Bioteknologi På Nanoskala

NANO SCIENCE CENTER KØ B E N H AV N S U N I V E R S I T E T Bioteknologi På Nanoskala Bionanoteknologi Laboratoriet Nano Science Center September 2009

Indholdsfortegnelse Bioteknologi på Nanoskala Baggrund... 3 Vesikler i nervesignalering... 3 Vesikler som nano laboratorium... 5 Fedtstoffets rolle for vesiklen... 7 Förster resonans energi overførsel (FRET)... 8 Måling af FRET effektivitet...11 Udførelse af forsøget... 12 Vesikel fremstilling... 12 Blandingstabel...12 Målinger af FRET... 14 Databehandling og beregninger... 15 Intensitetsmålinger... 15 Beregning af FRET effektiviteten... 16 Beregning af hastighedskonstanter for vesikelfusionen... 17 Hastighedskonstanten k...17 Den koncentrations uafhængige hastighedskonstant K...17 Diskussion... 18 Forslag til undervisningen... 18 Materialer og opløsninger... 19 Kemikalier... 19 Kemiske formler for anvendte fosfolipider... 20 Litteratur... 20 2

Bioteknologi på nanoskala Bioteknologi på nanoskala er baseret på tværvidenskabelig, nanoteknologisk forskning fra Nano Science Center på Københavns Universitet. Materialet er særlig målrettet undervisningen i bioteknologi A på de gymnasiale uddannelser og inddrager bioteknologi, biologi, kemi og fysik. Vesikler beholdere i nanostørrelse, kan både bruges som mini laboratorier og som modelsystem for nervesignalers udbredelse. I menneskelige celler foregår transport og kommunikation ved hjælp af vesikler. Vi fremstiller vesikler i laboratoriet og bruger dem som simpelt modelsystem for, hvordan nervesignaler udbredes i kroppen. Forskerne bruger også vesikler som mini laboratorium til fx at undersøge enzymaktivitet på nanoskala. Vesiklerne øger vores viden om biologiske systemer, og det er der store perspektiver i. På sigt kan det gøre os i stand til at bygge syntetiske biologiske komponenter som fotosyntese baserede solceller, intelligent medicin og biokompatibel elektronik. I øvelsen fremstiller vi to forskellige vesikler af fosfolipider den type fedtstoffer, som indgår i cellemembraner. Dannelsen af vesikler foregår ved spontan selvorganisering, som er en af grundpillerne i nanoteknologien populært sagt bygger vi funktionelle komponenter op fra bunden. De to vesikeltyper vi fremstiller har modsat ladning, og vi undersøger, hvordan de fusionerer med hinanden. Det er et simpelt eksempel på celle kommunikation og i eksperimentet fokuserer vi på den del af cellekommunikationen, hvor vesiklen fusionerer med cellemembranen. Fusionen følger vi ved hjælp af teknikken Förster resonans energi overførsel. De opsamlede data kan vi efterfølgende analysere kvantitativt, så vi får informationer om fusionshastighed og mekanisme. Baggrund Vesikler i nervesignalering Vesikler er nanobeholdere (50 200 nm), som naturen benytter sig af til at forsegle og transportere en bred vifte af vitale biomolekyler rundt i cellen og som budbringer i kommunikation med naboceller. En vesikel er bygget op af fedtstoffer. Vesikler har den egenskab, at de spontant kan samle sig selv til en membran kugleskal, der kan indkapsle alle vandopløselige kemikalier og biomolekyler. Figur 1: En vesikel har form som en kugleskal. Den er omkranset af en dobbeltlaget membran, som består af fedtstoffer. 3

OH Bioteknologi på Nanoskala, Nano Science Center Nogle af de vigtigste biomolekyler, der bliver fragtet i vesikler er signalstoffer i nervesystemer kaldet neurotransmittere. Neurotransmittere er enten enkelte aminosyrer eller små aminosyresekvenser, dvs. peptider (figur 2). De er ansvarlige for, at nerveceller kan sende signaler til hinanden, så alle kroppens enkelte celler kan fungere som en organisme. H O O H H N C C H R O O C C C C C NH2 O H Figur 2: Peptid, aminosyre og neurotransmitter. Peptider er små proteiner, som er opbygget af kæder af aminosyrer. Aminosyrer består af en karbon nitrogen rygrad, hvor forskellige kemiske grupper er bundet i R positionen. Her er vist aminosyren glutamat, som også fungerer som neurotransmitter. Kroppen danner nervesignaler ved, at en nervecelle kommer i kontakt med en anden nervecelle. Kontaktområdet mellem de to celler kaldes en synapse. Ved synapsen kan den elektriske aktivitet i en nervecelle, den presynaptiske nervecelle påvirke den elektriske aktivitet i den anden, den postsynaptiske nervecelle (se figur 3). Det er kortvarige elektriske impulser i nervecellernes membraner kaldet aktionspotentialer, som udgør nervesystemets elektriske signalering. Presynaptisk Postsynaptisk Figur 3: Nervesynapse. Den presynaptiske celle udsender neurotransmittere (grønne firkanter). De binder til receptorer (blå strukturer) på den postsynaptiske celle. Når neurotransmitterne er bundet til receptorerne, så kan nervesignalet rejse videre i den postsynaptiske celle. Når aktionspotentialet når enden af den presynaptiske nervecelle, åbner spændningsfølsomme calcium ion kanaler i nervecellens ydre membran. Denne membran er negativ ladet på indersiden og positivt ladet på ydersiden. Calcium ioner strømmer ind i den presynaptiske celle. Vesikler fyldt med neurotransmitter molekyler transporteres til den presynaptiske nervecelles ydre membran. Populært sagt neutraliserer calcium ionerne den negative ladning på vesiklernes yderside, så vesikler kan fusionere med den negative ladede membran. Det er denne proces eksperimentet illustrerer. Nu kan vesiklerne udløse deres indhold udenfor cellen ved at fusionere med den ydre membran. 4

Figur 4: Vesikler i en synapse. Vesiklerne bliver dannet i den presynaptiske nervecelle. De bliver fyldt med neurotransmittere (gule kugler) og de bliver opbevaret i vesiklen indtil der er brug for dem. Når et aktionspotentiale når enden af den presynaptiske celle, åbner calcium kanaler i den ydre membran. Det er specifikke interaktioner mellem proteiner på de to overflader, der driver fusionen mellem vesikel og den ydre membran. Billede fra Janet Richmond: The Wormbook. Den postsynaptiske celle fanger neurotransmitter molekylerne med specialiserede receptorer i den ydre cellemembran. Når først en receptor binder en neurotransmitter på ydersiden af cellen, bliver den i stand til at sende et signal videre til indersiden. Når membranen i den postsynaptiske nervecelle på grund af disse ydre påvirkninger, når over sit hvilepotentiale, opstår der et aktionspotentiale som rejser videre gennem nervecellen. I eksperimentet fremstiller vi to forskellige vesikel typer med modsatte ladninger. Den positiv ladede vesikel er model for vesiklen med neurotransmittere og den negative ladede vesikel model for nervecellens ydre membran. I naturen er vesiklerne fusion dog langt fra kun baseret på elektrostatisk tiltrækning, men er styret og drevet af specifikke interaktioner mellem proteiner på vesiklernes overflade og proteiner i og på cellemembranen. Flere af proteinerne, som sidder i vesikelmembranen er følsomme overfor calcium, og disse proteiner er nødvendige for hurtig, calcium udløst fusion. Vesikler som nano laboratorium Det er lykkedes for forskere gennem de seneste 50 år at reducere laboratoriets størrelse til nanoskala dvs. fra 0,1 til 100 nanometer ved at bruge vesikler her betragtet som en kolbe i nanostørrelse. Det betyder, at man i ekstrem høj grad kan effektivisere mange biokemiske forsøg forskerne kan lave utrolig mange forsøg samtidigt på meget lidt plads. I starten af 1900 tallet opdagede man, at cellemembranen på røde blodlegemer bestod af et dobbeltlag af fedtstoffer. Denne tynde hinde (tykkelse ca. 5 nm) er nok til at definere og afgrænse en hel celle, som er flere størrelsesordener større. Cellemembranen blev efterfølgende midtpunkt for mere dybdegående eksperimentelle og teoretiske studier. Forskerne fremsatte mange teorier om organiseringen og strukturen af membranen, men i sidste ende var de svære at bevise, fordi systematiske studier af hele cellemembraner endnu ikke var mulige. I starten af 1960 erne opdagede den britiske forsker A. D. Bangham, at det var muligt at fremstille primitive cellemembraner i laboratoriet. Han havde en opløsning af molekyler, hvor hver enkelt molekyle havde to helt forskellige fysisk kemiske egenskaber. En hydrofil del, der ønskede at være opløst i vand og en hydrofob del der, ligesom olie, ville mindske sin kontakt med vandet. Sådanne forbindelser kaldes amfifile. Den amfifile karakter gør, at molekylerne spontant selvorganiserer, når de opløses i vand. Både de hydrofile og hydrofobe egenskaber bliver tilgodeset, hvis molekylerne danner en kugleskal bestående af et amfifilt dobbeltlag (figur 5). 5

Polært/Hydrofilt Upolært/Hydrofobt Polært/Hydrofilt Figur 5: En simpel model af en membran. De hydrofile hovedgrupper (blå) skærmer de hydrofobe karbon kæder (gule) fra interaktioner med vandmolekyler. En dobbeltlaget membran er den energetisk set mest favorable struktur. Der er flere andre mulige strukturer, eksempelvis miceller og plane membraner. Kugleskallen, som også kaldes en vesikel, har den fordel, at den er i stand til at indkapsle meget små voluminer af vand (attoliter, en milliontedel af en milliardtedel af en liter!). Størrelsen af en vesikel afhænger af, hvilken kemisk forbindelse, den er blevet dannet af. Hvis vi bruger de naturlige fedtstoffer, som findes i menneskeceller får vi typisk dannet små vesikler (radius ca. 50 nm). Den mest udbredte måde at fremstille vesikler på er en særlig teknik, kaldet tyndfilm rehydreringsteknikken. Her fremstiller vi en tynd film af fedtstoffer på indersiden af en glaskolbe. I bedste tilfælde får vi dannet et enkelt dobbeltlag af fedtstoffer, men det kræver dog særlig omhyggelig forberedelse. I langt de fleste tilfælde får vi dannet stakke af dobbeltlag af fedtstoffer på indersiden af glaskolben. Vesiklerne fremstilles ved at tilsætte en vandig opløsning til glaskolben. Den tynde film af fedtstof bliver rehydreret og svulmer op, indtil spændingen i membranen bliver for stor og membranknoppen brækker af og danner en vesikel. Vesiklen består ikke blot af et enkelt kugleformet dobbeltlag af fedtstoffer, men af flere koncentriske kugleskaller (lameller). A B Figur 6: Produktion og manipulation af vesikler. (A) En stak dobbeltlag bestående af fedtstoffer danner ved rehydrering multilamellare strukturer (B) Vi kan gøre multilamellare vesikler homogene ved under tryk at filtrere dem gennem et filter med veldefineret porer, typisk med porediameter på 20 100 nm. Vi ønsker en ensartet fordeling af vesikler i opløsningen. Det indebærer, at lamellerne skal 6

fjernes. Det er muligt, hvis alle vesikler tvinges igennem et snævert filter. Processen medfører, at multilamellare vesikler bliver nedbrudt i filterporerne. Nedbrydningsprocessen gør, at der bliver dannet nye vesikler, som i gennemsnit kun indeholder en enkelt lamel den ydre. Størrelsen af disse nydannede vesikler er primært defineret af diameteren af det anvendte filter. De mest almindelige filterstørrelser spænder fra 50 400 nm. Vesikler igennem et filter på mindre end 100 nm benævnes små unilamellare vesikler (SUV). Fedtstoffets rolle for vesiklen En vesikels fysiske og kemiske egenskaber er defineret af grundbestanddelen fedtstoffet. Fosfolipider, som er den type fedtstoffer, der er grundbestanddelen i membraner, består af en polær hovedgruppe (den hydrofile del) og en apolær hydrokarbon kæde (den hydrofobe del) (se figur 7). Hydrofob hale Hydrofilt hoved Figur 7: Fosfolipidet DOPC. Fosfolipider består af alkoholen glycerol, som er bundet til to fedtsyrer og en fosfatgruppe med esterbindinger. På fosfaten er der også bundet en alkohol med en ny esterbinding. De fede syrer danner en hydrofob (vandskyende) hale, mens glycerol, fosfat og den ekstra alkohol danner et hydrofilt (vandsøgende) hoved. Fosfolipider kan antage 4 forskellige former (figur 8). Det er længden af hydrokarbonkæden, det enkelt fosfolipids overfladeareal og fosfolipidets volume, der bestemmer dets geometri. Det betyder, at lipidets geometriske form er afgørende for dels, om vesiklen er i stand til at blive dannet og dels hvilken gennemsnitsstørrelse, der er den termodynamisk favorable. Der er dermed en sammenhæng imellem fosfolipidets molekylær struktur og den selvsamlede superstruktur vesiklen (figur 9). a0 v lc Figur 8: Fedtstoffets geometri bestemmer den nanostruktur, der bliver dannet. Fedtstoffer kan findes i former fra venstre mod højre: Kegle, cylinder, inverteret keglestub og keglestub. De tre viste parametre l c : gennemsnitslængde af hydrekarbonkæden, a 0 : overfladearealet af et enkelt fedtstof og v: volumen af et fedtstof bestemmer nanostrukturen. I eksperimentet fremstiller vi nanoskopiske beholdere med en gennemsnitlig diameter på 30 nm. Vesikler med den diameter har et volumen på ca. 10 al (attoliter, 10 18 l). De består af ca. 30.000 fedtstofmolekyler og indkapsler ca. 380.000 vandmolekyler. Fedtstofferne er opløselige i ethanol, og det sikrer, at de mikses effektivt i de rigtige forhold. Når fedtstofferne er blandet, er det nødvendigt at fjerne opløsningsmidlet fra resten af 7

blandingen, så der dannes en tynd film af fedtstof på beholderens sider. Ethanolen fjernes nemmest ved en afdampning i varmeskab. Når ethanolen er fordampet bliver der efterladt en tynd film af fedtstof på glasoverfladerne af beholderen. Hydrophilt hoved Hydrophob hale Figur 9: Fosfolipidets rolle for vesiklen. En vesikel med en radius på 20 nm indeholder i alt ca. 15.000 fosfolipider. Lipidets geometriske form er afgørende for dels, hvorvidt vesiklen bliver dannet og dels, hvilken gennemsnitsstørrelse, der er den energimæssigt favorable. Den kemiske struktur af fosfolipidet DOPC, 1,2 dioleoyl sn glycero 3 phosphocholine er vist ved siden af vesiklen. Vi skal fremstille to forskellige vesikel populationer. Den ene indeholder negativt ladede fedtstofmolekyler og den anden indeholder positivt ladede. Den elektrostatiske tiltrækning imellem de to vesikler vil drive fusionen, som ellers vil foregå meget langsomt. Det kritiske skridt i en fusionsproces består i at krænge de to membraner åbne. Dette kræver energi, fordi den upolære del af fedtstofferne skal i berøring med vand. Energien vindes igen ved at bringe de to modsat ladede fedtstoffer tæt på hinanden. Samtidig er produktet af fusionen en vesikel med en større radius (> 30 nm) end de oprindelige vesikler, og det betyder, at membranen, som er elastisk, bliver mere afslappet. Förster resonans energi overførsel (FRET) For at kunne studere vesiklen nærmere er det nødvendigt at følge dets fysiske og/eller kemiske ændringer. I dette eksperiment bruger vi teknikken fluorescens resonans energi overførsel, forkortet FRET 1. Denne teknik er meget udbredt inden for både kemisk og biokemisk analyse, fordi den er i stand til at måle afstande med en præcision på under en nanometer. Teknikkens koncept er relativ simpelt, mens en dybdegående, kvantitativ forståelse forudsætter kendskab til videregående kvantemekanik. Og det er udenfor denne vejlednings primære fokus. Teknikken kræver to forskellige farvestoffer, der absorbere og udsender lys ved forskellige bølgelængder. Vi ved fra Bohrs atommodel, at hvis vi exciterer et atom med lys, så flytter vi en elektron et antal skaller som svarer til energien i lyset (exitation). Når elektronen falder tilbage til grundtilstanden, udsender den lys med en bølgelængde, der svarer til forskellen i energi mellem skalniveauer, som elektronen flytter sig (emission). 1 Förster Resonans Energy Transmission (FRET) 8

A E B Figur 10: Skematisk fremstilling af FRET. (A) Exitation af farvestofmolekyle (donor) sker ved, at valens elektroner i farvestofmolekylet absorberer lys med rette bølgelængde. Efter et stykke tid henfalder elektronen til grundtilstanden og udsender lys af højere bølgelængde, kaldet fluorescens emission. (B) Hvis et exiteret donorfarvestof kommer tæt nok på et acceptor molekyle, kan donoren overføre exitations energien til acceptoren, som efterfølgende fluorescerer. Molekyler som fx farvestoffer har også forskellige energiniveauer som Bohrs atommodel beskriver. Et farvestof er derfor i stand til at absorbere lys med en given bølgelængde ved at overføre en elektron til en exciteret tilstand og derved øge energien (figur 10). Bølgelængden af lyset afhænger af de molekylære energiniveauer og kan ved hjælp af kemi skræddersys til ethvert formål. På et tidspunkt vil den exciterede elektron springe tilbage til sin grundtilstand. Dette sker ved emission af lys og kaldes fluorescens. Absorption sker ved lavere bølgelængder (højere energi) end emission. En del af fedtstofferne indeholder en fluorescerende kemisk gruppe, som gør det muligt at iagttage fusionsprocessen, imens den foregår. Den ene vesikel population vil være farvet gul i almindeligt hvidt lys, men fremstå grøn under en UV lampe. Den anden population er rødlilla i almindelig belysning og orangegul under UV lys, se figur 12A for spektra. Grunden til, at vesiklerne udviser forskellig farve alt afhængig af belysningen, er forskellen imellem reflektion og fluorescens. Under normale betingelser består objekters farve af det lys, som de reflekterer (dvs. undlader at absorbere). I et helt mørkt lokale vil et objekt af gode grunde ikke have nogen farve. Hvis en UV lampe bliver brugt som den eneste lyskilde, vil et objekts farve nu være bestemt af det lys, som bliver absorberet. UV lys har høj energi i forhold til dagslys og er i stand til at excitere elektroner fra grundtilstanden til et højere energi niveau, hvilket er ensbetydende med, at lyset bliver absorberet. Når elektronen vender tilbage til grundtilstanden, er den nødsaget til at generere en enkelt foton. Det er nu denne foton, som giver objektet dets farve. Et farvestof, hvis emissions bølgelængde er identisk med absorptions bølgelængden af et andet farvestof, er i stand til at danne elektronisk resonans, figur 10B. Resonans medfører, at det første farvestofs exciterede elektron kan vende tilbage til grundtilstanden uden at udsende lys. Dette medfører dog, at energien må overføres til det andet farvestof i stedet. Det sker ved at excitere en elektron fra det andet farvestof, som med tiden vil vende tilbage til grundtilstanden og derved fluorescere. Den samlede FRET proces er sådan: Excitation af farvestof 1 Energioverførsel fra farvestof 1 til 2 Emission fra farvestof 2 Farvestof 1 kaldes FRET donor, hvorimod farvestof 2 kaldes FRET acceptor. Effektiviteten af FRET E F kan måles som forholdet imellem donor intensitet i nærvær af en acceptor I D og donor intensitet I D0, når der ingen acceptor er tilstede. 9

(Formel 1) E F = FRET effektiviteten I D = Intensiteten af acceptor I D0 = Intensiteten af donor FRET effektiviteten er 0, når I D = I D0 og 1 når I D = 0, hvilket svarer til, at al energi overføres fra donor til acceptor. Det viser sig, at E F afhænger af den indbyrdes afstand mellem donor og acceptor i sjette potens. Det betyder, at teknikken er meget sensitiv ved små afstandsændringer imellem donor og acceptor (figur 11). Den afstand, hvor der er 50% effektiv energioverførsel kalder vi Förster afstanden. Förster afstanden er karakteristisk for donor/acceptor parret, den spænder typisk fra 1 8 nm. FRET 1. > 10 nm 3. < 4 nm 2. FRET 10 nm > x > 4 nm Figur 11: Skitse af afstandsafhængigheden for FRET effektiviteten. Farverne afspejler farvestoffernes farve under almindeligt lys. (1) Donor vesiklen (gul) befinder sig mere end 10 nm fra acceptor vesiklen (lilla). Der sker derfor ingen overførsel ved exitation (sort pil) og donor vil derfor udsende gult lys. (2) Ved afstande mellem 4 10 nm sker der en vis energioverførsel, og vi kan måle emission fra både donor og acceptor. (3) Er donor og acceptor vesikel tættere på end 4 nm, observerer vi en komplet energioverførsel, og vi kan kun måle emission fra acceptor. De fluorescerende fedtstoffer, som vi bruger i øvelsen, er i stand til at overføre excitationsenergi imellem hinanden. Det ene fedtstof (DiO) er en energi donor, mens det andet fedtstof (DiI) er en acceptor. Under UV belysning er DiO grøn og DiI orangegul. Hvis DiO og DiI kommer meget tæt på hinanden (< 4 nm), vil DiO ikke længere lyse, men overføre sin energi til DiI, som derfor vil lyse endnu kraftigere. Denne effekt er kun synlig, hvis en fusion imellem to vesikler har fundet sted, og er derfor et direkte mål for fusions effektiviteten, se figur 12B. 10

A Donor Acceptor DiO-C 18 DiI-C 18 Normalized intensity B Wavelength / nm Donor absorption wavelength A A D i D0 D+A i D0 D D+A A (1-e F ) i D0 A D i D0 (1-e F ) i D0 e F i D0 e F i D0 Figur 12: Vesikelfusion og FRET effektivitet. (A) Absorptions og emissionsspektrum for donor og acceptorfarvestof. Absorptionen finder sted ved lave bølgelængder (høj energi) (stiplet linje). Fluorescens emissionsspektret for donor (D i0 ) har et stort overlap med absorptionsspektret for acceptor (D ii ) og derfor kan FRET foregå med stor effektivitet. (B) Skitse af hvordan fusion imellem to vesikler fører til forhøjet energioverførselseffektivitet. Hvert fusioneret vesikelpar (D+A) bidrager med FRET effektiviteten (e F ) til den samlede effektivitet. A = acceptor vesikel, D = donor vesikel, i D0 = intensitet donor. Et optisk spektofotometer kan måle fluorescenssignaler fra donor og acceptor. Et spektofotometer belyser en prøve gennem et optisk filter, som kun tillader lys med donorens absorptionsbølgelængde at passere. Prøven bliver derved exciteret og udsender fluorescens. Fluorescens fra prøven opfanges igennem et andet sæt af filtrer, der er designet til kun at lade lys med henholdsvis donors emissions og acceptorens emissionsbølgelængde passeres. Hvis vi også udfører en fluorescens måling af donoren alene, kan vi beregne FRETeffektiviteten. I det eksperiment vi udfører, foregår energioverførslen dog så effektivt, at vi kan observere den med et almindeligt digital kamera. Til analysen bruger vi et simpelt billedhåndteringsprogram. Måling af FRET effektivitet Målinger af FRET effektivitet (E F ) for forskellige koncentrationer af acceptor vesikler kan give information om fusionseffektiviteten. Når to vesikler med modsat ladning støder sammen i opløsningen, er der stor sandsynlighed for, at de vil smelte sammen til een stor vesikel (figur 13). Det medfører, at de to membraner udveksler fedtstoffer, neutraliserer den samlede elektrostatiske ladning og begynder energi overførsel fra DiO til DiI. Jo flere vesikler, der er tilstede i opløsningen, desto hurtigere vil en ændring i E F kunne måles. Energioverførsel medfører et fald i donorens fluorescens intensitet, som primært er domineret af grøn. Grønne farver kan let detekteres med et almindeligt digitalt kamera, fordi et digitalt billede er konstrueret ud fra tre billeder optaget med forskellige farve filtrer; rød, grøn og blå. Intensiteten fra det grønne billede er således en direkte indikator for fusions effektiviteten. 11

FRET D A D A Positiv Negativ FRET Neutral Figur 13: Skitse af vesikelfusion. Donor og acceptor vesiklerne tiltrækkes af hinanden pga. deres modsatrettede ladninger. Vesiklerne kommer så tæt på hinanden, at membranerne kan blive brudt op og fusionere med nabovesiklens membran. Ved fusionen kommer donor og acceptor farvestofferne så tæt på hinanden, at FRET er mulig. Vesiklernes farver er vist som de er under almindeligt lys. Udførelse af forsøget Eksperimentet indeholder disse elementer: (i) fremstille kunstige vesikler af fosfolipider (ii) karakterisere vesiklernes evne til at fusionere ved hjælp af elektrostatisk tiltrækning ved at bruge teknikken Förster resonans energi overførsel (iii) Behandlingen af data: kvantitativ analyse af fusions hastighed og mekanisme. Vesikel fremstilling 1) Bland efter nedenstående blandingstabel i to forskellige cylindrisk glasbeholdere (volumen 2.0 ml) fedtstofferne til donor og acceptor vesiklerne, så den total vægt af fedtstoffer bliver 2,0 mg. Volumen af hvert fedtstof skal udregnes efter formel 2. Blandingstabel Fedtstof Acceptor DiI (negativ ladede) Molvægt M i (g/mol) Membran mol % (ρ i ) DOPC 786 78 DOPG 797 20 DiI C 18 930 2 Vol. fra stam opl. (μl) Fedtstof Donor DiO(positiv ladede) Molvægt (g/mol) Membran mol % (ρ i ) DOPC 786 78 DOPC + 851 20 DiO C 18 882 2 Vol. fra stam opl. (μl) Prøvenr. Konc. acceptor Vol. acceptor fra stam opl. (μl) Konc. donor Vol. donor fra stamopl. (μl) Forholdet m. acceptor/donor Vol. Buffer (μl) 1 100 0 100 2 10 100 90 3 20 100 80 4 30 100 70 5 40 100 60 6 50 100 50 7 60 100 40 8 70 100 30 9 80 100 20 10 90 100 10 11 100 100 1 0 12 100 0 100 12

(Formel 2) V i = volumen til afmåling af det i'te lipid M i = molvægt af det i'te lipid ρ i = membrane molprocent af det i'te lipid C i = koncentration af lipid opløsningen af det i'te lipid m T = den totale fedtstof masse, her 2 mg Beregningseksempel: Volumen af DOPC til acceptorblanding, når koncentrationen er 20g/l (den eksakte koncentration af opløsningen fremgår af etiketterne på flaskerne): V 1 = 786 g mol 0,78 0,002g 20 g l (786 g mol 0,78 + 797 g mol 0,20 + 930 g mol 0,02) 106 = 77,5µl Figur 14: Laboratorieredskaber. (A) Yderst til venstre er de cylindriske glaskolber med volumen på ca. 2 ml. Vi bruger glaskolberne til at opbevare fedtstoffer, der er opløst i organiske opløsningsmidler. I forsøget er det ethanol vi bruger som opløsningsmiddel. (B) Når lipidfilmen skal rehydreres i saltvandsopløsningen er det nemmest at håndtere alle opløsninger med en plastik pipette. 2) Anbring glasbeholderne med donor og acceptor blandingerne uden låg i et varmeskab (30 40 o C) indtil ethanolen er fordampet 3) Overfør 2,0 ml fysiologisk saltvands opløsning til de tørre fedtstof film 4) Omryst grundigt indtil opløsningen bliver uklar og farvet 5) Placer et sterilt filter med porestørrelse på 0,2 µm for enden af en 5 ml plastik kanyle 6) Skyl filteret igennem 5 gange med saltvandsopløsningen 7) Lad donor vesikel opløsningen passeres igennem filteret 5 gange 13

8) Gentag 5) til 8) med acceptor vesikel opløsningen med en ny 5 ml kanyle og et nyt filter Filtreringen kan erstattes med ultralydbehandling. Beholderne med vesikel opløsningerne placeres i et ultralyds bad i 20 minutter. Ultralydbehandlingen giver mere uensartede vesikelstørrelser end ved filtrering. Målinger af FRET Figur 15: Prøvefremstilling. (A) Blandingen af donor og acceptor veskiler giver ophav til forskellige farver. Donorens gule farve bliver blandet med acceptorens rødlilla og giver derfor orange nuancer i dagslys. Efterhånden som fusionen finder sted bliver acceptorens farve mere og mere dominerende. (B) Prøverne arrangeres på en slukket UV lampe, så vi let kan identificere acceptor koncentrationen ved den efterfølgende databehandling. 1) Overfør 100 µl donor vesikler (DiO mærket) til i alt 11 små eppendorf rør 2) Overfør 100 µl saltvandsopløsning til det første, 90 µl til det næste og så fremdeles. Det sidste rør kommer til ikke at indeholde nogen saltvandsopløsning 3) Bland 100 µl acceptor vesikler (DiI mærket) med 100 µl saltvands opløsning i et nyt eppendorf rør 4) Placer alle eppendorf rør på en række under en UV lampe i et helt mørkt lokale. Arranger prøverne, så acceptor koncentrationen let kan identificeres ved den senere databehandling. 5) Placer et digitalkamera på en fod eller lignende, så alle billeder bliver identiske mht. perspektiv 6) Indstil digitalkameras eksponeringen så lavt som muligt for at forebygge mætning af pixelintensiteterne 2 7) Tag et enkelt billede af hele rækken af eppendorf rør med digital kameraet med UVlampen tændt 8) Tilsæt acceptor vesikler til alle rør, så det samlede volumen bliver 200 µl 9) Placer alle eppendorf rør under en UV lampe og tag et velfokuseret og eksponeret billede af hele opstillingen 10) Tag billeder hvert 5. minut i op til en time 11) Lad prøverne stå natten over op tag et sidste billede dagen efter, hvis der er mulighed for det. 2 Det er vigtigt for den efterfølgende databehandling, at de fotos vi tager er veleksponerede. Ved overeksponering vil pixels blive mættede og forskellen mellem de forskellige farver vil ikke blive nær så tydelig. Et foto er veleksponeret, hvis alle pixel værdier aktiveres uden at nå mætning. Et 8 bit billede har intensitetsværdier fra 0 255. Et veleksponeret foto udnytter maximalt værdier op til 254. Ved højere intensiteter vil all få tildelt værdien 255 og vi mister derved informationer. 14

Figur 16: Fluorescens billede af donor og acceptorprøver. (A) Når vi tænder en UV lampe, begynder prøverne at udsende fluorescens. Farven af fluoroscens lyset giver indirekte afstanden imellem donor og acceptor molekyler. (B) Billedbehandlingen foregår i programmet ImageJ, som kan åbne de flest billedformater. Databehandling og beregninger Intensitetsmålinger Al primær databehandling finder sted i det frit tilgængelige billedanalyseringsværktøj ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), figur 17. Computerprogrammet er i stand til at åbne digitale billeder og analysere hver farvekanal uafhængigt. Et FRET signal kan let måles, hvis man på samme billede har passende reference målinger. I dette tilfælde består referencerne af prøven, der udelukkende består af donor vesikler og den anden prøve, der udelukkende består af acceptor vesikler. I dette eksperiment er det lettest at måle FRET signalet i den grønne farvekanal. Det gør vi på følgende måde: 1) Fra menuen "File" i ImageJ vælg "Open" for at åbne det første billede i tidsserien 2) Billedet vises nu i farver på skærmen 3) Vælg "Analyze Set measurements" og sørg for, at det kun er punktet "Mean Gray Value", der er krydset af 4) Vælg "Image Color RGB Split" 5) Der vises nu tre billeder i gråtoner, der svarer til billedets tre farvekanaler. I parents efter navnet er den tilsvarende farve angivet. 6) I værktøjspanelet vælges "Polygon selections" og et enkelt af eppendorf rørene markers. Det er vigtigt, at det kun er den del af røret, hvor væsken er, der bliver markeret. 7) Vælg "Analyze Measure" 8) Programmet viser nu gennemsnittet af pixel værdier for den grønne kanal for det pågældende eppendorf rør. Det målte tal angiver derfor grønheds graden af væsken. Jo højere tallet er, jo grønnere er væsken. Den største værdi af grøn er i reference prøven uden acceptorvesikler. Alle andre prøver overfører grøn farve til acceptorerne, som laver det om til rød. 9) Mål på samme måde intensitetsværdierne af alle de andre eppendorf rør. 15

Figur 17: Databehandling i ImageJ. (A) Farvebilledet skilles ad i de tre grundfarve kanaler rød, grøn og blå. Acceptoren er tydeligst i den røde kanal, hvorimod den grønne farve er mest dominerende for donoren. I den blå farvekanal er alle eppendorf rørene mørkere end omgivelserne. Det tyder på, at der meste af det blå og ultraviolette lys bliver absorberet. (B) Vi kan udregne intensiteten fra hvert enkelt rør med ImageJ ved at vælge det polygonale markeringsværktøj fra menuen. Nederst ses en liste over intensiteter fra den grønne farvekanal fra de forskellige prøver. Beregning af FRET effektiviteten FRET effektiviteten er den procentdel af det grønne lys, der overføres fra donor farvestoffet til acceptoren. Acceptoren udsender også en vis mængde grønt lys, som det er nødvendigt at trække fra. Mængden af grønt lys, der stammer fra acceptoren I A udregnes ved at betragte intensiteten fra referenceprøven I R, der kun indeholder acceptor: (Formel 3) VT = det totale volumen af acceptor stamopløsning i reference prøven, her 100 µl Vi = antal µl af acceptor stamopløsningen, der er tilsat hvert enkelt eppendorf rør IR = intensiteten fra referenceprøven, der kun indeholder acceptor Når IA er beregnet for hvert rør, kan FRET effektiviteten (EF) udregnes ved brug af følgende formel: (Formel 4) Ii = den samlede målte intensitet af den grønne kanal for hvert eppendorf rør ID = den målte intensitet for referenceprøven kun indeholdende donor vesikler IA = mængden af grønt lys, der stammer fra acceptoren 16

Beregning af hastighedskonstanter for vesikelfusionen Hastighedskonstanten k Hastighedskonstanten k angiver, hvor sandsynligt det er, at en donor vesikel støder sammen med en acceptor vesikel og efterfølgende fusionerer. Det vil sige jo større k er, jo mere sandsynligt er det, at en donor og en acceptor vesikel møder hinanden i opløsningen. Hastighedskonstanten for hver vesikelpopulation dvs. for hvert rør, kan vi finde ved at plotte EF for hvert rør som funktion af tid (se figur 18). For et enkelt rør skal EF (t) følge en eksponentiel funktion givet som følgende: (Formel 5) E F (t) = E M (1 exp( kt)) EM = den maksimale FRET effektivitet målt for hele vesikel populationen. Jo højere koncentration af acceptor vesikler, der er tilsat, jo højere en værdi vil vi kunne opnå. k = hastighedskonstanten, bestemmes ved at aflæse tiden, hvor EF (t) = EM/2 (grøn linje i figur 18A) k kan også beregnes efter følgende formel: (Formel 6) Den koncentrations uafhængige hastighedskonstant K Når k er bestemt for alle prøver kan den koncentrations uafhængige hastighedskonstant K bestemmes ved at plotte hastighedskonstanterne k imod koncentrationen af acceptorvesikler. Det giver en ret linje, der går igennem origo, fordi k er direkte proportional med antallet af acceptor vesikler i opløsningen. Hældningen af den rette linje er derfor K (se figur 18B). Hastighedskonstanterne er en del af vores karakterisering af fusionsprocessen. 17

A 0.4 B 0.30 0.3 0.25 0.20 E F 0.2 0.1 k (min -1 ) 0.15 0.10 0.05 0.0 0 50 100 150 200 0 1 2 3 4 5 Tid (minutter) Antal acceptor vesikler x10 12 Figur 18: Målinger af fusionshastighedskonstanter. (A) Kurve for FRET effektiviteten målt som funktion af tid. Jo længere tid, der forløber jo større er værdi af E F. Vi kan aflæse værdien af hastighedskonstanten k for den givne koncentration af acceptor vesikler, hvor E F er steget til halvdelen af det maximalt opnåelige (den grønne linje). Den højeste værdi af E F måler vi flere timer efter acceptor og donor vesikler er blandet sammen. (B) Den koncentrationsuafhængige hastighedskonstant K aflæser vi som hældningen fra et plot af k imod acceptorvesikelkoncentrationen. 0.00 Diskussion Processen, hvor to bløde nanoskopiske beholdere (diameter < 100 nm) smelter sammen, finder vi også i naturen blandt nerveceller. Nerveceller bruger den samme proces til at sende nervesignaler videre til andre celler. I eksperimentet studerer vi fusionen ved hjælp af energi overførsel imellem to fluorescerende kemiske grupper. Det er en gængs teknik især inden for biologi, biokemi og nanoteknologi. Ved brug af FRET teknikken kan vi studere fusionsprocessen som funktion af tid, og vi kan beregne hastighedskonstanter for fusionen. Den fundne hastighedskonstant K er karakteristisk for den anvendte vesikel sammensætning, og den kan relateres direkte til den elektrostatiske tiltrækning imellem de to fusionerende vesikler. Hastighedskonstanterne er derfor særdeles nyttige parametre, der tillader os at sammenligne forskellige fusionsmekanismers effektivitet. Vi kan i princippet sammenligne denne karakterisering med enzymkinetik, hvor vi studerer de kemiske reaktioner, som enzymer katalyserer med fokus på deres reaktionshastighed. Forskerne anvender i stor udstrækning FRET teknikken til at studere samarbejdet imellem forskellige proteiner, der er involveret i nervesignalering. Forslag til undervisningen Vi anbefaler, at eleverne har kendskab til følgende områder: Opbygning af nervesystemet og dets funktion Eucaryote cellers opbygning Kendskab til fedtstoffers og proteiners struktur Bohrs atommodel Exitation og emission Forslag til udvidelse af eksperimentet Ændrer på koncentrationen af de ladede fedtstoffer. Mængden af ladede fedtstoffer har indflydelse på, hvor hurtigt fusionen foregår 18

Materialer og opløsninger UV lampe (bølgelængde omkring 254 nm) Digitalkamera på fod Computere med billedbehandlingsprogrammet ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) og Excel Glasbeholdere, 2 ml: Sigma alrich http://www.sigmaaldrich.com/analytical chromatography/vials/abc vials.html, Clear pr. nr 27493; 375.12 DKK, Amber 27487 U; 410.40 DKK Varmeskab, 30 40 C Pipetter + pipettespidser (20 200 µl) Eppendorfrør 200 nm filtre (Anotop 25 Syringe Filter, 200 nm fra Whatman, produktnr. 6809 2122: http://www.whatman.com/anotopsyringefilters.aspx#6809 2122 5 ml plastikkanyler Evt. ultralydsbad (så skal man ikke bruge filtre og plastikkanyler) Kemikalier DOPC ca. 1 mg pr. øvelse (konc. 20g/l i 96% ethanol) DOPG (konc. 10g/l i 96% ethanol) DOPC + (konc. 10g/l i 96% ethanol) DiI C 18 ca. 0,04 mg pr. øvelse (konc. 1g/l i 96% ethanol) DiO C 18 ca. 0,04 mg pr. øvelse (konc. 1g/l i 96% ethanol) Ethanol (96%) Saltvandsopløsning, ph 7,4 (1 l): 94 mmol NaCl, 3,1 mmol Na 2 HPO 4, 0,9 mmol NaH 2 PO 4 Kemikalie Firma Produkt Pris nr. DOPC lipid Avanti Polar Lipids 850375 39 USD pr. 200 mg (chloroform) DOPG lipid (negative) Avanti Polar Lipids 840475 37 USD pr. 25 mg (chloroform) DOPC lipid (positive) Avanti Polar Lipids 890704 77 USD pr. 25 mg (chloroform) DiI C 18 lipid Invitrogen, Molecular D7756 2595 DKK pr. 5 mg (acceptor) Probes DiO C 18 lipid (donor) Invitrogen, Molecular Probes D3898 2595 DKK pr. 5 mg Links til kemikalier: DOPC (1,2 dioleoyl sn glycero 3 phosphocholine): http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=231&itemid =207&catnumber=850375 DOPG (1,2 dioleoyl sn glycero 3 phospho (1' rac glycerol)): http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=589&itemid =233&catnumber=840475 DOEPC (1,2 dioleoyl sn glycero 3 ethylphosphocholine): http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=958&itemid =159&catnumber=890704 19

DiI: http://products.invitrogen.com/ivgn/en/us/adirect/invitrogen?cmd=catproductdetail&prod uctid=d7756&cid=search D7756 DiO: http://products.invitrogen.com/ivgn/en/us/adirect/invitrogen?cmd=catproductdetail&prod uctid=d3898&cid=search D3898 Kemiske formler for anvendte fosfolipider DOPC DiI-C 18 DOPG - DiO-C 18 DOPC + Litteratur 1) Sune M. Christensen, Andreas H. Kunding og Dimitrios Stamou, Det nye biokemiske laboratorium en milliard kolber på en enkelt chip, Aktuel Naturvidenskab, sep. 2008. Læs om hvordan nanoforskere bruger vesikler som laboratorier. 2) Sune M. Christensen, Dimitrios Stamou, Surface based lipid reactor systems: fabrication and applications, Soft Matter, 2007, 3, 828 836. Læs uddybende om anvendelse af vesikler som laboratorier. 3) Yee Hung M Chan and Steven G Boxer. Model membrane systems and their application, Curr. Opion. Chem. Biol., 2007, 11, 581 587. Læs mere om model systemer, som forskerne bruger til at forklare biologiske membraner. 4) Reinhard Jahn and Richard H. Scheller. SNAREs engines for membrane fusion. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2006, 7, 631 643. Læs om de proteiner, der i naturen er involveret i vesikelfusion i nerveceller og andre typer celler. 20