Udarbejdet af Anna-Alexandra Grube Hoppe

METODER - BIOKEMI For medicinstuderende - Panuminstituttet UDARBEJDET AF ANNA-ALEXANDRA GRUBE HOPPE

RESTRIKTIONSENZYM ANALYSE (E: 329-330) Restriktionsenzym analyse er en metode, der bruges til at kortlægge DNA. Det essentielle i metoden er restriktionsenzymerne - udvundet fra bakterier, hvoraf deres navn kommer som kløver en palindrom DNA-sekvens (en DNA-sekvens, der er symmetrisk omkring et centralt punkt). Afhængig af hvilket restriktionsenzym, der bruges, vil kløvningen efterlade DNAsekvenserne med blunt ends eller sticky ends (korte enkeltstrengede 5-3 -overhæng), der hjælper det skårede DNA-molekyle med at sammensættes igen ved komplementær baseparring. DNA-sekvenserne varierer i den frekvens hvormed de vil optræde i DNA et. Eksempelvis kløver enzymet NotI en sekvens på 8 basepar, og optræder med en frekvens på 1 for hver 4 8 basepar. DNA-prøven kløves enten med et enkelt restriktionsenzym eller med en kombination af flere. Derefter separeres fragmenterne på en gel og deres størrelse bestemmes ved sammenligning med en størrelsesmarkør, og DNA et kortlægges. Anvendelse: Restriktionsenzym analyse bruges i molekylære diagnoser og restriktionsenzymer benyttes også til at lave fragmenter til DNA-kloning. GEL-ELEKTROFORESE (E: 331) Bruges til at separere proteiner eller nukleinsyre-molekyler på baggrund af deres længde, efter de er kløvet med restriktionsenzym. (Bruges i mange af de følgende metoder) Prøven med DNA-fragmenter loades på en tyk argarose eller polyacrylamid gel i den ene ende af gelen, hvor der er brønde prøven kan fordeles i. En strøm sendes gennem gelen og fordi DNA er negativt ladet vil fragmenterne vandre mod den positive elektrode i den modsatte ende. De store fragmenter migrerer langsommere og kortere igennem gelen, fordi de hæmmes mere af gelens matrix. Efter en tid (timer) vil DNA-fragmenterne være fordelt på gelen og ses som rækker af diskrete bånd, der hver især består af en samling af DNA-molekyler med identisk længde. Det er muligt fysisk at isolere et bestemt DNA-fragment fra gelen ved, med en skalpel, at skære et det stykke af gelen ud, der indeholder fragmentet og ekstrahere DNA et. Derudover kan gelen visualiseres ved farvning af DNA et. DNA et udsættes for en farve (fx ethidium bromid), der er fluorescerende når den udsættes for UV-lys, mens det er

bundet til DNA. Man får derved et gelprint. En mere sensitiv metode kan være at inkorporere en radioisotop i DNA-molekylerne før elektroforese. Hertil bruges ofte 32 P, som kan inkorporeres i DNA ets fosfat og afgive en energisk-beta-partikel, der kan spores ved autoradiografi (en fotografisk film, der placeres på gelen) HYBRIDISATIONS ANALYSE (E: 332) En metode, der bruges til at identificere det fragment, der har en nukelotidsekvens af interesse. Metoden bygger på det faktum, at enhver enkelt streng af DNA kan danne Watson-Crick basepar med en anden streng med en komplementær nukleotidsekvens. Under normale omstændigheder holdes de to strenge i en DNA-dobbelthelix sammen af hydrogenbinder. Ved at opvarme DNA et til omkring 90 grader celcius eller udsætte det for ekstreme ph-værdier, vil DNA et denaturere og strengene adskilles. Ved langsomt at reversere temperatur eller ph vil DNA-strengene gendanne dobbelthelix en dette kaldes hybridisering, og kan forekomme mellem hvilke som helt to enkeltstrengede nukleinsyrekæder (DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA) forudsat de har komplemtære nukleotidsekvenser. Til dette bruges en probe (enkeltstrenget DNA-molekyle, 10-1000NT, typisk inkorporeret med en radioaktiv eller fluorescerende gruppe) der er komplementær til den nukleotidsekvens man ønsker at detektere à Denne metode benyttes ofte forbindelse med Southern, Nothern og Western blotting.

SOUTHERN, NOTHERN & WESTERN BLOT (E: 333 + Panel 4-3) SOUTHERN BLOT: Southern blotting er en metode til at lave restriktions analyse i situationer hvor DNA-prøven er så kompleks at de individuelle fragmenter ikke kan identificeres på en gel. A. Prøven med DNA fragmenter, generet ved restriktionsnuklease behandling af DNA, separeres efter længde ved gelelektroforese B. Et ark af nylonpapir eller nitrocellulosepapir lægges over gelen de separerede DNAfragmenter overføres på arket ved blotting. Gelen ligger på en svamp svøbet i alkali opløsning, som suges gennem gelen og nitrocellulosepapiret af et stak papirservietter placeret på toppen. Som bufferen suges igennem, denaturerer den DNA et og overfører de enkeltstrengede fragmenter fra gelen til overfladen på nitrocellulosepapiret hvortil de binder. C. Nitrocellulosepapiret fjernes forsigtigt fra gelen D. Og udsættes for en radioaktivt mærket DNA-probe - der specifik for DNA-sekvensen under betingelser, der favoriserer hybridisering. E. Arket vaskes grundigt så kun de prober, der er hybridiseret til DNA et på arket, vedbliver. Efter autoradiografi vil det DNA, der er hybridiseret til en probe, visualiseres som bånd på autoradiografiet. NOTHERN BLOT: Samme metode bruges til at detektere sekvenser i RNA. I dette tilfælde elektroforeseres mrna gennem gelen og proben er et enkeltstreget DNA-molekyle. Metoden bruges til at studere ekspressionen af gener på mrna niveau WESTERN BLOT: En metode analog til Southern og Nothern blotting dog er gelen en acrylamidgel (SDS-PAGE) og i stedet for DNA og RNA er det nu proteiner der separeres. Før elektroforese behandles proteinerne med SDS for at denaturere dem og give dem alle den samme ladning ved binding af SDS således, de separeres på baggrund af deres kæde-længde. Et specifikt antistof bruges til at detektere proteiner af interesse blandt alle de andre proteiner i prøven. Western blot bruges i mange forbindelser, men helt basalt bruges metoden til at analysere genekspression på proteinniveau.

SOUTHERN NOTHERN WESTERN FRAGMENTER DNA RNA Protein GEL Acrylamid eller agarose Agarose Acrylamid (SDS- PAGE) DETEKTION Radioaktiv/ Radioaktiv/ Antistof fluorescerende DNAprobe fluorescerende DNAprobe ANVENDELSE lave restriktions analyse i situationer hvor DNA-prøven er så kompleks at de individuelle fragmenter ikke kan identificeres på en gel studere ekspressionen af gener på mrna niveau analysere genekspression på proteinniveau. + anvendes sammen med basepar princippet i forbindelse med metoder i genteknologi fx primerbinding i PCR, sekventering + anvendes sammen med basepar princippet i forbindelse med metoder i genteknologi fx primerbinding i PCR, sekventering

DNA KLONING (E:347 + SAU) DNA kloning er en metode, der benyttes til at lave mange identiske kopier af et DNA-molekyle. Metoden i hovedtræk: DNA-fragmentet hvas end det er DNA, cdna eller et PCR-fragment insættes, ved brug af DNA ligase, i en vector (plasmid eller bakteriophag), der er blevet forberedt således at dets ender er kompatible med enderne på det fragment som skal klones. Det nu fremkomne rekombinante DNA-molekyle introduceres i en værts organisme (fx E.coli, human cellelinje, gærcelle) for formering. Udvalgte markører fx antibiotika resistance eller afhængighed af en vækstfaktor bruges til at udvælge den succesfulde rekombinant. Store mængder af DNA kan dannes fra en proteinkodende DNAsekvens klonet ind i en ekspressions vektor og introduceret i celler. En plasmid vektor er blevet konstrueret til at indeholde en meget aktiv promotor, der medfører at usædvanlig store mængder af mrna produceres fra det proteinkodende gen, der indsættes i vektoren. Vektoren indsættes i en organisme (bakterie, gær mm) hvor det indsatte gen transskriberes og translateres. Serie-DNA-kloning kan bruges til at sammen-splejse et sæt at DNA-fragmenter udvundet fra forskellige kilder. Efter hver DNA indsættelse, klones det rekombinante plasmid for at rense og op koncentrere det nye DNA. Det rekombinante molekyle kløves derefter med en restriktionsnuklease og bruges som vektor for det næste DNA-fragment.

SANGERSEKVENTERING (E:345) Sangersekventering er en metode udført in vitro - der benyttes til at bestemme den præcise rækkefølge af nukleotiderne (G, A, C, T/U) i et stykke af DNA eller RNA. Bruges oftest til at sekvensere få DNA templates ad gangen (fx plasmider eller PCR-produkter). Sekvensreaktionen kan analyseres på en polyacrylamid gelelektroforese kombineret med autoradiografi eller ved brug af kar elektroforese kombineret med laser detektion. KLASSISK METODE 1. Det dobbeltstrengede DNA separeres til dets to enkeltstrenge og en af strengene bruges som template for sekvensering. 2. De fire forskellige kæde-terminerende dideoxyribonucleosid trifosfater (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp mangler 3 hydroxyl gruppen (OH)) bruges i fire forskellige DNA-syntese reaktioner på kopier af den samme enkeltstrengede DNA-template. 3. Hver reaktion producerer et sæt DNA-kopier, der terminerer på forskellige tidspunkter i kæden. 4. Produktet af de fire reaktioner separeres ved elektroforese i fire parallelle baner på en polyacrylamid gel. 5. De nysyntetiserede fragmenter detekteres ved en radioaktiv eller fluorescerende label, der er blevet inkorporeret enten i primeren eller en af deoxyriboukleosid trifosfaterne, der bruges til at forlænge kæden. 6. I hver bane repræsenterer båndene DNA-fragmenter, der er blevet termineret i forskellige positioner. DNA-sekvensen læses fra bunden og op og er identisk med den fra originale dobbeltstrengede DNA.

MODERNE METODE Med den videre udvikling af sanger sekventering er de nu muligt at sekvensere på automatisk vis via en robot, der selv kan mikse reagenterne, loade dem, køre sekvenseringen og aflæse rækkefølgen på baggrund af gelen. De fire kæde-terminerende nukleotider er her mærket med forskelligfarvede fluorescerende farver og syntesen forløber samtidig og kan separeres på en enkelt bane på gelen. En detektor nær bunden af gelen læser og optager farverne af det fluorescerende label på hvert bånd og en computer gennem sekvensen. Bruges til at sekvensere fulde genomer og transskriptomer* * The transcriptome is the set of all RNA molecules, including mrna, rrna, trna, and other noncoding RNA produced in one or a population of cells. It differs from the exome in that it includes only those RNA molecules found in a specified cell population, and usually includes the amount or concentration of each RNA molecule in addition to the molecular identities.

DNA MICRO ARRAY (E: 352) DNA micro array er en stor skala hybridisationsanalyse, der bruges til at bestemme RNA niveauet af mange RNA er i en prøve samtidig fx alle mirna eller mrna I modsætning til notern blot analyse er det proberne som er fikseret til en matrix fx en glas plade mens prøven er i opløsningen. Prøven og en referenceprøve mærkes med forskellige fluorochromes og hybridiseres til proberne på gladpladen. Signalerne fra de to prøver trækkes fra hinanden for at afsløre op- og nedregulering. Proces: 1. mrna ekstraheres fra de celler, der studeres, og omdannes til cdna 2. cdna et mærkes med en fluorescerende probe 3. Mikroarray et inkuberes med den mærkede cdna prøve og hybridisering udføres. 4. Array et vaskes for at fjerne ubundne molekyler 5. Positionerne, hvortil de fluorescens mærkede DNA-fragmenter er hybridiseret ved komplementær baseparring, identificeres af et automatisk mikroskop. 6. Array positionerne matches med de bestemte gener, hvis DNA oprindelig var spottet på hver lokation. Anvendelse: 1. Måle ekspressionen af hvert gen i en celle samtidig 2. Måle mængder af RNA mm., der optræder samtidigt 3. Undersøgelse af alt fra ændringer i genekspression til genetiske signatur af forskellige typer af humane celler. 4. Eksempelvis kan genekspressions profil af humane Cancer bruges til at skelne mellem cancertyper hvilket afslutningsvis kan være med til at forudsige om patienten vil respondere på en specifik behandling. Forklaring til billede: mrna er samlet fra to forskellige celler for at sammenligne deres relative niveau af gen ekspression. mrna et ekstraheres, omdannes til cdna og markeres hhv. Med rod og grøn fluorescens. Prøverne hybridiseres til mikroarray et, der vasket og scannes. Røde prikker: indikerer at genet i prøve 1 ekspresseres på et højere niveau end det tilsvarende gen i prøve 2. Grønne prikker: Indikerer at genet i prøve 2 ekspresseres på et højere niveau end det tilsvarende gen i prøve 1 Gule prikker: Gen ekspressionen er på et lige niveau Mørke prikker: Indikerer ingen eller meget lille ekspression af genet hvis fragment er lokaliseret på denne position.

MASSE SPECTROMETRI Masse spektrometri er en metode, der kan bruges til at bestemme proteiner i komplekse miksture i proteomics* analyse. Proteinet fragmenteres af protease og massen af individuelle peptier bestemmet af instrumentet. Massen af fragmenterne bruges til at identificere hver fragment ved sammenligning med en database af forudbestemte masser, hvormed man kan identificere proteinet. Metoden tillader over tid at proteinerne bliver produceret i de store mængder, der er krævet for at bestemme deres 3-dimensionelle struktur. 1. Proteinet af interesse skæres ud af polyacrylamid gelen efter 2- dimensionel elektroforese 2. Derefter nedbrydes/kløves det med en protease (trypsin) 3. Peptid-fragmenterne loades i masse-spektrometeret og deres eksakte masse måles. 4. Der søges nu i en sekvens-database for at finde det protein, hvis profil (efter kløvning med trypsin) matcher de fremkomne værdier. Anvendelse: Kan anvendes til at identificere proteiner ved et bestemme den præcise masse af peptider udvundet fra dem. Analyse af miksture af proteiner * Proteomics is the large-scale study of proteins, particularly their structures and functions. PCR polymerase Chain Reaction (E: 340) PCR er en metode der bruges til at opformere en specifik DNA-sekvens fra en kompleks mikstur (fx genomisk DNA) således, at den kan blive analyseret ved simple biokemiske metoder (fx gel elektroforese, restriktionsanalyse, Sangersekventering) og bliver brugt til eksempelvis DNA kloning, EMSA eller Footprinting. Sekvensen, der opformeres defineres ud fra en skræddersyet primer, der binder sig til sekvensen og produktet refereres til som PCR-produkt. Så PCR kan kun bruges til at klone DNA hvis start og slut sekvens kendes. Den originale template der bruges i reaktionen kan være enten DNA eller RNA, så PCR kan bruges til at opnå enten en fuldt genomisk kopi (komplet med exons og introns) eller en cdna kopi. Hovedtræk: Metoden er baseret på brugen af DNA polymerase der kopierer en DNA template i gentagne runder af replikation. Polymerasen guides til sekvensen, der skal kopieres, af korte DNA primere, der tilføjes reaktionen og hybridiserer til DNA template i starten og slutningen af den ønskede DNA-skevens primerne forsyner DNA-polymerasen med de 3 ender, den har behov for, til at starte replikation på hver DNA-streng. Under hver runde af replikationen separeres de to DNA-strenge fra template og kopieres uafhængigt.

Anvendelse: 1. PCR bruges meget i forbindelse med research og diagnostiske tests for sygdomsgener 2. Opdagelse af infektioner af patogener på meget tidlige stadier. I dette tilfælde bruges korte sekvenser komplementære til petogenets genom som primer. 3. Bruges retsmedicinsk pga. den sensitivitet er det muligt at arbejde med meget små prøver af blod, væv mm., og stadig finde frem til DNA fingerprint af person det kommer fra. 4. PCR også kaldet kvantitativ PCR (gpcr) bruges til at kvantificere mængden af startmateriale til PCR reaktionen à opformering 5. Bruges i forbindelse med kloning af relativt korte DNA-fragmenter (under 10.00NT par) fra en celle PCR: (noter fra SAU) Metode til at opformere en given mængde af RNA eller RNA evt. i forbindelse med gel elektroforese. Ved PCR kan man ud fra et enkelt molekyle fremstille ubegrænsede mængder, såfremt noget af sekvensen kendes. Til PCR-analysen anvendes: 1. Template (DNA indeholdende det område, som skal amplificeres) 2. To primere (oligonukleotider på ca. 24-40 nukleotider, som baseparrer til to bestemte nukleotidsekvenser i template.) 3. Nukleotider (datp, dgtp, dctp, dttp) 4. Buffer (indeholdende salte samt et defineret ph) 5. En termostabil DNA polymerase termostabil så den ikke ødelægges ved opvarmning. Proces: Hver PCR-cyklus involverer tre steps: 1. DNA et denatureres ved opvarmning til 95grader 2. Afkøling til 55grader ved tilstedeværelse af primere, hvormed primerne hybridiserer til de to DNA-strenge. 3. Denne mixture inkuberes med DNA-polymerase og de fire dntp er, således at DNA-polymerasen forlænger hver primer ved at syntetisere en ny streng ved polymerisering af deoxynukleosidtrifosfater (dntp). Foregår ved 72grader Cyklus gentages mange gange og i praksis foregår det i en varmeblok med programmerbar temperaturstyring. I praksis opnås 10 5-10 6 gange amplifikation i løbet af 30 reaktionscykler. Bemærkning: primernes 3 -ender skal vende mod hinanden, ellers kan der ikke syntetiseres DNA svarende til det, der ligger imellem dem. 5 -enderne af de to nye strenge starter ved hhv. A og B hvis man derfor gentager processen vil der, med disse molekyler som templates, opstå dobbeltstrengede DNAmolekyler.

De nysyntetiserede fragmenter fungerer som template Hver cyklus fordobler mængden af DNA syntetiseret i den foregående cyklus. Som illustreret på billede er der efter 3. Cyklus produceret 16 DNA kæder hvor de 8 highlighted med gul er sammen længde og svarer til den originale sekvens. At de andre er længere skyldes, at de indeholder ekstra DNA nedstrøms fra den oprindelige sekvens, hvilket replikeres i de første par runder. Efter mange cykler vil alle DNA-sekvenser være af samme længde som den originale. Hver cyklus tager ca. 5min og i praksis behøves 20-30 for at opnår brugbart opformeret DNA. RT-PCR (E: 342) Reverse Transcription Polymerase chain Reaction er helt essentiel PCR på RNA. Undtagelsen er, at der tilføjet RT (revers transskriptase) hvormed der dannes cdna kopier af RNA et. En kvantitaion RT-PCR (qrt-pcr) bruges ofte til at bestemme mængden af specifikt RNA i en prøve. RT-PCR PCR kan udføres ud fra RNA ved at inkludere enzymet reverse transkriptase (RT). RT vil katalysere polymerisation af dntp til DNA med RNA som template i første cyklus, hvilket kaldes for RT-PCR. En metode, der bruges til analyse af genekspression. Forud for PCR-opformeringen udføre en revers transskriptase reaktion, hvor enkeltstrenget cdna syntetiseres ud fra mrna cdna et bruges derefter som template i en PCR. I en efterfølgende gel-elektroforese af PCR-produktet vil et kraftigt bånd betyde høj ekspression af genet, et svagt bånd vil betyde lav ekspression og intet bånd er ensbetydende med, at genet ikke ekspresseres. Proces: 1. mrna udrenses fra celler 2. Den første primer tilføjes til populationen af mrna og RT bruges til at lave en komplementær DNA-streng (cdna) 3. RNA-strengen nedbrydes nu med RNase H 5 -enden på mrna et bevares som primer for polymerasen. 4. Polymerasen laver en komplementær DNA-streng à dobbeltstrenget cdna kopi af original mrna 5. PCR-reaktionen kan nu forløbe som normalt. Det første af de nedenstående billeder viser RT-PCR, det næste viser princippet i begge to.

EMSA (SAU 19) Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) er en metode, der benyttes til at undersøge bindingen af en ligand fx bindingen af et protein til DNA. Kan bruges både med oprensede proteiner og celle ekstrakter. Metoden er baseret på princippet, at migrationsraten af et DNA-molekyle i en (polyacrylamid) gel reduceres ved binding af en ligand til DNA et dette skyldes den øgede størrelse af komplekset og/eller ændringer i DNA-struktur (bending/looping) eller dynamik (flexibility) Metode: Et mærket DNA fragment typisk mærket med 32 P fosfat inkuberes med liganden (eller en mikstur al ligander, eller (celle)ekstrakt), og analyseres efterfølgende ved gel elektroforese (A). DNA-fragmenterne med bundne ligander vil migrere langsommere og give ophav til individuelle bånd på gelen forskellige ligander vil have en forskellig effekt på migrationsraten og give individuelle bånd (A og B). Forholdet mellem mængden (bånd intensitet) af frit DNA og ligand-dna-kompleks afspejler direkte ligevægten for bindingsreaktionen og derfor kan ligevægts-konstanten bestemmes som koncentrationen ved hvilken lige mængder af frit DNA og ligand-dna-komplekser eksisterer. - Assay et kan udføres med mere end et DNA fragmenter hvilket tillader relative affiniteter for to (eller flere) forskellige DNA sekvenser at blive bestemt direkte (C).

Anvendelse: Bruges ofte til at undersøge bindingen af transskriptionsfaktorer til regulatoriske DNAsekvenser Analyse af multiprotein komponent DNA-komplekser kan blive analyseret ved EMSA (fx RNA polymerase, transskriptionsreulatorer) FOOTPRINTING (SAU 19) Footprinting bruges til at kortlægge bindingen af en ligand fx et proteins binding til et DNA fragment. Bruges oftest i forbindelse med EMSA, der fortæller om hvorvidt liganden er bundent, mens footprint fortæller hvor liganden er bundet. Ved footprinting opnås detaljer om det specifikke bindingssite på et DNA-molekyle. Metode: (A) Princippet er baseret på en høj (enkelt nukleotid) opløsning af DNA (gel- eller karelektroforese) analyse (fuldt analog til en sekvenserings analyse) ved at bruge et ende mærket DNA fragment der har været udsat for en DNA-kløvende reagent typisk DNase I. Hvert kløvningssite på DNA vil give ophav til tilsvarende DNA-bånd i gelen. Når en ligand er bundet vil DNA-helixen være beskyttet for kløvning i dette område og ikke give ophav til bånd, men i stedet efterlade et footprint. Således kan bindingssite på DNA for en given ligand blive bestemt ved at variere ligand koncentrationen (B). Også samtidig, medvirkende og udelukkende binding af mange proteiner kan studeres.

CHROMATIN IMMUNO PRECIPITATION, ChIP (SAU 20 + 21) ChIP bruges overvejende til at kortlægge bindingssites for DNA-bindende proteiner. Metode: Først isoleres kromatin og fragmenteres ind til tilfældige fragmenter. Dernæst bruges et antistof specifikt for proteinet, man vil undersøge, til at udfælde alle fragmenter der har bundet til proteinet. Afslutningsvis karakteriseres alle fragmenterne fx ved DNA sekventering. Ved at lokalisere overlap mellem fragmenterne, kan sekvensen blive indsnævret til bindingssitet for proteinet. Der findes mange variationer af teknikken fx PoLII ChIP til at kortlægge aktiv transskription og ChIP af histonmodifikationer til at kortlægge komatinstatus.

X-RAY KRYSTALLOGRAFI (E: 158) X-Ray krystallografi bruges til at bestemme den tredimensionelle struktur af et molekylse ved atomisk opløsning. - Dette er en meget besværlig metode, der sjældent lykkes. Det kan tage år at finde de rigtige betingelser for at danne en krystal. Metode: 1. Aminosyresekvens skal kendes og der skal være produceret nok af proteinet til at der kan arbejdes med det. 2. Proteinet skal lokkes til at danne krystaller for at dets struktur kan bestemmes ved x- Ray krystallografi krystallerne er store, meget ordnede systemer af det rene protein hvori hvert molekyle har sammen konformation og er perfekt opstillet ved siden af dets nabo. 3. En smal stråle af X-Ray rettes på en proteinkrystal og atomerne i proteinet spreder den indkomne stråling. 4. Disse sprede bølger enten forstærker eller annullerer hinanden hvormed de danner et kompleks diffraktionsmønster der opsamles af elektroniske detektorer. 5. Positionen og intensiteten at hver spot i mønsteret indeholder information omkring positionen af atomerne i proteinkrystallen. (Mønsteret er så komplekst at selv små proteiner kan generere 25.000 enkelte spots). 6. En computer bruges til at fortolke og transformere disse spots til kort over den relative rumlige position af atomerne, ved komplekse matematiske udregninger. 7. Ved at kombinere den opnåede information med proteinets aminosyresekvens kan en atomisk model over proteinets struktur genereres. Anvendelse: - Bestemmelse af strukturen af store komplekser (patikler) så som ribosomer

NMR SPECTROSKOPI (E: 159) NMR spektroskopi bruges til at bestemme 3D strukturen og dynamikken af mindre proteiner (<50.000 daltons hvis større kan man forsøge at opdele proteinet og analysere hvert domæne) Metode 1. En koncentreret opløsning af rent protein placeret i et stærkt magnetisk felt og bombaderes med radiobølger af forskellig frekvens. 2. Dets hydrogen kerne vil generere NMR signaler der kan bruges til at bestemme afstanden mellem atomerne i forskellige dele af proteinet. 3. Denne information bruges til at bygge en model af hvordan disse atomer er arrangeret i rum. 4. Kombineret med den kendte aminosyresekvens kan man beregne den tredimensionelle struktur af proteinet