Besvarelse af opgaverne til den 20-9-06 Spm.A: Her vil vi gerne sætte et relativt lille stykke DNA (FLAG) sammen med et relativt stort stykke (PRB1). Det lille stykke er for lille til at vi kan PCR amplificere det. Derfor vil vi vælge at indsætte den FLAG kodende del ved at påhæfte denne sekvens til vores down primer. Nu skal vi huske, at det er den kodende streng der er vist af både PRB1 og FLAG DNAet. For at vi ikke vender primerne forkert er det en god ide at opskrive DNA sekvensen omkring fusionsstedet for FLAG epitopen. Sekvensen efter fusionen skal se således ud 5 GACGAGAGCGAAAATTCCAGAGACTACAAAGACGACGACGACAAATGCTGA 3 Hvor den understregede sekvens er fra PRB1, den kursiverede fra FLAG delen og den fede er stopkodon for translation. Den understregede sekvens har vi valgt så primeren får en smeltetemperatur på 58 o C (Tm = 4 x (G + C) + 2 x (A + T)).Vores down primer skal nu være komplementær til hele sekvensen som vi opskrev. D.v.s. 5 TCAGCATTGTCGTCGTCGTCTTTGTAGTCTCTGGAATTTTCGCTCTCGTC 3, Med samme nomenklatur som før. Opprimeren vil vi vælge, så der er noget sekvens med før ATG kodon (for at sikre en effektiv translation, vi kommer tilbage til dette senere) Opprimeren : 5 CTTTACCCCAAAATATAAATCAG 3 Vi vil vælge længden af primeren, så vi får en smeltetemperatur den er den samme som downprimeren ± 2 o C. Dette opnår vi med ovenstående primer da den har en Tm = 60 o C. PCR på PRB1 DNA med ovenstående primere vil give den ønskede fusion. Spm. B: Når vi skal knock-oute et gen i en organismes genom bliver vi nødt til at anvende cellens mulighed for at lave homolog rekombination. Det er meget forskelligt, hvor effektive forskellige organismer er til at lave homolog rekombination i forhold til illigitim rekombination. For at kock-oute PRB1 genet i gær må vi have fremstillet et PCR fragment indeholdende en selektiv markør flankeret af sekvenser identiske med de gærsekvenser, der flankerer PRB1 på kromosomet. Det kan vi gøre ved at sætte 50 basepar kromosomal gærsekvens i enderne af vores PCR primer, som kan anneale til en selektionskasette. Det kunne se ud som følger:
A G418R B A-halen er så magen til de 50 nukelotider opstrøms for ATG kodon i PRB1 genet og B-halen er komplementær til de 50 nukleotider nedenstrøms for stop kodon i PRB1 genet. Vi transformerer nu gær med dette PCR fragment og selekterer for G418 resistens. De G418 resistente transformanter må vi så screene for om de har integreret G418 kasetten i PRB1 genet. Dette kunne vi gøre v.hj.a. PCR. Kigger vi på nedenstående figur kan vi se hvor primerne skal ligge. C E G418R D F Det vigtige er her, at C primeren ligger længere opstrøms end den hale sekvens, der var med i vores A primer fra foregående figur og at F primeren ligger længere nedenstrøms end halen på vores B primer fra foregående figur. Primer A + D og primer E + F kan så kun give et PCR fragment af den rigtige længde, hvis G418R er krydset ind det rigtige sted i genomer (har erstattet PRB1 genet) Spm. C: Vi kan udtrykke vores FLAG taggede PRB1 gen i gærstammen der har fået fjernet sin kromosomale PRB1 allel. Det FLAG taggede PRB1 protein vil så in vivo binde til de andre RNA polymerase II subunits. Fordi Prb1 proteinet indeholder FLAG epitopen kan vi immunoprecipitere det FLAgG taggede Prb1 protein. De proteiner, der sidder og binder til Prb1 in vivo vil blive immunfældet sammen med Prb1. Tager vi vores immunprecipitat og separerer på en SDS-PAGE gel vil protein interaktionerne bliove ødelagt på grund af detergentet SDS, og vi kan efter farvning af
gelen se de proteiner, der blev immunfældet sammen med Prb1. Identiteten af disse proteiner kan vi bestemme ved at spalte dem med trypsin og bestemme de genererede trypsinfragmenters molekylvægt ved massespektrometri. Ud fra de opnåede masser kan vi få computeren til at bestemme, hvilke proteiner, som gæresn genom kan kode for, der passer med vores eksperimentelt bestemte masser. Spm. D: Data i figur 2 stammer fra et EMSA assay. Dette assay kan bruges til at undersøge om et bestemt protein kan binde til et bestemt DNA eller RNA fragment, eller til at bestemme om der i et kerneekstrakt findes protein som kan binde til et bestemt oligonukleotid. Data som de i Figur 2 kan bruges til at undersøge i hvilken rækkefølge forskellige proteiner i et stort kompleks binder til et specifik DNA sekvens (her en promotor region). Hver gang et nyt protein binder til oligoen eller de proteiner der binder til oligoen vil komplekset få en større molekylvægt. Kigger vi på lane 1 kan vi se at D + A binder til oligoen da vi observerer et band shift. Fra lane 2 kan vi se at B kan binde til oligo som i forvejen har bundet D +A. Tilsætter vi derimod yderligere F, som vist i lane 3 ser vi ikke et yderligere shift i forhold til lane 2. Det må betyde at F ikke kan binde til komplekset bestående af oligoen og D + A+ B. Tilsætter vi derimod stigende mængder af RNA polymerase II til oligo + D + A+ B + F ser vi, at vi nu får et yderligere shift som tegn på at PolII ihvert fald binder. Da fjernelse af F fra en blanding af D + A + B + polii fører til at protein-oligo komplekset bliver mindre må det betyde at binding af F og polymerase II er indbyrdes afhængige. Den ene kan ikke binde uden tilstedeværelse af den anden. Fra lane 13 kan vi se at D er helt essentiel for at vi kan få et bandshift. Dette er i overensstemmelse med at D binder først. Fjerne vi B får vi det samme bandshift som hvis A + D er tilsted alene. Så Polymerse II og F kan ikke binde, hvis B ikke er tilstede. Hvis vi mangler A får vi bandshift som svarende til det nederste bånd i lanes 4 12. Dette må altså representere D + B + F + PolII. Så A er ikke essentiel for at F og PolII kan binde. Lane 16 er det samme som vi ser i lanes 4-12. Spm. E: En måde at finde ud af hvorledes de forskellige komponenter binder til vores promotorsekvens er at udføre et footprint eksperiment, hvor vi tilsætter flere og flere af vores komponenter til vores footprint eksperiment.som vi kan se i Figur 4 giver D alene et stort footprint, hvorimod tilsætning af A eller A + B ikke udvider det beskyttede område særligt meget. Kun tilsætning af F + polii udvider kraftigt det beskyttede område. Hvilke nukleotider er det så det er beskyttede? Til at bestemme deres lokalisering kan vi udføre en sekvensreaktion med den i figur 3 viste primer. Her er det vigtigt at den radioaktive mærkning sidder i 5 enden af det viste fragment og at sekventeringsprimeren har sin 5 ende samme sted. Kan vi bestemme hvilket nukleotid der ligger ud for det sidste bånd før den beskyttede region, ved vi hvor footprintet starter. Tilsvarende kan vi bestemme hvor det sidste nukleotid i footprintet er lokaliseret. Vi skal nu huske på at sekvensen er magen til det understregede skvens i figur 3. Vi genererer derfor den i figur 3 viste streng under vores sekvensreaktioner. Vi skal derfor i figur 4 finde en sekvens der er magen til sekvensen i figur 3. Læser vi sekvensen nede fra og op får vi : 5 gtggtgggctataaaaaggggcgggtccttggtcttcatcgctttcttctacttcgctgtttacgagc 3. For footprintet med protein D finder vi således at footprintet starter ved det understregede, fede c og slutter ved det understregede fede g.
Spm F: Dette eksperiment går ud på at undersøge, om et protein binder til major eller minor groove i DNAet. For at undersøge bindingen til TATA sekvensen kan vi anvende en TATA holdig oligo og en CICI holdig oligo. Argumentet herfor kan ses ud fra strukturformlerne for thymin i forhold til cytosin og adenin i forhold til inositol. Det kan ses at udskiftning af T med C og A med I ikke forandrer noget i minor grove, men ændrer på de funktionelle grupper i major grove. Kan vi observere et bandshift med både TATA og CICI oligoerne, må det betyde, at vores protein binder til minor groove. Det er netop, hvad vi ser i EMSA assayet i Figur 5.
Svar til opgave 1 juni 1998 Denne opgave fokuserer på teknikker til at undersøge om proteiner kan interagere med hinanden in vivo. Spm. A: I dette forsøg har vi fået nogle 193 celler til at producere to versioner af TβRII receptoren. Den ene version er tagged med en myc epitop, den anden med en flag epitop. Det betyder at den ene kan genkendes af et anti-myc-antistof og den anden kan genkendes af et anti-flag-antistof. Når vi laver immunoprecipitaion med anti-myc-antistoffet får vi fældet det protein der genkendes af anti-myc-antistoffet samt det som er associeret med protein, der genkendes af dette antistof. Kan vores receptorer danne mindst dimerer med hinaden kan vi få følgende kombinationer; mycmyc, flag-flag eller myc-flag. Der vil i såfald være nogle flag taggede receptorer der bliver immunoprecipiteret af anti-myc-antistioffet. I fald dette er tilfældet vil et western blot af det immunoprecipiterede protein give et bånd med anti-flagantistoffet. Da dette i følge figur 2 er tilfældet må receptorerne mindst danne dimerer med hindanden (homodimerer). Det ses også at homodimer-dannelsen er uafhængig af om der er TGFβ tilstede eller ej. Spm.B: Her udtrykker vi nu bare to forskellige typer receptorer i vores 293 celler. Cellerne producerer altså alle tre receptorer. Konceptet er som i Spm. A, at når vi immunoprecipiterer med et antistof får vi fældet alt det som antistoffet direkte reagerer med, samt de proteiner der interagerer med et protein der gendes af antistoffet. Disse andre proteiner siges at co-immunoprecipitere. Hvilke proteiner der findes i co-immunproecipiatet kan bestemmes hvis man antistoffer mod mulige kandidater. Her ser vi i figur 3 A det samme som i figur 2, nemlig at receptor type II mindst homodimeriserer uafhængigt af TGFβ. I B ser vi at receptor I kan binde til receptor II i tilstedeværelse af TGFβ. Der dannes altså mindst heterodimerer i tiulstedeværelse af TGFβ. SPm. C: Her vil vi undersøge om receptorerne bliver fosforyleret i tilstedværelse af TGFb. Dette kan vi undersøge ved at udtrykke vores receptorer i celler der dyrkes i tilstedeværelse af radioaktivt fosfat, [ 32 P]-PO 4 3 I figur 4 ses det, at der kun inkorporeres radioaktivitet i receptorerne (hvilken kan ikke ses), hvis de begge findesi den samme celle og hvis cellerne er behandlet med TGFβ. Spm. D: Disse plasmider kan anvendes til en 2-hybrid screening. Konceptet er at en transkriptionsfaktor (her GAL4) har mindst to funktionelle domæner. Den ene er et DNA bindende domæne det andet er et transkriptionsaktiverende domæne. Det DNA bindebde domæne sørger for at transkriptionsfaktoren binder det rigtige sted i genomet, medens det transkriptionsaktiverende domæne interagerer med det generelle transkriptionsapparat og forårsaget initiering af transkriptionen. Indsætter vi foreksempel Smad1 cdna ipsmadx-gal4tr plasmidet vil det DNA bindende domæne af GAL kun kunne fange det transkriptionsbindende domæne hvis Smad1 proteinet og smad3 proteinet kan interagere (se værktøjskasse). Kun hvis disse kan interagere vil vi fp transkriptionen aktiveret fra phis3 plasmidet og få gærceller, der kan gro i fravær af histidin. SPm. E: I figur 6 kan det ses at Smad3 proteinet ændrer lokalisering i celler efter stimulation af denne med TGFβ. I fravær af TGFβ er Smad3 lokaliseret i cytosollen,
medens tilsætbing af TGFβ forårsager translokation ind i kerne, hvor transkriptionsfaktorer jo har deres aktivitet. Det er meget normalt at genekspression er reguleret ved at en transkriptionsfaktor ændrer lokalisering. Dette kan bl. a. ske ved, at det kernelokaliseringssignal, transkriptionsfaktorer har, er gemt i proteinstrukturen under omstændigheder, hvor transkriptionsfaktoren ikke skal være aktiv, men er eksponeret til omgivelserne når transkriptionsfaktoren skal være aktiv. Det kan også være, at transkriptionsfaktoren under ikke-inducerende omstændigheder er bundet til et andet protein og denne binding maskerer kernelokaliseringssignalet. Denne binding kan så ødelægges under inducerende omstændigherer, og der kan efterfølgende ske kernelokalisering. Spm. H: Igen et typisk EMSA assay. Går vi fra venstre mod højre kan vi se at der i tilstedeværelse af TGFβ opstår nogle specifikke bandshifts, som tegn på at der er proteiner som kun findes i kernen når cellerne stimuleres med TGFβ. Vi kan i næste lane se at denne binding er reversibel idet den ukonkurreres af 50 ganges overskud af kold oligo. Vi kan i de næste 6 lanes se at bindingen er specifik, idet en muteret oligo ikke kan konkurrere med den rigtige om oligoer som genkendes af andre transkriptionsfaktorer ikke kan udkonkurrere bindingen. I det højre forsøg kan vi se at kun anti-smad3-antistof og anti-smad4-antistof kan supershifte vores bandshift. Derfor er disse to proteiner en del af det kompleks, der binder til vores oligo. At bindingen mellem antistoffet og proteinkomplekset er specifik indikeres af, at det peptid, der blev brugt til immunisering, kan udkonkurrere antistof bindingen. Sma3 og smad 4 kunne således have en rolle i at aktivere transkriptionen fra deres target-gener i tilstedeværelse af TGFβ.