PLATELIA CANDIDA Ag 96 TEST: 62798 PLATELIA CANDIDA Ag ER EN IMMUNENZYMATISK MIKROPLADEANALYSE AF SANDWICH-TYPEN TIL KONSTATERING AF CANDIDA MANNANANTIGEN I SERUM. 1 FORMÅL Platelia Candida Ag er en immunenzymatisk mikropladeanalyse af sandwich-typen til konstatering af cirkulerende Candida mannanantigen i serumprøver. 2 BRUGSANVISNING Platelia Candida Ag (kat. # 62798) er en test, der brugt i kombination med Platelia Candida Ab/Ac/Ak (kat. # 62799) muliggør en tidligere diagnose og øger sensitiviteten for diagnosticeringen af invasiv candidiasis som del af en komplet diagnostisk metode, der integrerer kliniske og mykologiske data og evaluering af indefrakommende og iatrogene risikofaktorer 12. Denne kombination er også en integreret del af et klinisk og laboratoriebaseret patientovervågningssystem som en hjælp til fastlæggelse af behandlingen. 3 OVERSIGT OG FORKLARING Candida-infektioner er den hyppigste form for nosokomielle svampeinfektioner 2. De invasive former repræsenterer de mest alvorlige infektioner med en dødelighed på 30-70 % hos personer med nedsat immunforsvar 10. Diagnosen for invasive Candida-infektioner er svær at etablere på grund af de kliniske symptomers ringe specificitet og kulturernes lave sensitivitet, på trods af de betragtelige fremskridt, der er gjort for nylig på dette område. Diagnosen på invasiv candidiasis, som fører til iværksættelsen af den rette behandling, er normalt baseret på en kombination af kliniske og mykologiske overvejelser sammenholdt med risikofaktorer 7. I denne sammenhæng skal diagnosen af systemisk candidiasis altid bestå af både serologiske teknikker og direkte mykologiske metoder. Konstateringen af cirkulerende antigener i serum lader til at fremme diagnosen af Candida-infektion, især hos personer med nedsat immunforsvar. Mannan, et af flere forskellige Candida-antigener, er et polysaccharid, der er ikke-kovalent bundet til gærcellevæggen og repræsenterer mere end 7 % af den drænede vægt af C. albicans 3. Dette antigen er tilsyneladende en af hovedindikatorerne for invasiv candidiasis 6. 4 PROCEDUREPRINCIP Platelia Candida Ag er en et-trins immunenzymatisk mikropladeanalyse af sandwich-typen, som muliggør kvantitativ eller kvalitativ konstatering af cirkulerende mannanantigen i humant serum. Analysen anvender det monoklonale antistof fra rotter EBCA-1, der retter sig mod Candida α 1-5 oligomannosider og er blevet karakteriseret i tidligere undersøgelser 1, 5, 11. Det monoklonale antistof anvendes til at: dække brøndene på mikropladen og binde mannanantigenet konstatere antigen, der er bundet til den sensibiliserede mikroplade (konjugatreagens: peroxidasekoblet monoklonalt antistof). Serumprøver varmebehandles ved forekomst af EDTA for at separere immunkomplekser og udskille serumproteiner, der kan påvirke testen. De behandlede serumprøver og konjugat tilsættes brøndene, der er dækket med monoklonalt antistof, og inkuberes. Et monoklonalt antistof mannan monoklonalt antistof/peroxidase-kompleks dannes ved forekomst af mannanantigen. Strimlerne vaskes for at fjerne alt ubundet materiale. Derefter tilsættes substratopløsningen, som reagerer med de forbindelser, der er bundet til brønden, og danner en blå farvereaktion. Enzymreaktionen standses ved tilsætning af syre, hvorved den blå farve skifter til 1
gul. Absorbansen (optisk densitet) af prøver, kontrolprøver og intervalpunkter bestemmes med et spektrofotometer, der er indstillet til en bølgelængde på 450 og 620 nm. Testen kan udføres ved hjælp af to metoder: Kvantitativ metode: Ved oprettelse af en kalibreringskurve ud fra 4 intervalpunkter: 2,0, 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml. Resultaterne af testprøverne er udtrykt i ng mannan pr. ml serum. Kvalitativ metode: Kun intervalpunkterne 0,25 ng/ml og 0,5 ng/ml anvendes; en sammenligning mellem den optiske densitet for testprøverne og den optiske densitet for de 2 intervalpunkter gør det muligt at angive resultater som negative, mellemhøje eller positive sera. 5 REAGENSER Platelia Candida Ag: produktnr. 62798 (96 test) Opbevar sættet ved +2-8 o C. Lad reagenserne i sættet nå stuetemperatur (+18-25 C) før brug. Nedkøl alle reagenserne til +2-8 C øjeblikkeligt efter brug. Læg ubrugte strimler/plader tilbage i posen, og forsegl den igen. Fjern ikke tørremidlet. Strimler skal bruges inden for 5 uger efter åbning og genforsegling af posen. Efter fortynding kan arbejdsvaskeopløsningen opbevares i 14 dage ved +2-8 C. Efter åbning er alle andre reagenser stabile indtil udløbsdatoen. Reagenser leveres i tilstrækkelige mængder til at udføre 96 test i maksimalt 6 batcher. R1 R2 R3 R4 R5 R6 Komponent Indhold Mængde Mikrobrønd - 96 brønde (12 strimler med 8 brønde hver), der er 1 plade / Strip dækket med monoklonalt EBCA-1 anti-mannanantistof. 12 x 8 brønde [Strimmel] Plate [Plade] Koncentreret vaskeopløsnin g (10x) Negativ kontrolserum Kalibratorseru m Positiv kontrolserum Konjugat (klar til brug) - Tris NaCl-buffer (ph 7,4) - 1 % Tween 20 - Konserveringsmiddel: 0,01 % thimerosal - Det humane kontrolserum, der er negativt for mannan, anvendes som negativ kontrolprøve og fortynder til standardserummet under forberedelsen af intervalpunkterne 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml i den kvantitative test og forberedelsen af kalibratorserummet i den kvalitative test (se "10. Procedure") - Negativt for anti-hiv1, anti-hiv-2, anti-hcv-antistoffer og HBs-antigen - Konserveringsmiddel: < 0,1 % natriumazid - Humant serum, der indeholder 2,0 ng/ml mannan, anvendes til forberedelsen af intervalpunkterne 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml i den kvantitative test og forberedelsen af kalibratorserummet i den kvalitative test (se "10. Procedure") - Negativt for anti-hiv1, anti-hiv-2, anti-hcv-antistoffer og HBs-antigen - Konserveringsmiddel: < 0,1 % natriumazid - Humant serum, der indeholder mellem 0,5 og 1,5 ng mannan - Negativt for anti-hiv1, anti-hiv-2, anti-hcv-antistoffer og HBs-antigen - Konserveringsmiddel: < 0,1 % natriumazid - Monoklonalt anti-mannanantistof/peroxidasemærket - Konserveringsmiddel: 0,01 % thimerosal 1 x 100 ml 1 x 10 ml 2 x 2 ml 1 x 2 ml 1 x 8 ml R7 R8 Serumbehandli ngsopløsning (klar til brug) TMBsubstratbuffer (klar til brug) -EDTA-syreopløsning, uden konserveringsmiddel - Citronsyre og natriumacetatopløsning ph 5,2, - 0,009 % hydrogenperoxid - 4 % dimethylsulfoxid (DMSO) 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 2
R9 Kromogen: TMB-opløsning (koncentreret) R10 Stopopløsning (klar til brug) Pladeforseglin - 90 % dimethylsulfoxid-opløsning (DMSO), der indeholder 0,6 % tetramethylbenzidin (TMB)* 1 x 1 ml - 1,5N-svovlsyre (H2SO4) 1 x 12 ml - Selvklæbende film til mikroplader 1 x 4 ark g *Bemærk! TMB (tetramethylbenzidin) er et ikke-karcinogent og ikke-mutagent kromogen til peroxidase. 6 ADVARSLER FOR BRUGERE 1. Til in vitro-diagnosticering. 2. Kun til professionel brug. 3. Det anbefales ikke at bruge dette testsæt med andre prøver end humant serum. 4. Det humane materiale, der anvendes ved forberedelse af reagenserne, er blevet testet og fundet negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2 og anti-hcv-antistoffer samt HBs-antigen. Eftersom ingen metode dog kan garantere fravær af smitsomme stoffer, skal alle reagenser og alle patientprøver håndteres som værende potentielt smittefarlige. Alle test skal udføres i henhold til de anbefalede forholdsregler mod blodbårne patogener. 5. Benyt beskyttelsesdragt og engangshandsker, når du håndterer reagenserne i sættet og patientprøver. Vask hænderne grundigt efter udførelse af testen. 6. Undgå at pipettere med munden. 7. Undgå at ryge, drikke eller spise i de områder, hvor prøverne eller reagenserne i sættet håndteres. 8. Undgå at sprøjte med prøvemateriale eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale. 9. Biologisk væske, der spildes, og som ikke indeholder syre, skal tørres grundigt op med et effektivt desinfektionsmiddel. De desinfektionsmidler, der kan bruges, er f.eks. en 10 % blegemiddelopløsning (0,5 % natriumhypochloritopløsning), 70 % ethanol eller 0,5 % Wescodyne. Væsker, der spildes, og som indeholder syre, skal tørres op uden brug af nogen væsker eller neutraliseres med natriumbikarbonat og derefter rengøres med et af de kemiske desinfektionsmidler. Materialer, der bruges til at tørre spildte væsker op med, skal bortskaffes som biologisk farligt affald. ADVARSEL! Placer ikke opløsninger, der indeholder blegemiddel, i autoklaven. 10. Bortskaf alle prøver og materiale, der har været anvendt i udførelsen af testen, som om de indeholder smitsomme stoffer. Bortskaffelsen skal overholde alle gældende krav til bortskaffelse af affald. 11. Nogle reagenser indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid kan danne kobber- og blyazider i laboratoriets rørledninger. Disse azider er eksplosive. Undgå enhver akkumulation af azider. Skyl rørene med rigelige mængder vand, når du hælder opløsninger, som indeholder azid, i afløbet efter deaktiveringen. 12. ADVARSEL! Svovlsyre (H 2 SO 4 ) 1.5 N og DMSO (dimethylsulfoxid) 90 % R36/38: Irriterer øjnene og huden. S:2-26-30: Opbevares utilgængeligt for børn. Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes. Tilsæt aldrig vand til dette produkt. 13. Undgå, at TMB-substratbuffer, kromogen: TMB-opløsning og stopopløsning kommer i kontakt med øjne, hud og slimhinder (fare for forgiftning, irritation og forbrændinger). 14. Materialesikkerhedsdataarket (MSDS) udleveres efter anmodning. 7 FORHOLDSREGLER FOR BRUGERE 1. NEDFROSNE SERUMPRØVER, DER HAR VÆRET OPBEVARET UNDER UKENDTE BETINGELSER, KAN GIVE FALSKE POSITIVE RESULTATER SOM FØLGE AF KONTAMINATION MED SVAMP OG/ELLER BAKTERIER. 2. Undgå at bruge sættet eller reagenser i sættet efter den angivne udløbsdato. 3. Undgå at blande reagenser fra andre sæt med andre batchnumre med undtagelse af den koncentrerede vaskeopløsning (R2) og stopopløsningen (R10). 3
4. Lad alle reagenser få stuetemperatur i mindst 15 minutter før brug. 5. Bland grundigt ved rekonstituering af reagenser, og sørg for at undgå mikrobiel kontamination. 6. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syrer, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. 7. Brug rene engangsplastikbeholdere (af polypropylen) til forberedelse af substratkromogenopløsningen. Hvis der skal bruges udstyr af glas, skal det først afvaskes i 1Nsaltsyre, skylles med destilleret vand og tørres. 8. Ved manuel pipettering af kontrolprøver og prøver skal der bruges særskilte pipettespidser for at forebygge overførsel af prøver. 9. For at sikre tilstrækkelig rengøring af brøndene skal det anbefalede antal vaskecyklusser overholdes, og du skal sørge for, at brøndene er helt fyldte og bagefter helt tømte. Vask må ikke udføres manuelt med en plastikflaske. 10. Undgå, at mikropladen tørrer mellem slutningen af vaskecyklussen og tilsætningen af reagenser. 11. Brug ikke den samme beholder til konjugat- og substratopløsninger. 12. Undgå, at konjugat- eller substrat-kromogenopløsninger kommer i berøring med metal eller metalioner. 13. Undgå at udsætte kromogenet: TMB-opløsning eller substrat-kromogen-opløsningen for stærkt lys under opbevaring eller inkubation. Undgå, at kromogenopløsningerne kommer i berøring med et iltningsmiddel. 14. Undgå, at stopopløsningen kommer i berøring med et iltningsmiddel. Undgå, at stopopløsningen kommer i berøring med metal eller metalioner. 15. Begræns kontakt med luften for opløsninger (sera, serumbehandlingsopløsning, konjugat) eller åbne beholdere (plader, rør, pipetter). 16. Undgå at hælde overskydende konjugat tilbage i den oprindelige beholder. 17. Substrat-kromogenopløsningen skal være farveløs. Fremkomsten af en blå farve efter fortynding angiver, at reagenset er kontamineret og ikke må anvendes. Kassér den, og forbered frisk reagens. 8 REAGENSFORBEREDELSE OG OPBEVARING Teststrimmelplade med mikropladebrønde (R1) Efter åbning af pladeposen er teststrimlerne med mikropladebrønde stabile i 5 uger, når de opbevares ved +2-8 C i deres omhyggeligt lukkede originalpose, der indeholder tørremiddel. Vaskeopløsning (R2) Forbered arbejdsvaskeopløsning efter behov ved at tilsætte en del koncentreret vaskeopløsning til 9 dele sterilt, deioniseret eller destilleret vand. Forbered en tilstrækkelig mængde arbejdsvaskeopløsning til at gennemføre kørslen (80 ml til en teststrimmel: 8 ml R2 + 72 ml destilleret vand). Arbejdsvaskeopløsningen kan opbevares i 14 dage ved +2 8 C. Efter åbning er arbejdsvaskeopløsningen, som opbevares ved +2 25 C, stabil indtil udløbsdatoen på etiketten, forudsat der ikke forekommer kontamination. Substrat-kromogenopløsning (R8+R9) Forbered substrat-kromogenopløsning ved at tilsætte en del koncentreret kromogen: TMB-opløsning, R9, til 50 dele TMB-substratbuffer, R8. Forbered 2 ml substrat-kromogenopløsning pr. teststrimmel: 40 µl R9 + 2 ml R8. Opløsningen er stabil i 6 timer, når den opbevares i mørke ved stuetemperatur (+18-25 C). Efter åbning er R8- og R9-reagenserne stabile indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ingen kontamination forekommer. Negativt kontrolserum (R3), kalibratorserum (R4), positivt kontrolserum (R5), konjugat (R6), serumbehandlingsopløsning (R7) og stopopløsning (R10) Efter åbning er R3-, R4-, R5-, R6-, R7- og R10-reagenserne stabile indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ingen kontamination forekommer. 4
9 PRØVETAGNING Tag blodprøver ifølge sædvanlige laboratorieprocedurer. Testen udføres på serum. Serumprøver må ikke være kontaminerede med svampesporer og/eller bakterier. Transporter og opbevar prøver i forseglede rør, hvor de ikke udsættes for luft. Prøver kan opbevares ved +2-8 C i 24 timer, før testen udføres. Ved længere opbevaring skal serummet opbevares ved -70 C. Serumprøver kan maksimalt gennemgå 3 nedfrysninger/optøninger. Tidligere nedfrosne prøver skal blandes grundigt efter optøning, før testen udføres. Resultaterne påvirkes ikke af prøver, der indeholder 90 g/l albumin, 200 mg/l bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder det, der svarer til 360 g/l triolein (triglycerid) eller hæmolyserede prøver, der indeholder 200 g/l hæmoglobin. Undgå at dekomplementere sera. 10 PROCEDURE Medfølgende materialer Se afsnittet REAGENSER. Krævede materialer, der ikke medfølger 1. Sterilt destilleret eller deioniseret vand, til fortynding af koncentreret vaskeopløsning. 2. Sugende papir. 3. Engangshandsker. 4. Beskyttelsesbriller. 5. Natriumhypoklorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, justerbare eller faste, til måling og fordeling af 50 µl, 100 µl, 300 µl og 1000 µl. 7. 1,5 ml mikrocentrifugerør af polypropylen med lufttætte hætter, der kan holde til opvarmning til 120 C (varmeblok) eller 100 C (kogende vandbad): Rør med skruelåg: 1,5 ml koniske rør, Bio-Rad kat. # 224-0010 eller tilsvarende. ELLER Rør med snaplåg: EZ-mikrotestrør, 1,5 ml, Bio-Rad kat. # 223-0010 eller tilsvarende. Låse til mikrorørslåg: VWR kat. # 6054001 eller tilsvarende. Disse låse forsegler rør med snaplåg og forhindrer lågene i at åbnes på grund af ændringer i temperatur eller tryk. Desuden gør låsene det nemt at løfte rørene ud af en varmeblok eller et kogende vandbad. 8. Laboratoriebænkcentrifuge til 1,5 ml polypropylenrør, der kan få 10.000 g. 9. Hvis der bruges varmeblok til behandling af seraene: Varmeblok. Følgende varmeblokmodeller anbefales: - 1 blokmodel: Grant kat. # QBD1 (VWR kat. # 460-0074) - 2 blokmodel: Grant kat. # QBD2 (VWR kat. # 460-0076) Blok til varmeblok: begge varmeblokke (QBD1 og QBD2) skal bruges med Grant-blok kat. # QB-E1 (VWR kat. # 460-8517) Hvis der bruges kogende vandbad til behandling af seraene: Rundt, flydende mikrocentrifugestativ til 1l-bæger. Kogende vandbad ved 100 C 10. Vortex-omryster. 11. Mikropladeinkubator ved 37 ± 1 C. 12. Halvautomatisk eller automatisk mikropladevasker. 13. Mikropladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm. 14. Beholder til kontamineret affald. Kommentarer til proceduren Negative, positive kontrolprøver og intervalpunkter skal testes ved hver kørsel for at validere testresultaterne. 5
Forberedelse af intervalpunkter Kvantitativ metode: R3 negativt kontrolserum For 1 serie For 6 serier (*) R4 R3 2 ng/ml negativt kalibratorserum kontrolserum R4 2 ng/ml kalibratorserum Punktet 2 ng/ml - 300 µl - 2000 µl Punktet 1 ng/ml 150 µl 150 µl 1000 µl 1000 µl Punktet 0,5 ng/ml 225 µl 75 µl 1500 µl 500 µl Punktet 0,25 ng/ml 262,5 µl 37,5 µl 1750 µl 250 µl (*) en mængde reagens, der svarer til 6 serier, kan forberedes på forhånd: For hvert intervalpunkt skal du dele mængden i afmålte portioner på 300 µl, som opbevares ved -20 C. Lad reagenserne få stuetemperatur (18-25 C), før de tages i brug. Kvalitativ metode: Forbered intervalpunkterne 0,5 ng/ml (kalibratorserum) og 0,25 ng/ml, som angivet i den foregående tabel. Behandling af sera Alle kontrolsera: negative (R3), positive (R5) og intervalpunkterne 2,0, 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml skal behandles samtidigt med testprøverne: 1. Pippetter 300 µl af hvert testserum, kontrolprøve og intervalpunkt i særskilte 1,5 ml polypropylenrør. 2. Tilsæt 100 µl serumbehandlingsopløsning (R7) til hvert rør. 3. Bland prøven i de enkelte rør grundigt ved at blande dem energisk eller ved at blande dem grundigt med en Vortex-mixer. Luk røret tæt til for at forhindre åbning under opvarmning. Undgå at prikke hul på hætten. 4. Ved brug af varmeblok: Opvarm rørene i 6 minutter i en varmeblok ved 120 o C. Rørene skal først anbringes i blokken, når den foreskrevne temperatur er nået. (*) ELLER Ved brug af vandbad: Hvis du bruger et kogende vandbad: opvarm rørene i 3 minutter ved 100 o C. Rørene skal først anbringes i vandbadet, når den foreskrevne temperatur er nået. (*) 5. Fjern forsigtigt de varme rør fra varmeblokken eller det kogende vandbad, og anbring dem i en centrifuge. Centrifuger rørene ved 10.000 x g i 10 minutter. Supernatanten anvendes til konstatering af mannanantigenet. 6. Test supernatanterne ved hjælp af følgende procedure. Efter behandling af serummet, skal testen udføres så hurtigt som muligt. Hvis analysen af resultaterne viser, at det er nødvendigt at foretage en ny test, skal der behandles en anden afmålt mængde serum til test. (*) Streng overholdelse af den foreskrevne temperatur og den foreskrevne behandlingstid, såvel som brug af de anbefalede materialer, er afgørende for, at testen bliver vellykket. Du kan ikke regne med den temperatur, der vises på apparatet, men kontroller, at temperaturen overholder specifikationerne ved hjælp af et kalibreret termometer i et rør, som indeholder mineralolie: der skal være 120 C inde i røret i en varmeblok og 100 C i et kogende vandbad. NB! - Alle serumprøver, der er behandlet ifølge denne procedure, kan bruges til at udføre Platelia Aspergillus EIA-testen, eftersom serumbehandlingsprocedurerne er identiske for de to test. - Opbevar ikke sera (kontrolprøver, intervalpunkter og testprøver) efter behandling. EIA-procedure Overhold den foreslåede protokol nøje. Overhold god laboratoriepraksis. 1. Lad reagenserne få stuetemperatur (18-25 C) i mindst 15 minutter før brug. 2. Forbered arbejdsvaskeopløsning, substrat-kromogenopløsning, negative og positive kontrolprøver og intervalpunkter. 6
3. Forbered et diagram til identifikation af testseraene, kontrolprøverne og intervalpunkterne på mikropladen. Kvantitativ metode: Kontrolseraene og intervalpunkterne (0,25, 0,50, 1,0 og 2,0 ng/ml) kan placeres efter følgende plan: - A1: Negativt kontrolserum (R3) - B1: Intervalpunktet 0,25 ng/ml - C1: Intervalpunktet 0,50 ng/ml - D1: Intervalpunktet 1,0 ng/ml - E1: Intervalpunktet 2,0 ng/ml (R4) - F1: Positivt kontrolserum (R5) - G1: Positivt kontrolserum (R5) Kvalitativ metode: Kontrolseraene og intervalpunkterne 0,5 ng/ml og 0,25 ng/ml kan placeres efter følgende plan: - A1: Negativt kontrolserum (R3) - B1: Intervalpunktet 0,25 ng/ml - C1: Intervalpunktet 0,5 ng/ml (kalibratorserum) - D1: Intervalpunktet 0,5 ng/ml (kalibratorserum) - E1: Positivt kontrolserum (R5) 4. Tag pladeholderen og teststrimlerne med mikropladebrønde (R1) ud af pladeposen. Læg ubrugte teststrimler tilbage i posen med tørremidlet, og forsegl posen igen. 5. Bland indholdet af flasken med konjugat (R6) ved at vende den før brug. Tilsæt 50 µl konjugat til hver brønd. Tilsæt derefter 50 µl behandlet serumsupernatant til hver brønd, som beskrevet ovenfor. Tilsæt ikke serumprøver til brøndene før konjugatet. 6. Dæk pladen med pladeforsegling eller på anden måde for at hindre fordampning, idet du skal sørge for, at hele overfladen er dækket og vandtæt. 7. Inkuber mikropladen i en tør mikropladeinkubator i 90 minutter (± 5 minutter) ved 37 C (± 1 C). 8. Fjern pladeforseglingen. Sug indholdet af alle brønde op i en affaldsbeholder (en beholder med natriumhypochlorit). Vask pladen 5 gange, og brug mindst 370 µl arbejdsvaskeopløsning. Vend mikropladen efter den sidste vask, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 9. Tilsæt hurtigt 200 µl substrat-kromogenopløsning (R8 + R9) til hver brønd, og undgå at udsætte dem for skarpt lys. 10. Inkuber mikropladen i mørke ved stuetemperatur (18-25 C) i 30 minutter (± 5 minutter). Undgå at bruge selvklæbende film under dette inkubationstrin. 11. Tilsæt 100 µl stopopløsning (R10) til hver brønd, og tilsæt substrat-kromogenopløsning i samme rækkefølge. Bland grundigt. 12. Tør bunden af hver plade grundigt. 13. Aflæs den optiske densitet for hver brønd ved 450 nm (referencefilter på 620/630 nm). Mikroplader skal aflæses inden for 30 minutter efter tilsætning af stopopløsning. 11 KVALITETSKONTROL (VALIDERINGSKRITERIER) Kvantitativ metode Brug kontrolsera og intervalpunkter på hver mikroplade for hver test. Følgende kriterier skal opfyldes, for at testproceduren kan valideres: Værdi for optisk densitet: 0,300 < OD for intervalpunktet 0,5 ng/ml < 1,100 Forhold: OD (intervalpunktet 2,0 ng/ml)/od (intervalpunktet 0,5 ng/ml) > 2,1 OD (intervalpunktet 1,0 ng/ml)/od (intervalpunktet 0,5 ng/ml) > 1,25 OD (intervalpunktet 0,25 ng/ml)/od (intervalpunktet 0,5 ng/ml) < 0,85 OD (R3)/OD (intervalpunktet 0,25 ng/ml) 0,80 Mannankoncentration: Koncentration af R5, svarende til den koncentration, der er angivet på flasken ± 20 %. 7
Kvalitativ metode Beregning af cut-off-værdi (CO) Tilføj de opnåede OD-værdier for hver brønd med intervalpunktet 0,5 ng/ml, og divider med 2. Valideringskriterier 0,300 < CO < 1,100 OD R5 > CO OD R3 < 0,7 CO Intervalpunktet 0,25 ng/ml OD < 0,85 CO 12 FORTOLKNING AF RESULTATER Kvantitativ metode Oprettelse af standardkurven Standardkurven er oprettet ud fra fire intervalpunkter 2,0, 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml som er forberedt fra kalibratorserum R4. Positive (R5) og negative (R3) kontrolprøver er ikke medtaget i kurven. Hvis du vil opnå størst mulig præcision, skal du oprette en sigmoid-kurve med ekstrapolation ved at angive mannankoncentrationen i ng/ml på X-aksen (logaritmisk skala) og optisk densitet på Y-aksen (lineær skala). Hvis pladeaflæseren ikke muliggør denne type repræsentation, skal du oprette en kurve, der forbinder de forskellige intervalpunkter. Bestemmelse af mannankoncentrationen i testsera Kalibreringskurven kan anvendes til at bestemme mannanantigenkoncentrationen, udtrykt i ng/ml, for hver testprøve. Fortolkning af resultaterne Sera med en mannankoncentration, der er under 0,25 ng/ml (C < 0,25), betragtes som "negative" for forekomsten af mannanantigen. Sera med en mannankoncentration, der er mellem 0,25 og 0,5 ng/ml (0,25 C < 0,5), betragtes som "mellemsensitive" for forekomsten af mannanantigen. Sera med en mannankoncentration, der er større end eller lig med 0,5 ng/ml (C 0,5), betragtes som "positive" for forekomsten af mannanantigen. De intervalpunkter, der benyttes til at oprette kalibreringskurven, muliggør ikke en præcis bestemmelse af koncentrationer over 2,5 ng/ml. Testen skal gentages efter fortynding af serum i forholdet 1:5 i negativt serum (R3) med henblik på at få en mere præcis bestemmelse af koncentrationen for stærkt positive sera. Bemærk: Platelia Candida Ag er tænkt som en hjælp til diagnosticering af invasiv candidiasis. Positive resultater, der er opnået med Platelia Candida Ag, bør sammenholdes med andre diagnosticeringsprocedurer, såsom mikrobiologisk kultur, histologisk undersøgelse af biopsiprøver og radiografiske undersøgelser. Regelmæssig screening af højrisikopatienter anbefales for at øge sensitiviteten og opnå en tidlig konstatering ved en positiv test. Kvalitativ metode Fortolkning af resultaterne Prøve OD < intervalpunkt 0,25 ng/ml OD: sera betragtes som negative for forekomsten af mannanantigen. Intervalpunkt 0,25 ng/ml OD prøve OD < CO: sera betragtes som mellemsensitive for forekomsten af mannanantigen. 8
Prøve OD CO: sera betragtes som positive for forekomsten af mannanantigen. Bemærk: Platelia Candida Ag er tænkt som en hjælp til diagnosticering af invasiv candidiasis. Positive resultater, der er opnået med Platelia Candida Ag, bør sammenholdes med andre diagnosticeringsprocedurer, såsom mikrobiologisk kultur, histologisk undersøgelse af biopsiprøver og radiografiske undersøgelser. Regelmæssig screening af højrisikopatienter anbefales for at øge sensitiviteten og opnå en tidlig konstatering ved en positiv test. NB! For at bestemme intensiteten for positive resultater er det muligt at beregne et indeks (I): I = positivt serum OD/CO Dette indeks giver mulighed for at angive resultater med en semikvantitativ metode. 13 PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. En negativ test udelukker ikke diagnosen invasiv candidiasis på grund af den meget lave koncentration og hurtige eliminering af mannan i løbet af infektionen. 2. En negativ test for mannanantigen skal også tolkes sammen med resultaterne for test af forekomst af anti-mannanantistoffer: også i tilfælde af invasiv candidiasis er antigenet sværere at konstatere hos patienter, der er testet positive for anti-mannanantistoffer (se kapitel 14. Særlige specifikationer for ydeevne). 3. Ydeevnen for konstatering af mannanantigen i serum er forbundet med hyppigheden af test udført for patienten 4. Regelmæssig overvågning af patienter i højrisikogruppen og screening for antimannanantistoffer anbefales for at øge sensitiviteten og opnå en tidlig konstatering ved en positiv test. 4. Proceduren for Platelia Candida Ag og fortolkningen af resultaterne skal følges, når der testes prøver for forekomsten af mannanantigen. Det anbefales brugeren af sættet at læse pakkens indlægsinformation grundigt, før testen udføres. Især skal testproceduren følges omhyggeligt, hvad angår prøve- og reagenspipettering, vask af plader og tidsbestemmelse af inkubationstrinnene. 5. Undlader man at tilføre prøvemateriale eller reagens efter instruktionerne i proceduren, kan det give falske negative resultater. Det bør overvejes at gentage testen for yderligere prøver, hvor der er klinisk mistanke om invasiv candidiasis eller en procedurefejl. 6. Kontamination af negative patientprøvebrønde med positive kontrol- eller patientprøvebrønde er mulig, hvis indholdet af den ene brønd overføres til en anden brønd på grund af uforsigtig håndtering af mikropladen eller forkert pipetteringsteknik under tilsætning af reagenserne. 7. Der er blevet observeret en krydsreaktion hos patienter, der fik infusion fra bestemte partier af plasmaekspandere til hydroxyethylstivelse (f.eks. Hesteril 6 %), som anvendes i behandlingen af kredsløbsforstyrrelser: hypovolæmi, hæmoragisk chok, septisk chok. 14 SPECIFIKATIONER FOR SÆRLIG YDEEVNE 14.1 Kvantitativ metode A Undersøgelser af reproducerbarhed Variation for den interne analyse: Fire sera (en negativ, en mellemsensitiv ved 0,48 ng/ml og to positive sera med koncentrationer på 0,69 ng/ml og 1,39 ng/ml) blev testet i 30 gentagelser. Variationskoefficienterne var henholdsvis 3,1 %, 6,9 %, 9,1 % og 7,0 %. Variation for krydskontrolleret analyse: Otte negative sera og fire positive sera blev testet på fem serier, der blev udført over en periode på fem uger. Variationskoefficienterne var < 20 % for koncentrationerne for de positive sera og < 13 % for den optiske densitet for de negative sera. 9
B Klinisk test SPECIFICITET Resultaterne for specificiteten er sammenfattet i tabellen nedenfor: Koncentration (ng/ml) Patientkategori Antal patienter (antal sera) C < 0,25 0,25 C < 0,5 C 0,5 Ikke indlagte 184 (184) 183 (99,5 %) 1 (0,5 %) Indlagte, ikke koloniserede efter: 151 (200) 140 (92,8 %) 7 (4,6 %) 4 (2,6 %) - Crohns sygdom 52 (52) 49 (98,1 %) 3 (1,9 %) - Colitis ulcerosa 43 (43) 41 (95,4 %) 1 (2,3 %) 1 (2,3 %) - Aspergillosis 26 (35) 23 (88,5 %) 1 (3,8 %) 2 (7,7 %) - Pneumocystosis 4 (4) 4 (100 %) - Kryptokokkose 13 (13) 12 (92,3 %) 1 (7,7 %) Indlagte, koloniserede efter Candida: 41 (160) 35 (85,3 %) 4 (9,8 %) 2 (4,9 %) SENSITIVITET Der blev udført kliniske test for at vurdere sensitiviteten for Platelia Candida Ag på tre universitetshospitaler i Frankrig. Studiet blev udført retrospektivt med i alt 366 serumprøver indsamlet fra 106 patienter fra forskellige hospitalsafdelinger: kirurgi, hæmatologi, intensiv behandling, forbrændinger Candida-gærtyper blev isoleret fra blodkulturer eller dybe prøver fra disse patienter 8, 9. I denne patientgruppe var den generelle sensitivitet for Platelia Candida Ag 51,5 % (eksklusive sera med en koncentration af mannanantigen på mellem 0,25 og 0,5 ng/ml, hvilket betragtes som mellemhøjt for forekomsten af mannanantigen: 6,6 % af patienterne). Afhængigt af de isolerede Candida-arter varierer sensitiviteten som vist i tabellen herunder: Antal Sensitivitet Isolerede patienter Candida-arter C 0,5 C 0,5 og 0,25 C < 0,5 (antal sera) C. tropicalis 10 (72) 70,0 % 70,0 % C. glabrata 12 (31) 58,3 % 58,3 % C. albicans 64 (208) 52,5 % 60,3 % C. kefyr 2 (5) 50,0 % 50,0 % C. parapsilosis 10 (29) 37,5 % 57,5 % C. krusei 8 (21) 20,0 % 20,0 % Sensitiviteten afhænger af antallet og hyppigheden af prøver 13. Disse kliniske studier viste også værdien af at kombinere konstateringen af mannanantigen med Platelia Candida Ag og antimannanantistoffer med Platelia Candida Ab/Ac/Ak. Patienter kan inddeles i 2 markant forskellige grupper (Chi-square-test, p < 0.0005), som illustreret gennem resultaterne i følgende tabel: Negative anti-mannanantistof-patienter: sensitivitet for Platelia Candida Ag er 78,8 % i forekomsten af C. albicans-infektioner og 66,6 % for kombinerede Candida-arter. Positive anti-mannanantistof-patienter: antigen-mannan er vanskeligere at konstatere. Infektionsarter (antal patienter) Kombinerede Candidaarter (106) C. albicans (64) Sensitivitet for Platelia Candida Ag: Anti-mannan Ab Anti-mannan Ab negative patienter positive patienter Alle patienter 66,6 % 17,5 % 51,5 % 78,8 % 16,1 % 52,5 % 10
Fortolkningen af Platelia Candida Ag-test skal derfor medtage oplysninger om patienternes immunstatus over for Candida mannan. Den kombinerede serologiske konstatering af mannanantigen og anti-mannanantistoffer viser en sensitivitet på 84,8 % (eksklusive de 6,6 % af patienterne med en mellemhøj koncentration af mannanantigen). Nogle patienter viste imidlertid en positiv reaktion over de to indikatorer på forskellige tidspunkter inden for den samme infektionsperiode. Prognosen for infektionen kan forbindes med balancen mellem mannanemia og antimannanantistofreaktion 13. 14.2 Kvalitativ metode A Undersøgelser af reproducerbarhed Variation for den interne analyse: Fire sera (en negativ, en mellemsensitiv indeks = 0,95 og to positive sera indeks = 1,24 og 2,00) blev testet i 30 gentagelser. Den procentvise variationskoefficient (CV-procent) var 3,1 %, 7,2 %, 5,9 % og 5,9 %. Variation for krydskontrolleret analyse: Ti positive sera og fire mellemsensitive sera blev testet i seks serier. Variationskoefficienterne (CVprocent) var < 15 % for koncentrationerne i positive og mellemsensitive sera. B Klinisk test SPECIFICITET SENSITIVITET I betragtning af at koncentrationerne 0,5 ng/ml eller < 0,25 ng/ml, der blev opnået med en kvantitativ metode, svarer til respektivt de positive og negative sera i kvalitativ metode, svarer specifikationerne for ydeevnen for test med kvalitativ metode til dem, der er beskrevet i kapitlet Kvantitativ metode. 15 PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti af slutproduktet gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for virksomheden. 16 REFERENCER 1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI og D. POULAIN. 1992. Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: s. 438-446. 2. FRIDKIN, S. K. og W. R. JARVIS. 1996. Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: s. 499-511. 3. FUKAZAWA, Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: s. 37-62. 4. HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT og D. POULAIN. 1992. Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: s. 2158-2164. 5. JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER og D. POULAIN. 1998. Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: s. 131-8. 6. PONTON, J., M. MORAGUES og G. QUINDOS. 2002. Non-Culture-Based Diagnostics, s. 395-425. In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 7. RUHNKE, M. og G. MASCHMEYER. 2002. Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: s. 227-235. 8. SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS og D. POULAIN. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: s. 433-442. 11
9. Sendid, B., M. Tabouret, J. L. Poirot, D. Mathieu, J. Fruit og D. Poulain. 1999. New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: s. 1510-1517. 10. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL og F. MENICHETTI. 2000. Deep Candida infections in the neutropenic and nonneutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: s. 199-204. 11. TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ og D. POULAIN. 1992. Mapping of Candida albicans oligomannosidic epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: s. 3845-51. 12. VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING og J. PONTON. 1998. Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: s. 146-155. 13. YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS og D. POULAIN. 2001. Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: s. 864-870. 12
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Frankrike Tlf.: +33 (0) 1 47 95 60 00 03/2008 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 880018 12