Transformation of Kalanchoe blossfeldiana with rol-genes is useful in molecular breeding towards compact growth. Plant Cell Reports vol 27, nr. 9, s. 1485-1495. Om forfatterne Renate Müller Professor og leder af forskergruppen, Floriculture and Translational Plant Science ved Instititut for Plante- og Universitet. Henrik Lütken Lektor og forsker i forskergruppen, Floriculture and Translational Plant Science ved Instititut for Planteog Universitet. Brian Christensen R&D specialist ved AgroTech A/S, Institut for Jordbrugs- og Fødevareinnovation, Taastrup. Inga Christensen Bach Kommunikationsmedarbejder ved Instititut for Plante- og Universitet og skrivende redaktør af Planteforskning.dk Specialer der har bidraget til denne forskning Line Jensen: Agrobacterium rhizogenes transformation and expression studies of rol genes in Kalanchoë species and hybrids Martin Himmelboe: Transformation of Ornamentals and Medicinal Plants of Crassulaceae with rol genes Jaime Pérez Molina: Natural Transformation in an Environmental Perspective Denne artikel er produceret med støtte af Undervisningsministeriets udlodningsmidler. 5 Januar 2014