Nukleinsyrebaseret vaccine til fisk

Transkript

1 Nukleinsyrebaseret vaccine til fisk»og hvad arbejder du så med?«- Udvikling af nukleinsyrebaseret vaccine mod en rabiesbeslægtet virus i fisk - er ikke det forventede svar. Princippet bag den molekylære vaccine er overraskende enkelt og mere effektivt i fisk end i andre dyrearter. Når historien er fortalt, stilles der oftest interesserede spørgsmål til et forskningsområde, hvor forskere ved DFVF i Århus er blandt verdens førende Af Katja Einer-Jensen, Ellen Lorenzen, Jesper S. Rasmussen og Niels Lorenzen, Fiskesektionen, Danmarks Fødevareforskning (DFVF), Århus Egtvedsyge, også kendt som viral hæmorrhagisk septikæmi (VHS), er en af de virusbetingede sygdomme, der resulterer i størst tab hos opdrættede regnbueørreder i Europa. Derfor checkes alle danske dambrug regelmæssigt af veterinærmyndighederne. I øjeblikket er 5-10% af dambrugene direkte berørt af sygdommen, der ofte forårsager høj dødelighed (over 90%). For 40 år siden blev det på DFVF s afdeling i Århus vist, at VHS forårsages af et virus, der i sin opbygning minder om rabiesvirus. Sygdommen kan ikke behandles, og den eneste effektive metode til at begrænse spredningen har været tørlægning og kemisk desinfektion af de angrebne dambrug. I de forløbne år har der været arbejdet med at udvikle traditionelle vacciner af svækket eller dræbt virus. Men trods effektiv beskyttelse af ørreder under eksperimentelle forhold ved henholdsvis bad- eller stikvaccination har det været meget vanskeligt og kostbart at benytte disse vacciner under dambrugsforhold. Figur 2. De bedøvede fisk vaccineres i rygmuskulaturen tæt på rygfinnen med 25 ml vaccineopløsning. Figur 1. Princippet bag nukleinsyrevaccinen mod VHS. a) VHS viruspartikel (rhabdovirus). Virusgenomet koder for 6 gener, hvoraf G-gene, der indgår i vaccinen, er vist i grøn. Det immunstimulerende virale G-protein (rød) eksponeres på viruspartiklens overflade. b) G-genet (grøn) fra VHSV inkorporeret i vaccineplasmid. c) Nærbillede af G-protein. Proteinets 3-dimensionale struktur fastholdes af intramolekylære svovlbroer (S-S) og domineres desuden af fire vedhæftede sukkergrupper (her illustreret som»gafler«) [9]. Figuren er modificeret i forhold til [3]. 44 Resultaterne fra den nye vaccine, en nukleinsyrevaccine, er derimod meget lovende. Princippet er overraskende enkelt. Det er baseret på cirkulært DNA (plasmid DNA), der indeholder genet for vaccineproteinet, i dette tilfælde overfladeproteinet (G-proteinet) fra VHS-virus (figur 1). Når et individ vaccineres, optager en lille del af cellerne vaccinen og begynder at producere det indkodede vaccineprotein. De bedøvede fisk injiceres i muskulaturen tæt på rygfinnen (figur 2), hvorefter G-proteinet udtrykkes på overfladen af de muskelceller, der har optaget plasmidet (figur 1 og 3, side 46). Dermed aktiveres fiskens immunforsvar formodentlig på samme måde som ved infektion af en normal virus. Blot med den væsentlige forskel at der ikke er noget levende virus til stede. Indtil nu har vaccinen kun været afprøvet under lukkede eksperimentelle forhold på DFVF s afdeling i Århus. Resultaterne har vist, at vaccinen meget effektivt beskytter fiskene mod sygdommen, uden at der er konstateret negative bivirknin- s

2 45

3 Figur 3. Immunhistokemisk farvning af muskelceller fra injektionsområdet. Vævsprøven er indsamlet 21 dage efter, at fisken (3-4 g) blev vaccineret med ekstra høj dosis (20 mg) af nukleinsyrevaccine. Snittet er tilsat mærket antistof som binder til G-proteinet. Rød farvning indikerer de områder hvor G- proteinet udtrykkes af muskelcellerne. Tilsvarende rød farvning observeres ikke i vævsprøver fra fisk vaccineret med plasmid uden G-genet (ikke vist). ger. Forskere i USA har udviklet en lignende vaccine mod en anden fiskevirus kendt som IHN (infektiøs haematopoietisk nekrose)-virus [1], og i de sidste 6 år har DFVF s forskere haft et tæt samarbejde med kollegerne på den anden side af Atlanten. Princippet er mere effektivt i fisk end i andre dyrearter Nukleinsyrevacciner fungerer umiddelbart godt for mange sygdomsmodeller i mus og andre mindre dyrearter. Ved forsøg med større dyr og mennesker er det derimod oftest nødvendigt at indbygge immunstimulerende komponenter eller at kombinere en primær plasmid-vaccination med booster-vaccination med andre vaccineformer. Så virker princippet tilsyneladende, og der udføres p.t. kliniske forsøg i udlandet, hvor (raske) mennesker vaccineres med nukleinsyrevacciner mod alvorlige sygdomme som hepatitis, HIV og malaria [2]. Forskere på Seruminstituttet i København arbejder f.eks. med udvikling af en DNA-vaccine mod HIV (Nyhederne, TV2, ). De mest overbevisende resultater er dog indtil videre opnået med nukleinsyrevacciner til fisk. Selv med vaccinedosis på 0.01 mg plasmid pr. fisk (3-4 g) er beskyttelsen signifikant (figur 4). Med en 0.1 mg dosis overlever næsten alle de vaccinerede fisk efter VHS-infektion, hvorimod 90% af de ikke vaccinerede fisk dør. Effekten er dog afhængig af fiskens størrelse, og større fisk kræver mere vaccine [3, 4]. Beskyttelsens varighed er ikke fuldt belyst, men god beskyttelse mod VHS og IHN kan påvises ½-2 år efter nukleinsyrevaccination [5, 6]. Så tidligt som 4-8 dage efter vaccination starter den effektive beskyttelse (figur 5). Det tidlige immunrespons er dog ikke specifikt, idet krydsbeskyttelse mod andre RNA-vira kan påvises [7, 8]. Tre til seks uger efter vaccinationen etableres de længerevarende specifikke immunmekanismer hvor bl.a. neutraliserende antistoffer indgår (figur 5). Mekanismer til aktivering af immunforsvaret Den effektive beskyttelse mod de to fiske-rhabdovirus har givet optimisme mht. brug af nukleinsyrevacciner i akvakultur sammenhænge. Men princippet har ikke kunnet inducere samme gode effekt mod andre fiskepatogener. Det er derfor nødvendigt med en nærmere karakterisering af de involverede immunologiske mekanismer. Her har VHS-nukleinsyrevaccinen og smittemodellen været nyttig. Når fisk for at opnå fuld beskyttelse vaccineres mod VHS med 100 gange mere plasmid end nødvendigt, kan tilstedeværelsen af G-proteinet på overfladen af muskelceller påvises (figur 3). I disse forsøg observeres intens inflammatorisk aktivitet omkring injektionsstedet. Netop inflammation eller på dansk»betændelsesreaktion«er et typisk tegn på aktivering af immunsystemet. Om denne respons hænger direkte sammen med vaccinens beskyttende effekt er endnu ikke afklaret. Men det står klart, at det kun er fisk vaccineret med plasmid indeholdende G-genet, der overlever smitte med VHS-virus. Den effektive aktivering af immunforsvaret formodes at være relateret til G-proteinets placering på celleoverfladen og proteinets 3-dimensionale struktur, herunder dets vedhæftede sukkerstrukturer (figur 1, [9]). For at belyse dette er forskellige G-proteinvarianter testet under eksperimentelle forhold. Forsøgene viste, at kun det oprindelige protein eller membranbundne varianter, hvor størstedelen af sukkerstrukturerne er intakte, kan inducere signifikant beskyttelse. Det støtter formodningen om, at det netop er G-proteinets forankring og rette 3-dimensionale struktur på celleoverfladen, der er afgørende for den effektive aktivering af beskyttende mekanismer. Disse observationer kan forhåbentlig bidrage til forbedring af Figur 4. Overlevelsesratio for regnbueørreder ved VHS-smitte er afhængig af vaccinedosis: 0.001, 0.01, 0.1 og 1 mg pr. fisk giver hhv. lidt, god og fuld (både ved 0.1 og 1 mg) beskyttelse mod VHSvirus. Plasmid uden G-genet (1 mg) havde ingen beskyttende effekt. Fiskene er smittet 51 dage efter vaccination, og der indgår 90 (3 x 30) individer pr. vaccinegruppe. Gengivet efter [5]. vacciner mod andre fiskepatogener og muligvis til optimering af nukleinsyrevacciner generelt. Første europæiske afprøvning under almindelige produktionsforhold I et projekt støttet af Direktoratet for FødevareErhverv og godkendt af Lægemiddelstyrelsen planlægger DFVF, i samarbejde med Dansk Akvakultur og firmaet GeneCare, at undersøge, om den nye vaccine er tilstrækkelig effektiv til at kunne beskytte fisk under dambrugsforhold. I øjeblikket arbejdes på at udrydde VHS i Danmark. Hvis vaccinen viser sig at fungere s 46

4 47

5 6. LaPatra, S. E., Corbeil, S., Jones, G. R., Shewmaker, W. D., Lorenzen, N., Anderson, E. D., and Kurath, G. (2001). Protection of rainbow trout against infectious hematopoietic necrosis virus four days after specific or semi-specific DNA vaccination. Vaccine 19, Lorenzen, N., Lorenzen, E., Einer-Jensen, K., and LaPatra, S. E. (2002). Immunity induced shortly after DNA vaccination of rainbow trout against rhabdoviruses protects against heterologous virus but not against bacterial pathogens. Developmental and Comparative Immunology 26, Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., and Nerland, A. H. (2003). A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine 21, Einer-Jensen, K., Krogh, T. N., Roepstorff, P., and Lorenzen, N. (1998). Characterization of intramolecular disulfide bonds and secondary modifications of the glycoprotein from viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus. Journal of Virology 72, Figur 5. Nukleinsyrevaccine-induceret beskyttelse (blå) består af nonspecifikke mekanismer (grøn) efterfulgt af specifikke mekanismer (rød). Beskyttelsen er vist som RPS a -værdier. Immunisering ved lavere temperaturer forlænger den nonspecifikke fase og forsinker den specifikke respons. Gengivet fra [3]. a RPS = relativ procent overlevelse. tilfredsstillende under dambrugsforhold, kan den blive et vigtigt værktøj i udryddelseskampagnen, idet man ved i en periode at anvende vaccinerede fisk i udsatte områder kan reducere virusets muligheder for at opformeres og spredes. Det er første gang en nukleinsyrevaccine afprøves under dambrugsforhold i Europa, og resultaterne kan få betydning for vaccinationsstrategier for akvakulturfisk i en række europæiske lande, hvor VHS og andre virusinfektioner medfører store omkostninger for dambrugerne og unødvendig belastning af omgivelserne som følge af tabt produktion. I Canada har man nylig iværksat et stort feltforsøg med nukleinsyrevaccination af laks i havbrug. Her vil de vaccinerede fisk komme til at indgå i konsumproduktionen. I det danske forsøg bliver forsøgsfiskene ikke anvendt til konsum, idet effektivitet såvel som sikkerhedsforhold under almindelige produktionsforhold ønskes klarlagt, inden kommerciel anvendelse kan komme på tale. Feltafprøvningen skal i første omgang afklare om nukleinsyrevaccinen også evner at beskytte, når produktionsrelaterede faktorer som bakterie- og parasitinfektioner, varierende vandkvalitet, stress mv. er til stede. -adresse Katja Einer-Jensen: kej@dfvf.dk Referencer: 1. Anderson, E. D., Mourich, D. V., Fahrenkrug, S. C., LaPatra, S., Shepherd, J., and Leong, J. A. (1996). Genetic immunization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) against infectious hematopoietic necrosis virus. Molecular Marine Biology and Biotechnology 5, Liu, M. A. (2003). DNA vaccines: a review. Journal of Internal Medicine 253, Lorenzen, N., Lorenzen, E., Einer-Jensen, K., and LaPatra, S. E. (2002). DNA vaccines as a tool for analysing the protective immune response against rhabdoviruses in rainbow trout. Fish and Shellfish Immunology 12, La Patra, S., Corbeil, S., Jones, G. R., Shewmaker, W. D., and Kurath, G. (2000). The dose-dependent effect on protection and humoral response to a DNA accine against infectious hematopoietic necrosis (IHN) virus in subyearling rainbow trout. Journal of Aquatic Animal Health 12, Lorenzen, E., Einer-Jensen, K., Martinussen, T., LaPatra, S. E., and Lorenzen, N. (2000). DNA Vaccination of Rainbow Trout against Viral Hemorrhagic Septicemia Virus: A Dose-Response and Time-Course Study. Journal of Aquatic Animal Health 12, Nyt om... plumban Manfred Weidenbruch ved universitetet i Oldenburg har specialiseret sig i fremstilling af stoffer med Pb-Pb-bindinger. Senest har han og medarbejderne fremstillet det på figuren viste stof, som så vidt vides er det første med en homocyklisk blyring. R er triethylphenyl. Bos 2003, Chemical & Engineering News, 25. august: 26 organiske halvledere Tobin J. Marks ved Northwestern University i Chicago fremstiller organiske halvledere. På figuren er vist strukturen af et par eksempler. Bos Steve Ritter 2003: Semiconductor switcheroo. Chemical & Engineering News. 1. September: 9. 48