Fotosyntetisk produktion af hydrogen med genmodificerede mikroorganismer

Fotosyntetisk produktion af hydrogen med genmodificerede mikroorganismer Forskerspirer 2009 Hovedområde: NAT Niels Christian Sanden ncsanden@hotmail.com Forskerkontakt: Poul Erik Jensen Værtsinstitution: KU LIFE Side 1 af 17

Projektets formål: At lave en genfusion mellem hydrogenase og Photosystem I. Projektet går ud på at producere energi ud fra sollys og vand. Energien skal kunne lagres, transporteres og bruges som brændstof med den teknologi vi har i dag. Hydrogen opfylder i dag disse krav, og der et stort udviklingspotentiale. Kan man producere hydrogen ud fra sollys og vand? Nogle planter og bakterier kan under visse betingelser. Projektet går ud på at ændre disse planters genetiske sammensætning vha. bioengineering, således at de kan bruges til en reel produktion af hydrogen. Helt konkret gøres dette gennem en genfusion mellem photosystem I og en hydrogenase. Indledning: Kravet om alternative energikilder vokser dag for dag. Vi er slet ikke gode nok til at udnytte solens energi. På en time modtager jorden lige så meget energi fra solen, som hele verdens befolkning bruger på et helt år. Godt nok er energitætheden i sollys meget ringe sammenlignet med olie. Dette gør det sværere at opsamle energien fra solen, men bliver vi i stand til at udnytte solens energi bedre, har vi pludselig adgang til nærmest ubegrænsede energimængder. Problemet med de metoder vi i dag benytter til opsamling af solenergi (solfangere, solceller) er, at energien er en del sværere at udnytte, end de fossile brændstoffer vi er vant til. Det største problem er, at energi som strøm er vanskelig at lagre og som varme vanskelig at transportere. Brint er et lovende bud på fremtidens brændstof. Det ville derfor være et kæmpe skridt, hvis det blev muligt at producere brint ud fra vand og sollys. Endvidere er der kun begrænsede mængder af de ressourcer (metaller og andre stoffer), man skal bruge til at fremstille de solfangere der bruges i dag. Dvs. vi kan aldrig dække vores energibehov med kendt solfangerteknologi. Planter har gennem millioner af år udviklet et sindrigt system til opsamling af solens energi. Det giver derfor god mening at lede efter en måde at udnytte fotosyntese til produktion af energi på. Optimalt set skal det foregå på en måde, hvorpå energi lagres direkte i brint, så man undgår Side 2 af 17

yderligere energitab ved fx elektrolyse af vand. Cyanobakterier var for 3,5 mia. år siden de første organismer, der udførte fotosyntese med vandspaltning og iltudvikling. Enzymer, kaldet hydrogenaser, findes bl.a. i cyanobakterier. Disse enzymer producerer dihydrogen ud fra den energi, der modtages fra solen. Oprindeligt kunne der veksles mellem CO 2 -fixation og hydrogenproduktion, men efterhånden som CO2 niveauet er steget, er muligheden for H 2 -produktion gradvist blevet undertrykt, således at den i nutidens cyanobakterier kun virker som en overtryksventil der kan hjælpe bakterien med at overleve i situationer, hvor der pludselig tilføres en stor mængde lysenergi. Desuden er hydrogenaserne meget iltintolerante. Dette betyder i praksis, at cyanobakterierne kun producerer H 2 et par sekunder, når de pludselig udsættes for lys. 1 Der er imidlertid potentiale i at udnytte denne egenskab til energiproduktion. Det gælder bare om at finde måder at ændre og forbedre denne proces på. Et område, der forskes meget i, er at gøre hydrogenaserne mere ilttolerante. En anden mulighed er at forbinde hydrogenaserne tættere til photosystem I, hvor de får energien fra. Målet med denne opgave er et forslag til en mulig forbedring af denne proces. Side 3 af 17

Udnyttelse af biokemiske processer til energiproduktion: Der omsættes energi i mange biokemiske processer (fig. 1), men for hvert led energien løber gennem tabes der en smule. Derfor giver det bedst mening at prøve at opsamle energien så tæt på stedet, hvor den bliver tilført, som muligt. I en plantecelle eller cyanobakterie tilføres der energi i form af lys (fotoner) ved de fotokemiske processer i chloroplasterne (fig 2.). Figur 1. Den biologiske energiomsætningen for en plantecelle. De to vigtigste processer i biologisk energiomsætning er respiration, der forgår i mitokondrierne, samt fotosyntese, der foregår i chloroplasterne. Området med rødt markerer Photosystem I og II hvor fotonerne indfanges (fig 2). Side 4 af 17

Figur 2. Reaktionscenteret for de fotokemiske processor. Dette består primært af photosystem II og I (PSII og PSI). De grønne områder er antennerne, hvor lyset opfanges af chlorofylkomplekserne (P680 og P700). I dette projekt er det vigtigste bindingsstedet for ferrodoxin (Fd), hvor elektronen transporteres væk og kan bruges af hydrogenase. De fotokemiske processer i planter foregår i Photosystem I og II (fig. 2). Energien opsamles ved at en elektron fra P680 eksiteres. Før P680 falder tilbage til den stabile tilstand når pheophytin at løsrive elektronen fra P680, hvorefter den bevæger sig gennem elektronhenfaldskæden til procescenteret i PS I. Ved hvert led mister elektronen en smule af dens potentielle energi. I PS I eksiteres elektronen yderligere hvorefter den gennem en anden kæde bevæger sig ud af PS I og ender i et ferrodoxinmolekyle(fd). Fd-molekylet virker som transportør af elektronen, som herved kan ende flere forskellige steder. I de fleste tilfælde vil elektronen blive brugt til at reducere NADP + til den biokemiske energibærer NADPH i enzymet FNR (Ferrodoxin NADP + -reductase). I få tilfælde transporterer Fd-molekylet elektronen tilbage til et led i kæden mellem PS II og PS I. 2 I cyanobakterier eksisterer muligheden for at elektronen ender i en hydrogenase og derved bliver brugt til at reducere 2H + til H 2 (bruger 2 elektroner). Side 5 af 17

Figur 3. PS I består af 17 subunits. Lhc (light harvesting complex) er de proteiner, der indeholder chorofylmolekylerne, der indfanger solens energi. Valg af subunit: PS I består af 17 subunits (fig. 3), der alle har forskellige funktioner. Hver subunit er ét protein, derfor er den genetiske kode for en subunit en sammenhængende gensekvens. For dette projekt er det essentielle sted på denne figur bindingsstedet for Fd. Hydrogenasen skal fusioneres til en subunit, der ligget tæt på bindingsstedet og samtidig er velegnet til genmanipulation. Subunit J er den bedste mulighed: Den ligger langs med PS I med den ene ende tæt på Fd bindingsstedet (figur 3 er meget skematisk, i virkeligheden ligger den tættere på end illustreret) Stedet, hvor et protein starter, kaldes N-terminalen, og stedet, hvor det slutter, C-terminalen. Begyndelsen af et gen svarer til N-terminalen og enden til C-terminalen. C-terminalen for J ligger tæt på Fd-bindingsstedet, derfor er det nemt at fusionere hydrogenasen på her. Da hydrogenasen fusioneres på for enden af en kæde af aminosyrer, bliver kun en meget lille del af J berørt af genfusionen. Det er derfor sandsynligt, at ingen vitale funktioner i PS I bliver ødelagt, og den derfor kan fungere som normalt på trods af modifikationen. Side 6 af 17

Valg af hydrogenase: Hydrogenase er et enzym der katalyserer processen hvor to protoner med to elektroner reduceres til dihydrogen. Hydrogenaser består af en eller flere subunits. Hydrogenaser kommer oprindeligt fra cyanobakterier, men også nogle grønalger har hydrogenaser. Grønalgen Chlamydomonas har en velegnet hydrogenase til dette projekt. Chlamydomonas hydrogenase har flere fordele: Den er simpel, idet den består af kun en subunit. Den er desuden en af de mest effektive hydrogenaser, man kender, med en effektivitet på op mod 2000 H 2 pr. sek. Derudover er genet for hydrogenasen kendt. 3 Valg af cyanobakterie: Prochlorococcus er den mindste (~0,6 μm) kendte organisme, der er i stand til at lave fotosyntese. Den har det korteste genom af alle cyanobakterier. Genomet er blot 1,6 mio. bp langt. En stor del af Prochlorococcus' pigment er chlorofyl a. I Chlamydomonas er der ligeledes mest chlorofyl a. Endvidere stammer de fotosyntetiske komplekser i alger og planter fra cyanobakterier, og der er store ligheder i opbygningen af eksempelvis PS I i alger og cyanobakterier. Dette betyder, at PS I i Prochlorococcus ligner PS I i Chlamydomonas, hvorved der er større sandsynlighed for, at genmanipulationen virker. At Prochlorococcus er så simpel, gør den også nem at arbejde med. Den er herudover verdens mest almindelige cyanobakterie, så der er nem adgang til den. Hele genomet for Prochlorococcus er kendt. 4 Denne række af fordele gør cyanobakterien meget velegnet til dette projekt. Side 7 af 17

Genfusionen: Figur 4. Mål for genfusionen: H 2 -ase sidder tæt på Fb bindingsstedet, forbundet til subunit J med en kæde (link) af aminosyrer. Mål med fusion: Figur 4 viser en skitse af målet med genfusionen. Hvor hydrogenasen i den oprindelige bakterie bevæger sig frit i cytoplasmaet, er den her sat fat på PS I tæt på Fd's bindingssted. Resultatet af fusionen er, at: a) For hvert PS I kompleks kommer der en hydrogenase. b) Hydrogenasen kommer tættere på bindingsstedet for Fd. Sandsynligheden for, at den eksiterede elektron bliver brugt til at lave hydrogen i hydrogenasen, bliver derfor langt større. Dette skulle gerne resultere i, at den genmodificerede cyanobakterie har en højere nettoproduktion af hydrogen end de organismer, der oprindeligt indeholder hydrogenaser. Side 8 af 17

Fremgangsmåde: 1. Undersøgelse af genomerne for J og hydrogenasen: Generne undersøges for at finde et sted hvor det er muligt at isolere den ønskede sekvens vha. et sæt primere. Et protein består af aminosyrer, tre basepar i en DNA-sekvens koder for en aminosyrer. 5 En subunit af et protein er kodet gennem en uafbrudt sekvens. Dvs. at de funktioner, der skal fusioneres, udtrykkes i form af to uafbrudte sekvenser. En primer er en RNA-streng, der bruges ved replikation af DNA, da enzymet der katalyserer denne proces, DNA-polymerase, kun kan bygge videre på en allerede eksisterende streng 6. Grundet de mange kombinationsmuligheder, de 4 baser giver, er primere efter en vis længde (18-28 bp) specifikke for netop ét sted på genomet. Genomerne skal altså isoleres mellem to gensekvenser, der svarer til et sæt primere. 2. Isolation af J og hydrogenase: Ved at opvarme DNA'et fra hele genomet til 95ºC splittes DNA op i enkeltstrengede stykker. Herefter nedkøles blandingen til 60ºC, hvor primerne binder sig til de to strenge. Herefter opvarmes til 72ºC hvor polymerase virker. Ud fra det primersæt, der passer på det gen, vi ønsker at isolere, danner polymerasen DNA-strengen fra det sted, der er komplementært til primeren. Der er nu to stykker DNA, hvor den ene streng i hver af stykkerne starter ved hver deres ende af genet, der ønskes isoleret. En gentagelse af denne procedure giver fire stykker DNA, hvor den ene streng i to af stykkerne, netop svarer til genet, der skal isoleres. I 3. cyklus dannes der otte stykker DNA, hvoraf to kun indeholder genet der ønskes isoleret. Processen kaldes PCR (Polymerase Chain Reaction) (fig. 5) og ved at gentage denne, fås en eksponentielt voksende mængde af det isolerede gen. Processen gentages derfor 20 til 40 gange. Herefter er generne for hydrogenasen og J isoleret. Side 9 af 17

Figur 5: PCR: En gensekvens (target) isoleres. 1. Denaturering ved opvarmning til 95º C 2. Primere binder sig til strengene ved 72 º C. 3. DNA-polymerase danner en ny streng ved 60 º C. 3. Fusion af generne: Ved at tilsætte restriktionsenzymer kan DNA-strengene klippes op på steder, hvor enderne passer sammen. Ligesom primere er restriktionsenzymer specifikke. Dvs. at det er muligt at finde et sted på hvert af generne, hvor en sekvens på 6 baser er den samme. Der vælges restriktionsenzymer, der ikke spalter mellem samme basepar i øvre og nedre streng. Herved vil enden af dobbeltstrengen have en øvre eller nedre streng, der først slutter 3-5 bp efter den modsatte. Herved dannes der såkaldte sticky-ends. 7 Restriktionsenzymerne er valgt således, at gensekvensen for hydrogenasens sticky-end er komplementær til den ene sticky-end af Side 10 af 17

gensekvensen for den lille kæde af aminosyrer, der indsættes mellem hydrogenase og J. Ligeledes skal sekvensen for J's sticky-end modsvare den anden ende af aminosyrekædens. Når generne er delt i stykker hvis sticky-ends modsvarer hinanden, tilsættes enzymet ligase, der sætter generne sammen (fig. 6). Figur 6: Fusion af gener med ligase. Disse trin gentages, så gensekvensen ud over generne for hydrogenasen og J indeholder: a) genet for kanamycinresistens for at muliggøre selektion senere. b) ca 1000 bp i hver ende der er identiske med sekvenser i genomet for Chlamydomonas, dette sørger for at genet senere bliver genkendt og optaget i organismen. Gensekvensen ser nu således ud: 1000 bp--- J AAAAA H 2 -ase --- KanR --1000 bp Hvor koderne for J og hydrogenasen kun er adskilt af koden for aminosyre-linket. Side 11 af 17

4. Indsættelse i Prochlorococcus, opformering og selektion: Ved hjælp af en vektor indsættes genet nu i cyanobakterien Prochlorococcus, hvorefter den genmanipulerede bakterie opformeres (fig. 7). En vektor er et stykke DNA, der bruges til at indsætte en gensekvens i en organisme. I vektoren erstattes genet for subunit J med det modificerede gen. Resten af vektoren svarer til noget af det oprindelige DNA i Prochlorococcus. Herved bliver det gen, der i forvejen sidder i bakterien, erstattet af det nye. Efter vektoren er overført til bakterien, opformeres den, hvorved der dannes en del, der indeholder det nye gen, og mange, der ikke gør. Herefter tilsættes kanamycin (et antibiotikum) hvorved de af bakterierne, der ikke indeholder genet, dør, da kun de genmodificerede organismer er kanamycinresistente. Figur 7 (a) Rekombination af vektor med det modificerede gen. (b) Indsættelse af vektor i Prochlorococcus. (c) Selektion af individer der indeholder vektoren vha. kanamycin Side 12 af 17

Kontrol af produkt: Gensekventering: Gennem hele genmanipulationen foretages der løbende gensekventering. Dvs. der tjekkes, om baserne sidder i den rækkefølge, de skal. Der findes flere metoder til gensekventering. SDS-page: Ved SDS-page folder man proteinerne ud og trækker dem gennem en gél vha. af elektrisk spænding. De længste proteiner bevæger sig langsommere gennem gelen end de korteste. Herved bliver proteinerne delt i bånd, hvor de tungeste er øverst og de letteste nederst. H 2 -asen vejer 50000 Dalton (1 Dalton = 1 g/mol), subunit J vejer 5000 Da. I en opløsning, hvor PS I er oprenset vil man kunne se bånd for hver subunit. Ud fra en sammenligning af SDS på PS I uden H 2 -ase og PS I med H 2 -ase genfusioneret på skulle det være muligt at se en forskel i vægt. SDS-page er en nem og billig analysemetode. Figur 8 Resultat af SDS-page Rød markering er PS I. Banen helt til venstre er størrelsesmarkør, fra top: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 og 10 KDa H 2 -kromatografi: Dette vil være en endelig funktionel analyse af produktet. Er fusionen lykkedes, burde der være en højere produktion af hydrogen ved de genmodificerede bakterier end ved de oprindelige. Dette kan måles ved at dyrke kulturer af hhv. den genmodificerede og den naturlige chlamydomonas. Ved at holde bakterierne i et lukket system kan hydrogenproduktionen let måles med en gaskromatograf, der måler mængden af hver luftart i den blanding, der undersøges. Side 13 af 17

Diskussion af metode: Denne metode er en sikker måde at få sat genet ind i bakterien på. Herefter er det sandsynligt, men ikke sikkert, at det bliver optaget og nedarvet til de næste generationer af bakterien. Dette sikres ved selektion med antibiotika. Derimod kan det ikke vides, om ændringen har den ønskede effekt. Effekten må derfor eftervises med de andre nævnte metoder. En sammensætning af gensekventering, SDS-page og H 2 -kromatografi kan bestemme om målet med genfusionen er nået. En fordel ved metoden til både genfusion og kontrollen af produktet er, at materialerne er forholdsvis billige. Hermed er det relativt omkostningsfrit at forsøge at ændre på forskellige parametre, hvis ikke projektet lykkedes i første omgang. En ulempe ved denne metode kan være, at der ikke er elektroner til cellens øvrige metabolisme og vækst, og at den derfor ikke kan leve. En anden ulempe er, at der ikke tages højde for hydrogenasens iltfølsomhed. Delkonklusion: Det er anskueliggjort, at det potentielt kan lade sig gøre at lave den skitserede genfusion. Perspektivering: Dette projekt er et skridt på vejen mod en produktion af biohydrogen med genmodificerede organismer, der er i stand til at producere hydrogen ud fra sollys og vand. Da hydrogen udskilles direkte gennem bakterierne, vil gassen være meget nem at opsamle. Den valgte cyanobakterie lever i saltvand. Der er derfor intet krav om rent vand, og spildevand med et indhold af næringssalte (nitrat, fosfat m.m.) vil kunne bruges. Der er mange områder, hvorpå man kan forbedre muligheden for produktion af biohydrogen gennem de fotokemiske processer. Som sagt forskes der meget i at gøre hydrogenaserne ilttolerante, hvilket ville være et stort spring i udviklingen. En anden mulighed er at fremstille et element, der efterligner fotosyntesen, muligvis med elementer taget direkte fra naturens fotokemiske processer. Side 14 af 17

Figur 9 Skitse af element til semi-artificial fotosyntese. Det er i dag muligt at fastsætte både PS II og PS I på elektroder for at fremstille et element til semiartificial fotosyntese (fig. 9). Ved at fusionere hydrogenase på PS I vil man muligvis kunne effektivisere et sådant element. En af fordelene ved dette element er, at hydrogenasen holdes fri for ilt. Ulempen ved disse halvkunstige systemer er, at de ikke er i stand til at reproducere sig selv, hvilket de modificerede cyanobakterier er. Udførelse: Tidsramme: Selve genfusionen vil kunne udføres i løbet af 4-6 måneder. Hertil kommer den funktionelle analyse af produktet. Projektet kan udføres på KU LIFE. Budget: Det samlede budget for materialer (kemikalier, reagenser mv.) forventes at ligge på omkring 50.000 kr. Side 15 af 17

Tak til: Min vejleder Poul-Erik Jensen, Professor, Ph.D, ved Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, Det Biovidenskabelige Fakultet LIFE på Københavns Universitet. Lærke Münter Lassen, Ph.D-studerende på LIFE, for hjælp til udførelse af SDS-page. Litteratur: Rögner, M., Esper, B., Badura, A.: Photosynthesis as a power supply for (bio-)hydrogen production, TRENDS in Plant Science vol. 11 no. 11 (2006) 543-549 Kruse, O., Rupprecht, J., Mussgnug, J.H., Dismukes, G.C., Hankamer, B.: Photosynthesis: a blueprint for solar capture and biohydrogen production technologies, Photochem. Photobiol. Sci. (2005, no. 4) 957-969 Williams, J.G., Patient, R.K.: Genetic Engineering, IRL Press (1988) Figurer: Fig. 1: Fra Kruse, O., m.fl. Photosynthesis: a blueprint for solar capture and biohydrogen production technologies, side 961. Fig. 2: http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/ps1_2.html Fig. 3: http://www.bio.ic.ac.uk/research/barber/psiiimages/psi.html Fig. 4: Figur 3, redigeret Fig. 5: http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/c7.20.7.pcr.jpg Fig. 6: http://openwetware.org/images/thumb/9/9e/macintosh_hd-users-nkuldell-desktop- 20109Ligation.png/300px-Macintosh_HD-Users-nkuldell-Desktop-20109Ligation.png, redigeret Fig. 7: http://www.web-books.com/mobio/free/images/ch9a1.gif, redigeret Fig. 8: Resultat af SDS-page udført på KU-LIFE d.1/10-2009. Fig. 9: Fra Rögner, M., m.fl. Photosynthesis as a power supply for (bio-)hydrogen production side 546 Side 16 af 17

1 Rögner, M., m.fl. Photosynthesis as a power supply for (bio-)hydrogen production. 543-44 2 Kruse, O., m.fl. Photosynthesis: a blueprint for solar capture and biohydrogen production technologies, 961 3 http://www.chlamy.org/chlamydb.html 4 Rocap, G. m.fl. Genome divergence in two Prochlorococcus ecotypes reflects oceanic niche differentiation, http://www.nature.com/nature/journal/v424/n6952/full/nature01947.html 5 http://nobelprize.org/educational_games/medicine/dna/b/translation/translation.html 6 Williams, J.G., Patient, R.K. Genetic Engineering, s. 3-6 7 http://www.biology-online.org/dictionary/sticky_end Side 17 af 17