2006 nr. 61. fisk & hav. tidsskrift for danmarks fiskeriundersøgelser

2006 nr. 61 fisk & hav tidsskrift for danmarks fiskeriundersøgelser

Danmarks Fiskeriundersøgelser Rådgivnings- og Kommunikationsenheden Jægersborgvej 64-66 2800 Lyngby Telefon 3396 3300 Danmarks Fiskeriundersøgelser er en sektorforskningsinstitution under Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri som gennemfører forskning, rådgivning og formidling om bæredygtig udnyttelse af levende ressourcer i havet og de ferske vande. Institutionen rådgiver Fødevareministeriet og andre offentlige myndigheder, fiskerierhvervet og internationale kommissioner. Mærket torsk Vild og udsat ørred Listeria hvorfra? Prædiktiv mikrobiologi Frossen torsk info@difres.dk www.difres.dk/fisk&hav.htm Redaktion: Tine Kjær Hassager, Rådgivnings- og Kommunikationsenheden Suzanne Rindom, Rådgivnings- og Kommunikationsenheden Gorm Rasmussen, Afdeling for Ferskvandsfiskeri Erling Larsen, Afdeling for Fiskeindustriel Forskning Per Johan Sparre, Afdeling for Havfiskeri Thomas Kiørboe, Afdeling for Havøkologi og Akvakultur FISK & HAV udgives 1-2 gange årligt Danmarks Fiskeriundersøgelser 2006 Forside: Torsk Torsk med mærke, den hvide cylinder på ryggen, er klar til at blive sat ud. Foto: Stefan Neuenfeldt, Danmark Fiskeriundersøgelser Grafisk tilrettelægning og trykkeri: Schultz Grafisk FISK & HAV eller dele heraf må ikke kopieres uden forudgående aftale med DFU ISSN 0105-9211

FISK & HAV 2006 nr. 61 fisk & hav 2006 nr. 61 2 Ken H. Andersen og Stefan Neuenfeldt Torskens hemmelige liv 10 Stig Pedersen Vilde fisk og udsatte fisk i Karup Å 20 Cisse Hedegaard Hansen, Birte Fonnesbech Vogel og Lone Gram Listeria monocytogenes, kommer de ind udefra 30 Paw Dalgaard og Ole Mejlholm Prædiktiv mikrobiologi et vigtigt redskab til forudsigelse og styring af fiskeprodukters holdbarhed og sikkerhed 42 Inger V. H. Kjærsgård, Mette R. Nørrelykke og Flemming Jessen Hvad sker der, når vi fryser torsken?

Torskens hemmelige liv Mærket torsk KEN H. ANDERSEN (kha@difres.dk) Stefan Neuenfeldt (stn@difres.dk).............. Danmarks Fiskeriundersøgelser Afdelingen for Havfiskeri Vi bruger i Danmark mange ressourcer på at overvåge fiskebestandene i havet omkring os. Opgaven er omfattende og kompliceret - havet er stort og vi kan ikke umiddelbart se, hvad der foregår under havets overflade. Vores oplysninger om, hvor fiskene er, har vi hovedsageligt fra trawl- og akustikundersøgelser med havundersøgelsesskibe. Her fra får vi mange oplysninger, men der er tale om en meget omkostningsfuld undersøgelsesform. Dertil kommer, at vi med disse undersøgelser kun får meget lidt viden om fiskenes faktiske adfærd under vandet. Ved at mærke fisk med elektroniske mærker har vi nu mulighed for at få meget mere at vide om den enkelte fisks adfærd over en længere periode.............................................. Moderne forvaltning af fiskebestande stiller større og større krav til vores viden om, hvor fisk foretrækker at opholde sig på forskellige tider af året, og hvad de laver. Dette gælder særligt i forhold til brugen af lukkede områder eller perioder. Det vil sige områder, der i en given periode er lukkede for fiskeri. I Danmark er denne form for forvaltning bl.a. blevet brugt for torsk i Østersøen, hvor Bornholmsbassinet, hvor torsken gyder, er lukket for fiskeri i torskens gydesæson. For at denne type forvaltning skal virke efter hensigten kræver det en præcis viden om, hvor og hvornår torsken gyder. I denne artikel vil vi beskrive, hvordan det er muligt at få netop den information ved at benytte en helt ny teknologi - elektroniske mærker monteret på ryggen af torsk. Mærkerne kan hjælpe os til at beskrive fiskens adfærd i detaljer, såsom hvorvidt den er aktiv eller i hvile, eller om der er forskel i aktiviteten mellem dag og nat. Endelig kan mærkerne fortælle om fiskens præferencer for vand med fx bestemte temperaturer eller saltholdigheder. Elektroniske mærker De elektroniske mærker er på størrelse med en lillefinger (se figur 1). De bliver monteret på ryggen af fisken, og så snart den er i vandet, registrerer mærket dybden, temperaturen og saltholdigheden af vandet ca. hvert kvarter. Informationerne bliver lagret i mærket, og hvis fisken bliver fanget og mærket returneret, kan informationerne overføres til en computer. Den procedure giver risiko for at mærker og information går til spilde, så hvorfor kan mærket ikke bare sende alle informationerne til en satellit eller noget lignende? Det kan det ikke, fordi elektromagnetiske bølger og dermed radiobølger bliver meget kraftigt dæmpet i havvand. Man kan derfor ikke kommunikere med satellitter fra bunden af havet. Det er derfor ubåde kommunikerer med lyd og ikke radiobølger. Dette betyder også, at mærket ikke kan bruge GPS-satelliter til at bestemme fiskens position. Hvis man vil finde ud af hvor mærket har været, skal man derfor bruge mere avancerede metoder, som fx geolokalisering.

FISK & HAV 2006 nr. 61 A B Figur 1 Mærkning.............. En torsk får sat et mærke på før udsætning. Foto: Stefan Neuenfeldt Forsøg med elektroniske mærker i Østersøen I Danmark har den hidtil største mærkningsindsats fundet sted i Østersøen (tabel 1), som del af forskningsprojekterne REX og Codyssey. For overhovedet at kunne bære mærkerne skal fiskene være større end 45 cm. I de fire forsøg er i alt 460 fisk blevet mærket. Af dem er 183 blevet fanget af fiskere, og mærkerne er returneret i løbet af mindre et år. Hvis dette er repræsentativt for fiskeriindsatsen betyder det, at mere end 40 % af torskene i bestanden bliver fanget på et år. I de gennemførte projekter har fokus været på torsk fra den østlige bestand, herunder disses gydevandring. For at kunne gyde skal torsken være i vand med saltholdigheder på over 10 promille ( rigtigt saltvand har en saltholdighed på omkring 33 promille). I farvandet omkring Bornholm findes disse saltholdigheder som regel kun i Bornholmsdybet. Bornholmsdybet ligger øst for Bornholm og har form som et stort trug med en maksimal dybde på lige omkring 100 m. Program Sted Antal mærkede fisk Antal returnerede mærker Retur rate 2003a Vestlige Østersø 75 22 29 % 2003b Østlige Østersø 63 29 46 % 2004 Østlige Østersø 158 76 48 % 2005 Østlige Østersø 164 56 34 % Ialt: 460 183 40 % Tabel 1 Oversigt over mærkninger af torsk med elektroniske mærker i Østersøen.............. Bemærk, at i gennemsnit 40 % af mærkerne er kommet retur efter mindre end et år.

Mærket torsk Afsløringer af torskens adfærd Et typisk bevægelsesmønster fra en mærket torsk ses i figur 2. Umiddelbart efter at være blevet mærket bevæger fisken sig lidt op og ned, hvorefter den efter et par dage falder til ro på en konstant dybde omkring de 38 meter. Det ser ud til at fisken nu har fundet et godt opholdssted, da dybden stort set ikke ændrer sig. Pludselig ved dag 137 om aftenen begynder fisken imidlertid at udvise en kraftig aktivitet, og bevæger sig ud på dybere vand. Mønstret passer med det tidspunkt, hvor vi ved at torsken bevæger sig ud i Bornholmsbassinets dybder for at gyde. I den næste måneds tid bevæger fisken sig en del omkring, indtil den omkring dag 175 er nået ud i bunden af bassinet på 95 meters dybde. Her opholder den sig halvanden måneds tid med aktivitet om dagen og inaktivitet om natten. Derefter bevæger den sig igen væk fra bunden af bassinet op til lavere dybder, hvor den fanges i løbet af efteråret. I figur 2 er der især to typer adfærd, som tydeligt kan registreres: 1) Perioder med hvile, hvor fisk blot synes at ligge stille på bunden og 2) perioder med aktivitet oppe i vandsøjlen om dagen og ophold ved bunden om natten, eller vice versa. Særligt de lange perioder med hvile er overraskende. Enkelte fisk hviler i flere uger i træk. Hvorimod mønstret med skiftende aktivitet mellem dag/nat blot bekræfter eksisterende viden. Derimod er det nyt, at vi nu kan se, at fisken kan skifte rytme meget pludseligt, alt efter hvad der er opportunt. Hvor har torsken været? Det mest spændende og relevante spørgsmål er, hvor fisken har været. Hvis vi ved det, kan vi nemlig sige noget om, hvorvidt fisken benytter sig af det lukkede område. Vi vil også kunne se i hvor høj grad, den er en standfisk, dvs. om den holder sig til et bestemt område for at æde, og om den vender tilbage til det Figur 2 Illustration af dybderegistreringer fra en fisks elektroniske mærke.............. I øverste billede ses dybdemønstret fra mærket sættes på til fisken fanges. I det andet billede (nederst til venstre) ses begyndelsen af gyde-migrationen. I det tredje billede ses eksempler på en periode, hvor fisken er aktiv oppe i vandsøjlen om dagen, mens den holder sig på bunden om natten. Dybde (meter) 0-20 -40-60 -80-100 100 140 160 180 200 220 240 260 Dag i året -25-30 -35-40 -45-50 -55-60 -65 125 130 135 140-55 -60-65 -70-75 -80-85 -90 220 225 230 235

FISK & HAV 2006 nr. 61 område A efter gydningen. Da vi jo ikke har kunnet logge fiskens position via GPS, må vi i stedet benytte vores viden om vandet i Østersøen, som har det særlige karakteristika, at saltholdigheden falder, jo længere man kommer væk fra Kattegat. I Kattegat ligger saltholdigheden omkring 33 promille, men omkring Bornholm er den faldet til omkring 10 promille afhængig af dybden. Helt oppe i den Botniske bugt er vandet stort set ferskt. Saltholdigheden i Østersøen afhænger både af dybden, årstiden og indstrømningen af havvand fra Kattegat, derfor benytter man hydrografiske modeller til at vise saltholdigheden på en given dato. I figur 3 ses modellens forudsigelse af saltholdigheden i 16 meters dybde den 10. november 2003. I figur 3 ses et eksempel på en elektronisk mærket torsk, som blev sat ud ved Bornholm og fanget igen ved Storebæltsbroen. Dette er ikke en typisk adfærd, som regel bliver B torskene fanget tæt på det sted, hvor de blev sat ud. Men det er en god illustration af, hvorledes man kombinerer information fra det elektroniske mærke med viden fra den hydrografiske model til at beskrive, hvor fisken har været. Denne fisk blev mærket den 28. april 2003, og som det ses af figur 3, har fisken de første syv måneder efter mærkningen opholdt sig i vand med en saltholdighed under 10 promille, svarende til forholdene omkring Bornholm. Den 10. november bevægede den sig pludselig ind i vand med en meget højere saltholdighed, op til over 30 promille. Det er saltholdigheder, som er karakteristiske for vandet i den vestlig Østersø og Kattegat. Fisken har opholdt sig i det salte vand, indtil den blev fanget under Storebæltsbroen et år senere. Det ubesvarede spørgsmål er imidlertid: Hvilken vej har den bevæget sig rundt om Sjælland? Har den bevæget sig syd om Lol- 20 0-20 -40 56.5 56 55.5 55 54.5 Dybde (meter) Saltholdighed (psu) 150 200 250 300 350 400 Dag i året Fanget d. 27 april 2004 Mulige positioner d. 10 november 2003 Mærket d. 28 april 2003 10 11 12 13 14 15 16 17 30 25 20 15 10 5 Figur 3 Eksempel på en mærket fisk udsat ved Bornholm og fanget et år senere under Storebæltsbroen.............. Størstedelen af tiden har fisken opholdt sig i vand med lav saltholdighed. Men omkring d. 10. november svømmer den ind vand med høj saltholdighed. Spørgsmålet er: Er fisken gået syd eller nord om Sjælland? Konturerne viser saltholdigheden ved 16 meters dybde på den dag, hvor fiskens mærke registrerede den ændrede saltholdighed, vist med en lodret streg i det øverste panel.

Mærket torsk land-falster, eller har den svømmet op igennem Øresund? På kortet med saltholdighederne for den dag, hvor fisken bevægede sig ind i vandet med de høje saltholdigheder, kan vi se, at registreringer i mærket svarer til saltholdigheden i Øresund lige nord for København eller i farvandet sydvest for Falster. I Øresund viser kortet, at der er en relativ skarp front af salt vand, der møder det mindre salte vand i Østersøen. Her vil vores fisk, derfor kunne komme fra vand med lav saltholdighed og ind i vand med høj saltholdighed på relativ kort tid. Syd for Falster viser kortet, at overgangen mellem vand med lav og høj saltholdighed er noget længere. Da informationerne fra mærket tyder på, at denne overgang er sket meget hurtigt for fisken, konkluderer vi, at det er mest sandsynligt, at fisken er svømmet nord om Sjælland frem for sønden om. Geolokalisering Hvor fisken har opholdt sig kan også estimeres mere præcist ved at benytte avancerede statistiske metoder til geolokalisering (se boks 1). Metoder, der udover over at inddrage information om saltholdigheden, som beskrevet ovenfor, tager højde for områdets dybde og fiskens mulige svømmehastighed. Ved at benytte geolokalisering kan vi fx un- Figur 4 Eksempel på brug af geolokalisering til at vise, hvor fisken fra figur 2 kan have opholdt sig............... De grå kontur-linier viser dybden med 20 meter mellem konturlinierne. Den sorte prik viser det sted, hvor fisken sandsynligvis har været. Den mørkegrå plamage er der hvor fisken med 67 % sikkerhed har været, og den lysegrå plamage viser det område, hvor den har været med 95 % sikkerhed. Det blå felt viser det lukkede område i 2003 som var håndhævet mellem d. 15. maj og 31. august. Dag 118 Dag 138 Dag 159 Dag 179 Dag 200 Dag 220 Dag 240 Dag 261

FISK & HAV 2006 nr. 61 dersøge, A om fisken har været inde i det lukkede område under gydningen eller ej. Et eksempel på dette ses i figur 4 og figur 5. Den første fisk har været inde i det lukkede område, mens det anden fisk med stor sandsynlighed har opholdt sig udenfor området. Resultaterne tyder altså på, at hvis man vil beskytte torsken under gydningen, skal der lukkes et større område. Hvorfor viser vi ikke bare geolokaliseringen med en streg på et kort, der viser hvilken rute fisken har svømmet? Grunden til det er, at vi ikke med 100 % sikkerhed kan sige, hvor B fisken har været. Der er usikkerheder i den hydrografiske model, der bruges til at foretage geolokaliseringen, og der er usikkerhed i målingerne af saltholdigheden på det elektroniske mærke. Modellen forsøger i nogen grad at kompensere for dette, men den væsentlige kvalitet ved modellen er, at den viser os præcis, hvor stor usikkerhed, der er på estimatet. På andre tidspunkter kan vi heldigvis med stor sikkerhed bestemme, hvor fisken er og har været. Det er f.eks. når fisken er nede på bunden af Bornholmsdybet, som på figur 4 mellem dag 179 og 220 der findes nemlig ingen andre steder i området, der er så dybe. Dag 118 Dag 148 Dag 133 Dag 163 Figur 5 Et andet eksempel på geolokalisering Her brugt til at vise, hvor en fisk med stor sandsynligvis har opholdt sig. I dette tilfælde i området lige omkring det sted, hvor den blev mærket muligvis med afstikkere syd- og østpå. Dag 179 Dag 194 Dag 209 Dag 224

Boks 1 GEOLOKALISERING.............. Metoden bag geolokaliseringen er et såkaldt partikelfilter-metode, som er en avanceret statistisk metode, udviklet til at spore fly og missiler via radar. Princippet bag geolokaliseringen er at sammenligne mærkets målinger af saltholdighed med saltholdigheden beregnet i en hydrografisk model. For et givet tidspunkt kan positionen af fisken bestemmes som det punkt, hvor målingen stemmer bedst overens med værdien i den hydrografiske model. Dertil lægger man information om, hvor hurtigt en fisk kan svømme, samt viden om områdets dybde. Derefter søges der kun efter de lokaliteter, der giver den bedste overensstemmelse mellem informationer fra mærket og modellen. (figur 6). Mærket torsk Figur 6 Illustration af principperne bag geolokaliseringen.............. Hver dag undersøges den hydrografiske database inden for en radius, som er bestemt af hvor hurtigt fisken kan svømme (blå cirkel). Den valgte position er den, der bedst stemmer overens med den saltholdighed, der er målt fra mærket. Mærkning Mulige positioner Fremtiden for de elektroniske mærker Fremtiden for brugen af elektroniske mærker, som et alternativ til de traditionelle havundersøgelsestogter er lovende. Mærkerne kan levere den information, der er påkrævet i en moderne fiskeriforvaltning. Det vil sige informationer om, hvor fisken er på hvilket tidspunkt. Visionen er at udvikle mærkerne og analysen af data, så de kan indgå rutinemæssigt i forvaltningen og overvågningen af fiskebestandene. For at det skal blive virkelighed, er der især to faktorer ved mærkerne, som skal forbedres: Deres pris og størrelse. Prisen skal ned, så flere fisk kan blive mærket, og mærkerne skal være mindre, så også små fiskearter kan mærkes. Derfor har Danmarks Fiskeriundersøgelser og Institut for Mikro- og Nanoteknologi på Danmarks Tekniske Universitet startet et samarbejde om udviklingen af sensorer til Bedste næste position de elektroniske mærker baseret på mikroog nanoteknologi. Samarbejdet har ledt til udviklingen af en ny mikroelektronisk multisensor, som kan måle saltholdighed, lys, dybde og temperatur (figur 7). Inden denne multisensor kan tages i brug, skal den integreres med noget elektronik, der kan styre sensoren og lagre målingerne. I dag bruger man konventionelle elektroniske komponenter, men på længere sigt skal også elektronikdelen gøres mindre, så det samlede mærke kan blive meget mindre end i dag. Brugen af elektroniske mærker er endnu i sin vorden. Der er dog ingen tvivl om, at de er kommet for at blive. I de kommende år håber vi at aflure mere af ikke blot torskens hemmelige liv, men også hvad andre og mindre fiskearter laver.

FISK & HAV 2006 nr. 61 A B Figur 7 Mikroelektronisk multisensor Sensordelen i det nye mikroelektroniske mærker er ikke større end 4 x 6 mm. På dette lille område er der sensorer for lys, tryk (dybde), temperatur og saltholdighed.

Vilde fisk og udsatte fisk i Karup Å Vild og udsat ørred Stig Pedersen (sp@difres.dk).............. Danmarks Fiskeriundersøgelser Afdeling for Ferskvandsfiskeri 10 Der er stigende opmærksomhed på værdien af vandløbenes vildørred, altså fisk der naturligt gennemfører hele deres livsforløb i vandløb og hav. Det er der gode grunde til. Blandt andet klarer de sig bedre end fisk fra dambrug. I en undersøgelse af ørrederne i Karup Å har Danmarks Fiskeriundersøgelser vist, at ørredsmolt, der er vokset op som vilde fisk, klarer sig bedre end ørreder, der er sat ud i naturen som smolt. Undersøgelsen viser, at havørredernes vandring i havet bestemmes af genetikken, mens vandringen tilbage til og i gydevandløbet er tillært......................................................... Indledning Ørreden (Salmo trutta) er den mest udbredte danske laksefisk. Den findes i næsten alle danske vandløb, og både bæk- og havørred fiskes ivrigt af lystfiskere. I mange vandløb foretager lystfiskerne udsætninger af ørred, tidligere mest ørred fra dambrug, men i de senere år overvejende afkom af vilde ørred fra vandløbene. Fra 2006 skal alle udsætninger af genetiske hensyn være baseret på afkom af vildfisk. Foruden de genetiske hensyn har der de senere år været en stigende opmærksomhed på den generelle værdi af at fremme den naturlige produktion af fisk i vandløbene, altså af fisk der, indtil de vandrer ud i havet som havørred, lever hele deres liv i vandløbet. I denne artikel bringer vi resultaterne fra en større undersøgelse, der sammenligner vandring, genfangst og generel overlevelse for den naturlige ørredyngel, der er vokset op i Karup Å, med udsatte ørreder og med voksne havørreder fra vandløbet. For at belyse forholdene for ørredbestanden i hele vandsystemet opstiller vi en foreløbig model for gydningen og produktionen i hovedløbet og for produktionen i tilløbene til åen. Ørreden Ørredens livscyklus er kort fortalt, at bækog havørred gyder i vandløbene i november til februar, hvor æggene nedgraves i vandløbets sten og grus. Æggene klækkes i gruset, hvor yngelen vokser, mens den tærer på blommesækken. Omkring 1. april søger de små ørreder op fra gruset og begynder at leve frit i selve vandløbet. I løbet af denne første periode bliver yngelen territoriehævdende, og det bliver de ved med at være resten af livet, hvis de forbliver i vandløbet. I de fleste danske vandløb forlader en del af bestanden imidlertid vandløbet i forårsmånederne og vandrer ud i havet som havørred. Det gør de typisk, når de er fra et til tre år gamle og 10 til 25 cm lange. I dette stadie kaldes fiskene smolt. Skiftet fra ungfisk til smolt er forbundet med en lang række fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer. Blandt andet forøges fiskenes evne til at kunne tilpasse sig det omgivende vands saltholdighed, ligesom fiskene i smolt-stadiet præges til at kunne finde tilbage til deres hjemvandløb, når de som voksne havørreder skal tilbage for at gyde. Havørrederne lever i havet i én eller flere vækstsæsoner, inden de vender tilbage til hjemvandløbet.

FISK & HAV 2006 nr. 61 Figur 1 Mærket vild smolt fra Karup Å foto: Morten Carøe Hovedparten af de ørreder, der forlader vandløbet som smolt, er hunner. Andelen af hunner varierer mellem de enkelte bestande, men ligger typisk på ca. 75 %. Ørredens evne til at vende tilbage til hjemvandløbet udnyttes også ved udsætninger af fisk, der er opdrættet i dambrug. Ørrederne betragter nemlig udsætningsvandløbet som deres hjemvandløb, uanset om det dambrug de har tilbragt den første del af deres liv ligger ved et andet vandløb. Efter gydningen kan de voksne havørreder vende tilbage til havet, genvinde deres kondition og siden vende tilbage for at gyde igen op til flere gange. Der observeres dog ofte en betydelig dødelighed efter gydningen, hvor mange ørreder pådrager sig infektioner mv. Der er foretaget talrige undersøgelser af forskellige dele af ørredens livscyklus, ofte i forbindelse med afdækning af specifikke og afgrænsede problemstillinger. I denne undersøgelse dækker vi hele Karup Å-ørredens livscyklus fra æg til voksen og får dermed for første gang et indblik i, hvor stor bestanden er i hovedløbet af en større å. Vi får altså kendskab til hele bestanden, hvordan overlevelsen er i forskellige faser og i, hvor stor udvekslingen er mellem ørredbestandene i de forskellige delsystemer. Dette er nyttig viden for forvaltningen af vandløbets ørreder. Undersøgelsen blev gennemført i et samarbejde mellem Danmarks Fiskeriundersøgelser, Karup Å Sammenslutningen (sammenslutning af en række sportsfiskerforeninger ved Karup Å) samt Ringkøbing og Viborg Amter. Undersøgelsen Undersøgelsen i Karup Å bestod af en række delundersøgelser: I vinteren 1996/97 blev bestanden af gydefisk undersøgt ved mærkning og genfangst. Ud fra en senere bestemmelse af antallet af æg, som hunfisk i forskellig stør- 11

Figur 2 Havår og gydninger.............. Alder i havår og antal gydninger mod størrelse hos havørredhunner i Karup Å. Antal år / Gydninger 7 6 5 4 3 2 1 0 30 40 50 60 70 80 90 Længde Havalder år Gydninger Vild og udsat ørred 12 relse indeholder, kunne antallet af æg, der er gydt i hovedløbet beregnes. I den følgende sommer (1997) blev antallet af tre måneder gammel yngel bestemt ved elektrofiskeri. Antallet af overlevende ørreder fra denne årgang blev fulgt inden for den samme vandløbsstrækning de næste to år (1998 og 1999). Udvandringen af smolt om foråret blev undersøgt ved fangst i fælder i 1997, 98 og 99. Der blev mærket tre typer smolt: vilde fisk (opvokset i vandløbet), smolt, der var opdrættet afkom fra vilde fisk i Karup Å, og opdrættet smolt, der var afkom fra en dambrugsstamme (se billedet figur 1). Der blev mærket voksne havørreder indfanget i vandløbet i de tre vintre 1996/97, 1997/98 og 1998/99. Gydebestand, æg og yngel i hovedløbet En sammenligning af sportsfiskernes fangster ved el-fiskeri for de enkelte år viste, at gydebestanden i vinteren 1996/97 lå en anelse over gennemsnittet for perioden fra 1993 til 2002, men var meget nær gennemsnittet for perioden fra 1995 til 1998. Den gennemsnitlige alder i havår hos gydefiskene blev beregnet til 3,2 år. De gydemodne havørreder i Karup havde altså en bred alderssammensætning, og en betydelig andel af fiskene havde gydt en eller flere gange tidligere (figur 2). Det samlede antal æg, der blev gydt i vandløbet i perioden, blev ud fra størrelsessammensætning og antal hunner beregnet til at være 53,3 (37,1 84,5) mio. stk. Den samlede bestand af ca. tre måneder gammel yngel samt et og to år gamle ørreder i selve hovedløbet blev bestemt ved elektrofiskeri på en række repræsentative stationer i vandløbet mellem Agerskov Dambrug og Fly. Tætheden af både yngel og de et og to år gamle ørreder varierede meget ned gennem vandløbet (figur 3). De store forskelle i fisketætheden i vandløbet afspejler med stor sandsynlighed en tilsvarende variation i forekomsten af gode gydebanker, hvor områderne omkring disse fungerer som opvækstområder. Det beregnede antal æg, yngel, ét og toårs fisk på den undersøgte vandløbsstrækning er vist i figur 3. Det ses at antallet af toårs fisk er større end antallet af etårs fisk, hvilket sandsynligvis skyldes indvandring af fisk fra tilløbene til åen.

FISK & HAV 2006 nr. 61 Antal 0+ pr. m A 0+ 1+ 2+ 1.8 B 0.16 1.6 Uhre Hessellund Fårbæk Hagebro Åkær 0.14 1.4 Agerskov Karup Høgild Høstrup Vridsted 0.12 1.2 0.1 1 0.08 0.8 0.06 0.6 0.04 0.4 0.2 0.02 0 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Station (m fra udspring) Antal 1+ og 2+ pr. m^2 Figur 3 Ørredtæthed Tætheden af yngel pr m. vandløb samt af 1 og 2 år gamle ørreder i Karup Å Overlevelsen fra æg, der gydes i hovedløbet, til tre måneder gammel yngel blev beregnet til at være 0,14 %. Hvis det antages, at overlevelsen hos yngelen i perioden fra klækning og ca. tre måneder frem er på niveau med, hvad der er fundet i detaljerede studier i mindre danske vandløb (ca. 40 %), kan det beregnes, at overlevelsen i ægstadiet dvs. i gydebankerne har været på 0,36 %. Overlevelsen i ægfasen har i andre undersøgelser vist sig at være meget varierende. Overlevelsen afhænger i høj grad af indlejringen af sediment i gydegruset og af, hvor dybt nede i gruset æggene blev deponeret. I en nyere dansk undersøgelse, hvor betydningen af sandfang i vandløbene blev undersøgt, var det generelle billede, at enten overlevede næsten alle æggene indtil en vis dybde, eller også døde alle æggene (Nielsen 2003). Den kritiske dybde for overlevelse af æg var tydeligt korreleret med sandindlejringen: jo større sandindlejring, jo ringere overlevelse. Den beregnede overlevelse i hovedløbet af Karup Å på 0,36 % er lavere, end det generelt er fundet i undersøgelser af overlevelse af æg hos laksefisk ved moderat sandindlejring. Der findes ingen andre danske undersøgelser af overlevelse af æg i større vandløb og derfor heller ikke noget at sammenligne med. Sedimenttransporten i vandløb er størst ved høje vandføringer om vinteren. Altså i netop den periode hvor ørredens æg er deponeret i vandløbet og derfor er følsom over for tilsanding. I hvor stort et omfang gydebankerne i Karup Å faktisk sander til, ved vi ikke, men der er en betydelig sedimenttransport i vandløbet. I en ældre undersøgelse foretaget af Hedeselskabet for Viborg Amt, anslås sedimenttransporten i den nedre del af vandløbet til gennemsnitligt ca. 38 tons pr. dag, set over hele året (Anon. 1981). Ørreder i tilløbene og opstrøms for det undersøgte område Ørredbestandene i tilløbene til Karup Å blev beregnet ud fra de ørredudsætningsplaner, der var gældende på det pågældende tidspunkt (Dolby 1995). 13

Figur 4 Udvandring i relation til vandføring og temperatur.............. Udvandringen af ørredsmolt i foråret 1999. Figuren viser antal ørreder fanget i fælder under udvandringen, vandføring og temperatur. Antal smolt/10, Temperatur 35 30 25 20 15 10 5 Antal / 10 Temperatur Vandføring Nørk 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 Vandføring (L/sec) 0 19 23 27 31 4 8 12 16 20 24 28 2 6 10 14 18 0 Marts April Maj Vild og udsat ørred 14 De mindre vandløb rummer vigtige gydeog opvækstområder for ørreden, og det er de eneste dele af vandløbene, hvor bestandene har været regelmæssigt overvåget, f.eks. i forbindelse med udarbejdelse af udsætningsplaner for ørred. Som yngel er ørreden afhængig af, at der findes områder med lav vanddybde, men efterhånden som fiskene vokser, bliver behovet for vanddybde og plads anderledes. Generelt betyder det, at ørrederne med stigende alder trækker længere nedstrøms i vandløbet. I et vandsystem som Karup Å vil det betyde, at en del af bestanden i tilløbene vil bevæge sig ud i selve hovedløbet. Præcis hvor stor en del af bestanden, der vil bevæge sig fra tilløbene og ud i hovedløbet vil variere med bestandsstørrelse og -tætheder, tilgængelige habitater og vandføring. På samme måde kan der have bevæget sig fisk ind på den undersøgte strækning fra nedstrøms beliggende tilløb og fra den nederste del af selve hovedløbet. De ørredtætheder, der blev fundet i forbindelse med udsætningsplanen, blev sammen med tallene fra hovedløbet brugt til at opstille en model for ørrederne i åen, herom senere. Udvandring af smolt Udvandringen af havørredsmolt fra vandløbet blev undersøgt hvert forår fra 1997 til 1999. Ørredens smoltifikation er styret af udviklingen i daglængden, mens det præcise udvandringstidspunkt bliver bestemt af vandføringen og i nogen grad af temperaturen. Forløbet af udvandringen (i form af fangst af ørredsmolt) er vist for udvandringen i foråret 1999 sammen med vandtemperatur og vandføring i figur 4. På figuren ses en stigning i fangsten af smolt ved stigende vandføring. Især i starten af udvandringsperioden er denne sammenhæng tydelig. Senere ses også en respons på den stigende temperatur i form af øget udvandring og dermed fangst. Antallet af smolt der vandrede ud de enkelte år varierede mellem ca.15.000 og 33.000, og alderen varierede mellem et og fire år (figur 5). Den gennemsnitlige alder varierede mellem 1,8 og 2,2 år, hvilket svarer meget godt til fundene i andre danske undersøgelser.

FISK & HAV 2006 nr. 61 Antal smolt 35000 A 30000 25000 20000 15000 1997 1998 1999 B Figur 5 Udvandring fordelt på alder.............. Antal ørredsmolt udvandret fra Karup Å 1997 1999 fordelt på alder. 10000 5000 0 1 2 3 4 Alder Figur 6 Genfangster geografisk.............. Geografisk fordeling af genfangster fra udsætningerne af mærkede ørred i Karup Å. Symboler F1 smolt Smolt damstamme Vilde smolt Voksne havørred Mærkede ørreder Der blev mærket tre typer ørredsmolt: 1) vilde ørredsmolt fra vandløbet, 2) smolt der var afkom fra vilde fisk i Karup Å, men opdrættet på dambrug og 3) smolt der var afkom af en dambrugsstamme også opdrættet på dambrug. De vilde smolt blev fanget i fælder under udvandringen eller indfanget i vandløbet inden udvandring og mærket. Smoltene med dambrugsoprindelse blev mærket på dambruget et par dage inden udsætning. I alt blev der over de tre år mærket 2.188 vilde smolt, 2.997 smolt der var opdrættet 15

Figur 7 Genfangster over tid.............. Kumuleret genfangst over tid (dage efter udsætning) af mærkede ørreder fra udsætningerne i Karup Å. 1 0.5 Vild og udsat ørred 16 Havørred Afkom vildørred Damstamme Vildørred 0 0 200 400 600 800 1000 1200 afkom af vildfisk, 2.973 smolt der var opdrættet afkom af dambrugsstamme og 674 voksne havørreder. De 674 voksne havørreder blev mærket for at kunne sammenligne med smoltens vandring og overlevelse. Alle fiskene blev mærket med en type mærker der kaldes Carlin-mærker. Det er mærker, der sidder uden på fiskens ryg som det ses på figur 1. Mærkerne er individuelt nummereret og indsamles fra fiskeriet eller indsendes af dem, der finder en mærket fisk. Denne type mærker er almindelige og bliver rutinemæssigt anvendt til at mærke især laks og ørred. Genfangstandelen var størst for de voksne havørreder, gennemsnitligt ca. 6,5 % og mellem ca. 1,3 og 1,9 % for smolt. Genfangstprocenten for smoltene var lav, betydeligt lavere end genfangsterne fra en serie udsætningsforsøg i Limfjorden og i Karup Å i 1980 erne, men nogenlunde på niveau med, hvad der er fundet i andre mærkningsforsøg med ørredsmolt i de senere år. Årsagen til de forholdsvis lave genfangster er ikke kendt, men i de senere år er der i de fleste områder konstateret dalende genrapporteringsrater fra udsætningsforsøg. Der synes at være en klar forskel i smoltenes vandringsmønster afhængig af, om de er af vild oprindelse eller af dambrugsoprindelse. Mærkningsforsøgene viste nemlig, at genfangster af ørred fra åens stamme af ørred (dvs. vilde smolt, smolt der er afkom af vildfisk og voksne havørred) strækker sig fra Skive Fjord, fortrinsvis østover gennem Limfjorden og sydpå gennem Kattegat til den vestlige Østersø. En enkelt fisk er endda fanget langt inde i selve Østersøen (figur 6). Derimod blev der kun genfanget få ørreder af dambrugsafstamning i saltvand, og det skete enten i Limfjorden eller nordpå i forhold til Limfjorden. Der var en meget stor geografisk spredning på genfangsterne, men den største andel blev i alle tilfælde genfanget i Karup Å, hvor 57-91 % fra hver udsætningsgruppe blev genfanget.

FISK & HAV 2006 nr. 61 70 A 60 50 40 % 3 0 20 1 0 0 Havørred tilbage i hjemvandl. Havørred i havet B Inden udvandring Havørred Afkom vildørred Damstamme Vild smolt Ukendt Figur 8 Genfangster fordelt på grupper og lokalitet Fordelingen af genfangsterne for de enkelte udsætningsgrupper på forskellige typer lokaliteter: Tilbage i vandløbet som havørred, i havet som havørred, i vandløbet inden udvandring eller med ukendt genfangstlokalitet. En mere detaljeret analyse af hvor i åen fiskene blev fanget, viste en tydelig forskel i hvor de forskellige typer af mærkede fisk blev genfanget. Havørred, der var mærket som vilde smolt, blev genfanget forholdsvis langt oppe i vandløbet, og det samme blev havørred, der var mærket som voksne havørreder. Til forskel herfra blev hovedparten af de ørreder, der havde en fortid på dambrug, fanget længere nedstrøms i åen mere eller mindre samme sted som de var sat ud, uanset om de var af vild afstamning eller af dambrugsafstamning. De fleste af genfangsterne skete ved lystfiskeri, der stod for mellem ca. 15 og ca. 50 % af genfangsterne for de enkelte typer af ørred. Lystfiskeriets andel af genfangsterne var størst for de ørreder, der havde en fortid i dambrug, og lavest for de vilde smolt. Med det forholdsvis lave antal genfangster kan vi ikke give sikre tal for overlevelsen hos de enkelte grupper. Ved at sammenligne genfangsternes tidsmæssige fordeling, kan man imidlertid få et godt indtryk af, hvordan overlevelsen er relativt set mellem de forskellige typer fisk. De vilde ørredsmolt fanges væsentligt senere og overlever altså længere end de øvrige grupper, der genfanges nogenlunde lige hurtigt (figur 7). Det er lidt overraskende, at de voksne havørreder ikke genfanges hurtigere, da de straks fra mærkningen har en fangbar størrelse. Resultaterne viste også, at en stor del af de voksne ørreder overlever og kommer ind i vandløbet for at gyde igen. Der er fanget ørred fra denne gruppe tilbage i vandløbet frem til ca. to år efter mærkningen. Det bekræfter altså, at havørrederne gyder flere gange (figur 2). Den forholdsvis bedre overlevelse af de vilde smolt i forhold til de andre grupper, kan delvis forklares ved, at der er forskel på, i hvor stort omfang de vandrer ud fra vandløbet. De vilde ørreder synes klart at være den gruppe, der vandrer bedst sammenlignet med de andre grupper af smolt. Mens de vilde smolt vandrede langt væk, blev en betydelig del af de andre grupper nemlig fanget i løbet af sommeren uden at have forladt åen. Havørreder, der blev mærket som vilde smolt, er også dem, der i størst antal vender tilbage til Karup Å som voksne havørreder på gydevandring (figur 8). 17

Figur 9 Ørredbestanden i Karup Å i undersøgelsesperioden.............. Ørredbestanden i hovedløbet gennem undersøgelsesperioden og beregnet indvandring fra områderne ovenfor den undersøgte strækning. Antallet af ørredsmolt der vandrer ud som 1 og 2 år gamle smolt i 1998 og 1999 er også vist. Tid Aldersgruppe Opstrøms Hovedløb Udvandring Vinter1996 Sommer 1997 Forår 1998 Æg 3 mdr. Yngel 53 mill. 77.000 2.260 1 år 832 Vild og udsat ørred Sommer 1998 Forår 1999 1 år 2.667 9.162 2 år? 10.998 Sommer 1999 2 år? 15.536 Indvandring fra nedre dele af vandløb 18 Sammenhængen i hele vandløbet For at belyse udvekslingen af ørred imellem de forskellige dele af vandløbet, er tallene for bidrag af ørred fra tilløbene og fra hovedløbet sammenstillet i figur 9. Tallene er baseret på undersøgelsens delresultater og kohorte analyse og på resultater fra udsætningsplanen for åen (Dolby 1995). Parameterværdierne præsenteret i denne foreløbige model, er de bedste estimater på undersøgelsens tidspunkt. Men som i andre modeller er der mulighed for at raffinere og udbygge de forskelle komponenter med f.eks. estimater af og spredning på overlevelse i de forskellige delafsnit af vandløbet og med kvantitative mål for vandringen. En yderligere raffinering af modellens tal vil kræve en betydelig større indsats, der kan klarlægge vandringsdynamikken i vandløbssystemet. Dette lå imidlertid uden for undersøgelsens mål og økonomiske ramme.

FISK & HAV 2006 nr. 61 A B Ørredyndel med blommesæk foto: Finn Sivebæk Litteratur Anon. (1981) Undersøgelse af materialtransporten i Skive - Karup å. Det Danske Hedeselskab, Rapport til Viborg Amt. Dolby, J. (1995) Udsætningsplan for Karup Å (Distrikt 23, vandsystem 3). IFF..rapport nr 41. 22 pp. Nielsen, B. (2003) Sandfangs betydning for sedimentindlejring, iltforhold og overlevelse af ørredyngel (Salmo trutta L.) i gydegravninger. Specialerapport, Odense Universitet (SDU). 19

Listeria monocytogenes, kommer de ind udefra? Listeria hvorfra? Cisse Hedegaard Hansen (chh@difres.dk) Birte Fonnesbech Vogel (bfv@difres.dk) Lone Gram (gram@difres.dk).............. Danmarks Fiskeriundersøgelser Afdeling for Fiskeindustriel Forskning 20 Bakterien Listeria monocytogenes kan være årsag til listeriose, der er en alvorlig infektionssygdom, hvor ca. 25-30 % af alle patienterne dør af sygdommen. Listeriose er fødevarebåren det vil sige at man kan blive syg af at spise madvarer, der indeholder bakterien i høje koncentrationer. L. monocytogenes kan findes på gulvet og på udstyret i mange af de virksomheder, der fremstiller fødevarer, så her kan ske en overførsel af bakterien til madvaren. Bakteriens naturlige forekomst er i naturen, fx i planter i forrådnelse og i jord, men et nyt arbejde fra Danmarks Fiskeriundersøgelser har som det første undersøgt, om og hvor stor betydning L. monocytogenes i naturen har for forekomsten af bakterien inde i fiskeslagterier og røgerier......................................................... Listeriose rammer oftest ældre mennesker eller personer, der i forvejen har andre sygdomme og dermed et svækket immunforsvar. Gravide kvinder er også i risikogruppen, idet bakterien kan overføres til fosteret. Inficeres den gravide kvinde, kan det medføre, at barnet fødes med en alvorlig infektion eller i alvorlige tilfælde resultere i abort. I Danmark registreres der ca. 40 tilfælde pr. år (figur 1), og sygdommen har en dødelig udgang for en fjerdedel af patienterne. Vi spiser alle jævnligt fødevarer, der indeholder et lavt antal L. monocytogenes uden at bliver syge, og det skyldes, at der skal mange bakterier til for at fremkalde infektionen. Internationalt er der enighed om, at fødevarer med mindre end 100 L. monocytogenes pr. gram ikke udgør nogen risiko. For at L. monocytogenes kan forekomme i så høj koncentration, at madvaren er farligt at indtage, er det nødvendigt, at L. monocytogenes får tid til at vokse. Det er derfor typisk varer med en lang holdbarhed, der kan give problemer. Heldigvis overlever bakterien ikke, hvis fødevaren opvarmes før den spises. Dermed er det kun den gruppe af levnedsmidler, der er spiseklare og samtidig har en lang holdbarhed, der udgør en risiko for forbrugeren. Eksempler på disse er en lang række pålægsprodukter som fx bløde oste, især hvis de er fremstillet af upasteuriseret mælk, kødpålæg, salater og kold-røgede fiskeprodukter. Fra man har spist en madvare med høje koncentrationer af bakterien til de første symptomer viser sig, kan der gå alt mellem 1 og 90 dage. Det gør det meget svært at bestemme, hvilken fødevare der forårsagede infektionen. Ofte er der ikke mere mad tilbage, der kan analyseres for forekomst af bakterien, og det er også svært for patienten at huske hvad han eller hun har spist for så længe siden. Der har dog været tilfælde, hvor forureningskilden er blevet fundet, og årsagen har fx været coleslaw, bløde oste, smør, hot dog pølser, røgede muslinger, kold-røget regnbueørred og gravad regnbueørred.

FISK & HAV 2006 nr. 61 Antal listeriose tilfælde pr. år i DK 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Figur 1 Listeriose i Danmark I Danmark har antal listeriose-tilfælde varieret mellem 8 og 44 de sidste 24 år. Kilde: www.dfvf.dk Hvordan ender Listeria monocytogenes i vores madvarer? Virksomheder og myndigheder har to værktøjer til at nedbringe mængden af L. monocytogenes. De kan prøve at forhindre forurening af produkterne, og de kan udvikle konserveringsteknikker, der forhindrer bakterien i at vokse i madvarer. Man skulle tro, at det var nemt at forhindre forurening af fødevarer, men dels forekommer bakterien naturligt på mange af de råvarer, der bruges i fødevareproduktionen, og dels har bakterien en helt speciel evne til at overleve og etablere sig i procesanlæg til fødevarer. Både Danmarks Fiskeriundersøgelser og udenlandske laboratorier har vist, at man i nogle produktionsanlæg kan isolere de samme undertyper af L. monocytogenes år efter år. Det vides ikke, om det skyldes, at disse typer er de hyppigst forekommende i naturen og derfor hele tiden føres ind i fabrikken, eller om disse typer er helt specielle og har tilvænnet sig produktionsmiljøet. Forståelse for dette er vigtig for, at fabrikkerne kan vurdere, om de skal fokusere på speciel rengøring inde i fabrikken eller på at isolere alt indendørs fra det ydre miljø. Figur 2 Prøvetagning Ved prøvetagning fra overflader bruges sterile svampe og handsker for ikke selv at forurene prøven med bakterier. foto: birte Fonnesbech Vogel 21

Er Listeria monocytogenes indenfor og udenfor de samme? For at undersøge hvor mange og hvilke typer af L. monocytogenes, der forekommer i miljøer inde i fiskeproduktioner og udenfor, tog vi prøver fra Mølleåen, hvor der ikke er udledning fra levnedsmiddelproduktion, og fra tre dambrug, to havbrug, to fiskeslagterier og ét fiskerøgeri. I det ydre miljø, det vil her sige Mølleåen, dambrug og havbrug, blev der samlet prøver af fx jord, vand og planter, og disse blev analyseret for forekomst af L. monocytogenes. I det indre miljø inde på slagterierne og på røgeriet blev der primært brugte svampe til at tage prøver fra overfladerne med (figur 2). Hver svamp blev undersøgt for tilstedeværelse af L. monocytogenes. I laboratoriet blev prøverne fra de forskellige lokaliteter sået ud på Listeria-selektive agarplader. Det vil sige, at det kun er forskellige Listeria-arter, der kan vokse frem som synlige kolonier på pladen, mens andre arter af bakterier bliver hæmmet (figur 3). Listeria-arter danner sorte kolonier på den selektive agarplade, og desuden har L. monocytogenes kolonier en fordybning i midten. Dermed kan den adskilles fra de andre Listeria-arter. Bakterie-stammer blev isoleret fra kolonier på de selektive agarplader, og dernæst blev en række biokemiske tests gennemført for entydigt at fastslå, at det var L. monocytogenes. Listeria hvorfra? Figur 3 Listeria-selektiv plade.............. Alle Listeria arter danner sorte kolonier på den selektive plade. Listeria monocytogenes kan kendes på fordybningen i midten af kolonien navlen 22 I alt 65 ud af de 400 prøver indeholdt L. monocytogenes (tabel 1). Det viste sig, at efterfoto: Cisse Hedegaard Hansen

FISK & HAV 2006 nr. 61 ASteder prøverne er taget Antal prøver Antal Positive B Positive % Sommer Vinter Sommer Vinter Total Å 12-0 - 0-12 0 0 Dambrug 82 88 7 10 9 11 170 17 10 Havbrug 18 27 0 1 0 4 45 1 2 Slagteri, inde a 3 67 0 10 0 15 70 10 14 Slagteri, 6 19 2 3 33 16 25 5 20 området a bløgge- Slagteri, ude 11 22 4 5 36 23 33 9 27 Røgeri, inde b 31-21 - 68-31 21 68 Røgeri, ude 14-2 - 14-14 2 14 -: Ingen prøver taget a : Vi har kun taget få prøver om sommeren, idet slagteriet ikke producerede på dette tidspunkt. b : Dette er ikke et udtryk for den gennemsnitlige forekomst af L. monocytogenes, idet prøverne er taget, hvor vi forventer at finde bakterien Sommer Vinter Antal Prøver Antal Pos. % pos. Tabel 1 Antallet af prøver og forekomst af Listeria monocytogenes i prøverne. hånden som graden af forarbejdning steg, steg andelen af positive prøver også. I Mølleåen fandtes ingen L. monocytogenes, mens 2 % af prøverne fra havbrugene og 10 % af prøverne fra dambrugene var positive. I slagterierne var 14 % af prøverne positive for L. monocytogenes, og i røgeriet indeholdt 68 % af alle prøverne L. monocytogenes. Det skal pointeres, at prøver taget i røgeriet var målrettet mod steder, hvor det forventes at finde bakterien, og at dette røgeri i den periode, hvor prøverne blev taget, havde problemer med forekomst af L. monocytogenes. Derfor var der relativt mange positive prøver. Røgeriet modtager primært laks fra Norge (oprdrætslaks), så der var ingen sammenhæng mellem fx de undersøgte dambrug og det undersøgte røgeri. Det har været foreslået, at der på nogle årstider findes højere forekomst af L. monocytogenes, men i dette prøvemateriale var der ingen sæsonvariation, idet der om sommeren var 14 prøver ud af 136, der indeholdt L. monocytogenes, og om vinteren var 15 af 134 prøver positive. Selvom alle de 65 bakterie-isolater er L. monocytogenes, kan de godt være genetisk forskellige, ligesom DNA-prøver fra forskellige mennesker er forskellige, selvom vi alle er mennesker. Det er for eksempel forskelle og ligheder i DNA-profiler, politiet bruger til at koble en mistænkt til en forbrydelse. I disse forsøg blev en DNA-profil for hvert enkelt bakterie-isolat udarbejdet. Rent praktisk foregår det ved, at DNA oprenses fra hver af alle bakterie-isolaterne, hvorefter små stykker af DNA et opformeres. De små stykker afsættes på en agarosegel, som er en matrix af agarose-cellulose-polymerer, og vha. elektrisk spænding adskilles DNA-stykkerne efter størrelse. Til sidst farves gelen med et stof, der binder til DNA. Efterfølgende ses et båndmønster på agarosegelen for hver bakterie-isolat (figur 4). Denne teknik blev brugt til at undersøge, om det var den sam- 23

Listeria hvorfra? Figur 4 Er alle Listeria monocytogenes de samme?.............. På genetisk niveau kan der godt være forskel på L. monocytogenes selvom de hedder det samme. Ved at sammenligne båndmønsteret fra DNA et fra forskellige isolater, kan det afgøres om de er ens eller forskellige. Bane 1 og 8 er standarder og derfor har de ens båndmønster, mens alle de 10 stammer på billedet er forskellige (bane 2-7 og 9-12) 24 me slags L. monocytogenes, der var fundet inde i fabrikkerne og i miljøet udenfor. foto: Cisse Hedegaard Hansen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Der var kun ganske få forskellige DNA-typer inde i slagterierne og røgeriet, og hver virksomhed havde sin egen specielle type (tabel 2). Omvendt var der mange forskellige DNA-typer i dambrugene og miljøet udenfor fabrikkerne, og mange af dem blev kun fundet én eller to gange. Dog var der én type (type 2), som otte gange blev isoleret fra dambrug. DNA-type 8, som var den mest almindelige i det ene slagteri, blev ikke fundet andre steder, mens den DNA-type, der var almindelig i røgeriet (type 7) kun blev fundet få gange i det ydre miljø. Den omgivende natur kan derfor godt være den oprindelige kilde til de DNA-typer, der dominerer i fabriksmiljøerne, idet de findes i naturen. Omvendt er der kun få af de fabriks-dominerende DNA-typer i den omgivende natur, hvorfor de ikke udgør et konstant og markant pres på virksomhederne. Kan Listeria monocytogenes overleve i naturen? Man mener, at L. monocytogenes er en miljøbakterie, dvs. at den naturligt findes i naturen, men der har kun været få undersøgelser, der dokumenterer, hvor godt den overlever i naturen. Derfor er det på Danmarks Fiskeriundersøgelser blevet undersøgt, hvordan tre forskellige stammer af L. monocytogenes, der alle er forskellige DNA-typer, overlever i miljøet. En af bakteriestammerne (kode N53-1) repræsenterer en DNA-type, der er

FISK & HAV 2006 nr. 61 ADNA- type Antal isolater B Fiskeopdræt Fiskeslagteri Fiskerøgeri Dambrug Havbrug Inde Bløggeplads Ude Inde Ude 1 1 1 2 8 2 10 3 3 3 4 1 1 5 1 1 6 1 1 7 1 2 1 16 1 21 8 7 7 9 3 3 10 1 1 11 1 1 12 1 1 13 1 1 14 1 1 15 2 2 16 1 1 17 2 2 1 5 18 1 1 19 2 2 20 1 1 Antal DNAtyper 7 1 3 3 7 4 2 Total Tabel 2 Alle Listeria monocytogenes er ikke ens på DNA-niveau............... Nogle DNA-typer blev kun fundet én eller to gange, mens andre var mere dominerende. meget almindelig i røgerier, en anden (kode Br21) blev isoleret fra vand i et dambrug og kode 4542 er en L. monocytogenes, der er isoleret fra en patient med listeriose. Kunstigt havvand (Instant Ocean (IO)) og kunstigt ferskvand (phosphate-buffered saline (PBS)) blev fremstillet, og ca. 10 5 L. monocytogenes pr. ml vand blev tilsat. Flaskerne blev opbevaret ved 5 ºC. Med passende mellemrum undersøgte vi antallet af L. monocytogenes. Både i IO og PBS overlevede alle tre stammer af L. monocytogenes fint, så de meget næringsfattige forhold medførte ikke at bakterierne døde (figur 5a og 5b). 25

Figur 5 Overlevelse af Listeria monocytogenes i kunstige miljøer............... Alle stammer af L. monocytogenes ( N53-1, Br21, 4542) overlever fint i både (a) kunstigt havvand (IO) og i (b) en buffer (PBS) med få næringsstoffer ved 5 ºC. L.m. betyder Listeria monocytogenes. Log 10 L. m /ml 7 6 5 4 3 2 1 0 7 a 0 20 40 60 80 100 b 6 5 Listeria hvorfra? Log 10 L. m /ml 4 3 2 1 26 0 0 20 40 60 80 100 Tid (dage) Dernæst blev det undersøgt, hvordan de tre stammer overlevede i naturligt hav- og ferskvand ved både 5 ºC og 20 ºC. Alle tre typer af L. monocytogenes døde meget hurtigt i begge typer af vand (figur 6a), og de forsvandt hurtigere ved 20 ºC end ved 5 ºC. For at undersøge hvad der var årsag til reduktionen af L. monocytogenes, blev hav- og ferskvand varmebehandlet eller filtreret (filter med porestørrelse 0,2 μm) før L. monocytogenes blev tilsat. Både i varmebehandlet og filtreret vand overlevede bakterien i meget længere tid end i det naturlige vand (figur 6b og c). Derfor er der formodentlig i hav- og ferskvand nogle biologisk aktive organismer/stoffer, der reducerer de tilsatte L. monocytogenes. I hav- og ferskvand forekommer protozoer og phager (virus) naturligt. Disse kan spise bakterier eller lysere dem dvs. ødelægge cellemembranen og dermed reducere antallet af mikroorganismer i marine miljøer [Rozen & Belkin, 2001]. Proto-

FISK & HAV 2006 nr. 61 A Log10 L. m /ml 7 6 5 4 3 2 1 0 7 6 a B 0 20 40 60 80 100 b Figur 6 Overlevelse af Listeria monocytogenes i havvand. I naturligt havvand ved 20 ºC dør alle stammer af Listeria monocytogenes ( N53-1, Br21, 4542) meget hurtigt (a), mens de overlever længere tid i både varmebehandlet (b) og sterilfiltreret (c) vand. Pilene i (a) og (b) betyder, at detektionsgrænsen for analysemetoden er nået. L.m. betyder Listeria monocytogenes 5 Log 10 L. m /ml 4 3 2 1 0 7 0 20 40 60 80 100 c 6 5 Log 10 L. m /ml 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 Tid (dage) 27

zoer er større end 0,2 μm, mens phager er mindre end 0,2 μm, og derfor er de sidstnævnte stadigvæk i vandet efter sterilfiltrering. Derfor må det være protozoer, der i disse forsøg har dræbt L. monocytogenes i det naturlige hav- og ferskvand, idet bakterierne ikke forsvandt i det filtrerede vand. Konklusion L. monocytogenes forekommer i naturen, men antallet af prøver, hvor bakterien kan findes, er relativt lavt. Det stemmer godt overens med, at bakterien overlever dårligt i naturligt hav- og ferskvand. Hvis bakterien introduceres til det ydre miljø fx fra en inficeret patient, er det sandsynligt, at antallet af bakterier vil reduceres hurtigt. Samtidig viser DNA-typningen, at de L. monocytogenestyper, der dominerer inde i fiskeslagterierne og -røgeriet, kun findes i begrænset omfang i miljøet udenfor. Selvom det ydre miljø og/ eller råvaren må være den oprindelige kilde til L. monocytogenes, kan vi konkludere, at forekomsten af L. monocytogenes i det ydre miljø formodentlig kun har en mindre betydning for dens forekomst i produktionsmiljøerne, hvis bakterien vel og mærke allerede er etableret her. Det betyder, at selvom fødevarefabrikker naturligvis skal være meget omhyggelige med at hindre introduktion af L. monocytogenes fra miljøer udenfor fabrikken, så er det helt centralt for kontrollen af L. monocytogenes at den spores i fabriksmiljøet, og der sættes ind med målrettet rengøring og desinfektion i de nicher, hvor den findes. Listeria hvorfra? Arbejdet er Cisse Hedegaard Hansens afsluttende speciale som Levnedsmiddelkandidat, og det er en del af projekter Proceskrittiske kontrolpunkter til styring af persisterende Listeria monocytogenes finansieret af Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri, Direktoratet for FødevareErhverv. Projektet udføres i samarbejde med Højmarklaboratoriet A/S og en række fiskeproducerende virksomheder, som alle takkes for hjælp med prøvetagning samt konstruktive diskussioner af resultaterne. Litteratur Fonnesbech Vogel, B., Gram, L., 2003. Listeria monocytogenes i fiskeindustrien hvad er problemet? Fisk & Hav nr. 56, side 38-47. Hansen, C.H., Vogel, B.F., Gram L. 2006. Prevalence and survival of Listeria monocytogenes in Danish aquatic and fish processing environments. Journal of Food Protection, vol. 69, side 2113-2122. 28 Rozen, Y., Belkin, S., 2001. Survival of enteric bacteria in seawater. FEMS Microbial Reviews, vol. 25, side 513-529.

FISK & HAV 2006 nr. 61 A B Eksempel på dambrug foto: Jens Astrup 29

Prædiktiv mikrobiologi et vigtigt redskab til forudsigelse og styring af fiskeprodukters holdbarhed og sikkerhed Paw Dalgaard (pad@difres.dk) Ole Mejlholm (ome@difres.dk).............. Danmarks Fiskeriundersøgelser Afdeling for Fiskeindustriel Forskning Prædiktiv mikrobiologi omhandler vækst, drab eller overlevelse af mikroorganismer med betydning for fødevarers kvalitet og sikkerhed. Prædiktiv mikrobiologi fokuserer på kvantitative forhold og matematisk modellering, således at det kan forudsiges, hvordan konservering, lagringstid og hygiejne påvirker mikrobiologiske ændringer. Danmarks Fiskeriundersøgelser har udviklet prædiktive mikrobiologiske modeller og indbygget disse i et brugervenligt software. Denne artikel beskriver med eksempler, hvordan prædiktive mikrobiologiske modeller kan bidrage til at bestemme og forbedre fiskeprodukters holdbarhed og sikkerhed i forbindelse med produktudvikling, produktion og distribution......................................................... Prædiktiv mikrobiologi Prædiktiv mikrobiologi Fødevaremikrobiologi beskæftiger sig med fordærvelsesbakterier, som påvirker levnedsmidlers holdbarhed og spisekvalitet, samt med de fødevarebårne mikroorganismer og især bakterier, der kan forårsage sygdom hos mennesker. Vækst af disse bakterier til kritisk høje niveauer i fødevarer forhindres normalt med god hygiejne under fremstilling, konservering (f.eks. varmebehandling, køling og emballering) og begrænsning af et produkts deklarerede holdbarhed. Prædiktiv mikrobiologi er det område indenfor fødevaremikrobiologi, som beskæftiger sig med kvantitative studier samt matematisk modellering. Formålet med disse studier og matematiske modeller er at forudsige vækst, drab eller overlevelse af bakterier i fødevarer. Dette er vigtigt og kan bidrage væsentligt til: At forudsige levnedsmidlers holdbarhed og sikkerhed. Det kan f.eks. forudsiges, hvordan opbevaringstemperaturen gennem en kølekæde fra fremstilling til forbruger vil påvirke holdbarhed samt evt. vækst af sygdomsfremkaldende bakterier i et ferskt eller letkonserveret fiskeprodukt. At forudsige effekten af ændringer i produktegenskaber og/eller opbevaringsbetingelser. For fersk fisk kan det f.eks. forudsiges, hvordan pakning i en modificeret atmosfære med øget indhold af kuldioxid (CO2) vil forlænge holdbarheden i forhold til traditionel opbevaring uden emballering. For letkonserverede fiskeprodukter er det bl.a. muligt at forudsige, hvordan en bestemt kombination af konservering kan erstattes med en anden. 30

FISK & HAV 2006 nr. 61 Anvendelse af prædiktive mikrobiologiske modeller kan have stor praktisk betydning i forbindelse med: (i) Produktudvikling samt tilpasning af eksisterende produkter til forskellige markeder og lovgivningskrav. (ii) Kvantitative mikrobiologiske risikovurderinger, hvor det er afgørende at kunne bestemme koncentration af bakterier i et levnedsmiddel på det tidspunkt, hvor produktet bliver spist. Under forarbejdning og distribution kan bakterier i levnedsmidler dræbes eller vokse, og deres antal kan ændres markant, ofte med en faktor på mere end 1 million. Prædiktive mikrobiologiske modeller er derfor nødvendige, når den samlede effekt af forskellige forarbejdnings- og distributionsscenarier skal vurderes. (iii) Opsætning af planer for kvalitetssikring baseret på Hazard Analyse Critical Control Point (HACCP), hvor etablering af grænseværdier for kritiske kontrolpunkter (CCP) er vigtigt. Prædiktive mikrobiologiske modeller kan f.eks. anvendes til at bestemme hvilke konserverende parameter, der er krævet for at forhindre vækst af f.eks. en sygdomsfremkaldende bakterie. Modellerne kan også bestemme hvilke kombinationer af flere forskellige konserverende parameter, der giver den samme effekt. Dette er af stor praktisk betydning. (iv) Formidling, f.eks. undervisning og rådgivning, hvor især modeller indbygget i brugervenligt computersoftware er særligt velegnede. Prædiktive mikrobiologiske modeller kan f.eks. let, hurtigt og billigt illustrere effekten af forskellige opbevaringsbetingelser og produktegenskaber for en fødevares holdbarhed og sikkerhed. Både internationalt og nationalt har prædiktiv mikrobiologi opnået betydelige fremskridt gennem de seneste år. Der er udviklet matematiske modeller samt databaser med information om mange forskellige typer af bakterier. En betydelig mængde af de prædiktive mikrobiologiske modeller er i dag inkluderet i computersoftware, der gør det forholdsvis let at forudsige vækst eller drab af bestemte bakterier (boks 1). Det skal dog understreges, at modeller ikke kan anvendes til alle typer af fødevarer. Inden en prædiktiv mikrobiologisk model anvendes i praksis, er det derfor yderst vigtigt, at brugeren kontrollerer, om modellen er testet og fundet velegnet til den specifikke fødevaretype. Brugervenligt computersoftware for prædiktive mikrobiologiske modeller bør indeholde information om test af modellen samt en tydelig angivelse af de enkelte modellers anvendelsesområde mht. produkter, konservering og opbevaringsbetingelser. 31

Boks 1 Modelsoftware.............. Frit tilgængeligt software med modeller for vækst eller drab af bakterier i fødevarer PATHOGEN MODELING PROGRAM (PMP) www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm PMP er udviklet i USA (USDA-ARS Eastern Regional Research Center, Philadaphia, Pennsylvania). Programmet indeholder 37 modeller for vækst eller drab af 11 forskellige arter af sygdomsfremkaldende bakterier. PMP indeholder ikke information om test af de forskellige modeller med fødevarer. Dette gør det usikkert at anvende modellerne til f.eks. fiskeprodukter. COMBASE www.combase.cc England, USA, Australien samt EU har deltaget i udvikling af ComBase. Systemet indeholder ComBase Predictor med modeller for vækst eller drab af 12 forskellig arter af sygdomsfremkaldende bakterier samt fordærvelsesbakterien Brochothrix thermosphacta. Information om test af modellerne med forskellige fødevarer er ikke inkluderet i systemet. ComBase browser giver dog adgang til ca. 35 000 vækst/ drabs-kurver for fødevarerelaterede bakterier, og en del af disse data stammer fra forsøg med fødevarer. SEAFOOD SPOILAGE AND SAFETY PREDICTOR (SSSP) www.difres.dk/micro/sssp/ SSSP er udviklet af Danmarks Fiskeriundersøgelser og indeholder modeller for holdbarhed samt vækst af fordærvelsesbakterier og Listeria monocytogenes i fiskeprodukter. Resultater fra test af modellerne med specifikke fiskeprodukter er inkluderet i programmets hjælpemenu, og dette bidrager til at gøre SSSP meget brugervenligt for fiskesektoren. SSSP kan forudsige effekten af varierende opbevaringstemperatur på holdbarheden af forskellige fiskeprodukter. Prædiktiv mikrobiologi Modeller til forudsigelse af holdbarhed og sikkerhed Det er ikke formålet med denne artikel at give en detaljeret beskrivelse af de forskellige matematiske modeller, som anvendes indenfor prædiktiv mikrobiologi. Det skal dog fremhæves, at der findes to markant forskellige typer af modeller: Modeller for relativ fordærvelseshastighed (RFH, se beskrivelse i afsnit næste side), som anvendes til at forudsige effekten af opbevaringstemperatur på holdbarhed af fiskeprodukter. Modeller der beskriver vækst, drab eller overlevelse af specifikke bakterier. Disse kaldes kinetiske modeller. 32

FISK & HAV 2006 nr. 61 Ln (Relativ fordærvelseshastighed) A 4.0 3.0 2.0 1.0 Drænede MAP lagerejer Fersk fisk fra tropiske farvande Fersk fisk fra tempererede farvande Vakuumpakket koldrøget laks Varmrøget og pakket fisk B Figur 1 EFFEKT AF TEMPE- RATUR PÅ FORDÆR- VELSESHASTIGHED AF FORSKELLIGE FISKEPRODUKTER Lagringstemperaturens effekt på holdbarhed er stærkt afhængig af produkttype. Forskellige matematiske modeller til forudsigelse af holdbarhed er derfor nødvendige. 0.0 0 5 10 15 20 25 Lagringstemperatur ( C) Holdbarhed af fiskeprodukter reduceres typisk 10-20 gange når opbevarings-temperaturen hæves fra 0 C til 25 C. Dette forhold er dog meget produktafhængigt og kan være så lavt som ca. 2 gange (for varmrøget og pakket fisk) eller helt op til ca. 50 gange for lagerejer i modificeret atmosfære pakning (MAP) (figur 1). Derfor kræves forskellige holdbarhedsmodeller til forskellige typer af fiskeprodukter. Ved udvikling af RFH-modeller bestemmes fiskeprodukters holdbarhed vha. et panel af smagsdommere, som fastsætter holdbarhed ud fra ændringer i lugt og smag under opbevaring. Den relative fordærvelseshastighed (RFH) er defineret som holdbarhed ved en kendt referencetemperatur divideret med holdbarhed ved den aktuelle temperatur. Effekten af lagringstemperatur på RFH kan, for de fleste typer af fiskeprodukter, beskrives med en simpel eksponentielmodel (fi- gur 1). I figur 1 ses eksponentielmodeller som rette linier. For fersk fisk fra kolde farvande er en såkaldt kvadratrodsmodel imidlertid bedre egnet til at beskrive effekten af lagringstemperatur. Modellen ses som en linie med en svagt aftagende hældning. Kinetiske modeller for vækst eller drab af specifikke mikroorganismer har flere fordele, og de kan relativt let udvikles gennem laboratorieforsøg. Der findes mange modeller for både fordærvelses- og sygdomsfremkaldende bakterier (boks 1). Når kinetiske modeller anvendes til forudsigelse af holdbarhed, skal det dog altid huskes, at fordærvelsesbakterier har et afgrænset fordærvelsesdomæne, og en specifik bakterie er derfor kun ansvarlig for fordærv af et levnedsmiddel, når opbevaringsbetingelser og produktegenskaber ligger indenfor dette område. 33

Figur 2 Modeller.............. Prædiktive mikrobiologiske modeller udvikles i to trin og indeholder primære og sekunære modeller Log (cfu/g) A) PRIMÆR MODEL B) SEKUNDÆR MODEL 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Lagringstid 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 25 50 75 100-10 -50 5 1015 Prædiktiv mikrobiologi Boks 2 Eksempel på en kardinalparameter model.............. Modellen beskriver væksthastighed samt grænsen for vækst af listeria monocytogenes i fiskeprodukter afhængig af 8 forskellige konserverende parametre. 34 Kinetiske modeller udvikles typisk i to separate trin (figur 2). En såkaldt primær model tilpasses vækst- eller drabskurver og centrale kinetiske parametre (nølefase, væksthastighed og maksimal celletæthed) bestemmes (figur 2a). En sekundær model beskriver herefter, hvordan væksthastighed samt evt. nølefase og maksimal celletæthed afhænger af opbevaringsbetingelser f.eks. temperatur og CO 2 samt produktegenskaber f.eks. ph, salt, og andre konserverende parametre (figur 2b, boks 2). Væksthastighed = konstant temperatur-led vandaktivitets-led ph-led mælkesyre-led nitrit-led røgkomponent-led CO2-led eddikesyre/diacetat-led interaktions-led Figur 2b viser en sekundær kardinalparametermodel med to led for effekten af henholdsvis temperatur og CO 2 på væksthastigheden af fiskefordærvelsesbakterien Photobacterium phosphoreum. Kardinalparametermodeller er populære, relativt simple og indeholder led, med en værdi mellem 0 og 1 for hver af de konserverende parametre, der indgår i modellen. Boks 2 viser de led, der er inkluderet i DFU s seneste model for vækst af den sygdomsfremkaldende bakterie Listeria monocytogenes i letkonserverede fiskeprodukter. Det beskrives senere, hvordan denne model kan anvendes til at finde kombinationer af opbevaringsbetingelser og produktegenskaber, som forhindrer vækst af bakterien i overensstemmelse med den nye EU-lovgivning på området (EC 2073/2005).

FISK & HAV 2006 nr. 61 Forudsigelse af fiskeprodukters holdbarhed med SSSP programmet A Til forudsigelse af holdbarhed indeholder Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP) programmet både modeller for relativ fordærvelseshastighed (RFH) (figur 3) samt kinetiske modeller for specifikke fordærvelsesorganismer (SFO) (figur 4 og figur 5). Anvendelse af en RFH-model kræver, at holdbarhed for et fiskeprodukt er kendt ved en enkelt konstant opbevaringstemperatur. Ud fra denne information kan SSSP programmet forudsige holdbarhed for: Forskellige konstante opbevaringstemperaturer Simple temperaturprofiler som består af serier af konstante opbevaringstemperaturer Komplekse temperaturprofiler f.eks. indsamlet med dataloggere under køledistribution af et fiskeprodukt For et ferskt fiskeprodukt med en holdbarhed B på 14 dage ved 0 C viser figur 3 effekten af en simpel temperaturprofil (4 dage ved 0 C, 2 dage ved 4 C, 12 timer ved 14 C og 4 dage ved 0 C). SSSP forudsiger den resterende holdbarhed (RH) ved 0 C, 5 C og 10 C. Den røde kurve i figur 3 viser således den resterende holdbarhed ved 0 C, og for en given opbevaringstid angiver denne kurve hvor mange dages holdbarhed, der er tilbage, hvis produktet fra den aktuelle tid og fremefter opbevares ved 0 C. Temperaturprofilen vist i figur 3 svarer til en holdbarhed på 9,7 dage (skæringspunktet for de tre RH-kurver i figur 3). Opbevaring af produktet i 2 dage ved 4 C samt i 12 timer ved 14 C har således nedsat holdbarheden fra 14 dage ved 0 C til 9,7 dage for den viste temperaturprofil. Forudsigelser af denne type kan anvendes i mange situationer og er i særdeleshed relevante, når det skal vurderes, om en kølekæde tillader distribution af Programmet kan forudsige effekt af temperatur på holdbarhed af: 1. Fersk fisk fra kolde farvande 2. Fersk fisk fra varme/tropiske farvande Resterende holdbarhed (dage) 14 12.15 10.3 8.45 6.6 4.75 2.9 1.05 3. Koldrøget laks 4. Kogte og pillede lagerejer Resterende holdbarhed (RH) og temperaturprofil 5. Levnedsmidler med brugerdefineret temperaturfølsomhed -0.8-1 0 1.05 2.1 3.15 4.2 5.25 6.3 7.35 8.4 9.45 10.5 Opbevaringstid (dage) RH ved 0 C RH ved 5 C RH ved 10 C Temperaturprofil 15 13 11 9 7 5 3 1 Temperatur ( C) Figur 3 SSSP.............. SSSP kan forudsige effekten af konstant og varierende lagrings temperatur på holdbarheden af forskellige fiskeprodukter 35

Figur 4 Fordærvelsesorganismer.............. Typisk vækst af specifikke fordærvelse organismer (SFO) i fersk fisk Log (cfu/g) Specifik fordærvelsesmikroorganisme (SFO) Aerobt kimtal Metabolitter Holdbarhed Mikrobiologisk indeks for fordærv Kemisk indeks for fordærv Koncentration af metabolitter Lagringstid Prædiktiv mikrobiologi 36 et kendt fiskeprodukt eller om forbedring af kølekæden eller ændring af produktets ønskede holdbarhed evt. er nødvendig. Det er vist for adskillige fiskeprodukter, at en enkelt art af bakterier er ansvarlige for fordærv. Kendskab til disse såkaldte specifikke fordærvelsesorganismer (SFO) gør det muligt at udvikle og anvende kinetiske vækstmodeller til forudsigelse af holdbarhed (figur 4). For fersk kølet fisk er svovlbrinte producerende Shewanella-bakterier typisk ansvarlige for fordærv, mens Photobacterium phosphoreum begrænser holdbarheden af ferske marine fisk i modificeret atmosfære pakning (MAP). SSSP indeholder modeller for vækst af både svovlbrinte producerende Shewanella-bakterier og Photobacterium phosphoreum (figur 5). Som et eksempel er det således muligt at forudsige holdbarhed for fersk MAP fisk afhængigt af, de betingelser fisken er opbevaret under (temperatur og CO 2 koncentration i den modificerede atmosfære), samt den hygiejne produktet er produceret under (start niveau af Photobacterium phosphoreum). Figur 5 viser en temperaturprofil, hvor opbevaringstemperaturen svinger systematisk mellem ca. 0 C og ca. 10 C. Dette eksempel illustrerer, at SSSP kan anvendes generelt til at forudsige effekten af konkrete temperaturprofiler, således som de f.eks. er målt gennem hele køledistributionskæden vha. temperaturloggere. SSSP indeholder flere kinetiske holdbarhedsmodeller samt en model for den sygdomsfremkaldende bakterie Listeria monocytogenes (figur 5). Programmet indeholder også en generel model med brugerdefinerede parameterværdier. Med denne facilitet

FISK & HAV 2006 nr. 61 A Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP) Bkan forudsige effekt af opbevaringsbetingelser og produktegenskaber på vækst af fordærvelsesbakterier og Listeria monocytogenes. SSSP programmet indeholder følgende modeller for vækst af bakterier: 1. Photobacterium phosphoreum i fersk torsk, rødspætte og laks i modificeret atmosfære pakning 2. Shewanella (svovlbrinte producerende) bakterier i uemballeret fersk fisk 3. Generel model med brugerdefinerede parameterværdier 4. Listeria monocytogenes og mælkesyrebakterier i koldrøget laks Figur 5 Temperatur og holdbarhed Effekt af varierende temperatur på vækst af Photobacterium Phosphoreum og resterende holdbarhed af fersk map torsk Temperatur ( C) 11.4 9.82 8.25 6.68 5.1 3.52 1.95 0.38-1.2 0 0.52 1.03 1.55 2.07 2.58 3.1 3.61 4.13 4.65 5.16 Opbevaringstid (dage) Temperaturprofil Temperaturprofil Log (cfu/g) Forudsagt mikrobiologisk vækst 8.84 7.79 6.75 5.7 4.66 3.61 2.56 1.52 0.47-0.4 0 0.52 1.03 1.55 2.07 2.58 3.1 3.61 4.13 4.65 5.16 Opbevaringstid (dage) Mikrobiologisk vækst RH ved 0 C RH ved 5 C RH ved 10 C 14.31 12.47 10.63 8.79 6.95 5.12 3.28 1.44 Resterende holdbarhed (dage) 37

kan SSSP sammenligne forudsigelser med to forskellige modeller. Det er således muligt at vise grafer for effekten af (i) forskellige opbevaringsbetingelser (temperatur og CO 2 ) og/eller produktegenskaber (vandaktivitet og ph) for en bestemt model eller (ii) sammenligne hvordan ændring af parametrene i en kardinalparameter model påvirker mikrobiologisk vækst og holdbarhed for forskellige lagringsbetingelser og produktegenskaber. SSSP s omfattende hjælpemenu er en vigtig del af programmet. Hjælpemenuen beskriver opbevaringsbetingelser og produktegenskaber, hvor de forskellige modeller er testet og kan anvendes. Den giver også referencer og information om andre lignende programmer. Programmets hjælpemenu er så omfattende, at den sammen med SSSP kan anvendes som et kursus i prædiktiv mikrobiologi. Forudsigelse af fiskeprodukters sikkerhed Som beskrevet ovenfor kan prædiktive mikrobiologiske modeller for vækst eller drab af sygdomsfremkaldende bakterier bidrage til øget fødevaresikkerhed. Modellerne kan bl.a. være en hjælp til at identificere kombinationer af opbevaringsbetingelser, konservering og deklareret holdbarhed således, at en sygdomsfremkaldende bakterie ikke kan vokse til et farligt niveau. Både Pathogen Modeling Program og ComBase Predictor (boks 1) indeholder modeller for sygdomsfremkaldende bakterier, som kan være til stede i fiskeprodukter f.eks. Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Salmonella og Staphylococcus aureus. Der er samlet rigtig meget information i disse programmer, og dette bør fiskesektoren udnytte så meget som muligt. Det skal dog bemærkes, at de modeller, der er inkluderet i disse programmer, ikke normalt er testet mht. anvendelighed for specifikke fiskeprodukter. Ved Danmarks Fiskeriundersøgelser Prædiktiv mikrobiologi Figur 6 Eksempel på forudsigelse.............. Danmarks Fiskeriundersøgelsers nye vækstgrænsemodel for Listeria Monocytogenes % Mælkesyre / laktat 2 1.6 1.2 0.8 0.4 Forudsagt vækstgrænse for Listeria monocytogenes i MAP koldrøget hellefisk Ingen vækst Vækst 0 38 0 0.1 0.2 0.3 0.4 % Eddikesyre / diacetat

FISK & HAV 2006 nr. 61 har A vi testet Listeria monocytogenes modellerne fra PMP og ComBase. For kogte og pillede rejer i modificeret atmosfære pakning var forudsigelserne acceptable, men dette var derimod ikke tilfældet for vakuum-pakket koldrøget laks. PMP og ComBase bliver mere anvendelige for fiskesektoren, når resultater fra test af programmerne med fiskeprodukter bliver tilføjet til disse systemer. Listeria B monocytogenes forekommer desværre ofte i spiseklare fiskeprodukter. Omfattende risikovurderinger har dokumenteret, at lave koncentrationer af Listeria monocytogenes ikke udgør et problem mht. fødevaresikkerhed. Det er dog samtidig vist, at vækst af Listeria monocytogenes til høje koncentrationer absolut skal undgås i spiseklare fødevarer, som ikke koges, inden de bliver spist. I over- Produkt Produktegenskaber og lagringsbetingelser 1 2 Listeria monocytogenes (celler per gram) 1 1 Lagringsperiode (dage) 40 40 Temperatur ( C) 5,0 5,0 Salt i vandfase af produkt (%) 4,0 4,0 ph 6,0 6,0 Mælkesyre i vandfase af produkt (mg/l) 8000 8000 Røgkomponenter (phenol, mg/kg) 0,0 0,0 % CO 2 i headspace gas i ligevægt 0 25 Diacetat i vandfase af produkt (mg/l) 0 1500 Nitrit (mg/kg) 0 0 Figur 7 Forudsigelse af vækst samt vækstgrænsen for Listeria monocytogenes. Danmarks Fiskeriundersøgelsers nye model er i sin nuværende form indbygget i et Excel regneark, således at den kan anvendes i forbindelse med vores rådgivning og undervisning. Log (cfu/g) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Listeria monocytogenes Produkt 1 Produkt 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Lagringstid 39

Prædiktiv mikrobiologi 40 ensstemmelse med denne erkendelse skelner den nye EU-lovgivning (EC 2073/2005) mellem spiseklare fødevarer, som er tilberedt så de forhindrer eller ikke forhindrer vækst af Listeria monocytogenes. For den første gruppe af spiseklare produkter tillades op til 100 Listeria monocytogenes per gram. Det er vigtigt at forhindre vækst af Listeria monocytogenes i spiseklare fiskeprodukter, og Danmarks Fiskeriundersøgelser har vist, at dette kan opnås ved at tilsætte diacetat (eddikesyre) evt. sammen med mælkesyre (figur 6). Effekten af diacetat og mælkesyre afhænger dog i betydelig grad af opbevaringsbetingelser og andre produktegenskaber. Vi har derfor udviklet en matematisk model, der kan forudsige, hvordan et letkonserveret fiskeprodukt kan sammensættes, således at vækst af Listeria monocytogenes effektivt kan forhindres (boks 2, figur 6, figur 7). Denne nye model er en udvidet version af den Listeria monocytogenes model, som allerede er indbygget i SSSP programmet (version 2 fra april 2005). Den tidligere Listeria monocytogenes model er udvidet med led for effekten af diacetat, CO2 og for interaktionen mellem alle led i modellen (boks 2). Omfattende test af den nye model har vist, at den er velegnet til flere forskellige letkonserverede fiskeprodukter f.eks. koldrøgede, gravad og marinerede produkter. Mange produktegenskaber påvirker vækst af Listeria monocytogenes i letkonserverede fiskeprodukter. En matematisk model, som beskriver den kombinerede effekt af alle disse parametre, er derfor særdeles velegnet i forbindelse med produktudvikling, kvalitetsstyring og dokumentation. Figur 7 viser et eksempel på forudsigelser opnået med Danmarks Fiskeriundersøgelsers nye model. Eksemplet viser, hvordan tilsætning af diacetat (1500 mg/l i vandfasen) samt anvendelse af en modificeret atmosfære med 25 % CO 2 (figur 7, produkt 2) vil forhindre vækst af Listeria monocytogenes i et saltet produkt, som ellers i udtalt grad tillod vækst af bakterien (figur 7, produkt 1). Den nye model for vækst samt for vækstgrænsen af Listeria monocytogenes forventes inkluderet i næste version af SSSP programmet, som forhåbentligt bliver tilgængelig i 2007. Fremtidens udfordringer Indenfor de seneste år er der opnået meget betydelige fremskridt indenfor prædiktiv mikrobiologi, og anvendeligheden af de matematiske modeller til forudsigelse af levnedsmidlers holdbarhed og sikkerhed er blevet markant forbedret. Der er dog stadig betydelige udfordringer at tage fat på, så prædiktive modeller i fremtiden kan blive til større gavn for fiskesektoren. Blot nogle få eksempler kan nævnes her: Når fiskeprodukter forårsager sygdom hos mennesker skyldes det oftest histaminforgiftning, virus eller Vibrio bakterier. For histaminproducerende bakterier og Vibrio bakterier er der behov for modeller, der kan forudsige deres vækst i fiskeprodukter. For virus mangler der modeller, som kan forudsige virus inaktivering afhængig af især temperatur, salt og ph. I alle tre tilfælde er der behov for, at der udvikles brugervenligt computersoftware, så modellerne nemt kan anvendes af fiskesektoren. For vækst og overlevelse af Listeria monocytogenes er der behov for at udvide den eksisterende vækstgrænse-model (boks 2, figur 7) med en funktion for effekten af benzoesyre, citronsyre og sorbinsyre. En udvidet model, der også er anvendelig for rognprodukter og skaldyr i lage, vil lette produktudvikling betydeligt. Danmarks Fiskeriundersøgelser arbejder pt. med denne udvidelse.

FISK & HAV 2006 nr. 61 A Vedr. forudsigelse af holdbarhed er der B For de fiskeprodukter, hvor fordærv ikke behov for nye modeller samt forbedring skyldes mikrobiologisk aktivitet, er behovet for nye prædiktive modeller også af flere af de eksisterende. F.eks. mangler der kinetiske modeller, som kan forudsige vækst af mælkesyrebakterier og for holdbarhed af frosne fiskevarer, som meget udtalt. Bl.a. savnes der modeller holdbarhed af flere letkonserverede fiskeprodukter. opbevaringstemperatur på kan forudsige effekten af variationer i frostvarer. Brian J. Cowan takkes for en betydelig indsats i forbindelse med programmering af SSSP- programmet. LITTERATUR Dalgaard, P. 2002. Modelling and predicting the shelf-life of seafood. Chapter 12 in Safety and Quality Issues in Fish Processing. Bremner, H.A. (ed). Woodhead Publishing Ltd. pp.191-219. McMeekin, T. A., J. Baranyi, J. Bowman, P. Dalgaard, M. Kirk, T. Ross, S. Schmid, M.H. Zwietering 2006. Information systems in food safety management. Int. J. Food Microbiol. 112, 181-194. Mejlholm, O. and P. Dalgaard 2006. Modelling and predicting the growth boundary of Listeria monocytogenes in lightly preserved seafood. J. Food Prot. (In press). Mejlholm, O, P Dalgaard, L. D. Schönemann-Paul, N. Bøknæs 2006. Listeria monocytogenes - forudsigelse af letkonserverede fiskeprodukters sikkerhed. Plus Proces 5, 8-10. Ross, T. and P. Dalgaard 2004. Secondary models. In: Modeling Microbial Responses in Foods. McKellar, R.C. and Lu, X. (eds). CRC Press, Boca Raton, USA, pp. 63-150. 41

Hvad sker der, når vi fryser torsken? Frossen torsk Inger V. H. Kjærsgård (ivk@difres.dk) Mette R. Nørrelykke mette.rindom.norrelykke@ teknologisk.dk Flemming Jessen (flj@difres.dk).............. Danmarks Fiskeriundersøgelser Afdeling for Fiskeindustriel Forskning 42 Mange af de fisk vi spiser i dag, bliver fanget langt fra kysten. For at sikre at de kommer i land som et højkvalitetsprodukt, bliver fisken frosset ombord på fiskefartøjet. Hvorvidt fiskene bliver ved med at være et højkvalitetsprodukt afhænger imidlertid af, hvor længe og hvor koldt fisken bliver opbevaret, og hvilken art der er tale om. F.eks. vil frysning af torsk ved -20ºC eller -30ºC i et år betyde, at nogle af de vigtige proteiner i muskelfibrene ændres. Fryselagring i tre til seks måneder synes derimod at give mindre ødelæggelser i muskelstrukturen og dermed spisekvaliteten......................................................... Fiskekød Når vi spiser svine- okse- eller kalvekød, foretrækker de fleste lagret kød, som er mørt og nemt at tygge. Når det gælder fisk, er det omvendt, for her falder spisekvaliteten typisk, når fisken lagres. Den bliver ofte mere fisket i smagen og løs og tør i strukturen. Grundlæggende er alle celler (boks 1) og alt muskelvæv (boks 2) opbygget på samme vis, uanset om det stammer fra pattedyr, fjerkræ eller fisk. Hovedparten af musklen (kødet) består af proteiner, lipider (fedtstoffer) og vand. Proteinerne danner muskelens struktur og er derfor afgørende for kødets konsistens. Strukturen i muskelceller er opbygget af henholdsvis tynde og tykke protein-filamenter, hvor de vigtigste proteiner er henholdsvis aktin, tropomyosin og troponin i de tynde filamenter, og myosin heavy chain (MHC) og myosin light chain (MLC) 1, MLC 2 og MLC 3 i de tykke filamenter (boks 2). Når de proteiner, der udgør musklens struktur, nedbrydes, bliver musklen blød. Der sker et væsketab, og kødet vil blive tørt og trevlet, når det tilberedes. Der er typisk to forskellige årsager til, at musklens proteiner nedbrydes. Den ene årsag er mekanisk stress, hvor proteinerne rives i stykker. Den anden er, at proteinerne nedbrydes af særlige enzymer proteaser. Når en fisk dør, sker der en ændring af ph i musklen, hvilket medfører en aktivering af proteaserne. Proteomanalyse For at få en bedre forståelse af årsagen til kvalitetsforringelsen under lagring af fisk har Danmarks Fiskeriundersøgelser gennem en årrække anvendt den såkaldte proteomanalyse (boks 3). Proteomanalyse giver et øjebliksbillede af alle de proteiner, der er i musklen, når prøven bliver udtaget, herunder koncentrationen af alle de enkelte proteiner. Typisk vil der kunne analyseres omkring 2000 forskellige proteiner fra en almindelig muskelprøve. I det forsøg, der er beskrevet her, er metoden brugt til at undersøge, hvad der sker med proteinerne i fiskekød ved forskellige lagringsbetingelser. De store datamængder, der opnås ved at bruge proteomanalyser,

FISK & HAV 2006 nr. 61 A forventes på længere sigt også at give os viden, som kan anvendes til at udvikle et simpelt testsystem til kvalitetsbedømmelse af de fisk, der skal anvendes til konsum. Hypotesen er, at hvis f. eks. et bestemt protein (markørprotein) går fra at være vandopløseligt i friske fisk til ikke at være vandopløseligt, når fisken har været lagret i lang tid, vil det kunne anvendes som markørprotein for kvalitet. Markørproteiner anvendes allerede i dag i stor udstrækning af læger til f.eks. at afgøre, om mennesker med halsbetændelse har en bakteriel streptokok infektion. Proteomanalysen blev introduceret første gang i 1995. Det er en arbejdstung og avanceret teknik, hvor bl.a. analysen af proteinpletterne i gelerne er meget tidskrævende. Siden 1995 er der sket en stor udvikling, og proteomanalyse er i dag et vigtigt og udbredt analyseværktøj, som anvendes inden for mange forskellige forskningsgrene f.eks. i den medicinske kræftforskning. Et af de nyere tiltag i forbindelse med proteomanalysen er at kombinere den med multivariat dataanalyse (boks 4), et felt hvor Danmarks B 3 måneder ved -30 C Opbevaring ved 2 C i 0 og 14 dage -30:03:00-30:03:14 6 måneder ved -30 C Opbevaring ved 2 C 6 måneder ved -20 C Opbevaring ved 2 C i 0, 7 og 14 dage i 0, 7 og 14 dage 12 måneder ved -30 C -30:06:00-30:06:07-30:06:14 Opbevaring ved 2 C i 0 og 14 dage -30:12:00-30:12:14 12 måneder ved -20 C -20:06:00-20:06:14 Opbevaring ved 2 C i 0 og 14 dage -20:12:00-20:12:14 Fiskeriundersøgelsers afdeling for Fiskeindustriel Forskning er blandt pionererne. Hvad er det egentlig, man ser og måler i torsk, der har været frosset ned? I det forsøg vi beskriver her har vi undersøgt proteinsammensætningen i torskefileter ved forskellige opbevaringsbetingelser. Der var tale om varierende frysetemperaturer og varierende nedfrysningsperioder og lagringstider på køl. Fiskene på køl blev pakket i modificeret atmosfære pakning (MAP) og opbevaret ved 2 ºC efter optøning (figur 1). I alt er 11 forskellige opbevaringsbetingelser blevet undersøgt og sammenlignet. Ændringer i fiskemusklernes proteinsammensætning kan man måle ved at opløse proteinerne og adskille dem på 2D-geler (boks 3). Typisk vil man på den måde kunne opløse 1500-2000 proteiner fra hver muskelprøve. De kan så ses som enkelte pletter i 2D-gelerne (figur 2). Da proteinerne i den øverste del af gelen ofte ligger meget tæt, kan det imidlertid være svært at skelne dem fra hinanden. Derfor har vi her sorteret proteinerne, så det kun er proteiner med pi værdier på 3-10 og proteinstørrelser på ca. Figur 1 Flowdiagram af lagringsbetingelserne Torskefileterne var først fryselagret ved -30 ºC i 3 måneder. Herefter blev de yderligere fryselagret 3 måneder (6 måneders total frysetid) eller 9 måneder (12 måneders total frysetid). Numrene i kasserne med den tykke kant viser prøvenavnene og svarer til de følgende værdier: frysetemperatur: måneders frossen lagring: dage i modificeret atmosfære pakning (MAP) ved 2º C. 43

Figur 2 2D-geler af torskemuskelproteiner Mw 3.5 ph 9.0 36.5 opløst efter fem forskellige lagringsbetingelser 31.0 Proteinerne blev først adskilt efter ladning med en pi gradient 21.5 på 3-10 og derefter med 12 % SDS-PAGE. Gelerne er sølvfarvet. Prøverne er navngivet som anført i figur 1. 14.4-30:03:00 3.5 ph 9.0 3.5 ph 9.0 Hvide ellipser markerer de Mw proteiner, der tydeligst for- 36.5 svinder efter lang fryselagringstid. Her er kun vist det 31.0 partielle proteom, som er markeret med en stiplet line i figur 3. 21.5 14.4-30:06:00-20:06:00 3.5 ph 9.0 3.5 ph 9.0 Mw 36.5 31.0 21.5 14.4-30:12:00-20:12:00 Frossen torsk 44 12-40 kda, der er analyseret i detaljen. I dette tilfælde svarer det til pletterne inden for den stiplede firkant i figur 3. I forsøget blev proteinpletterne i 2D-gelerne fra de 11 prøver sammenlignet (figur 1). Det viste sig at seks kraftige (dvs. at der er meget af dem i musklen) proteinpletter forsvandt efter 12 måneder uafhængigt af, hvad frysetemperaturen havde været. Det betyder, at de bliver nedbrudt, mens fiskene ligger i fryseren, og at det ikke har nogen betydning

FISK & HAV 2006 nr. 61 A Mw 97.4 66.3 55.4 Actin; 4017 36.5 Tropomyosin; 1710 31.0 MLC 1; 1305 MLC 2; 1203 21.5 MLC 3; 101 1 4.4 3 pi 1 0 Myosion heavy chain f; 2108 for nedbrydningen af disse proteiner, om fiskene har været opbevaret ved -30 ºC eller -20 ºC. Hvad er det for proteiner, der ændrer sig, og hvad betyder det? Nogle af de proteiner, der ændrede sig mest under langvarig frysning, var muskelfilament proteinerne: MLC 1 (plet 1305), MLC 2 (plet 1203), MLC 3 (plet 101) og tropomyosin (plet 1710) (figur 2). Desuden steg koncentrationen af et proteinfragment fra MHC (plet 2108) og to aktin-fragmenter (plet 3412 og 3506). Ændringerne blev fundet ved at sammenligne prøver, der havde været frosset i hhv. 3, 6 og 12 måneder. B Aldose A; 8803 GADPH; 8702 Actin f; 3506 Tim; 6303 Actin f; 3412 8110 8108 9101 8803). Disse proteiner udgør ikke direkte en del af muskelstrukturen i fisken, men findes i strukturen omkring de tynde filamenter. Det er derfor sandsynligt, at der sker en nedbrydning af disse proteiner samtidig med, at der sker en nedbrydning af aktin i de tynde filamenter. Hvad betyder ændringen af disse proteiner? Som nævnt tidligere, er strukturen i muskelceller bygget op af henholdsvis tynde og tykke filamenter, hvor de vigtigste proteiner er henholdsvis aktin, tropomyosin og troponin i de tynde filamenter, og MHC og MLC 1, 2 og 3 i de tykke filamenter. Figur 3 Sølvfarvet 2D-gel af 60 µg opløst torskemuskel protein efter 6 måneders lagring ved -30 ºC og 7 dage i MAP, ved 2 ºC Den stiplede firkant viser området, hvor der er analyseret videre på proteinpletterne. Proteinpletter, der ændrer sig i koncentration som følge som lagringstiden, er identificeret med nano-lc-ms/ms (boks 5), og er markeret med en cirkel. Plet 3506, 3412, 2108 og 5104 er fragmenter af hhv. aktin, MHC og nucleoside diphosphate kinase B. Plet 8110, 8108 og 9101 er ikke blevet identificeret, men er markeret, da det er nogle af de proteiner, der korrelerer stærkt med fryselagringstiden. Endvidere så vi markante ændringer af proteinerne: triose-phosphate isomerase (plet 6303), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (plet 8702) og aldolase A (plet I de prøver, som havde været frosset i 12 måneder viste stigningen i koncentrationen af aktinfragmenterne (plet 3412 og 3506), at der var sket en nedbrydning af aktin. 45

Figur 4 PCA score og loadingsplot af data fra 2D-gelerne (A) Scoreplot af alle prøverne. Prøverne er navngivet som vist i figur 1. (B) Loadingsplot. De proteinpletter, der er meget af i prøver, der har været frosset i 3 og 6 mdr., ligger længst til højre, mens de proteinpletter, der har en høj koncentration i de fisk, der har været frosset i 12 mdr. ligger længst til venstre. Principal komponent 2 4 2 0-2 -4 A -30: 1 2 : 00-30: 1 2 :1 4-3 0:1 2 :00-20:1 2 : 1 4-20: 1 2 : 1 4-30:1 2 :1 4-20: 1 2 : 00 Scores -30:06:07-30: 06: 07-20: 06:1 4-20:06: -30: 06:1 1 4 4-30:03 :00-30:06:00-20: 06: 00-30:03 :1 4-3 0:03 :00-30:06:00-30:03 :1 4-5 -4-3 -2-1 0 1 2 3 4 Principal komponent 1 Principal komponent 2 0.3 0.2 0.1 0-0.1-0.2 B X-loadings 71 04 71 02 5 1 04 7401 1 1 1 1 4 2004 21 08 73 3 408 02 2 4 2 4 5 1 5 5 63 09 1 403 21 06 1 404 5 5 4 5 1 1 21 2 1 3 2 2 2 2 2 7 2 5 2 2 2 2 4 5 4 4 4 4 402 4 3 5 4 2 4 7 4 5 5 5 5 5 5 7 7 1 21 206 0 11 5 1 01 201 408 41 503 504 604 1 0 1 21 3 208 1 1 508 505 809 704 409 605 041 1 209 1 3 05 1 402 25 052207 1 21 2706 003 3 1 3 407 5161 06 3 35503 3 21 3 1 04 61 6503 71 01 01 717001 08 7807 3 4051 033 21 107 1 505 1 1 701 51 204 1 01 509 1 203 1 401 507 502 3 2 81 4 03 207 21 4 1 1 21 406 604 703 21 011 3 006 3 702 5 501 1 5602 04 1 603 51 1 506 801 2005 23 409 2204 2604 3 3 23 2209 606 708 1 61 1 706 21 704 0 21 03 21 09 21 23 02 2208 2404 2202 2201 2203 21 2206 2205 2702 23 26052606 09 23 206 41 3 34003 06 23 23 261 2401 1 2502 2402 2501 24062405 2705 3 2704 2409 07 2801 203 205 201 603 3 208 21 21 2408 1 2607 3 03 008 1 261 61 2 1 2708 2808 1 3 4 209 3 3 506 509 221 3 40044006 5404 6001 602 341 607 4401 41 4406 5409 3 3 3 202 3 3 403 605 3 803 41 41 4205 43 41 4202 4203 4206 054141 01 4201 4204 43 4405 4403 43 43 441 4407 4503 4502 4504 4606 43 4607 4608 5002 4402 5005 14806 53 51 01 5 3 08 5407 5 4408 4409 4601 3 604 321 1 1 1 347 404 4602 2703 4604 01 3 701 47 53 401 53 5 53 5402 5405 5406 408 403 5 41 55 5 504 5502 55055 601 5 41 1 5 507 5603 5604 5605 5602 5606 5609 57 5561 5607 5703 571 5806 56006 803 61 6003 5807 5708 5705 09 581 0 61 61 7404 08 63 62056206 63 6201 6202 640264 6603 64056404 6407 7202 65 6406 6403 6203 61 63 6204 63 6408 6502 6208 6604 6606 6504 6608 63 6601 63 6605 03 6607 6703 7407 8201 6705 71 74027 73 7207 77206 17204 6707 7403 3 6706 6709 205 7504 7 6602 6701 005 75077 501 761 7605 7607 4704 61 63 5801 4805 6704 6708 203 761 7508 7604 6801 1 7606 7601 7702 681 503 7405 7406 7506 7608 7603 6808 7602 0 7703 761 2 7705 81 7701 708 01 81 83 8509 7 7709 0 7802 01 83 7804 81 83 85 098401 81 7806 7803 7 81 0 8005 81 8204 8403 8502 83 8406 0783 8407 1 8202 8405 0 8803 8701 8802 8501 8404 8601 8408 106 06 7 509 81 1 0 818602 8703 71 85 7502 03 8402 851 1 9406 8702 48014808 9407 4404 9405 81 08 4705 4702 1 47 507 2603 4803 4804 4605 03 3 7 02 2403 261 2806 91 01 2 3 1 09 8809 3 402 7 4 2707 45 05 2601 261 2608 5 2609 3 704 401 4603 2503 3 705 Frossen torsk -0.3-0.1 5-0.1 0-0.05 0 0.05 0.1 0 0.1 5 0.20 0.25 Principal komponent 1 46

FISK & HAV 2006 nr. 61 Samtidig A så vi, at tropomyosin (plet 1710), som er det protein, der binder aktinfilamenterne sammen, også nedbrydes, og derved bliver de tynde filamenters struktur blødere. MHC udgør basis i de tykke filamenter. I prøverne så vi, at koncentrationen af et MHC fragment steg under lagringsforløbet, samtidig med at koncentrationen af MLC 1, 2 og 3 faldt. Begge dele er klare tegn på, at de tykke filamenter også bliver nedbrudt. Tilsammen udgør de ovenfornævnte proteiner grundstrukturen i muskelcellerne. Ændringer i koncentrationen, interaktionen og bindingen af disse proteiner viser, at der er en klar sammenhæng mellem fryselagringstiden, og graden af hvor ødelagt muskelstrukturerne bliver. Disse ødelæggelser er sandsynligvis årsagen til, at fiskemusklen under fryselagring mister sin evne til at binde vand, hvilket igen betyder, at fiskekødet efter tilberedning vil blive mindre saftigt. Torsk og gris Proteomanalyser af forskellige opbevaringsforløb for svinekød viser en stigning i koncentrationen af et aktin-fragment, der minder om det, vi finder i torsk. Det indikerer, at mønsteret for proteinnedbrydningen er det samme i begge arter. Et faktum der eventuelt kan udnyttes, hvis det lykkes at identificere en proteinmarkør for kvalitet. Proteomanalyse kombineret med multivariat dataanalyse Efter den traditionelle analyse af proteinpletterne blev proteomdata underkastet endnu en analyse. Denne gang blev der anvendt et multivariat databehandlingsprogram kaldet unscrambler (boks 4). I B PCA scoreplottet af proteinpletterne fra 2D-gelerne ses det, at prøverne danner to grupper (figur 4A). En i højre side af diagrammet med prøver fra alle de fisk, der har været frosset i 3 eller 6 måneder og en til venstre, som indeholder alle de prøver, der har været frosset i 12 måneder. I PCA loadingsplottet (figur 4B) ses x-variablene dvs. proteinpletnumrene. Proteinpletterne i venstre udkant af plottet er dem, der er kraftige i prøverne efter 12 måneders fryselagring f. eks. plet 7104, mens f.eks. plet 8803 er kraftig i 3 og 6 måneds prøverne. Dette ses også i gelerne (figur 2). Ved at kigge på akserne ses, at 17 % af variationen beskrives af PC1, der beskriver forskellene i fryselagringstiden, nemlig 3 og 6 måneder versus 12 måneders fryselagring. Langs PC2 kan grupperingen ikke beskrives i forhold til lagringsbetingelserne (det eksperimentelle design), men kan skyldes individforskelle i de enkelte fisk, som f.eks. alder eller køn. Desværre har vi ikke information om denne biologiske variation i dette forsøg. Det fremgår, at der ikke er den store forskel i proteinpletmønsteret alt efter om prøverne har været opbevaret ved -20 ºC eller -30 ºC eller 0 eller 7 dage ved 2 ºC. Ved at lave en DPLSR (boks 4) af proteomdataene (figur 5) finder vi, at 288 ud af de i alt 504 proteinpletter i datasættet korrelerer med fryselagringstiden. Resultatet er vist i et korrelationsplot hvor alle x- og y-variable er vist i samme graf. De proteinpletter, der ligger i samme område som en designvariabel (f.eks. temperaturen), korrelerer med denne. Analysen viser altså, at prøver fra de fisk, der havde været frosset i tre eller seks måneder klart adskilte sig fra de prøver, hvor fisken havde været frosset i tolv måneder. Resultaterne viser endvidere, at der efter 6-47

Figur 5 DPLSR af x (proteinpletterne) og y (designvariablene) Der er vist et korrelations loadingsplot af x og y variablene. Proteinpletter, der er refereret til i teksten, er markeret med en større skrift og indrammet med en sort kant. Se figur 3 for identiteten af pletterne. Designvariablene er markeret med en større skrift og indrammet med en stiplet kant. Cirklerne repræsenterer hhv. 50 % og 100 % forklaret varians. Principal komponent 1 1.0 0.5 0-0.5-1.0 P C2C 2 3 M 2603 2601 2609 1 507 3 1 1 1 2503 6801 261 5 4605 5 261 2 63 01 27086702 6701 502 6808 508 261 1 2703 81 03 4603 7502 4601 4704 3 54707 91 01 2806 1 1 1 2 4503 4408 1 02 4308 2408 8602 3 803 4702 1 207 9405 24033 1 09 4405 2202 4706 3 12406 3 4402 7803 851 23 08 4205 5507 4705 3 60523 1 571 0 0 5509 8404 7509 3402 2705 3 3 04 43 5 7 5 3 7705 2402 07 4407 4004 3 208 31 201 1 05 4306 4409 5801 6601 8005 83 09 8703 0d 8809 4502 4701 7-3 0 C 1 1 5807 211 502 05 23 7806 3202 3 3 3 1 2005 3403 07 5 1 1604 1 01 3 02 3602 41 04 4606 5402 7506 681 7503 1 6206 771 1 705 81 4 1 505 2502 3 1 53 082607 41 3 21 051 5708 61 6605 63 046704 703 9406 7 61 02 7 3 2505 20231 05 3 21 3 6708 81 08 43 03 31 02 7701 71 1 1 09 1 401 603 3 5504 71 63 3006 41 1 21 4 7 503 1 708 2206 61 11 51 1 1 208 509 5 1 7703 1 23 3 407 405 5201 61 06 61 05 8163 06 83 0205 83 0508 581 0 6205 761 06 1 4d 01 0 7 7 7405 6504 1 7 1 0 7302 2605 2209 2808 5608 7601 541 6006 1 6402 1 2M5404 2207 3 7706 81 1 0 21 1 206 506 1 201 1 702 3 1 1 03 1 3 04 23 09 2606 3 409 51 06 61 03 6608 6204 6401 5503 5601 7204 7207 81 05 851 8204 0 73 43 02 51 1 51 0 21 09 232305 03 6603 6505 7 703 7501 8803 8601 8201 02 3 207530931 3 304 06 64053 406 4608 1 5014806 6309 84087804 83 07 73 706 5 8802 1 21 1 212 02004 1 307 8501 7702 1 403 3 204 5408 7508561 0 51 01 2706 6001 7607 7608 1 404 5706 5709 73 205 06 303-20 C 3 02 7604 6604 7 7 81 04 5609 201 21 03 303 3 003 53 5502 720271 086406 21 02 1 1 04 3 206 51 05 5303761 7603 2 7807 21 08 1541 30 1 203 3 3 7606 5803 1 204 1 2604 17205 1 1 6606 7404 1 01 7708 5002 8405 1 21 3 3 41 2 Correlation Loadings (x and Y) 7407 71 02 717 1 04 7d7 d 515 1 04 6M 8702 P C 1-1.0-0.5 0 0.5 1.0 Principal komponent 1 Frossen torsk 48 12 måneder sker flere markante ændringer i proteinstrukturen uafhængig af frysetemperaturen. Om hastigheden, hvormed disse proteinændringer indtræder, afhænger af frysetemperaturen, kan vi ikke sige noget om ud fra dette forsøg. Ved brug af den multivariate dataanalyse blev det muligt for os at udpege nogle af de proteiner, der ændrede sig mest under fryselagringsforløbet. Samtidig bekræftede analyserne at: 1) Opbevaring på frost i mere end seks måneder giver den største ændring i proteinmønsteret i torskemusklen, 2) De proteiner, der ændrer sig mest, er de strukturelle proteiner i muskelfilamenterne og 3) Det er både proteiner fra de tynde og tykke filamenter, der bliver nedbrudt. Med andre ord vil frysning i mere end seks måneder ændre muskelstrukturen og dermed spisekvaliteten. Udviklingsmuligheder I dag baserer mange virksomheder en stor del af deres produktion af fiskeprodukter på frosne råvarer, hvor kvaliteten af råvaren naturligvis vil afhænge af såvel frostperioden som opbevaringstemperaturen. Derfor er identifikationen af markørproteiner særdeles interessant, da det på længere sigt kan føre til udviklingen af et værktøj, som forarbejdningsindustrien kan bruge til hurtigt at vurdere kvaliteten af de råvarer, de køber. På kort sigt er der imidlertid behov for yderligere analyser ikke bare af de proteiner og enzymer, der ændrer sig under fryselagring, men også de proteiner der ændrer sig under kølelagring, opdræt og stress, og som også har betydning for spisekvaliteten. En stor del af vores spisefisk er ferske. Det er derfor også yderst relevant at undersøge mulige markørproteiner for ferske fisk både

FISK & HAV 2006 nr. 61 mht. A kølelagringstid og -temperatur. På baggrund af de ovenfor nævnte og potentielle markørproteiner for fryselagring vil det være oplagt at undersøge, om det er muligt at udvikle immunoassays eller enzymassays dvs. relativt hurtige og brugervenlige metoder, der kan indikere råvarens kvalitet. B Forkortelser anvendt i artiklen: DPLSR: Discriminant partial least squares regression; GADPH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease; LC; liquid chromatography; MAP: modificeret atmosfære pakning; MCL: myosin light chain; MHC: myosin heavy chain; PCA: principial component analysis; TIM: triose-phosphate isomerase Figurerne 1, 2, 3, 4a, 4b og 5 er venligst gengivet med tilladelse efter: Changes in cod muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis, Inger V. H. Kjærsgård, Mette R. Nørrelykke and Flemming Jessen, Proteomics 2006, 6, 1606-1618 Litteratur: Changes in cod muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis. Inger V. H. Kjærsgård, Mette R. Nørrelykke and Flemming Jessen. Proteomics 2006, 6: 1606 1618. 49

Boks 1 Eukaryote celler Skitsen giver et overblik over, hvordan alle eukaryote celler (celler med kerner) er opbygget. Bakterier og svampe har en anden opbygning i cellen. Hver eneste celle i en eukaryot organisme har det samme genome. Dvs. at DNA et i cellekernen er identisk i f.eks. vores hud-, øjen- og muskelceller. Det, der bestemmer celletypen, er, hvilke gener fra DNA et der bliver oversat (transcriberet) til mrna, der så igen bliver oversat (translateret) til proteiner. En celle De tre grundmolekyler i cellen og de informationer, de giver: DNA: Vores arvemateriale, som er ens fra top til tå, består af fire baser (adenine, guanine, cytosine, thymine), der sættes sammen efter hinanden. DNA et er dobbeltstrenget, og de to DNA-strenge binder sammen nærmest som en lynlås. mrna: transcriberet fra DNA Er mellemleddet mellem DNA et og proteinerne. Fortæller hvilke gener, der er tændt og slukket for. Som DNA et består det af fire baser (adenine, guanine, cytosine, uracil). mrna sekvensen er en enkeltstrenget kopi af DNA sekvensen. Protein: translateret fra mrna Udfører opgaver som enzymkatalyse, transport og lagring af f.eks. ilt, koordinering af bevægelse, immunforsvar, kontrol af vækst og opbygning af struktur. Proteiner består af 20 aminosyrer og kan desuden være modificerede på forskellige måder (f.eks. glykosyleret og fosforyleret). Hvilke proteiner er udtrykt? Ydre faktorer som stress, miljø og udvikling kan regulere hvilke proteiner, der udtrykkes i cellerne. Det sker både ved at påvirke det mrna, der bliver transcriberet, og de proteiner, der bliver translateret. Når vi spiser sker der f.eks. en kraftig ændring i sammensætningen af de fordøjelsesenzymer, som er i vores spyt. En celle Genomet DNA DNA Transkribtomet: mrna transkriberet fra genomet mrna Frossen torsk Protein Proteomet: Proteiner udtrykt fra genomet 50 Stress, miljø & udvikling

FISK & HAV 2006 nr. 61 Filamenterne A glider ind og ud imellem hinanden, B når musklen arbejder. De tykke filamenter består primært af proteinet myosin heavy chain (MHC) og af tre myosin light chains (MLC 1, 2 og 3). Udover et ATP (adenine triphosphate) og to MLC bindingssteder har MHC et aktin bindingssted. De tynde filamenter består primært af aktin, samt tropomyosin og troponin. Derved dannes der et netværk af tynde og tykke filamenter, der udgør basisstrukturen i muskler. De nævnte proteiner, der er byggestene i disse tykke og tynde filamenter, refereres ofte til som de myofibrilære proteiner. Boks 2 Muskelvæv Fibrene i en muskelcelle er opbygget af tynde og tykke proteinfilamenter Hvad sker der i musklen? Tynde filamenter Tykke filamenter Tynde filamenter Tropomyosin Troponin Actin Troponin Tykke filamenter Myosin Myosin Myosin hovedet Myosin hovedet Hængsel området Hængsel området Haleregionen, to heliske proteiner Haleregionen, to heliske proteiner Tilpasset fra General Biology Laboratory Exercises 51