En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et:

F2011-Opgave 1. En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: Forward primer: 5 CC ATG GGT ATG AAG CTT TGC AGC CTT GCA 3 og Reverse primer: 5 GGT GGA ATT CCG TTT TAG AGA CAG CGG CAA AAG3 (codon er fra cdna et (kursiv) er vist i primerne som blokke á tre nukleotider). Efter endt PCR, blev PCR produktet og en pet-vektor, petm-13 (figur 1-1), skåret med restriktionsenzymerne NcoI and EcoRI (genkendelsessekvenserne er indikeret med fed skrift i primersekvenserne; NcoI and EcoRI skærer ikke i cdna sekvensen), og blandet sammen i en ligeringsreaktionsmix. Ligeringsreaktionsmixen blev anvendt til at transformere E. coli stammen BL21(DE3), og de transformerede celler blev pladet ud på en LB-agar plade indeholdende kanamycin, som petm-13 bærer et resistensgen for. Men, der kom ingen kolonier på agarpladen selv ved gentagne forsøg. En kontrol med intakt vektor gav det forventede antal transformanter. 1) Forklar, hvad der kan være årsag til den manglende transformation. Hvad kan forskeren gøre for at få transformation med rekombinant vektor? Svar: Problemet er, at forskeren har glemt at sætte nogle ekstra baser foran NcoI sitet i forward primeren. Det medfører, at NcoI, der jo er en endonuclease, ikke kan skære i det endelige PCR produkt i 5 -enden af cdna et (set i forhold til mrna). Så han er nødt til at gentage hele forsøget med en ny primer 1, hvor der er et antal baser før NcoI sitet. Endelig fik forskeren løst problemet med manglende transformation; men nu fik han et nyt problem, da han udtrykte klonen: Det proteinprodukt, som blev produceret var meget større end man ville forudsige ud fra cdna et åbne læseramme. 2) Hvad er problemet med insertet? Hvordan kan forskeren løse dette problem? Svar: Forskeren har glemt at inkludere stop codon, da han designede primeren. Reverse primerne mangler en sekvens, som er komplementær til stopcodon. Så en sådan skal tilføjes en ny reverse primer, og hele forsøget skal gentages. 3) Design et primersæt, som kan anvendes til at lave et PCR produkt, som når det indsættes i NcoI and EcoRI skæringsstederne giver en konstruktion fra hvilket cdna et kan udtrykkes med et N-terminalt His-tag. Svar: Forward primer: 5 CC ATG GGT cac cat cac cat cac cac ATG AAG CTT TGC AGC CTT GCA 3. De seks histidin-codons indføjes umiddelbart før den kodende del af cdna et. Som reverse primer anvendes den, som laves i spm 2, altså den med stop-codon. 1

Figur 1-1. Multiple cloning site området i petm-13 ekspressions vektoren. Opgave 2 En forsker har isoleret meget små mængder af et protein fra en blodprøve fra en antilope. Proteinet er blevet delvist sekventeret vha massespektrometri, og nu vil han gerne isolere en fuldlængde cdna klon, som koder for proteinet for at kunne udtrykke nok protein til at foretage en karakterisation af dets funktion. Han forsøger derfor at isolere cdna med mrna fra leverceller, blodkarvægge og leukocytter, men uden held. 1) Hvordan kan forskeren med udgangpunkt i peptid-sekvenser finde ud af, i hvilket væv genet for proteinet transkriberes? Svar: Forskeren kan isolere RNA fra en masse forskellige væv, - lave et Northern blot med det og hybridisere til Northern blottet med prober lavet ud fra de kendte aminosyresekvenser. Husk, at proberne skal være komplementære til mrna. Dvs., at proberne skal laves som komplementære til 2

den kodende sekvens, som er den, der direkte back-translateres fra aminosyrerne med de mulige codons. Forskeren er i stand til at isolere cdna ved RT-PCR baseret på degenererede primere lavet ud fra aminosyresekvenser i forskellige peptider. Han finder dog ud af, at han mangler noget af 5 -enden af cdna et (den ende, som svarer til 5 -enden af mrna). 2) Hvordan kan forskeren fastslå, at det isolerede cdna sandsynligvis ikke er fuld-længde cdna? Svar: Når han sekventerer cdna et, ser han ikke noget, der kan minde om en start methionin. Der er åben læseramme helt fra 5 enden og ned til stop codon. Han kan evt. også se, at det stykke cdna, som han har fået isoleret ikke i længde svarer til det, han ville forvente ud fra resultaterne af Northernblottet i spm 1. Forskeren kan ikke få en 5 RACE til at fungere og laver derfor en såkaldt guess-mer primer ud fra den N-terminale sekvens af proteinet. Med denne primer og en primer syntetiseret ud fra den kendte del af cdna sekvensen laver han et forsøg med PCR på kromosomalt DNA. Her får han et produkt, som han vil have sekventeret. Firmaet, som foretager sekventeringen vil have leveret i alt 3 μg PCR fragment i en koncentration af 0.2 μg/μl. Forskeren har i alt 50 μl oprenset PCR fragment og har udtaget 5 μl PCR fragment og fortyndet op til 100 μl med vand og målt absorbansen af fortyndingen ved 260 nm til 0.08. 3) Hvor mange μg PCR fragment havde forskeren ialt? Og hvordan får han lavet en opløsning af PCR fragmentet, som er 0.2 μg/μl? Svar: Konc. i kuvetten er 0.08 x 50 μg/ml, dvs. 4 μg/ml. Dvs., at koncentrationen i plasmidpreparationen (de 50 μl) er 20 gange højere (80 μg/ml), fordi prøven, som blev udtaget til OD-målingen blev fortyndet 20 gange (5 μl i et totalvol på 100 μl). Altså har forskeren i alt i de 50 μl: 50 μl x 80 μg/ml eller 0.05 ml x 80 μg/ml, altså 4 μg. For at få en koncentration på 0.2 μg/μl må prøven opkoncentreres (dens konc. er jo 0.08 μg/μl). DNA et kan fældes med ethanol eller køres over en silikasøjle og opløses henholdsvis elueres i 20 μl vand for at give en konc på 0.2 μg/μl (4 μg/20 μl. I sekvensen kan han godt genkende noget af den sekvens, der ligger nedstrøms i forhold til 3 enden af den N-terminale primer, og han ser faktisk en sekvens, som kan translateres til en af de mange aminosyre-sekvenser, som han har bestemt; men desværre er der ikke som forventet en åben læseramme gennem hele PCR fragmentet. 4) Forklar hvad der kan være årsagen til, at han får et PCR produkt, men at det ikke har en åben læseramme (antag at der ikke er sket mutationer under PCR). 3

Svar: Husk, at han har anvendt genomisk DNA som template til sin PCR. Dvs., at der er introns med. Han har sandsynligvis lavet PCR hen over en eller flere introns. Når der er en intron, er der yderst sjældent en åben læseramme gennem intron en. Forskeren ser også noget underligt i sekvensen af PCR produktet. Der er tre steder i sekvensen, hvor der er to overlappende toppe i samme position. 5) Forklar dette fænomen (antag, at der ikke er sket mutationer under PCR). Svar: Det, han ser, er, at individet, som han har taget DNA et fra, er heterozygot i tre positioner. Når han laver PCR på genomisk DNA (eller for den sags skyld også cdna) som her, kan man komme ud for at se eksempler på to allel er, fordi der jo laves PCR af alt det mulige template DNA, hvor der ikke bliver skelnet mellem allel er, når de ligger internt i et PCR produkt, som jo er milliarder af individuelle fragmentmolekyler lavet ud fra alle de matchende template molekyler, som fandtes i DNA preparationen til at starte med. Opgave 3 Under en oprensning af enzymer fra E. coli havde forskeren inkuberet et radioaktivt mærket dobbeltstrenget DNA fragment samt forskellige nødvendige buffere og reagenser med en af sine fraktioner fra et E. coli celleekstrakt. Efter nogle timers inkubation agarosegel-separerede hun DNA'et og lavede et autoradiografi. Forsøget blev udført to gange med to forskellige restriktionsfragmenter. I et forsøg (bane 1 og 2 i figur 3-1) anvendte hun et DNA fragment isoleret efter skæring med SmaI. I et andet forsøg (bane 3 og 4 i figur 3-1) anvendte hun et DNA fragment isoleret efter skæring med EcoRI. Restriktionsfragmenterne var begge 100 bp lange. Figur 3-1. Autoradiografi af radioaktivt mærket DNA separeret efter inkubation med E. coli celleekstrakt (Se ovenstående tekst for forklaring). Bane 1 og 3 er DNA fragmenter før inkubation med celleekstrakt, medens bane 2 og 4 er DNA separeret efter inkubation med celleekstrakt. 1) Giv en forklaring på det observerede resultat? Forklar herunder, hvad forskellen er på de to slags restriktionsfragmenter, der blev anvendt i de to forsøg? (sekvensen af fragmenterne er uden betydning). 4

Svar: Det, hun observerer, er aktiviteten af E. coli DNA ligase. Den kan ikke ligere blunt end DNA (SmaI-fragmentet), men gerne sticky end DNA (EcoRI-fragmentet). Ved elektroforese af en plasmid DNA preparation i en agarose gel ses ofte to bånd på gelen. Nedenfor er vis resultatet af en agarose gelelektroforese af ubehandlet plasmid DNA (bane 1) og EcoRI behandlet plasmid DNA (bane 2). bane 1 bane 2 2) Identificér de tre bånd, som ses på gelen, og forklar forskellen i mobilitet imellem dem. Svar: I bane 1 ses den oprindelige plasmid preparation. Her ses to bånd, hvoraf det nederste er supercoiled plasmid, mens det øverste er relaxet eller nicked plasmid. I bane 2 ses lineariseret plasmid, som vandrer langsommere end supercoiled plasmid. 3) Selvom restriktionsenzymer udtrykkes inde i bakterieceller, ødelægger de ikke cellens eget DNA. Hvorfor ikke? Svar: Bakterierne har såkaldte restriktionssystemer, dvs., at de i tilknytning til et givet restriktionsenzym har en tilknyttet methylase, som oftest gør, at genkendelsessekvenserne ved methylering ikke kan skæres, eller som i sjældnere tilfælde gør, at kun genkendelsessteder kan skæres. 5