Løsninger til opgaverne den 12-9-07 Spm. A: Her er vi i en situation at det eneste der kendes til vores receptor er, at den kan binde en ligand, som vi har til rådighed i en radioaktiv mærket version. For at klone vasopressin receptor cdna må vi anvende expressionskloning i Xenopus oocytter, som angivet i værktøjskassen. Vi må så anvende vores radioaktive vasopressin til at identificere de oocytter, der udtrykker funktionel vasopressin receptor. Så vi må screene os frem til den rigtige cdna klone ved at bruge binding af den radioaktive vasopressin ligand som verifikation af at receptoren er til stede. Spm. B: Vi må lave reverse transkription efterfulgt af PCR. Til reverse transkription kan vi bruge en polydt primer. Som op primer kan vi bruge følgende sekvens: 5 atgctcctggtgtctacc 3 (Tm = 4 x 10 + 2 x 8) = 56 o C Som down primer kan vi anvende 5 tcaggagggtgtatccttc 3 (Tm = 10 + 2 x 8) = 56 o C. For at klone receptor cdnaet I en vector ville det være smart og påsætte genkendelsessites for restriktionsenzymer i 5 enden af primerne. Spm. C: Her må vi lave overlap extension PCR som angive i værktøjskassen. Vi kan lægge vores primer et sted opstrøms for den kodende region af pre-pro-delen. F. Eks. Helt til venstre: Op-primeren (A) bliver så: 5 caagaagattacaaactatcaa 3 (Tm = 56 o C) Primeren til overgangen mellem pre-pro-delen og vasopressin (B) bliver følgende: 5 ccaggagcattcttttatccaaagatacccct 3 (Tm = 56 o C) Den understregde sekvens er komplementær til den sidste del af pr-pro-delen før spaltningsstedet. Resten er komplementær til den kodende del af starten af vasopressin receptoren. Op-primeren til amplifikation af vasopressin receptor delen (C) bliver følgende: 5 ggataaaagaatgctcctggtgtctacc 3 (Tm = 56 o C) Den understregede sekvens er magen til starten af vasopressin receptor cdna. Den anden del er identisk med sekvensen umiddelbart før pre-pro-spaltningsstedet. Vi kunne også vælge kun at have en hale på den ene primer, f.eks. opprimeren til amplifikation af vasopressin receptor cdna. Halen ville vi så vælge så lang, at den ville have en smeltetemperatur på 56 o C. Down primeren (D) skal være komplementær til slutningen af vasopressin receptor cdna.0 5 tcaggagggtgtatccttc 3 (Tm = 56 o C)
Vi foretager nu PCR I et rør med primerne A + B og I et andet rør med primerne C + D. Dernæst anvender vi en lille smule af disse fragmenter som template til en ny PCR reaktion med primerne A + D. Dermed har vi fået fusioneret vores pre-pro-del til vasopressin receptor cdna. Hvis vi vil klone vores fusion kan vi sætte nukleotider for restriktions-enzym-genkendelses-sites i 5 enden af vores to yder primere (A + D) A C B D Spm.D: Springer vi over og vender tilbage til i detaljer i Gentek 2. Men dtet jo klart at plasmidet skal indeholde et replikationsorigin til E. coli (p15a) og et til gær (2μ), samt en selektionsmarkør til E. coli (bla som giver resistens mod beta-lactam antibiotika som penicillin) og en selektionsmarlør til gær (URA3, der koder for et enzym i uracil biosyntesen; gærstammen skal så være ødelagt i sit URA3 gen). Der skal også være en promoter til transkription af vores vasopression cdna). Spm. E + F: Det ville jo være rart at kunne vise, om der akkumulerer er mrna, når nu der ikke akkumulerer noget protein. For at påvise mængden af mrna har vi i hvert fald tre muligheder.vi kunne derfor fremstille et Northern blot med en vasopressin specifik probe og en probe, der rammer et konstitutivt udtrykt gen. Det signal vi opnår med den sidste probe tjener som en normaliserings kontrol. Det
betyder, at vi kan normalisere vores signal fra vasopressin mrna til signalet fra vores konstitutivt udtrykte gen. Vi kunne lave RNase protection med en probe specifik for vasopression mrna og en probe specifik for et konstitutivt udtrykt gen. Eller vi kunne lave real time PCR på revers transkriberet mrna. Det sidste ville være det mest kvantitative og nemmeste at lave. Det ville også være rart at vise, om der rent faktisk skete syntese af vores vasopressin receptor protein. Når det ikke akkumulerer kan det jo betyde, at nedbrydningen er hurtigere end syntesen. For at måle syntesen kan vi lave et pulse experiment, hvor vi mærker cellens protein med 35 S-methionin og cystein i kort tid. Ved slutningen af pulsen udtager vi en lille mængde celler, som vi homogeniserer, tilsætter anti-vasopressin-antistof og senere sepharose-kugler coated med protein A (Se under immunoprecipitation i værktøjskassen). Derved laver vi et pull-down forsøg. Det fældede protein-antistof-proteina-sepharose kompleks spindes ned i en centrifuge, vaskes og separeres ved SDS-PAGE. Efter PAGE analyseres gelen ved autoradiografi eller på en FosfoImager. Hvis der sker proteinsyntese vil vi få et radioaktivt bånd på vores gel. En anden mulighed ville være at lave en polysom analyse (se værktøjskassen). Polysomer er mrna dækket af ribosomer. Jo flere ribosomer, der sidder på mrnaet, jo bedre translateret er mrnaet. mrna med 0, 1, 2, 3, 4, 5 o.s.v. ribosomer på kan fraktioners i en sukrosegradient ved ultracentrifugering. Tapper vi nu fraktioner ud af gradienten (som vist i værktøjskassen), kan vi analysere RNA indholdet i de enkelte fraktioner på et Northern blot, RNase protection eller real-time PCR. Er vores vasopressin receptor mrna associeret med mange ribosomer vil det vandre langt ned i gradienten, hvis det er nøgent vil det ikke vandre ned i gradienten. Ud fra positionen i gradienten ved man fra tidligere forsøg, hvor mrna med forskellig antal ribosomer ligger. For at bestemme halveringstiden af vorees vasopressin receptor in vivo kan vi lave et pulse-chase forsøg (se værktøjskassen). Her mærker vi vores celler med 35Smethionin og cystein i en kort periode. I denne periode bliver alle proteiner som er under syntese mærkes (hvis de indeholder cys/met). Efter denne puls periode indleder vi et chase ved at tilsætte et så stort overskud af kold (ikke-radioaktiv) met/cys at der i praksis ikke vil indkorporeres mere radioaktivitet under cellens proteinsyntese. Vi isolerer protein fra celler lige før tilsætning af koldt met/cys og til forskellige tidspunkter derefter. For at bestemme hvor meget radioaktivt mærket vasopressin receptor protein der er i cellen til de forskellige tidspunkter, foretager vi
immunoprecipitation og adskiller immunoprecipitatet i en SDS holdig poly-akrylamid gel. Iintensiteten i den immunoprecipiterede vasopressin receptor bestemt ved fosfoimage analyse er et mål for, hvor meget af den oprindeligt mærkede receptor, der er tilbage i cellen. Intensiteten i vores vasopressin-receptor bånd plottes i semi-log papir som funktion af tiden efter pulsen. Dette gør vi, da nedbrydning af makromolekyler førlger 1. ordens kinetik. D.v.s. at dn/dt = k d N hvilket giver N(t) = N (t = 0) exp ( k d t). Logaritmeres denne ligning får vi: Log{N(t)/N(t = 0)}= k d t Hvor k d er nedbryningshastigheden. Halveringstiden er den tid der går til halvdelen af proteinet er forsvundet. Det er således tiden mellem 100% protein og 50% protein. Eller mellem 50% og 25%. Sammenhængen mellem kd og t½ kan bestemmes ud fra ovenstående ligning ved at indsætte t = t½ og N(t½) = ½ N(t = 0)
Opgave 1juni 1999 Spm. A: Her skal vi klone i en lambda replacement vektor. Vi kan så klone ca. 20 kb i vektoren. Vi skærer det genomiske DNA partielt med Sau3A til vi opnår fragmenter med en gennemsnitsværdi på ca. 20 kb. Disse ligeres til lambdavektorens venstre og højre arme efter skæring med BamHI. DNAet pakkes in vitro og bruges til at inficere en E. coli stamme. Da vi har en cdna klon til rådighed kan vi bruge cdnaet som probe efter mærkning med radioaktivitet eller et kemiloumiscerende stof. Spm. B: Det er smart at bakteriestammen indeholder en lysogen P2 fag, da vi så bortselekterer ikke rekombinante lambda fager, da kun red - gam - fager kan gro på en sådan stamme. Dette er vigtigt da vi ellers ikke kan være sikre på hvor stort vores bibliotek i virkeligheden er (altså hvor stor procent del af de plaqes, der udgør biblioteket der ret faktisk er rekombinante) Spm. C:Hvis vi gerne vil analysere promotoren af vores gen er det vigtigt at undersøge promotoren i en celletype, hvor den er aktiv. Det nytter således ikke at analysere en leverspecifik promotor i en cellelinje fra nyre. Derfor er det vigtigt, at verificere at den cellelinje, man vælger at bruge tillader promotoren at være aktiv. Dette kan undersøges med et Northern blot. 28S proben er taget med for, at man kan normalisere sine resultater (kompensere for om der ikke er sat lige meget RNA i hver brønd på gelen). Spm.D: Her skal vi huske, at det vi genererer ved vores sekvensreaktion er den streng som er komplementær til den viste (DNA polymerasen kan kun sætte nukleotider på en fri 3 ende). Når vi læser sekvensgelen nedefra og op læser vi den komplementære sekvens fra 5 enden mod 3 enden. Sekvensen på gelen indtil primer extensionproduktet giver: 5 GTACATCTGCTCCTGTTTCTAAGAC 3 Den komplementære sekvens (den der er vist i figuren) til den vi har læst på gelen giver: 5 GTCTTAGAAACAGGAGCAGATGTAC 3 Det første G idenne sekvens er således transkrtiptionsstartsitet. Spm.E: Denne metode er i virkligheden 5 RACE. Vi kan lave 5 RACE produktet, sekventere det og sammenligne sekvensen med sekvensen af det genomiske DNA. Herved kan vi bestemme transkriptionsstartsitet.
Spm. F: Dette er et eksempel på en klassisk promoteranalyse, hvor vi fusionerer promotoren til et reportergen, som her er luciferase. Aktiviteten af reporterproteinet kan så bestemmes ved at måle den lysmængde som luciferasen udsender. Der er så propertionalitet mellem antal luciferase proteiner og mængden af udsendt lys. Når vi analyserer data som de viste (og alle mulige andre) er det vigtigt at vide, hvor signifikant data er. Vi må derfor tage hensyn til spredningerne på data. Spredningerne på de viste data er nogle steder meget store. Det betyder også,at de eneste der er signifikant forskellige fra vildtypepromotoren er de tre sidste konstruktioner før pgl3-basic. Så de områder,der er vigtige for promoteraktiviteten,må ligge i det,der i figuren hedder untranslated exon. Generelt ved transiente transfektionsforsøg vil man co-transficere med et plasmid der indeholder en konstitutiv promoter fusioneret til et andet reportergen. Grunden hertil er at vi ikke får den samme transfektionseffektivitet hver gang vi transficerer celler. Det vil selvfølgelig gøre det umuligt at sammenlige to forskellige konstruktioners reportergenaktivitet (jo flere celler der optager plasmidet jo højere aktivitet vil vi selvfølgelig få). Da transfektionseffektiviteten for kontrolplasmidet og vores promoter-reporterfusion er den samme, kan vi korrigere for transfektionseffektivitet ved at normalisere til reporteraktiviteten fra vores kontrolplasmid. Spm. G: Et eksempel på et EMSA assay.vi kan se fra den venstre figur, at der findes protein i kerneekstraktet, der kan binde til O1 oligonukleotidet. Vi kan også se at O1 og OC men ikke NT kan udkonkurrere denne binding. Bindingen er altså reversibel. På Figuren til højre kan vi se, at αoct1 proteinet er en del/det hele af dette shiftede kompleks, idet tilsætning af anti-αoct1 antistof forårsager et supershift. Så Oct1 bindingssitet har en potentiel rolle i regulering af hccr2 promotoren. Vi skal huske på at et EMSA assay er et in vitro assay og at binding af et protein til promoten ikke nødvendigvis er det samme, som at proteinet kan aktivere transkriptionen.