Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit

Transkript

1 August 2014 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 24 Version 1 Kvalitativ in vitro-diagnostik Til brug med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumenter QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Storbritannien R DA Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyseteknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder inden for: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nucleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyseteknologier Vores opgave er at sætte dig i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information henvises til

3 Indhold Tilsigtet anvendelse 5 Opsummering og forklaring 5 Procedureprincip 7 Reagenser 9 Medfølgende materialer 13 Kit-indhold 13 Nødvendige materialer, som ikke medfølger 14 Advarsler og forholdsregler 15 Sikkerhedsinformationer 15 Generelle forholdsregler 15 Opbevaring og håndtering af reagenser 16 Prøveindsamling, klargøring til analyse og opbevaring 17 Procedure 19 DNA-ekstrahering (CRC-prøver) 19 DNA-ekstrahering (NSCLC-prøver) 20 Protokol: DNA-prøvevurdering 21 Protokol: Påvisning af KRAS-mutationer 32 Fortolkning af resultater 44 Fejlfindingsvejledning 45 Flag genereret af therascreen KRAS Assay Package 46 Kvalitetskontrol 52 Begrænsninger 52 Forventede resultater 53 Ydelseskarakteristika (CRC) 53 Analytisk ydeevne 53 Påvisningsgrænse (LOD) 58 DNA-input og linearitet 63 Interfererende stoffer 68 Krydskontaminering 69 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014 3

4 Eksklusivitet/krydsreaktivitet 69 Repeterbarhed og reproducerbarhed 72 Variabilitet i håndtering af prøver 73 Lottenes indbyrdes udskiftelighed 75 Ydelseskarakteristika (NSCLC) 75 Analytisk ydeevne 75 Påvisningsgrænse (LOD) 78 DNA-input og linearitet 80 Interfererende stoffer 84 Eksklusivitet/krydsreaktivitet 86 Repeterbarhed og reproducerbarhed 88 Variabilitet i håndtering af prøver 90 Ækvivalens i prøvehentningsmetoder 93 Lottenes indbyrdes udskiftelighed 95 Referencer 96 Symboler 99 Kontaktoplysninger 100 Appendiks: Installation af therascreen KRAS Assay Package 101 Bestillingsinformation Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

5 Tilsigtet anvendelse therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er en kvalitativ real-time PCR-analyse til påvisning af syv somatiske mutationer i KRAS-onkogenet ved hjælp af Rotor- Gene Q MDx 5plex HRM*-instrumentet. KRAS-kittet er beregnet til brug sammen med DNA, der er ekstraheret fra formalinfikserede og paraffinindstøbte prøver (FFPE) af primært væv fra kolorektalcancer (CRC) eller ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). Somatiske mutationer i KRAS-genet er potentielle prædiktive biomarkører for resistens ved behandlinger med human epidermal vækstfaktor (EGFR), som f.eks. panitumumab og cetuximab til behandling af CRC. Somatiske mutationer i KRAS-genet kan også være angivet som en potentiel prædiktiv biomarkør til at træffe beslutninger om visse NSCLC-behandlinger. Patientens mutationsstatus vil sammen med andre sygdomsfaktorer blive vurderet af en kliniker for at træffe beslutning om behandling. Der bør ikke træffes nogen behandlingsbeslutninger for cancerpatienter alene på basis af KRAS-mutationsstatus. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er ikke beregnet til at diagnosticere CRC, NSCLC eller andre sygdomme. Opsummering og forklaring Mutationer i KRAS-onkogenet findes hyppigt ved human cancer (1-4). Tilstedeværelsen af disse mutationer falder sammen med en manglende respons på visse cancerbehandlinger med EGFR-hæmmere hos patienter med metastatisk kolorektalcancer og ikke-småcellet lungecancer (5-19, 23-26). therascreen KRAS RGQ PCR-kittet muliggør påvisning af følgende mutationer i codon 12 og 13 i KRAS-onkogenet mod en baggrund af vildtype-genomisk DNA (se tabel 1) ved hjælp af teknologierne Scorpions og ARMS (Amplification Refractory Mutation System) (20, 21). De syv mutationer, som påvises af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, er baseret på data i COSMIC-databasen (2012 v59) og udgør >97 % af alle rapporterede KRAS-mutationer hos CRC-patienter og >92 % af alle rapporterede mutationer hos NSCLC-patienter (22). * therascreen KRAS RGQ PCR-kittet kan også køres på Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumentet, hvis det er tilgængeligt. Dette instrument er i nogle lande kendt som Rotor-Gene Q MDx. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014 5

6 Tabel 1. Liste over mutationer og COSMIC-identiteter Mutation Basisændring COSMIC-id* GLY12ALA (G12A) GGT>GCT 522 GLY12ASP (G12D) GGT>GAT 521 GLY12ARG (G12R) GGT>CGT 518 GLY12CYS (G12C) GGT>TGT 516 GLY12SER (G12S) GGT>AGT 517 GLY12VAL (G12V) GGT>GTT 520 GLY13ASP (G13D) GGC>GAC 532 * COSMIC-id'er stammer fra Catalog of Somatic Mutations in Cancer (22) ( Testen er meget specifik og giver mulighed for påvisning af en lav procentdel af mutant-dna mod en baggrund af vildtype-dna. Hvis der er tilstrækkelige kopier af DNA, er påvisning af 0,8 % mutant i en baggrund af vildtype-dna mulig (se oplysninger om påvisningsgrænsen for hver mutation i Ydelseskarakteristika (CRC), side 53). therascreen KRAS RGQ PCR-kittet anvendes i en polymerasekædereaktion (PCR). Fordelen ved dette kit er, at det er udviklet specifikt til formålet og er hurtigt og effektivt uden subjektivitet i bestemmelsen af resultaterne. 6 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

7 Procedureprincip therascreen KRAS RGQ PCR-kittet indeholder 8 separate PCR-forstærkningsreaktioner: 7 mutationsspecifikke reaktioner i codon 12 og 13 af exon 2 i KRAS-onkogenet og en vildtype-kontrol i exon 4. Hovedkomponenterne i kittet er forklaret nedenfor. Mutationsreaktionsblandinger Hver reaktionsblanding bruger en mutationsspecifik ARMS-primer til selektivt at forstærke det muterede DNA og derefter en Scorpions-primer til at påvise amplifikationsproduktet. ARMS Allele-specifik amplifikation opnås med ARMS, som anvender muligheden for, at Taq DNA-polymerase kan skelne mellem en matchet og en ikke matchet base i 3'-enden af en PCR-primer. Når primeren er fuldstændigt matchet, fortsætter forstærkningen med fuld effektivitet. Når 3'-basen ikke er matchet, kan der kun forekomme baggrundsforstærkning på et lavt niveau. En muteret sekvens forstærkes derfor selektivt, selv i prøver hvor størsteparten af DNA'et ikke bærer mutationen. Scorpions Påvisning af forstærkning udføres med Scorpions. Scorpions er bifunktionelle molekyler, der indeholder en PCR-primer, som er kovalent kædet til en probe. Proben indeholder fluorokrom carboxyfluorescein (FAM ) og en quencher. Sidstnævnte slukker fluorescensen i fluoroforen. Når proben binder til ARMSamplikonet under PCR, adskilles fluoroforen og quencheren, hvilket fører til en påviselig stigning af fluorescens. Kontrolreaktion Control Reaction Mix (CTRL) (Kontrolreaktionsblanding) anvender en Scorpionsprimer og en ukendt primer til at forstærke en kort sekvens af exon 4 i KRASgenet. Kontrolreaktionen bruges til at bestemme, om der er et passende niveau af DNA, der kan forstærkes i prøven, og er en faktor, som bruges i de analytiske beregninger, der bruges til at bestemme mutationsstatus. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014 7

8 Intern kontrol Hver af de otte reaktionsblandinger indeholder en intern kontrol, der er udviklet til at påvise fejl i reaktionen (f.eks. ved tilstedeværelsen af hæmmere). Den interne kontrol indeholder en oligonukleotid målsekvens, der ikke er KRASrelateret, en umærket primer og en Scorpions-primer, der er mærket med hexachlorofluorescein (HEX ) for at adskille det fra de FAM-mærkede Scorpions-primere i kontrollen og mutationsreaktioner. Positiv kontrol therascreen KRAS RGQ PCR-kittet indeholder også den positive kontrol for KRAS (PC). Den positive kontrol er en blanding af syntetiske oligonukleotider, der repræsenterer hver af de mutationer, som kittet påviser. Påvisning af den positive kontrol bekræfter den korrekte funktion i hver af kittets reaktionsblandinger. Negativ kontrol therascreen KRAS RGQ PCR-kittet indeholder nukleasefrit vand til ikke-skabelonkontrol (NTC), som skal bruges til ikke-skabelon-kontrol -reaktionen (NTC). NTC fungerer som en negativ kontrol og vurderer potentiel kontaminering under analyseopsætningen. Taq DNA-polymerase Taq DNA-polymerase er enzymet for den polymerasekædereaktion, der anvendes af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Platform og software therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er specifikt udviklet til at anvendes sammen med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet. Rotor-Gene Q-instrumentet er programmeret til forskellige cyklusparametre eller kørsler efter therascreen KRAS Assay Package. therascreen KRAS Assay Package består af to skabeloner: therascreen KRAS QC Locked Template (til DNA-prøvevurdering) og therascreen KRAS Locked Template (til påvisning af KRAS-mutationer). Disse skabeloner indeholder PCRkørselsparametre og beregner resultaterne. 8 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

9 De samme kørselsparametre anvendes for både DNA-prøvevurdering med Control Reaction Mix (Kontrolreaktionsblandingen) og til påvisning af KRASmutationer ved hjælp af mutationsreaktionsblandinger: 1. Opbevares ved 95 C i 15 minutter for at aktivere Taq DNA-polymerase. 2. PCR for 40 cyklusser ved 95 C i 30 sekunder for at denaturere og 60 C i 1 minut for at afhærde og udvide. PCR-cyklussen, hvor fluorescensen fra en bestemt reaktion overskrider den foruddefinerede tærskelværdi, der gives af therascreen KRAS Assay Package, defineres som CT-værdien. Ved at anvende kontrolreaktionen til at vurdere DNA-prøven, er det muligt ud fra de CT-værdier, der opnås, at bestemme, om prøverne indeholder DNAniveauer, der er egnet til analyse, og hvilke prøver, der kræver fortynding forud før analyse. Vurdering af prøven ved hjælp af forskellige mutationsreaktionsblandinger til at bestemme deres respektive CT-værdier giver therascreen KRAS Assay Packagesoftwaren mulighed for at udføre en beregning for at bestemme CT-værdien af prøven ved hjælp af ligningen: CT = [mutationsanalyse CT-værdi] [kontrolanalyse CT-værdi] Baseret på fastlagte analytiske CT- og CT-værdier bestemmer Rotor-Gene Q- softwaren mutationsstatussen for DNA-prøverne og rapporterer, hvilke prøver der indeholder hvilken mutation.* Reagenser Reaktionsblandinger er dobbelte og indeholder FAM-mærkede reagenser til at påvise mål og en HEX-mærket intern kontrol. Reaktionsblandingerne og de positive kontrolreagenser indeholder Tris EDTA-buffer, og den positive kontrol indeholder bæreren Poly A RNA. * En tumor kan i sjældne tilfælde indeholde mere end én mutation. I sådanne tilfælde identificeres den mutation, der giver den laveste C T-værdi. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014 9

10 Tabel 2. Reagenser, der følger med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet Reagens Control Reaction Mix (Kontrolreaktionsblanding) Ingredienser Umærket primer til kontrol, Scorpionsprimer til kontrol, umærket primer til intern kontrol, Scorpions-primer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 2 rør x 600 µl 12ALA Reaction Mix (12ALA-reaktionsblanding) 12ASP Reaction Mix (12ASP-reaktionsblanding) 12ARG Reaction Mix (12ARG-reaktionsblanding) 12ALA ARMS-primer, Scorpions-primer, umærket primer til intern kontrol, Scorpions-primer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTAbuffer, PCR-buffer 12ASP ARMS-primer, Scorpions-primer, umærket primer til intern kontrol, Scorpions-primer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTAbuffer, PCR-buffer 12ARG ARMS-primer, Scorpionsprimer, umærket primer til intern kontrol, Scorpions-primer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl Tabellen fortsættes på næste side 10 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

11 Tabel 2. Fortsat Reagens 12CYS Reaction Mix (12CYS-reaktionsblanding) 12SER Reaction Mix (12SER-reaktionsblanding) 12VAL Reaction Mix (12VAL-reaktionsblanding) 13ASP Reaction Mix (13ASP-reaktionsblanding) Ingredienser 12CYS ARMS-primer, Scorpions-primer, umærket primer til intern kontrol, Scorpionsprimer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 12SER ARMS-primer, Scorpions-primer, umærket primer til intern kontrol, Scorpionsprimer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 12VAL ARMS-primer, Scorpions-primer, umærket primer til intern kontrol, Scorpionsprimer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 13ASP ARMS-primer, Scorpions-primer, umærket primer til intern kontrol, Scorpionsprimer til intern kontrol, intern kontrolskabelon, deoxynukleosid trifosfater, magnesiumklorid, Tris EDTA-buffer, PCR-buffer 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl 1 rør x 600 µl KRAS Positive Control (Positiv kontrol for KRAS) Kontrolskabelon, 12ALA-skabelon, 12ASPskabelon, 12ARG-skabelon, 12CYS-skabelon, 12SER-skabelon, 12VAL-skabelon, 13ASPskabelon, Poly A RNA, Tris EDTA-buffer 1 rør x 250 µl Tabellen fortsættes på næste side Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

12 Tabel 2. Fortsat Reagens Taq DNA Polymerase (Taq-DNApolymerase) Water for NTC (Vand til NTC) Water for Sample Dilution (Vand til fortynding af prøven) Ingredienser Taq-polymerase: 50 % glycerol/vand Nukleasefrit vand Nukleasefrit vand 1 rør x 70 µl 1 rør x 1,9 ml 1 rør x 1,9 ml Platforme therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er udviklet specifikt til brug sammen med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet, der er installeret med Rotor- Gene Q-software (build 9), og therascreen KRAS Assay Package version , som findes på cd (katalognr ). Se oplysninger om instrumentet i brugervejledningen. Se instruktioner i installation af therascreen KRAS Assay Package i Appendiks: Installation af therascreen KRAS Assay Package, side 101. Rotor-Gene Q-instrumenter skal vedligeholdes i overensstemmelse med kravene i instrumentets brugervejledning. 12 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

13 Medfølgende materialer Kit-indhold therascreen KRAS RGQ PCR Kit (24) Katalognr Antal forberedelser 24 Farve Identitet Røridentifikation Volumen Rød Control Reaction Mix (Kontrolreaktionsblanding) 1 CTRL 2 x 600 µl Lilla Orange Lyserød Grøn Gul Grå Blå Beige Mintgrøn 12ALA Reaction Mix (12ALA-reaktionsblanding) 12ASP Reaction Mix (12ASP-reaktionsblanding) 12ARG Reaction Mix (12ARG-reaktionsblanding) 12CYS Reaction Mix (12CYS-reaktionsblanding) 12SER Reaction Mix (12SER-reaktionsblanding) 12VAL Reaction Mix (12VAL-reaktionsblanding) 13ASP Reaction Mix (13ASP-reaktionsblanding) KRAS Positive Control (Positiv kontrol for KRAS) Taq DNA Polymerase (Taq DNA-polymerase) 2 12ALA 600 µl 3 12ASP 600 µl 4 12ARG 600 µl 5 12CYS 600 µl 6 12SER 600 µl 7 12VAL 600 µl 8 13ASP 600 µl 9 PC 250 µl Taq 70 µl Hvid Water for NTC (Vand til NTC) NTC 1,9 ml Hvid Water for Sample Dilution (Vand til fortynding af prøven) Fort. 1,9 ml therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbook (Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit) (engelsk) 1 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

14 Nødvendige materialer, som ikke medfølger Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS'er), som kan fås hos produktets leverandør. 0.1 ml Strip Tubes and Caps (0,1 ml båndrør med hætter), til brug med rotor med 72 brønde (katalognr eller ) Sterile mikrocentrifugeringsrør til klargøring af masterblandinger Sterile pipettespidser med aerosolbarriere Sprittusch Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrument med fluorescenskanaler for grøn og gul (påvisning af hhv. FAM og HEX) Rotor-Gene Q-software version Bemærk: therascreen KRAS Assay Package-softwaren kan kun fungere sammen med softwareversion (build 9). therascreen KRAS Assay Package CD version (katalognr ) Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes (Isætningsblok 72 x 0,1 ml rør), aluminiumsblok til manuel opsætning af reaktioner (katalognr ) Dedikerede pipetter* (justerbare) til prøveforberedelse Dedikerede pipetter* (justerbare) til klargøring af PCR-masterblanding Dedikerede pipetter* (justerbare) til dispensering af DNA-skabelon Thermomixer, opvarmet orbital inkubator, varmeblok eller vandbad, der kan inkubere ved 56 C og 90 C* Bordcentrifuge* med rotor til 1,5 ml rør Benchtop-vortexer* QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (katalognr , se DNA-ekstrahering, side 19) Xylen Ethanol ( %) * Sørg for, at instrumenterne er blevet kontrolleret og kalibreret i henhold til producentens anbefalinger før brug. Der må ikke bruges denatureret alkohol, som indeholder andre stoffer, som f.eks. metanol eller methylethylketon. 14 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

15 Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnostisk brug Til professionelt brug Sikkerhedsinformationer Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS'er). Disse er tilgængelige online i et praktisk og kompakt PDF-format på adressen hvor det er muligt at finde, få vist og udskrive SDS'et for hvert QIAGEN-kit og hver kitkomponenter. Generelle forholdsregler Denne test er beregnet til brug sammen med formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsprøver. Alle kemikalier og alt biologisk materiale er potentielt farligt. Prøver er potentielt farlige og skal håndteres som biologisk farlige materialer. Prøve- og analyseaffald skal bortskaffes i henhold til lokale sikkerhedsprocedurer. Reagenserne til therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er fortyndet optimalt. Fortynd ikke reagenserne yderligere, da dette kan resultere i tab af ydelse. Brug ikke reaktionsvolumener (reaktionsblanding plus prøve) på under 25 µl. Alle reagenser i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er formuleret specifikt til brug sammen med de test, der følger med therascreen KRAS RGQ PCRkittet. Alle reagenser, der leveres med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, er udelukkende beregnet til brug sammen med de øvrige reagenser i det samme therascreen KRAS RGQ PCR-kit. Reagenserne i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet må ikke udskiftes blandt therascreen KRAS RGQ PCR-kit, da dette kan påvirke ydelsen. Brug kun den Taq-DNA-polymerase (Taq), der findes i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Den må ikke udskiftes med Taq DNA-polymerase fra andre kit af den samme eller en anden type eller med Taq DNA-polymerase fra en anden leverandør. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

16 Se brugervejledningen til Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet for at få flere oplysninger om advarsler, forholdsregler og procedurer. Forældede eller forkert opbevarede komponenter må ikke bruges. Bemærk: Udvis ekstrem forsigtighed for at forhindre forurening af kontrollen og reaktionsblandingsreagenserne med de syntetiske materialer, der findes i det positive kontrolreagens. Bemærk: Brug individuelle, velegnede pipetter til indstilling af reaktionsblandinger og tilføjelse af kontrolreagenser. Bemærk: Udfør klargøring og dispensering af reaktionsblandinger i et område, der er adskilt fra det, der bruges af den positive kontrol. Bemærk: Rotor-Gene Q-instrumentet må ikke åbnes, før kørslen er afsluttet. Bemærk: Rotor-Gene Q-rør må ikke åbnes, efter kørslen er afsluttet. Bemærk: Der skal udvises forsigtighed for at sikre korrekte test af prøver, hvad angår forkert prøveangivelse, fejl ved isætning og pipetteringsfejl. Opbevaring og håndtering af reagenser therascreen KRAS RGQ PCR-kittet forsendes på tøris. Hvis nogle af komponenterne i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet ikke er frosne ved modtagelse, hvis den ydre emballage har været åbnet under transporten, eller hvis forsendelsen ikke indeholder en følgeseddel, denne håndbog eller reagenserne, skal der rettes henvendelse til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden, eller besøg therascreen KRAS RGQ PCR-kittet skal straks efter modtagelse opbevares ved -15 til -25 C i en fryser med konstant temperatur og beskyttes mod lys. Når det opbevares under de specifikke opbevaringsbetingelser, er therascreen KRAS RGQ PCR-kittet stabilt, indtil den anførte udløbsdato. Når de er åbnet, kan reagenser opbevares i deres originale emballage ved -15 til -25 C indtil udløbsdatoen, der er angivet på emballagen. Undgå gentagen optøning og indfrysning. Et reagens må højst indfryses og optøs 6 gange. Reagenserne skal optøs ved stuetemperatur i mindst 1 time og højst 4,5 timer. Når reagenserne er klar til brug, kan PCR-reaktionerne opsættes. Rotor- Gene Q-rør, der indeholder masterblandinger og DNA-prøve, kan sættes i Rotor-Gene Q-instrumentet med det samme. Når PCR-reaktionerne er klargjort, må den samlede tid før kørslen ikke overstige: 7 timer, hvis de opbevares ved stuetemperatur Bemærk: Dette tidsrum omfatter både PCR-opsætningen og opbevaringen. 16 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

17 18 timer, hvis de opbevares i køleskab (2-8 C) Bemærk: Dette tidsrum omfatter både PCR-opsætningen og opbevaringen. Bemærk: Scorpions (som det er tilfældet med alle fluorescensmærkede molekyler) i reaktionsblandingens reagenser er lysfølsomme. Beskyt kontrol- og reaktionsblandingsreagenser mod lys for at undgå fotoblegning. Reagenser i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet fortyndes optimalt, og der kræves ikke yderligere oprensning eller behandling før brug ved analyse, som anvist i håndbogen til therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Vær opmærksom på de udløbsdatoer og opbevaringsbetingelser, der er trykt på æsken og på etiketterne til samtlige komponenter. Forældede eller forkert opbevarede komponenter må ikke bruges. Prøveindsamling, klargøring til analyse og opbevaring therascreen KRAS RGQ PCR-kit er beregnet til brug på DNA-prøver, der ekstraheres fra formalinfikseret paraffinindstøbt (FFPE) tumorvæv, der er indsamlet fra patienter med kolorektalcancer (CRC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). Tumorer er heterogene med hensyn til både genotype og phenotype. Mutationspositive tumorer kan indeholde vildtype-dna og lignende histologi kan vise områder af ikke-tumorvæv. Alle vævsprøver skal håndteres som potentielt farlige. Sådan forberedes vævsprøver til DNA-ekstrahering (CRC) Ved hjælp af standardmaterialer og -metoder fikseres vævsprøven i 10 % neutralt bufret formalin (NBF) og indstøbes i paraffin. Ved hjælp af en mikrotom skal man skære 5 µm serielle sektioner fra paraffinblokken og montere dem på objektglas. En uddannet person (f.eks. en patolog) skal undersøge en hæmatoxilyn og eosin-farvet sektion for tumorindhold og områdebestemmelse. Markér det farvede objektglas for at adskille tumoren fra normalt væv. Brug serielle sektioner til DNA-ekstrahering. Brug sektioner med >20 % tumorindhold i et område til behandling uden makrodissektion (se nedenfor). For sektioner med <20 % tumorindhold i området skal én eller flere sektioner makrodissekeres. Bortskaf ikke-tumorvæv. For sektioner med <4 mm 2 i området skal to eller flere sektioner behandles for at øge det samle tumorområde til mindst 4 mm 2 (gælder for prøver både med og uden makrodissektion). Bortskaf ikke-tumorvæv. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

18 Skrab overskydende paraffin bort fra vævet med en ny, steril skalpel. Bemærk: Brug tørre skalpeller. Udfør ikke dette trin i laminar strømning eller stinkskab. Skrab tumorvævet bort fra sektionerne og ind i mærkede mikrocentrifugeringsrør med en ny skalpel for hver prøve. Sådan forberedes vævsprøver til DNA-ekstrahering (NSCLC) Ved hjælp af standardmaterialer og -metoder fikseres vævsprøven i 10 % neutralt bufret formalin (NBF) og indstøbes i paraffin. Ved hjælp af en mikrotom skal man skære 5 µm serielle sektioner fra paraffinblokken og montere dem på objektglas. En uddannet person (f.eks. en patolog) skal undersøge en Hæmatoxilyn og Eosin-farvet (H&E) sektion for tumorindhold. Brug serielle sektioner til DNAekstrahering. Skrab overskydende paraffin bort fra vævet med en ny, steril skalpel. Bemærk: Brug tørre skalpeller. Udfør ikke dette trin i laminar strømning eller stinkskab. Skrab tumorvævet bort fra sektionerne og ind i mærkede mikrocentrifugeringsrør med en ny skalpel for hver prøve. Opbevaringsforhold Mærk, håndter og opbevar tumorprøver, blokke, objektglas, prøver og mikrocentrifugeringsrør klar til ekstrahering på en kontrolleret måde i henhold til lokale procedurer. Opbevar FFPE-blokke og objektglas ved stuetemperatur. Objektglas kan opbevares ved stuetemperatur i op til 4 uger før DNA-ekstrahering. Genomisk DNA kan opbevares ved 2-8 C i en uge efter ekstrahering, derefter ved -15 til -25 C i op til 8 uger før brug. 18 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

19 Procedure DNA-ekstrahering (CRC-prøver) therascreen KRAS RGQ PCR-kittets ydelseskarakteristika blev genereret ved hjælp af DNA, der er ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet (katalognr ). Hvis QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet anvendes, skal DNAekstraheringen udføres i henhold til instruktionerne i håndbogen med følgende bemærkninger: Læs om klargøring af prøver før DNA-ekstrahering i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet må kun anvendes manuelt. Brug ikke RNase-trinnet, der er beskrevet i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Brug ikke QIAGEN-deparaffineringsopløsning. Brug kun xylen-/ethanolmetoden til deparaffinering som beskrevet i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Proteinase K-fordøjelse (trin 11 i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet)) skal udføres i en time. Prøverne skal elueres i 200 µl elutionsbuffer (ATE-buffer) fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kit. Opbevar genomisk DNA ved 2-8 C i en uge efter ekstrahering og derefter ved -15 til -25 C i op til 8 uger før brug. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

20 DNA-ekstrahering (NSCLC-prøver) therascreen KRAS RGQ PCR-kittets ydelseskarakteristika blev genereret ved hjælp af DNA, der er ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet (katalognr ). Hvis QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet anvendes, skal DNAekstraheringen udføres i henhold til instruktionerne i håndbogen med følgende bemærkninger: Læs om klargøring af prøver før DNA-ekstrahering i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Brug 2 x 5 µm sektioner pr. ekstrahering. QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet må kun anvendes manuelt. Brug ikke RNase-trinnet, der er beskrevet i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Brug ikke den QIAGEN-deparaffineringsopløsning, som følger med QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet. Brug kun xylen-/ethanol-metoden til deparaffinering som beskrevet i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Proteinase K-fordøjelse (trin 11 i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook (håndbog till QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet)) skal udføres i en time. Prøverne skal elueres i 60 µl elutionsbuffer (ATE) fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet og inkuberes i 2,5 minutter. Centrifuger ved fuld hastighed i 1 minut. Udfør endnu et elutionstrin med yderligere 60 µl elutionsbuffer (ATE) fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet, og inkuber i 2,5 minutter. Opbevar genomisk DNA ved 2-8 C i en uge efter ekstrahering og derefter ved -15 til -25 C i op til 8 uger før brug. 20 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

21 Protokol: DNA-prøvevurdering Denne protokol bruges til vurdering af det samlede DNA, der kan forstærkes, i prøver. Vigtige anvisninger før start Der kan bedømmes op til 24 prøver med Control Reaction Mix (CTRL) (Kontrolreaktionsblandingen). Brug Control Reaction Mix (CTRL) til at vurdere DNA'et før test. Bemærk: Det er vigtigt at anvende Control Reaction Mix (CTRL) som beskrevet nedenfor til denne vurdering i stedet for spektrofotometri eller andre alternative metoder. Stærkt nedbrudt DNA kan muligvis ikke forstærkes, selvom primerne genererer korte DNA-fragmenter. For effektiv brug af reagenserne i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, skal DNA-prøverne så vidt muligt samles for at oprette fulde kørsler. Hvis prøverne testes individuelt eller i mindre antal, opbruges flere reagenser, og det samlede antal prøver, der kan testes med et enkelt therascreen KRAS RGQ PCR-kit, reduceres. Taq-DNA-polymerasen (Taq) eller blandinger, der indeholder Taq-DNApolymerase, må ikke vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. Pipettér Taq-DNA-polymerasen ved forsigtigt at placere pipettens spids lige under væskens overflade, så spidsen ikke dækkes af overskydende enzym. Ting, der skal gøres før start Kontrollér, at therascreen KRAS Assay Package-softwaren er installeret, før Rotor-Gene Q-instrumentet anvendes første gang (se Appendiks: Installation af therascreen KRAS Assay Package, side 101). Før hver brug skal alle reagenser optøs helt i mindst en time ved stuetemperatur (15-25 C), blandes ved at vende dem 10 gange og centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. Kontrollér, at Taq DNA-polymerase (Taq) har stuetemperatur (15-25 C) inden hver brug. Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

22 Procedure 1. Optø Control Reaction Mix (CTRL) (Kontrolreaktionsblanding), nukleasefrit vand til ikke-skabelon-kontrol (NTC) og positiv kontrol for KRAS (PC) helt ved stuetemperatur (15-25 C) i mindst en time. Tiderne for optøning af reagenser, PCR-opsætning og opbevaring før start af kørsel er angivet i tabel 3. Bemærk: PCR-opsætning skal udføres ved stuetemperatur. Tabel 3. Optøningstid, PCR-opsætningstider og opbevaringstemperaturer Optøningstid Minimum Maksimum 1 time 4,5 timer Opbevaringstemperatur* efter PCR-opsætning Stuetemperatur (15-25 C) Maksimal tid for PCR-opsætning og opbevaring 7 timer 1 time 4,5 timer 2-8 C 18 timer * Begrebet Opbevaring henviser til tiden mellem fuldførelsen af PCR-opsætningen og starten af PCR-kørslen på Rotor-Gene Q-instrumentet. Bemærk: Bring Taq-DNA-polymerase (Taq) til stuetemperatur (15-25 C) ved samme tid som de andre reagenser (se Opbevaring og håndtering af reagenser, side 16). Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. 2. Bland de optøede reagenser ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokale saltkoncentrationer, og centrifuger derefter kort for at samle alt indhold i bunden af røret. 3. Forbered tilstrækkelige mængder masterblanding (kontrolreaktionsblanding [CTRL] samt Taq DNA-polymerase [Taq]) i henhold til volumenerne i tabel 4 for: alle DNA-prøverne 1 positiv kontrolreaktion (PC) for KRAS 1 nukleasefri vand til ikke-skabelon-kontrolreaktion (NTC) 1 ekstra prøve for at sikre tilstrækkelig ældning til PCR-opsætningen Masterblandingen indeholder alle de komponenter, der er nødvendige ved PCR, undtagen prøven. 22 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

23 Tabel 4. Forberedelse af kontrolmasterblanding Komponent Control Reaction Mix (CTRL) (Kontrolreaktionsblanding) Taq-DNA-polymerase (Taq) Volumen i alt Volumen 19,76 µl x (n+1)* 0,24 µl x (n+1)* 20 µl/reaktion * n = antallet af reaktioner (prøver plus kontroller). Forbered nok masterblanding til en ekstra prøve (n+1) for at sikre tilstrækkelig ældning til PCR-opsætningen. Værdien må ikke overstige 24 (plus kontroller), da 24 er det maksimale antal prøver, der er plads til i en kørsel. Bemærk: Når masterblandingen forberedes, tilsættes først den nødvendige volumen af Control Reaction Mix (CTRL) (Kontrolreaktionsblanding) til det relevante rør, og Taq-DNA-polymerasen (Taq) tilsættes til sidst. 4. Placer det passende antal PCR 4-båndrør (hvert bånd har fire rør) i isætningsblokken i overensstemmelse med visningen i tabel 5. Sæt ikke hætte på rørene. Bemærk: Lad hætterne blive i plastikbeholderen, til de skal bruges. Tabel 5. Kør layoutet i isætningsblokken til DNA-prøvevurdering Analyse Position (PC) (NTC) Kontrol Tallene angiver positioner i isætningsblokken og indikerer den endelige rotorposition. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

24 5. Indstil en pipette til en volumen, der er lavere end den samlede volumen af reaktionsmasterblandingen, og bland grundigt ved at aspirere helt op- og ned 10 gange. 6. Tilsæt straks 20 µl masterblanding til hvert PCR-båndrør. Bemærk: Se rørlayoutet i tabel 5. Til DNA-prøvevurdering skal analysemasterblandingen tilsættes til ét PC-rør, ét NTC-rør og ét rør for hver DNAprøve. 7. Tilsæt straks 5 µl nukleasefrit vand til ikke-skabelon-kontrol (NTC) til NTCrøret (rørposition 2), og sæt hætte på røret. 8. Tilsæt 5 µl af hver DNA-prøve til prøverørene (rørpositioner 3-26), og sæt hætter på rørene. 9. Tilsæt 5 µl positiv kontrol for KRAS (PC) til PC-røret (rørposition 1), og sæt hætte på røret. Hvert rør skal indeholde en samlet reaktionsvolumen på 25 µl (20 µl masterblandingen, der er forberedt i tabel 4 samt 5 µl NTC/prøve/PC). 10. Brug en sprittusch til at markere hætterne på de første rør i den laveste numeriske position i hvert PCR 4-båndrør (f.eks. positionerne 1, 5 og 9 osv.) for at vise, i hvilken retning rørene skal sættes i rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q-instrumentet. 11. Vend rørene med hætter på 4 gange for at blande prøven og reaktionsblandingen. 12. Placer alle PCR 4-båndrør i de korrekte positioner i rotoren med 72 brønde i overensstemmelse med kørselslayoutet (tabel 5) ved hjælp af retningsmærkerne. Bemærk: Hvis rotoren ikke er helt fyldt, skal alle tomme positioner på rotoren fyldes med et tomt rør med hætte på. Dette sikrer, at Rotor Gene Q- instrumentets termiske effektivitet opretholdes. 13. Sæt rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q-instrumentet. Kontrollér, at låseringen (leveres sammen med Rotor-Gene Q-instrumentet) er placeret oven på rotoren for at sikre rørene under kørslen. 14. Start Rotor-Gene Q-softwaren, og åbn samtidigt skabelonen ved at dobbeltklikke på ikonet therascreen KRAS QC Locked Template på skrivebordet på den computer, der er sluttet til Rotor-Gene Q-instrumentet (figur 1). 24 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

25 Figur 1. Ikonet therascreen KRAS QC Locked Template. 15. Fanen Setup (Opsætning) vises som standard (figur 2). Kontrollér, at låseringen er korrekt påsat, og markér afkrydsningsfeltet Locking Ring Attached (Låsering påsat). Luk låget på Rotor-Gene Q-instrumentet. Figur 2. Fanen Setup (Opsætning) og afkrydsningsfeltet Locking Ring Attached (Låsering påsat). 16. Angiv kørsels-id i dialogboksen Run ID (Kørsels-id) i overensstemmelse med den lokale navnekonvention. Angiv prøvenavnet i dialogboksen Sample Name (Prøvenavn) i overensstemmelse med den lokale navnekonvention, og tryk på returtasten. Dette føjer prøvenavnet til listen over prøven nedenfor og giver prøven et Sample ID (Prøve-id) (1, 2, 3 osv). Derudover opdateres panelet Layout of the pipetting adapter (Layout for den pipetterende adapter) i højre side til at omfatte prøvenavnet (figur 3). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

26 Bemærk: I panelet Layout of the pipetterende adapter (Layout for den pipetterende adapter) skal man kontrollere, at tilsætningen af prøvenavnet er fremhævet med en ændring af farven, og at prøvenavnet er i prøvepositionen (figur 3). Bemærk: Prøvenavne med mere end 8 tegn vises muligvis ikke helt i panelet Layout of the pipetting adapter (Layout for den pipetterende adapter). Figur 3. Angivelse af Run ID (Kørsels-id) og Sample Name (Prøvenavn). 17. Gentag trin 15 for at angive navnene på yderligere prøver (figur 4). Bemærk: For at redigere et prøvenavn skal man klikke på Sample Name (Prøvenavn) på listen over prøver og derefter vises den valgte prøve i dialogboksen Sample Name (Prøvenavn) ovenfor. Rediger prøvenavnet efter de lokale navnekonventioner, og tryk på returtasten for at opdatere navnet. 26 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

27 Figur 4. Angivelse af yderligere prøvenavne i dialogfeltet Sample Name (Prøvenavn). 18. Når alle prøvenavne er angivet, skal man bekræfte, at de er korrekte. Tilføj eventuelle yderligere oplysninger i dialogfeltet Notes (Bemærkninger), om nødvendigt, og klik derefter på Start Run (Start kørsel) (figur 5). Figur 5. Dialogfeltet Notes (Bemærkninger), knappen Start Run (Start kørsel) og Warning (Advarsel) for tomme positioner. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

28 Bemærk: Hvis nogle rotorpositioner er tomme, vises en Warning (Advarsel) (figur 5 og figur 6) for at minde brugeren om, at alle tomme positioner på rotoren skal udfyldes med et tomt rør med hætte. Kontrollér, at alle tomme rotorpositioner udfyldes med et tomt rør med hætte, og klik på OK for at fortsætte. Figur 6. Warning (Advarsel) for tomme positioner. 19. Vinduet Save As (Gem som) vises. Vælg et passende filnavn, og gem PCRkørslen som en *.rex-kørselsfil på den valgte placering. Klik på Save (Gem) (figur 7). Figur 7. Lagring af kørselsfilen. 28 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

29 20. PCR-kørslen starter. Bemærk: Når kørslen starter, åbnes fanen Run Progress (Kørselsstatus) automatisk for at vise temperatursporingen og den resterende kørselstid (figur 8). Figur 8. Fanen Run Progress (Kørselsstatus). 21. Når kørslen er afsluttet, åbnes fanen Analysis (Analyse) automatisk. Bemærk: Hvis fanen Analysis (Analyse) ikke åbnes, skal man klikke på fanen Analysis (figur 9). Bemærk: Der vises en forklaring på beregningsmetoden i afsnittet Fortolkning af resultater, side 44. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

30 Figur 9. Fanen Analysis (Analyse) og rapportering af resultater. 1 = fanen Analysis (Analyse), 2 = Sample QC Result Table (Resultattabel for prøve-qc). 22. Kontrolresultater rapporteres på følgende måde i Sample QC Result Table (Resultattabel for prøve-qc) (2 i figur 9). Kørselskontroller (PC og NTC, henholdsvis rørpositioner 1 og 2): Teksten Valid (Gyldig) vises, hvis resultaterne er inden for de acceptable områder. Ellers vises teksten Invalid (Ugyldig). Prøvekontrolanalyse CT <32,00: Teksten Invalid (Ugyldig) vises. Kvantiteten af DNA er ikke tilstrækkelig til mutationsanalyse. Test prøven igen. Hvis kvantiteten af DNA'et stadig er utilstrækkelig, skal der ekstraheres mere væv, hvis det er tilgængeligt (se Fejlfindingsvejledning, side 45). Prøvekontrolanalyse CT <21,92: Teksten Invalid (Ugyldig) vises. DNAkoncentrationen er for høj til mutationsanalyse. Fortynd med nukleasefrit vand til fortynding (Fort.), og test igen. Fortynd til en CT på 21,92-32,00. En 1:1-fortynding øger CT-værdien med ca. 1,0. Prøvekontrolreaktionens CT på 21,92-32,00 (21,92 kontrol- CT 32,00): Teksten Valid (Gyldig) vises og DNA-koncentrationen er egnet til mutationsanalyse. Bemærk: Hvis det er nødvendigt at ekstrahere prøven igen eller fortynde den, skal kontrolreaktionen gentages for at bekræfte, at DNA-koncentrationen er passende til brug. 30 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

31 23. Rapportfiler kan oprettes ved at klikke på Report (Rapport). Vinduet Report Browser (Rapportbrowser) vises. Vælg KRAS Analysis Report (KRAS-analyserapport) under Templates (Skabeloner), og klik derefter på Show (Vis) (figur 10). Bemærk: Rapporter kan gemmes på et alternativt sted i Web Archivesformat ved at klikke på knappen Save As (Gem som) i øverste venstre hjørne af hver rapport. Figur 10. Vælg KRAS Analysis Report (KRAS-analyserapport). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

32 Protokol: Påvisning af KRAS-mutationer Denne protokol er til påvisning af KRAS-mutationer. Vigtige anvisninger før start En prøve kan testes ved hjælp af KRAS-mutationsanalyserne, når den har bestået prøvevurderingen. For at udnytte therascreen KRAS RGQ PCR-kittet effektivt skal prøverne grupperes i batch af 7 (så rotoren med 72 brønde fyldes). Mindre batchstørrelser betyder, at der kan testes færre prøver med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Taq-DNA-polymerasen (Taq) eller blandinger, der indeholder Taq-DNApolymerase, må ikke vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. Pipettér Taq-DNA-polymerasen ved forsigtigt at placere pipettens spids lige under væskens overflade, så spidsen ikke dækkes af overskydende enzym. Ting, der skal gøres før start Før hver brug skal alle reagenser optøs i mindst 1 time ved stuetemperatur (15-25 C), blandes ved at vende dem 10 gange og centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. Kontrollér, at Taq DNA-polymerase (Taq) har stuetemperatur (15-25 C) inden hver brug. Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. Protokol 1. Optø alle rør med reaktionsblandingen, nukleasefrit vand til ikke-skabelonkontrol (NTC) og positiv kontrol for KRAS (PC) helt ved stuetemperatur (15-25 C) i mindst en time. Tiderne for optøning af reagenser, PCR-opsætning og opbevaring før start af kørsel er angivet i tabel 6. Bemærk: PCR-opsætning skal udføres ved stuetemperatur. 32 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

33 Tabel 6. Optøningstid, PCR-opsætningstider og opbevaringstemperaturer Optøningstid Minimum Maksimum 1 time 4,5 timer Opbevaringstemperatur* efter PCR-opsætning Stuetemperatur (15-25 C) Maksimal tid for PCR-opsætning og opbevaring 7 timer 1 time 4,5 timer 2-8 C 18 timer * Begrebet Opbevaring henviser til tiden mellem fuldførelsen af PCR-opsætningen og starten af PCR-kørslen på Rotor-Gene Q-instrumentet. Bemærk: Bring Taq-DNA-polymerase (Taq) til stuetemperatur (15-25 C) ved samme tid som de andre reagenser (se Opbevaring og håndtering af reagenser, side 16). Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. 2. Bland de optøede reagenser ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokaliserede saltkoncentrationer. Centrifugér kort for at samle alt indhold i bunden af røret. 3. Mærk 8 mikrocentrifugeringsrør (medfølger ikke) i overensstemmelse med hver tilsvarende reaktionsblanding, som vist i tabel 7. Forbered tilstrækkelige mængder masterblanding (kontrol- eller mutationsreaktionsblanding [CTRL, 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12CYS, 12SER, 12VAL eller 13ASP] samt Taq DNA-polymerase) til: alle DNA-prøverne 1 positiv kontrolreaktion (PC) for KRAS 1 nukleasefri vand til ikke-skabelon-kontrolreaktion (NTC) 1 ekstra prøve for at sikre tilstrækkelig ældning til PCR-opsætningen Masterblandingen indeholder alle de komponenter, der er nødvendige ved PCR, undtagen prøven. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

34 Tabel 7. Forberedelse af analysemasterblandinger Analyse Reaktionsblandingsrør Volumen af reaktionsblanding Volumen af Taq DNA-polymerase (Taq) Kontrol CTRL 19,76 µl x (n+1)* 0,24 µl x (n+1)* 12ALA 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ASP 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ARG 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12CYS 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12SER 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12VAL 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 13ASP 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) * n = antallet af reaktioner (prøver plus kontroller). Forbered nok masterblanding til en ekstra prøve (n+1) for at sikre tilstrækkelig ældning til PCR-opsætningen. Værdien må ikke overstige 24 (plus kontroller), da 24 er det maksimale antal prøver, der er plads til i en kørsel. Bemærk: Når masterblandingen forberedes, tilsættes først den nødvendige volumen af Control Reaction Mix (CTRL) (kontrolreaktionsblanding) eller Mutation Reaction Mix (mutationsreaktionsblanding) til det relevante rør, og Taq DNA-polymerasen (Taq) tilsættes til sidst. 4. Placer det passende antal PCR 4-båndrør (hvert bånd har 4 rør) i isætningsblokken i overensstemmelse med visningen i tabel 8. Sæt ikke hætte på rørene. Bemærk: Lad hætterne blive i plastikbeholderen, til de skal bruges. 34 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

35 Tabel 8. Kør layoutet i isætningsblokken til påvisning af KRAS-mutationer Kontroller Prøvenummer Analyse PC NTC CTRL 1* ALA ASP ARG CYS SER VAL ASP * Tallene angiver positioner i isætningsblokken og indikerer den endelige rotorposition. 5. Tilsæt straks 5 µl nukleasefrit vand for ikke-skabelon-kontrollen (NTC) til NTC-rørene (rørpositionerne 9-16), og sæt hætte på rørene. 6. Tilsæt 5 µl af hver DNA-prøve til prøverørene (rørpositioner 17-72), og sæt hætter på rørene. 7. Tilsæt 5 µl positiv kontrol for KRAS (PC) til PC-rørene (rørpositionerne 1-8), og sæt hætte på rørene. 8. Brug en sprittusch til at markere hætterne på de første rør i den laveste numeriske position i hvert PCR 4-båndrør (f.eks. positionerne 1, 5 og 9 osv.) for at vise, i hvilken retning rørene skal sættes i rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q-instrumentet. 9. Vend rørene med hætter på 4 gange for at blande prøven og reaktionsblandingen. 10. Placer alle PCR 4-båndrør i de korrekte positioner i rotoren med 72 brønde i overensstemmelse med kørselslayoutet (tabel 8) ved hjælp af retningsmærkerne. Bemærk: Der kan højst medtages 7 prøver i hver PCR-kørsel. Hvis rotoren ikke er helt fyldt, skal alle tomme positioner på rotoren fyldes med et tomt rør med hætte på. Dette sikrer, at Rotor Gene Q-instrumentets termiske effektivitet opretholdes. 11. Sæt rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q-instrumentet. Kontrollér, at låseringen (leveres sammen med Rotor-Gene Q-instrumentet) er placeret oven på rotoren for at sikre rørene under kørslen. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

36 12. Start Rotor-Gene Q-softwaren, og åbn samtidigt skabelonen ved at dobbeltklikke på ikonet therascreen KRAS Locked Template på skrivebordet på den computer, der er sluttet til Rotor-Gene Q-instrumentet (figur 11). Figur 11. Ikonet therascreen KRAS Locked Template. 13. Fanen Setup (Opsætning) vises som standard (figur 12). Kontrollér, at låseringen er korrekt påsat, og markér afkrydsningsfeltet Locking Ring Attached (Låsering påsat). Luk låget på Rotor-Gene Q-instrumentet. Figur 12. Fanen Setup (Opsætning) og afkrydsningsfeltet Locking Ring Attached (Låsering påsat). 14. Angiv kørsels-id i dialogboksen Run ID (Kørsels-id) i overensstemmelse med den lokale navnekonvention. 36 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

37 15. Angiv prøvenavnet i dialogboksen Sample Name (Prøvenavn) i overensstemmelse med den lokale navnekonvention, og tryk på returtasten. Dette føjer prøvenavnet til listen over prøven nedenfor og giver prøven et Sample ID (Prøve-id) (1, 2, 3 osv). Derudover opdateres panelet Layout of the pipetting adapter (Layout for den pipetterende adapter) i højre side til at omfatte prøvenavnet (figur 13). Bemærk: I panelet Layout of the pipetterende adapter (Layout for den pipetterende adapter) skal man kontrollere, at tilsætningen af prøvenavnet er fremhævet med en ændring af farven, og at alle otte prøver i kolonnen under prøvecirklen fremhæves (figur 13). Bemærk: Der kan højst tilføjes 7 prøver. Prøve-id'er (i prøvecirklerne) tildeles automatisk fra 1 til 7. Bemærk: Prøvenavne med mere end 8 tegn vises muligvis ikke helt i panelet Layout of the pipetting adapter (Layout for den pipetterende adapter). Figur 13. Angivelse af Run ID (Kørsels-id) og Sample Name (Prøvenavn). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

38 16. Gentag trin 14 for at angive navnene på yderligere prøver (figur 14). Bemærk: For at redigere et prøvenavn skal man klikke på Sample Name (Prøvenavn) på listen over prøver og derefter vises den valgte prøve i dialogboksen Sample Name (Prøvenavn) ovenfor. Rediger prøvenavnet efter de lokale navnekonventioner, og tryk på returtasten for at opdatere navnet. Figur 14. Angivelse af yderligere prøvenavne i dialogfeltet Sample Name (Prøvenavn). 38 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

39 17. Når alle prøvenavne er angivet, skal man bekræfte, at de er korrekte. Tilføj eventuelle yderligere oplysninger i dialogfeltet Notes (Bemærkninger), om nødvendigt, og klik derefter på knappen Start Run (Start kørsel) (figur 15). Bemærk: Hvis nogle rotorpositioner er tomme, vises en Warning (Advarsel) (figur 15 og figur 16) for at minde brugeren om, at alle tomme positioner på rotoren skal udfyldes med et tomt rør med hætte. Kontrollér, at alle tomme rotorpositioner udfyldes med et tomt rør med hætte, og klik på OK for at fortsætte. Figur 15. Dialogfeltet Notes (Bemærkninger), knappen Start Run (Start kørsel) og Warning (Advarsel) for tomme positioner. Figur 16. Warning (Advarsel) for tomme positioner. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

40 18. Vinduet Save As (Gem som) vises. Vælg et passende filnavn, og gem PCR-kørslen som en *.rex-kørselsfil på den valgte placering (figur 17). Figur 17. Lagring af kørselsfilen. 40 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

41 19. PCR-kørslen starter. Bemærk: Når kørslen starter, åbnes fanen Run Progress (Kørselsstatus) automatisk for at vise temperatursporingen og den resterende kørselstid (figur 18). Figur = Fanen Run Progress (Kørselsstatus). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

42 20. Når kørslen er afsluttet, åbnes fanen Analysis (Analyse) automatisk. Bemærk: Hvis fanen Analysis (Analyse) ikke åbnes, skal man klikke på fanen Analysis (figur 19). Bemærk: Der vises en forklaring på beregningsmetoden i afsnittet Fortolkning af resultater, side 44. Figur 19. Fanen Analysis (Analyse) og rapportering af resultater. 21. Analyseresultater rapporteres på følgende måde (figur 19): Panelet Run Controls, Positive Control (Kørselskontroller, positiv kontrol): Hvis resultaterne er inden for et acceptabelt område, viser Positive Control Status (Positiv kontrolstatus) Valid (Gyldigt), ellers vises resultatet som Invalid (Ugyldigt). Panelet Run Controls, Negative Control (Kørselskontroller, negativ kontrol): Hvis resultaterne for både NTC og Internal Control (Intern kontrol) er inden for acceptable områder, viser Negative Control Status (Negativ kontrolstatus) Valid (Gyldigt), ellers vises resultatet som Invalid (Ugyldigt). Panelet Sample Result Table (Tabel over prøveresultat): Der rapporteres specifikke mutationer for mutationspositive prøver under kolonnen KRAS Mutation Status (KRAS-mutationsstatus). 42 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

43 22. Rapportfiler kan oprettes ved at klikke på Report (Rapport). Vinduet Report Browser (Rapportbrowser) vises. Vælg KRAS Analysis Report (KRAS-analyserapport) under Templates (Skabeloner), og klik derefter på Show (Vis) (figur 20). Bemærk: Rapporter kan gemmes på et alternativt sted i Web Archivesformat ved at klikke på Save As (Gem som) i øverste venstre hjørne af hver rapport. Figur 20. Vælg KRAS Analysis Report (KRAS-analyserapport). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

44 Fortolkning af resultater Analyse- og mutationsbestemmelser udføres automatisk af therascreen KRAS Assay Package, når en kørsel er afsluttet. De følgende oplysninger forklarer, hvordan therascreen KRAS Assay Package udfører analyse- og mutationsbestemmelserne. PCR-cyklussen, hvor fluorescensen fra en bestemt reaktion overskrider den foruddefinerede tærskelværdi, defineres som CT-værdien. CT-værdier angiver kvantiteten af bestemt input-dna. Lave CT-værdier angiver højere input-dnaniveauer, og høje CT-værdier angiver lavere input-dna-værdier. Reaktioner med en CT-værdi klassificeres som positiv forstærkning. Rotor-Gene Q-softwaren interpolerer fluorescenssignaler mellem to registrerede værdier. CT-værdierne kan derfor været et reelt tal (ikke begrænset til heltal) inden for området 0 til 40. For therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er tærskelværdien indstillet til 0,05 relative fluorescensenheder. Denne værdi konfigureres i therascreen KRAS Assay Package for både fluorescenskanalerne for grøn og gul. Tærskelværdien blev defineret under udviklingen af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Der udføres en beregning for at bestemme CT-værdien ved hjælp af ligningen: CT = [mutationsanalyse CT-værdi] [kontrolanalyse CT-værdi] Kørselskontrollerne (positiv kontrol, NTC og interne kontroller) vurderes for at sikre, at acceptable CT-værdier opfyldes, og at reaktionerne fungerer korrekt. Prøvens CT-værdier beregnes som forskellen mellem mutationsanalysens CT og kontrolanalysens CT fra den samme prøve. Prøverne klassificeres som mutationspositive, hvis de giver en CT-værdi, der er mindre end eller lig med cut-off- CTværdien for den pågældende analyse. Over denne værdi indeholder prøven enten mindre end den mutationsprocentdel, der kan påvises af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (ud over analysens grænser), eller også er prøven mutationsnegativ, hvilket rapporteres som No Mutation Detected (Ingen mutation påvist). Ingen forstærkning i mutationsreaktioner klassificeres som No Mutation Detected (Ingen mutation påvist). CT-værdier, der er beregnet fra baggrundsforstærkning, forventes at være højere end cut-off- CT-værdierne, og prøven klassificeres som No Mutation Detected (Ingen mutation påvist). Analyseresultaterne vises som Mutation Positive (Mutationspositiv), No Mutation Detected (Ingen mutation påvist), Invalid (Ugyldigt), eller hvis 44 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

45 en kørselskontrol mislykkes, Run Control Failed (Kørselskontrol mislykkedes). For de mutationspositive prøver rapporteres de specifikke mutationer. Andre mulige resultater, der kan vises, beskrives i afsnittene Protokol: DNA-prøvevurdering, Protokol: Påvisning af KRAS-mutationer og Fejlfindingsvejledning i denne håndbog. En tumor kan i sjældne tilfælde indeholde mere end én mutation. I sådanne tilfælde identificeres den mutation, der giver den laveste CT-værdi. Fejlfindingsvejledning Denne fejlfindingsvejledning kan være nyttig til at afhjælpe eventuelle problemer. For yderligere information henvises også til siden Frequently Asked Questions (Hyppigt stillede spørgsmål) hos vores Technical Support Center: Derudover svarer personalet fra QIAGENs tekniske service gerne på spørgsmål vedrørende enten informationen og protokollerne i denne håndbog eller prøve- og analyseteknologier (kontaktinformation: se bagsiden, eller besøg Ugyldige resultater a) Opbevaringsbetingelserne for en eller flere kitkomponenter var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet Opbevaring og håndtering af reagenser (side 16) b) therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er for gammelt Kommentarer og forslag Kontrollér opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen for reagenserne (se kittets etiket), og brug evt. et nyt kit. Kontrollér opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen for reagenserne (se kittets etiket), og brug evt. et nyt kit. NTC-prøver viser positive resultater i FAM-kanalen Der opstod kontaminering under klargøringen af PCR'en Gentag PCR'en med nye reagenser. Hvis det er muligt, skal PCR-rørene lukkes straks efter tilsætning af den prøve, der skal testes. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne dekontamineres regelmæssigt. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

46 Flag genereret af therascreen KRAS Assay Package Tabel 9 viser de mulige flag, der kan genereres af therascreen KRAS Assay Package, deres betydning og de handlinger, der skal foretages. Tabel 9. therascreen KRAS Assay Package-flag Flag Betydning Handling, der skal foretages PC_CTRL_ASSAY _FAIL PCR-kørsel ugyldig FAM-CT uden for området for positiv kontrol i kontrolreaktion. Gentag hele PCR-kørslen. PC_MUTATION _ASSAY_FAIL PC_CTRL _INVALID_DATA PC_MUTATION _INVALID_DATA NTC_INT_CTRL _FAIL NTC_INT_CTRL _EARLY_CT NTC_INVALID _CT PCR-kørsel ugyldig FAM-CT uden for området for én eller flere mutationskontrolreaktioner. PCR-kørsel ugyldig fluorescensdata i positiv kontrol (Control Reaction Mix) kan ikke fortolkes. PCR-kørsel ugyldig fluorescensdata i positiv kontrol (mutationsreaktionsblan ding) kan ikke fortolkes. PCR-kørsel ugyldig intern kontrol over området for negativ kontrol. PCR-kørsel ugyldig intern kontrol er under området for negativ kontrol. PCR-kørsel ugyldig FAM ugyldig (mindre end grænsen) for negativ kontrol. Gentag hele PCR-kørslen. Gentag hele PCR-kørslen. Gentag hele PCR-kørslen. Gentag hele PCR-kørslen. Gentag hele PCR-kørslen. Gentag hele PCR-kørslen. 46 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

47 Flag Betydning Handling, der skal foretages NTC_INVALID _DATA PCR-kørsel ugyldig fluorescensdata i negativ kontrol kan ikke fortolkes. Gentag hele PCR-kørslen. SAMPLE_CTRL _INVALID_DATA SAMPLE_CTRL _HIGH_CONC SAMPLE_CTRL _LOW_CONC SAMPLE_CTRL _FAIL Prøve ugyldig fluorescensdata i prøvekontrol kan ikke fortolkes. Prøve ugyldig FAM-CT for lav i prøvekontrol. Lav koncentration i prøvekontrol (advarsel, ikke fejl). Prøve ugyldig FAM-CT for høj i prøvekontrolreaktion. Sæt ny PCR-kørsel op for at gentage de(n) relevante prøve(r). Fortynd prøven for at øge kontrollens CT-værdien. Denne fortynding skal beregnes på en forudsætning om, at fortynding 1:1 med det vand, der leveres sammen med kittet, vil øge CT-værdien med 1,0; når prøven er fortyndet, skal en ny PCR-kørsel sættes op for at gentage prøven. Ingen. Sæt en ny PCR-kørsel op for at gentage prøven. Hvis den er ugyldig ved en gentagen PCR-kørsel, skal prøven ekstraheres fra et nyt FFPEpræparat. Sæt en ny PCRkørsel op for at teste en ny ekstrahering. Hvis den er ugyldig, skal denne sekundære ekstrahering testes igen. Hvis prøven ikke giver et gyldigt resultat efter denne kørsel, får prøven en ubestemt mutationsstatus, og der skal ikke udføres yderligere test. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

48 Flag Betydning Handling, der skal foretages SAMPLE_INT _CTRL_FAIL CT for høj (eller ingen CT) til intern kontrol (HEX), FAM-kanal er mutationsnegativ. Hvis prøven får gyldig status Ingen handling. CRC-prøver: Hvis prøven får ugyldig status, skal en ny PCR-kørsel sættes op for at gentage prøven. Hvis den er ugyldig ved en gentagen PCR-kørsel, skal prøven ekstraheres fra et nyt FFPEpræparat. Sæt en ny PCRkørsel op for at teste en ny ekstrahering. Hvis den er ugyldig, skal denne sekundære ekstrahering testes igen. Hvis prøven ikke giver et gyldigt resultat efter denne kørsel, får prøven en ubestemt mutationsstatus, og der skal ikke udføres yderligere test. 48 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

49 Flag Betydning Handling, der skal foretages SAMPLE_INT _CTRL_FAIL (fortsat) NSCLC-prøver: Hvis prøven får ugyldig status, fortyndes den resterende prøve 1 til 7 med vand fra røret med mærket DIL. Den endelige volumen skal være større end 40 µl (f.eks. 10 µl DNA og 70 µl vand fra røret med mærket DIL). En ny PCRkørsel skal opsættes for at gentage prøven. Hvis den er ugyldig ved den gentagne PCR-kørsel, skal prøven ekstraheres fra nye FFPEpræparater. Sæt en ny PCRkørsel op for at teste en ny ekstrahering. Hvis den er ugyldig, fortyndes den resterende prøve 1 til 7 med vand fra røret med mærket DIL. Den endelige volumen skal være større end 40 µl, og fortyndelsen skal testes. Hvis prøven ikke giver et gyldigt resultat efter denne kørsel, får prøven en ubestemt mutationsstatus, og der skal ikke udføres yderligere test. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

50 Flag Betydning Handling, der skal foretages SAMPLE_INT _CTRL_EARLY_CT Mutationsrør er ugyldigt CT HEX for lav til prøve (intern kontrol). Hvis prøven får gyldig status Ingen handling. Hvis prøven får ugyldig status, skal en ny PCR-kørsel sættes op for at gentage prøven. Hvis den er ugyldig ved en gentagen PCR-kørsel, skal prøven ekstraheres fra et nyt FFPE-præparat. Sæt en ny PCR-kørsel op for at teste en ny ekstrahering. Hvis den er ugyldig, skal denne sekundære ekstrahering testes igen. Hvis prøven ikke giver et gyldigt resultat efter denne kørsel, får prøven en ubestemt mutationsstatus, og der skal ikke udføres yderligere test. 50 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

51 Flag Betydning Handling, der skal foretages SAMPLE_INVALID _DATA Mutationsrør er ugyldigt fluorescensdata i intern kontrol kan ikke fortolkes. Hvis prøven får gyldig status Ingen handling. Hvis prøven får ugyldig status, skal en ny PCR-kørsel sættes op for at gentage prøven. Hvis den er ugyldig ved en gentagen PCR-kørsel, skal prøven ekstraheres fra et nyt FFPE-præparat. Sæt en ny PCR-kørsel op for at teste en ny ekstrahering. Hvis den er ugyldig, skal denne sekundære ekstrahering testes igen. Hvis prøven ikke giver et gyldigt resultat efter denne kørsel, får prøven en ubestemt mutationsstatus, og der skal ikke udføres yderligere test. MUTATION _EARLY_CT Mutationsrør er ugyldigt CT FAM for lav til prøve. Hvis prøven får gyldig status Ingen handling. Hvis prøven får ugyldig status, skal en ny PCR-kørsel sættes op for at gentage prøven. Hvis den er ugyldig ved en gentagen PCR-kørsel, skal prøven ekstraheres fra et nyt FFPE-præparat. Sæt en ny PCR-kørsel op for at teste en ny ekstrahering. Hvis den er ugyldig, skal denne sekundære ekstrahering testes igen. Hvis prøven ikke giver et gyldigt resultat efter denne kørsel, får prøven en ubestemt mutationsstatus, og der skal ikke udføres yderligere test. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

52 Flag Betydning Handling, der skal foretages SAMPLE _POSITIVE_AND _INVALID Én eller flere mutationer til en prøve er gyldige og positive, samtidig er én eller flere mutationer til den samme prøve ugyldige (advarsel, ikke en fejl). Ingen. Kvalitetskontrol I overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede kvalitetsstyringssystem testes hvert lot af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet efter fastlagte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. Begrænsninger Denne test er udviklet til at påvise 7 mutationer i codon 12 og 13 i KRAS-genet. Prøver med resultater som No Mutation Detected (Ingen mutation påvist) kan indeholde KRAS-mutationer, der ikke påvises af analysen (f.eks. 13CYS). Påvisning af mutationer afhænger af prøvens integritet og mængden af amplificerbart DNA, der findes i prøven. Proceduren skal gentages, hvis den første vurdering af DNA i prøven angiver, at mængden enten ikke er tilstrækkelig eller er for høj til mutationsanalyse. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet anvendes i en polymerasekædereaktion (PCR). Som med alle PCR-procedurer kan prøver være kontaminerede med eksterne kilder til DNA i testmiljøet og DNA'et i den positive kontrol. Udvis forsigtighed for at undgå kontaminering af prøver og reaktionsblandingsreagenser. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet må ikke anvendes til diagnosticering af sygdomme. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er kun beregnet til at skelne mellem vildtypeog mutant-dna. Testen er udviklet således, at hver mutantreaktion er mest følsom over for den specifikke mutation, der måles. I prøver, hvor en mutation påvises, kan der opstå krydsreaktivitet med andre mutationsreaktioner. Hvis mere end én mutantreaktion er positiv, er resultatet den reaktion med det laveste CT-resultat. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er kun godkendt til formalinfikseret, paraffinindstøbt kolorektalcancervæv og ikke-småcellet lungecancervæv. 52 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

53 therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er kun godkendt til brug sammen med QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet. Kun Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM- eller Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrumenterne er godkendt til brug sammen med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Forventede resultater therascreen KRAS RGQ PCR-kittet indeholder en kvalitativ angivelse af tilstedeværelsen af syv mutationer i codon 12 og 13 i KRAS-onkogenet. Analyseresultaterne vises som Mutation Positive (Mutationspositiv), No Mutation Detected (Ingen mutation påvist), Invalid (Ugyldigt) for hver mutation eller, hvis der er en mislykket analysekontrol, Run Control Failed (Kørselskontrol mislykkedes). Hvis resultatet Mutation Positive (Mutationspositiv) vises, vises den specifikke påviste KRAS-mutation også. Ydelseskarakteristika (CRC) Analytisk ydeevne De specifikke ydelseskarakteristika i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet blev bestemt af undersøgelser med formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) vævsprøver, der er indsamlet fra patienter med kolorektalcancer (CRC) og 8 formalinfikserede, paraffinindstøbte humane cellelinjer (FFPE-cellelinjer), hvoraf 7 indeholder kendte KRAS-mutationer, der er påvist af analysen, og én KRAS-vildtype (dvs. ingen mutationer i codon 12 og 13). Mutationsstatus for prøverne blev bekræftet af bidirektional Sanger-sekventering. Cut-off 220 FFPE-prøver blev testet med en metode, der fulgte vejledningen i CLSI EP17-A (2004) (27), for at fastlægge cut-offs for analysen. Kontrolreaktionens CT-område blev fastlagt til 21,92 til 32,00. Cut-off-værdierne, som er baseret på CT i den kontrolreaktion, der er trukket fra CT i mutantreaktionerne ( CT), er vist i tabel 10. Tabel 10. Fastlagte cut-off-værdier for hver mutationsanalyse Mutationsanalyse 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Cut-off ( CT) 8,0 6,6 8,0 8,0 8,0 7,5 7,5 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

54 Tomgrænse For at vurdere ydelsen i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet i mangel af en mutantpositiv skabelon og for at sikre, at en tom prøve ikke genererer et analytisk signal, der kan indikere en lav koncentration af mutation, blev prøverne uden skabelon evalueret. Resultaterne viste ingen påviselig kontroleller mutant-ct-værdier i nogen af mutations- eller kontrolreaktionsrørene (den interne kontrols CT-værdier var alle gyldige). Sammenligning med den analytiske referencemetode Der blev udført to undersøgelser for at påvise overensstemmelsen i mutationsstatus for CRC-prøver, der er testet med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet i forhold til bidirektional sekventering. I den første undersøgelse blev 350 tumorprøver fra CRC-patienter valgt baseret på et sæt baseline-kliniske og demografiske egenskaber i tumorprøven. Ved hjælp af en statistisk stikprøveteknik blev 150 prøver med ukendt mutationsstatus valgt til evaluering. Disse (150) FFPEprøver blev testet og efterfølgende analyseret i denne undersøgelse ved hjælp af statistiske metoder med overensstemmelse/uoverensstemmelse fra vejledningen i CLSI EP12-A2 (2008) (28). I alt 137 af FFPE-prøverne viste gyldige resultater for både therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og bidirektional sekventering. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet rapporterede om 2 negative prøver. Bidirektional sekventering angiver, at én prøve er positiv for 12ASP, og at den anden er positiv for 13ASP. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet rapporterede til gengæld, at 3 prøver indeholdt KRAS-mutation, men blev ikke rapporterede som postive ved bidirektional sekventering. Derudover blev én prøve, som blev identificeret som 12ARG af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, bestemt til at være 12ASP ved bidirektional sekventering. 5 prøver, som blev bestemt til at være mutationsnegative ved bidirektional sekventering, blev enten fundet ubestemmelige (3 prøver) eller ugyldige (2 prøver) af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (data ikke vist). Én prøve, der blev fundet ubestemt ved Sangerbidirektional sekventering, blev bestemt til at være 12SER af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (data ikke vist). Tabel 11 viser analysen af overensstemmelse mellem therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og bidirektional sekventering. 54 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

55 Tabel 11. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet i forhold til Sanger-bidirektional sekventering Mutationsbestemmelse med bidirektional sekventering Neg 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 1 Negativ 80 1 Positiv 12ALA Positiv 12ARG Positiv 12ASP Positiv 12CYS Positiv 12SER Positiv 12VAL I alt KRAS-kit-bestemmelse Positiv 13ASP 1 I alt Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

56 Resultaterne i tabel 11 viser en positiv overensstemmelse i procent (PPA) på 96,3 %, en negativ overensstemmelse i procent (NPA) på 96,3 % og en samlet overensstemmelse i procent (OPA) på 96,4 %. De samlede resultater, med undtagelse af 6 mislykkede Sanger-prøver, vises i tabel 12 nedenfor. Tabel 12. Analyse af overensstemmelse Måling af overensstemmelse Hyppighed (%) 95 % konfidensinterval (CI) Overordnet procentdel af overensstemmelse 132/137 (96,35) 92,69-98,21 Procentdel af positiv overensstemmelse 52/54 (96,30) 89,41-98,77 Procentdel af negativ overensstemmelse 80/83 (96,39) 91,30-98,55 Et sekundært unikt sæt prøver blev evalueret for at supplere dataene fra den første undersøgelse. Et sæt med 271 CRC FFPE-prøver blev udtaget; 250 af ukendt mutationsstatus og 21 prøver af kendt mutationsstatus til at berige med sjældne mutationer blev sammenlignet med Sanger-bidirektional sekventering som beskrevet ovenfor. I alt 13 (ca. 5 %) prøver krævede makrodissektion for therascreen KRAS RGQ PCR-kittes evaluering. Ud af de 271 prøver med bidirektionale sekventeringsresultater blev 24 af prøverne fundet ubestemte af therascreen KRAS RGQ PCRkittet (mislykket kontrol CT-område; data ikke vist). Overensstemmelsesanalyse blev udført på 247 prøver med gyldige bidirektionale og therascreen KRAS RGQ PCR-kit-resultater. Der var 9 afvigende prøver. Én ud af 247 prøver havde et mutationspositivt resultat med bidirektional sekventering men resultatet No Mutation Detected (Ingen mutation påvist) med therascreen KRAS RGQ PCRkittet, og 8 prøver viste sig at have et positivt resultat med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet men et negativt resultat med bidirektional sekventering. I alt var overensstemmelsen 96,4 %. Dataene understøtter den nøjagtige ydeevne i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (se tabel 13 og tabel 14). Tabel 13. Analyse af overensstemmelse (sekundær undersøgelse) Måling af overensstemmelse Hyppighed (%) 95 % konfidensinterval (CI) Overordnet procentdel af overensstemmelse 238/247 (96,36) 93,73-98,09 Procentdel af positiv overensstemmelse 106/107 (99,07) 95,64-99,95 Procentdel af negativ overensstemmelse 132/140 (94,29) 89,93-97,13 56 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

57 Tabel 14. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet i forhold til Sanger-bidirektional sekventering (sekundær undersøgelse) Mutationsbestemmelse med bidirektional sekventering Neg 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP I alt Negativ Positiv 12ALA Positiv 12ARG Positiv 12ASP Positiv 12CYS Positiv 12SER KRAS-kit-bestemmelse Positiv 12VAL Positiv 13ASP I alt Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

58 Påvisningsgrænse (LOD) Arbejdsområdet for therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er baseret på mængden af amplificerbart DNA i prøven, som bestemt af kontrolreaktionens CT-værdi. Det angivne input-område for analysen er defineret af det prædefinerede område for kontrollens CT på 21,92 til 32,00. LOD er den laveste procentdel af mutant- DNA, der kan påvises på en baggrund af vildtype, når det samlede amplificerbare DNA er inden for det angivne input-område og stadig under tærsklens cut-off- CT-værdi. Der blev gennemført en undersøgelse for at fastlægge påvisningsgrænsen (LOD) for hver af de 7 mutationsspecifikke reaktioner, der er indeholdt i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. For therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er grænsen for påvisning af mutant-dna på baggrund af vildtype-dna angivet som den laveste fortyndingsfaktor, hvorved 95 % af testreplikater for hver mutationspositive prøve blev bestemt til at være positiv. Otte FFPE-cellelinjer; 7 med kendt mutant-dna-indhold og én vildtype, blev brugt til denne evaluering. Denne fordeling af mutant i samlet amplificerbart DNA (mutant-dna i procent) blev tidligere bestemt ved hjælp af en bidirektional Sanger-sekventeringsmetode fra ufikserede celler, efterfulgt af relativ spidsanalyse. Hvis der er 3 cellelinjer, var mutantindholdet 100 % (dvs. cellelinje-dna'et var homozygotisk mutant). De andre cellelinjer var af blandet zygositet. Der blev pooled flere DNA-ekstraheringer fra hver prøve for at generere DNA-lagre. DNA-lagrene blev derefter normaliseret til at opnå målet for kontrolreaktionens CT-værdier. Normaliserede mutant-dna-ekstrakter blev fortyndet med normaliseret vildtype-dna-ekstrakt til at oprette fortyndingsserier af ekstrakter, der indeholder det samme niveau af samlet amplificerbart DNA, men forskellige niveauer af mutant-dna. Serielle fortyndinger blev derefter genereret fra disse prøver og kørt i flere replikater. 58 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

59 Den første fortyndingsserie blev oprettet for kontrolreaktionens CT-værdi i midterområdet (ca. 26). I alt 9 replikater pr. fortynding blev testet. Procentdelen af korrekte bestemmelser som en funktion af fortyndingen for hver mutantreaktion vises i tabel 15. Fremhævede værdier angiver den procentdel, hvor over 95 % af replikaterne viste korrekte bestemmelser. Tabel 15. Procentdel af korrekte bestemmelser % mutationsfortynding Analyse % af korrekte bestemmelser 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 0,78 100* 0 33,3 55,6 22,2 66,7 0 1, ,3 100* 100* 88,9 100* 0 3, , * ,7 6, * * 12, , , * Mere end 95 % af replikaterne gav korrekte bestemmelser. Mutationsfortyndingen for denne prøve var 40,0 %. Resultaterne af den første fortyndingsserie blev brugt til at generere fortyndinger til bekræftelse af LOD-værdier ved hjælp af mere snævre, reaktionsspecifikke områder for mutationsfortyndinger i procent ved både lave og høje niveauer inden for inputområdet for analysen. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

60 I alt 12 replikater blev hver evalueret for den høje fortyndingsserie. Procentdelen af korrekte bestemmelser som en funktion af fortyndingen for den høje fortyndingsserie (målværdier ca. CT 23-24) vises i tabel 16. Fremhævede værdier angiver den procentdel, hvor over 95 % af replikaterne viste korrekte bestemmelser. Tabel 16. Procentdel af korrekte bestemmelser (høj) Analyse % mutationsfortynding (høj) 12ALA 0,13 0,27 0,54 1,08 2,15 4,30 % korrekte bestemmelser ,7 100* ASP 0,56 1,13 2,25 4,50 9,00 18,00 % korrekte bestemmelser 0 8,3 33,3 83,3 100* ARG 0,16 0,33 0,65 1,30 2,60 5,20 % korrekte bestemmelser 0 0 8,3 100* CYS 0,12 0,24 0,49 0,98 1,95 3,90 % korrekte bestemmelser 0 0 8,3 83,3 100* SER 0,31 0,63 1,25 2,50 5,00 10,00 % korrekte bestemmelser ,3 66,7 100* VAL 0,17 0,34 0,69 1,38 2,75 5,50 % korrekte bestemmelser ,7 100* ASP 0,63 1,25 2,50 5,0 10,0 20,0 % korrekte bestemmelser * * Mere end 95 % af replikaterne gav korrekte bestemmelser. 11 gyldige replikater. 60 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

61 For den lave serie blev der brugt 24 replikater pr. fortynding, medmindre andet er angivet. Procentdelen af korrekte bestemmelser som en funktion af fortyndingen for den lave fortyndingsserie (mål ca. CT-værdi 31) vises i tabel 17. Fremhævede værdier angiver den procentdel, hvor over 95 % af replikaterne viste korrekte bestemmelser. Tabel 17. Procentdel af korrekte bestemmelser (lav) Analyse % mutationsfortynding (lav) 12ALA 0,27 0,54 1,08 2,15 4,30 8,60 12,90 % korrekte bestemmelser 12,5 20,8 33,3 83,3 100* ASP 0,56 1,13 2,25 4,50 9,0 18,0 27,0 % korrekte bestemmelser 0 16,7 29,2 58,3 100* ARG 0,33 0,65 1,30 2,60 5,20 10,4 15,6 % korrekte bestemmelser 8,3 4,2 29,2 52,2 95,8* CYS 0,24 0,49 0,98 1,95 3,90 7,80 11,7 % korrekte bestemmelser 8,3 4,2 20,9 54,2 83,3 100* SER 0,63 1,25 2,50 5,0 10,0 20,0 30,0 % korrekte bestemmelser 0 0 8,3 33,3 70,9 83,3 100* 12VAL 0,34 0,69 1,38 2,75 5,50 11,00 16,50 % korrekte bestemmelser 4,3 16,7 46,7 75,0 100* ASP 0,63 1,25 2,5 5,0 10,0 20,0 30,0 % korrekte bestemmelser 0 4,2 8,3 33,3 70,8 100* 100 * Mere end 95 % af replikaterne gav korrekte bestemmelser. Ved 2,60 fortynding af 12ARG var antallet af gyldige replikater 23. Antallet af gyldige replikater i 12VAL-serien var 23, 24, 15, 16, 13, 12 og 19. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

62 Der blev anvendt logistiske regressionsmodeller til hver analyse for de lave og høje input-dna-datasæt. I disse modeller var responsvariablen det binære output af påvist mutation (påvist = 1) og ikke påvist mutation (påvist = 0), den kontinuerlige forklarende variabel var log2 % mutationsfortynding. LOD'erne blev beregnet som mutationsfortynding i procent, hvilket gav en sandsynlighed for påvisning på 0,95. LOD'erne, som er bestemt fra fortyndingsserien og begynder med enten de lave eller høje CT-værdier, vises i tabel 18. Tabel 18. Logistiske regressionsdata til lave og høje CT-fortyndingsserier Analyse Lav Høj 12ALA 4,25 0,56 12ASP 10,23 6,43 12ARG 7,27 0,87 12CYS 6,90 1,21 12SER 25,75 4,20 12VAL 5,17 0,90 13ASP 18,83 4,16 De endelige LOD-værdier fra FFPE-cellelinjer, når input-ct-værdien er mellem ca. 22 og 27 CT, er vist i tabel 19 nedenfor. I den lave ende af CT-inputområdet falder følsomheden i analysen, da mængden af input-dna muligvis ikke indeholder tilstrækkelige kopier til at understøtte det samme procentforhold af vildtype til mutant-dna, der er observeret inden for de høje og midterste punkter i arbejdsområdet. 62 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

63 Tabel 19. LOD-værdier for hver mutationsanalyse ved hjælp af FFPE-cellelinjer Analyse LOD C95 (procentdel af mutant-dna i vildtype-dna) 12ALA 0,8 12ARG 2,6 12ASP 6,4 12CYS 1,5 12SER 5,6 12VAL 1,6 13ASP 6,4 DNA-input og linearitet Effekten af DNA-inputniveau på CT-værdier Når prøver ved forskellige samlede DNA-niveauer indeholder den samme fordeling af mutant-dna, forventes det, at de målte CT-værdier forbliver ensartede. Målet med undersøgelsen var at vise, at ydelsen i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er konstant over det samlede DNA-inputområde (kontrollens CT) i analysen. Der blev brugt DNA fra 8 FFPE-cellelinjer til at forberede pools af DNA med den lavest mulige værdi for kontrolreaktionens CT. Koncentrerede DNA-lagre blev efterfølgende fortyndet til at generere DNA inden for arbejdsområdet (i alt 5 fortyndinger inklusive det første koncentrerede lager). For hvert punkt i arbejdsområdet blev der forberedt tilstrækkeligt materiale til at udføre 6 replikattest. Fortyndingsområdet for hver mutationsreaktion og den gennemsnitlige CT-værdi, der blev opnået fra resultaterne, er vist i tabel 20. For hver mutation, der er påvist af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, opfyldte de CT-værdier, der blev målt ved forskellige samlede DNA-inputniveauer i analysens arbejdsområde, de forudindstillede godkendelseskriterier for undersøgelsen. Selvom der er en let stigning i CT, når DNA-inputtet øges, var CTværdierne samlet set ensartede inden for arbejdsområdet i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet efter de foruddefinerede godkendelseskriterier. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

64 Tabel 20. Effekten af DNA-input på CT-værdier inden for inputkontrolreaktionens CT-område FFPE-cellelinjer CT Fortynding 3 ~26-27 C T Analyse Fortynding 1 ~20-21 C T Fortynding 2 ~23-24 C T Fortynding 4 ~29-30 C T Fortynding 5 ~32-33 C T 12ALA 1,56 1,25 1,16 1,14 1,27 12ASP* 2,46 2,18 2,11 2,11 1,75 12ARG 1,18 0,63 1,08 0,94 1,06 12VAL 0,29 0,25 0,15 0,26-0,1 12SER 2,91 2,21 2,15 2,15 2,08 12CYS 0,98 0,71 0,58 0,81 0,67 13ASP 3,57 2,84 2,54 2,46 2,62 * Det samlede antal replikater for 12ASP var 27. Linearitets-/forstærkningseffektiviteten som en funktion i DNA-input Linearitets- og forstærkningseffektiviteten i PCR for hver mutationsreaktion i forhold til kontrolreaktionen, inden for arbejdsområdet i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet blev påvist. Forstærkningseffektiviteten blev beregnet for hver mutationsreaktion, og kontrolreaktionen som [2(-1/hældning)] -1. Forstærkningseffektiviteten af kontrollen sammenlignet med mutantreaktionen angiver, at CT, og således mutationsbestemmelsen, er ensartet inden for arbejdsområdet i analysen. Den største forskel i forstærkningseffekten mellem kontrolreaktionen og en mutant reaktion blev observeret for 13ASP-analysen med en gennemsnitlig forskel i effektiviteten på ca. 14,5 %. Der vises en oversigt over dataene i tabel 21. Linearitets-/forstærkningseffektiviteten som en funktion i mutation i procent Målet med denne undersøgelse var at evaluere effekten af en serielt fortyndet mutantpositiv prøve på forstærkningseffektiviteten inden for arbejdsområdet i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet ved at begynde med inputniveauer af CT ved ca CT. DNA-ekstrakter fra FFPE-cellelinjer blev først vurderet af OD-aflæsninger, før PCR udføres med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. DNA-lagre blev derefter forberedt til en kontrolreaktions CT svarende til ca. 23 CT. Lagrene blev serielt dobbeltfortyndet hver gang ved hjælp af vildtype DNA for at holde det samlede 64 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

65 vildtype-dna konstant, mens procentdelen af mutant-dna i skabelonen varieres. Hver genereret skabelon havde den samme absolutte kvantitet og koncentration af DNA, men forskellige forhold af vildtype- til mutant-dna. Pools af tilstrækkeligt DNA til 6 replikater pr. mutation blev forberedt. CT- og CT-data for hvert mutation ved hver fortyndingspunkt blev beregnet. Mutationsreaktionens CT-værdier blev plottet, og effektiviteten beregnet; kontrolreaktionens CT-værdier var konstante i fortyndingsserien for hver mutation. For hver prøve, hvor kontrolreaktionens CT-værdi faldt inden for det angivne område (21,92-32,00), blev der beregnet CT-værdier. En lineær regressionsmodel blev forsynet med mutationsreaktionens CT i forhold til log2 DNA-inputfortynding. Hældningen og 95 % konfidensintervaller blev rapporteret. Undersøgelsen viste fortyndingen af mutationer på en baggrund af en konstant koncentration af vildtype-dna, der resulterede i en forstærkningseffektivitet, der ikke varierede betydeligt uden for de værdier, der blev bestemt i ovenstående linearitetsundersøgelse med den forstærkningseffektivitet, der adskiller sig med mindre end ±10 % (tabel 22). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

66 Skæringspunkt, standardfejl 0,060 0,103 0,083 0,083 0,13 0,065 0,063 0,039 0,050 0,087 0,047 0,043 0,056 0,106 Beregnet hældning -1,008-0,987-1,035-0,993-1,013-1,015-0,981-0,961-1,003-0,934-0,995-0,972-1,001-0,909 Standardfejl (hældning) 0,007 0,013 0,01 0,011 0,16 0,008 0,01 0,006 0,008 0,014 0,006 0,005 0,009 0,017 Tabel 21. Forstærkningseffektiviteter Skæringspunkt 21,060 22,476 Kontrol-CT 12ALA 12ALA CT 20,825 23,237 Kontrol-CT 12ASP 12ASP CT 20,385 21,347 Kontrol-CT 12ARG 12ARG CT 23,437 24,289 Kontrol-CT 12CYS 12CYS CT 22,568 25,212 Kontrol-CT 12SER 12SER CT 21,208 21,532 Kontrol-CT 12VAL 12VAL CT 23,207 26,466 Nedre tosidet 95 % konfidensgrænse (hældning) -1,023-1,013-1,056-1,016-1,046-1,032-1,003-0,974-1,02-0,963-1,007-0,983-1,02-0,945 Øvre tosidet 95 % konfidensgrænse (hældning) -0,993-0,961-1,014-0,97-0,98-0,999-0,96-0,947-0,986-0,904-0,983-0,961-0,982-0,873 Forstærkningseffektivitet 0,989 1,019 0,954 1,01 0,982 0,979 1,026 1,058 0,996 1,101 1,007 1,04 0,999 1,144 Forskel i forstærkningseffektivitet 0,03 0,056-0,003 0,032 0,105 0,033 0,145 Prøve Kontrol-CT 13ASP 13ASP CT 66 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

67 Tabel 22. Forstærkningseffektiviteter Skæringspunkt Skæringspunkt, standardfejl 12ALA 23,540 0,025 12ASP 24,804 0,054 12ARG 24,226 0,028 12CYS 24,354 0,027 12SER 25,376 0,054 12VAL 22,703 0,035 13ASP 27,555 0,057 Beregnet hældning -0,968-1,030-1,008-0,981-0,892-1,021-0,810 Standardfejl hældning 0,010 0,022 0,011 0,011 0,022 0,014 0,023 Nedre tosidet 95 % konfidensgrænse (hældning) -0,989-1,075-1,031-1,003-0,937-1,050-0,857 Øvre tosidet konfidensgrænse (hældning) -0,947-0,985-0,984-0,959-0,847-0,992-0,763 Forstærkningseffektivitet 1,047 0,960 0,990 1,027 1,174 0,972 1,353 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

68 Interfererende stoffer Formålet med denne undersøgelse var at evaluere potentielt interfererende stoffers indflydelse på therascreen KRAS RGQ PCR-kittets ydelse. Dette blev gennemført ved at analysere hvert stofs indflydelse ved hjælp af tilsætningseksperimenter ved to koncentrationer, på CT-værdierne og mutationsstatus for testprøver. Koncentrationerne er vist i tabel 23. Tabel 23. Mængde af interfererende stoffer, der er testet i hver analyse (dvs. 1x) Interfererende stof Faktisk høj mængde (µl/200 µl eluat) Faktisk lav mængde (µl/200 µl eluat) Buffer AL 1,33 x ,33 x 10-5 Buffer ATL 5,40 x ,35 x 10-4 Ethanol 1,35 x ,38 x 10-4 Paraffinvoks (i xylen) 2,00 x ,00 x 10-5 Proteinase K 1,32 x ,30 x 10-6 Vaskebuffer AW1 0,50 1,25 x 10-1 Vaskebuffer AW2 5,00 1,25 Xylen 2,00 x ,00 x 10-5 Ingen af de potentielt interfererende stoffer, som blev evalueret ved de koncentrationer, der kan forventes ved normal brug, påvirker therascreen KRAS RGQ PCR-kittets evne til at skelne mellem mutationspositive og mutationsnegative prøver. Udover undersøgelsen af interfererende stoffer blev den potentielle effekt af nekrose i kliniske prøver vurderet for at afgøre, om høje niveauer af nekrotisk væv i tumorprøver påvirker evnen til at generere gyldige data. Ud af i alt 421 prøver, der blev vurderet som en del af undersøgelserne Sammenligning med den analytiske referencemetode, havde 29 prøver nekrose på et niveau over 50 % som bestemt af den patologiske gennemgang. Ud af disse 29 prøver viste de 28 gyldige resultater, der var i overensstemmelse med bidirektional Sanger-sekventering. Et enkelt resultat var ugyldigt på grund af utilstrækkeligt DNA. 68 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

69 Krydskontaminering Formålet med denne undersøgelse var at bestemme omfanget af krydskontaminering (der kunne medføre falsk-positive resultater) mellem DNA-prøver ved brug af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Potentielle kilder til krydskontaminering er: Ekstrahering af prøver (f.eks. skrabning af glas) Pipettering af prøver Lukning ( hættepåsætning ) af prøverør Kontaminering af kitreagenser under brug Isætning af analyserør på Rotor-Gene Q-instrumentet Til denne undersøgelse blev der anvendt FFPE-standarder: vildtype-standarden og 12ALA-standarden (da 12ALA-reaktionen er den reaktion i kittet, der har den laveste påvisningsgrænse). Undersøgelsen bestod af 10 PCR-kørsler, der var beregnet til at undersøge muligheden for kontaminering både i og mellem Rotor-Gene Q-instrumentkørsler. I disse testkørsler blev der anvendt rør indeholdende vildtype-dna til at teste for kontaminering fra mutant DNA. Resultaterne af denne undersøgelse viste ingen påviselig kontaminering i nogen af de vildtype-dna-ekstrakter, der var beregnet til påvisning af krydskontaminering. Eksklusivitet/krydsreaktivitet therascreen KRAS RGQ PCR-kittet består af 8 separate reaktioner. Disse udgør en enkelt kontrolreaktion, som påviser et ikke-polymorft område i KRAS-genet og 7 mutationsspecifikke reaktioner. Der er ingen reaktion, som specifikt måler vildtype KRAS-sekvensen ved codon 12 eller 13. KRAS-resultatet No Mutation Detected (Ingen mutation påvist) (dvs. vildtype) bestemmes fra manglen på en af de 7 mutationer, der giver et positivt mutationsresultat. Derfor er det nødvendigt at påvise mængden af uspecifik forstærkning eller krydsreaktivitet, der opstår i hver reaktion med overskydende mængder KRASvildtype-DNA for at sikre, at der ikke opstår falske positive resultater. På samme måde evalueres en uspecifik forstærkning af KRAS-mutationer, som reaktionen ikke skal påvise. Dette viser, at omfanget af krydsreaktivitet mellem mutantreaktioner ikke resulterer i fejlagtige mutationsbestemmelser, hvis der er overskydende mængder mutant-dna. Da DNA-inputtet for denne analyse er baseret på kontrollens CT-område (21,92-32,00), er den højeste koncentration af DNAinput baseret på, at kontrollens CT-værdi er ca. 22. FFPE-kliniske prøver og FFPEcellelinje-DNA blev brugt til denne evaluering. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

70 Uspecifik forstærkning/krydsreaktivitet: vildtype-kras-dna Mængden af uspecifik forstærkning af vildtype-dna ved reaktionsblandinger, der er udviklet til at forstærke specifikke mutationer blev behandlet. I alt 60 replikater af vildtype-ffpe-cellelinje-dna eller DNA ekstraheret fra CRCtumorvæv blev evalueret i den højeste koncentration amplificerbare DNAinputniveauer ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. For DNA, som er ekstraheret fra FFPE-cellelinjen, var kontrol-ct-værdierne ca Kontrol CT-værdierne for 3 vildtype-crc-prøver var mellem 24 og 25. Resultaterne viste, at CT-værdierne oversteg de fastlagte cut-offs. De gennemsnitlige og/eller laveste CT-værdier, der blev observeret for hver reaktion, vises i tabel 24. Tabel 24. Gennemsnitlig CT og laveste CT observeret for vildtype-prøver i mutantanalysereaktioner Analyse Cut-off Laveste C T observeret 12ALA 8 12,76 Prøve 1 C T-gennemsnit (laveste) 18,00 (11,40) Prøve 2 C T-gennemsnit (laveste) 18,62 (11,50) Prøve 3 C T-gennemsnit (laveste) 20,03 (19,36) 12ASP 6,6 10,35 10,90 (9,62) 10,34 (8,84) 10,68 (9,01) 12ARG 8 14,26 20,33 (12,94) 20,02 (13,20) 20,03 (19,36) 12CYS 8 13,66 20,62 (17,38) 20,29 (19,62) 20,03 (19,36) 12SER 8 11,97 17,26 (11,14) 17,90 (11,42) 18,05 (10,44) 12VAL 7,5 11,81 14,87 (11,46) 16,27 (11,50) 18,68 (11,36) 13ASP 7,5 10,94 12,35 (9,08) 13,68 (10,69) 14,82 (9,97) 70 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

71 Uspecifik forstærkning/krydsreaktivitet/eksklusivitet: mutationspositivt KRAS DNA Mutantprøver med en høj koncentration af input-dna blev testet i forhold til alle reaktionsblandinger. Der blev forberedt DNA-prøver fra hver FFPE-cellelinje, så kontrolreaktionen CT svarede til ca. 23. Seks replikater af hver mutationsprøve blev evalueret. Procentdelen af mutation i prøven blev bestemt af mutantprocentdelen i cellelinje-dna'et. De gennemsnitlige CT-værdier, der er angivet i tabel 25, viser, at der er en krydsreaktion mellem mutantreaktionerne. 12ALA-mutationen blev forstærket og genererede CT-værdier under CT-tærsklen for 12CYS-, 12SER- og 12VALreaktioner. 12VAL-mutationen blev forstærket og genererede en CT-værdi under CT-tærsklen for 12ALA-reaktionen. I alle tilfælde viser resultaterne, at den korrekte mutation blev bestemt med den tilsvarende mutationsreaktion (dvs. den laveste CT-værdi var den korrekte mutationsbestemmelse). Alle andre tilfælde i testen blev enten ikke påvist eller var uden for CT-tærkslen. Tabel 25. Krydsreaktivitet ( CT) mellem mutationsreaktioner ved hjælp af FFPEcellelinje-DNA ved højt input-område Mutant- DNA Cut-off Analyse CT 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 8 1,42* 12,66 IR 5,81 2,78 6,31 13,21 12ASP 6,6 12,56 2,42* IR IR 13,44 11,21 13,55 12ARG 8 13,12 11,56 1,12* 11,42 IR 13,43 12,66 12CYS 8 14,2 12,48 9,23 0,98* IR 7,96 12,88 12SER 8 IR 13,39 13,31 IR 3,02* 12,99 13,97 12VAL 7,5 6,83 IR IR IR 13,38 0,28* 13,74 13ASP 7,5 IR 13,29 13,89 IR IR 14,36 4,5* * C T-værdier fra tilsvarende reaktioner. IR: Ingen krydsreaktion. C T fra krydsreagerende reaktioner under cut-off. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

72 Repeterbarhed og reproducerbarhed therascreen KRAS RGQ PCR-kittets præcision blev bestemt ved hjælp af en protokol, der indeholdt aspekter af CLSI EP12-A (28) og CLSI EP5-A2 (29). Kliniske CRC-prøver blev brugt til denne evaluering. Én vildtype og én prøve for hver mutation blev testet med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, hvor 2 operatører på hvert sted testede alle prøver og kontroller på 3 lot med therascreen KRAS RGQ PCR-kit, hver dag i 5 dage, med to kørsler pr. dag og med 2 replikater af hver prøve på hver kørsel. De CT- og CT-værdier, der blev opnået for hver reaktion i hver prøve, blev desuden analyseret med varianskomponentanalyse. Reproducerbarheden for therascreen KRAS RGQ PCR-kittet blev vist for mutantprøver med lave niveauer (3x LOD) og vildtypeprøver, med mindst 39/40 korrekte mutationsbestemmelser for alle analyser på tværs af flere lot, platforme samt operatører og for både inden for og mellem laboratorieeksperimenter. De demonstrerede variansestimater (én ganget med standardafvigelsen), ved hjælp af C50- og 3x LOD-prøver, er angivet i tabel 26 og tabel 27. Tabel 26. Præcisionsestimater for analysevarians og reproducerbarhed % CV for CT % CV for mutant-ct % CV for kontrollens CT Analyse 3x LOD C50 3x LOD C50 3x LOD C50 WT 12ALA 13,14 8,32 1,87 2,02 0,97 1,12 1,12 12ARG 10,79 8,04 1,59 1,96 1,24 1,51 1,15 12ASP 12,86 5,87 1,11 1,00 0,90 0,90 1,04 12CYS 17,61 10,83 1,86 2,02 1,54 1,22 1,15 12SER 13,97 10,43 1,71 2,11 0,94 1,19 1,15 12VAL 9,66 15,47 1,52 1,65 1,11 3,74 1,26 13ASP 13,73 9,35 1,91 2,08 1,11 1,41 1,19 72 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

73 Tabel 27. Præcisionsestimater for repeterbarhed % CV for CT % CV for mutant-ct % CV for kontrollens CT Analyse 3x LOD C50 3x LOD C50 3x LOD C50 WT 12ALA 10,71 7,51 1,69 1,76 0,77 0,90 0,79 12ARG 9,83 8,04 1,21 1,76 0,84 1,33 0,90 12ASP 10,16 4,08 0,93 0,89 0,80 0,76 0,76 12CYS 13,15 8,80 1,31 1,76 1,40 1,01 0,76 12SER 6,76 6,18 1,10 1,48 0,80 0,90 0,90 12VAL 9,21 15,32 1,40 1,42 0,91 3,49 0,94 13ASP 8,67 7,01 1,30 1,65 0,91 1,19 0,97 Den anslåede fordeling af 3x LOD-prøver, der testede mutant- og vildtypeprøver, blev rapporteret overordnet set og inden for hvert sted. For alle analyser og prøvekombinationer gav mindst 79 ud af 80 replikater den korrekte mutationsbestemmelse. Den samlede fordeling af korrekte bestemmelser var 99,6 % (1115/1120): 99,6 % (558/560) for mutationspositive (3x LOD) prøver og 99,5 % (557/560) for prøver, der er klassificeret som No Mutation Detected (Ingen mutation påvist) (vildtype) (se tabel 28). Tabel 28. Korrekte bestemmelser i alt Prøve Mutant 3x LOD Vildtype (lav) Korrekte bestemmelser for mutationsanalyser 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 79/80 80/80 80/80 79/80 80/80 80/80 80/80 80/80 79/80 80/80 80/80 79/80 79/80 80/80 Variabilitet i håndtering af prøver For at vurdere variabiliteten i prøvehåndteringen som en del af therascreen KRAS RGQ PCR-kittets testproces blev 30 sekventielle 5 µm sektioner skåret fra hver af 10 FFPE CRC-prøver (3 vildtype og 1 pr. mutation). Sektioner blev randomiseret til ét af 3 teststeder, så hvert sted modtog 10 sektioner pr. FFPEprøve (100 sektioner i alt). Ud af de 300 DNA-ekstraheringer, der blev testet, var 298 gyldige. Der var 99,33 % overensstemmelse med hensyn til KRAS- Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

74 mutationsbestemmelser mellem de 3 steder. Variansen i CT-værdier for hver analyse blev vurderet, og bidraget af mellem og inden for laboratoriekilderne blev vurderet ved hjælp af en ANOVA-varianskomponentmodel. Variansen inden for teststeder var højest for 12ASP (0,30). Variansen mellem teststeder var højest for 12SER (0,05). En sammenligning af stedernes gennemsnitlige CT-værdier med tilsvarende standardafvigelse for mutant- og vildtypeprøver viste stor overensstemmelse mellem resultaterne (se tabel 29 og tabel 30). Resultaterne viser overensstemmelsen mellem DNA-ekstraheringsproceduren og prøveprocessen i forbindelse med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Tabel 29. Sammenligning af stedernes gennemsnitlige CT-værdier (standardafvigelse) for mutanttypeprøver Sted 1 Gennemsnitlige CT-værdier (standardafvigelse) for analyse 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 2,44 (0,1) 2,62 (0,3) 3,03 (0,6) 2,24 (0,1) 2,34 (0,3) 2,51 (0,1) 3,93 (0,4) 2 2,44 (0,2) 2,52 (0,4) 3,01 (0,7) 2,29 (0,2) 2,10 (0,4) 2,44 (0,5) 4,15 (0,7) 3 2,67 (0,6) 2,52 (0,2) 3,07 (0,5) 2,29 (0,2) 2,74 (0,5) 2,56 (0,2) 3,95 (0,3) Tabel 30. Sammenligning af stedernes gennemsnitlige CT-værdier (standardafvigelse) for vildtypeprøver Sted 1 Gennemsnitlige CT-værdier (standardafvigelse) for analyse 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12,46 (0,3) * 10,37 (0,4) 11,84 (0,4) 12,36 (0,5) 11,11 (0,6) 2 12,09 (0,6) 13,07 (0,2) 10,17 (0,5) 11,71 (0,7) 12,20 (0,6) 11,00 (0,9) 3 12,07 (0,2) 10,61 (0,4) 11,94 (0,3) 12,28 (0,6) 11,82 (0,5) * : Manglende værdi, hvor der ikke observeres noget gennembrud. 74 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

75 Lottenes indbyrdes udskiftelighed Lottenes indbyrdes udskiftelighed, som kan have indflydelse på mutationspåvisningen, blev vurderet. I denne undersøgelse blev 3 lot af QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet og therascreen KRAS RGQ PCR-kittet med hvert lot af FFPEekstraheringskittet evalueret. DNA blev ekstraheret fra formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer med 3 lot FFPE-ekstraheringskit for at producere DNA-prøver med målkontrol-ct-værdier på ca. 23, 26 og 31. Disse CT-værdier blev valgt til at spænde over det angivne arbejdsområde for samlet DNAinputniveau for therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (kontrol-ct inden for 21,92-32,00). I alt 6 replikatekstraheringer ved hver af CT-målværdierne blev testet efter hver af de 3 uafhængige therascreen KRAS RGQ PCR-kit-lot. Der blev indsamlet CT-værdierne og mutationsbestemmelserne for alle testprøver. De foruddefinerede mål for undersøgelsen blev opfyldt med den korrekte mutationsbestemmelse observeret i 100 % af de gyldige test, hvilket bekræfter, at prøvemutationens bestemmelse ikke påvirkes ved at bruge forskellige lot af FFPE-ekstraheringskit og/eller therascreen KRAS RGQ PCR-kit. Ydelseskarakteristika (NSCLC) Analytisk ydeevne De specifikke ydelseskarakteristika for therascreen KRAS RGQ PCR-kittet blev bestemt af undersøgelser med formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) vævsprøver, der er indsamlet fra patienter med ikke-småcellet lungecancervæv (NSCLC). Hentningsmetoderne omfatter grovnålsbiopsi (CNB), finnålsaspiration (FNA) og resektion. Der blev brugt i alt 8 formalinfikserede, paraffinindstøbte humane cellelinjer (FFPE-cellelinjer), hvor 7 var positive for KRAS-mutationer, som blev påvist af analysen. Den resterende cellelinje var KRAS-vildtype (dvs. ingen mutationer ved codon 12 og 13). Mutationsstatus for alle prøverne blev bekræftet ved bidirektional Sanger-sekventering. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

76 Sammenligning med den analytiske referencemetode Målet med undersøgelsen var at påvise overensstemmelsen (nøjagtigheden) i rapportering af mutationsstatus (mutationspositiv eller mutationsnegativ) for NSCLC-prøver, der er testet med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, når det sammenlignes med bidirektional Sanger-sekventering. Kliniske FFPE NSCLC-prøver, som blev hentet via resektion, CNB eller FNA, blev brugt til denne undersøgelse. DNA blev ekstraheret fra hver prøve, før testen blev udført med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Resultaterne fra denne test blev sammenlignet med dem, der blev hentet via bidirektional Sangersekventering. I alt 360 prøver viste et gyldigt resultat for både therascreen KRAS RGQ PCRkittet og den bidirektionale Sanger-sekventering med 340 prøver med samstemmende resultater. Der var 20 uoverensstemmende resultater mellem therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og den bidirektionale Sanger-sekventering. Ud af disse havde 1 prøve et positivt resultat med Sanger-sekventering, men et negativt resultat med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. De resterende 19 prøver var positive med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, men negative med Sangersekventering. Overensstemmelsen mellem therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og den bidirektionale sekventering er vist i tabel Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

77 Tabel 31. therascreen KRAS RGQ PCR-kittet i forhold til Sanger-bidirektional sekventering Mutationsbestemmelser med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet I alt Negativ 12ALA 12ARG 12ASP 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Negativ Positiv 12ALA Positiv 12ALA_12CYS Positiv 12ARG Positiv 12ASP Positiv 12CYS Positiv 12CYS_12VAL Positiv 12VAL Positiv 13ASP Mutationsbestemmelse med bidirektional Sanger-sekventering I alt Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

78 To prøver viste dobbeltmutationsbestemmelser med Sanger-sekventering. Én mutation var den samme som therascreen KRAS RGQ PCR-kittets resultat. Disse prøver blev derfor klassificeret som samstemmende for analysen af den samlede overensstemmelse, den positive overensstemmelse og den negative overensstemmelse, som er vist i tabel 32. Tabel 32. Oversigt over overensstemmelse og konfidensgrænser Måling af overensstemmelse Hyppighed (%) 95 % konfidensinterval (CI) Overordnet procentdel af overensstemmelse 340/360 (94,44) 92,03-96,29 Procentdel af positiv overensstemmelse 79/80 (98,75) 94,21-99,94 Procentdel af negativ overensstemmelse 261/280 (93,21) 90,20-95,51 Denne undersøgelse påviste, at der opnås samstemmende resultater ved test af NSCLC-væv med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og bidirektional Sangersekventering. Overensstemmelsen blev beregnet med 340 overensstemmende prøver og 20 uoverensstemmende prøver. Den overordnede procentdel af overensstemmelsen er derfor 94,44 %. Den nedre grænse for det ensidede eksakte 95 % konfidensinterval (svarende til den nedre grænse for det tosidede 90 % eksakte konfidensinterval) for den overordnede procentvise overensstemmelse for den samlede mutationsstatus var 92,03 %. Godkendelseskriteriet for denne undersøgelse (at den overordnede procentdel af overensstemmelsen skal være lig med eller større end 90 %) blev således opfyldt. Påvisningsgrænse (LOD) LOD for analyser med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet blev bestemt og verificeret ved hjælp af CRC-væv (se afsnittet Ydelseskarakteristika (CRC) ). Undersøgelsen bekræftede, at LOD-værdierne for CRC-væv (Tabel 19) også var gældende for NSCLC-væv. Undersøgelsen var i to dele. I del 1 blev 60 replikater af 7 mutant FFPE NSCLCcellelinjer, som repræsenterede hver mutation, fortyndet til LOD i den pågældende analyse og testet. I del 2 blev 96 replikater af kliniske FFPE NSCLC-prøver, som repræsenterer hver mutation på tværs af 3 hentningsmetoder (resektion, CNB og FNA), testet efter fortynding til LOD for den pågældende analyse. På grund af begrænsede sektioner af kliniske prøver blev FFPE-cellelinjer eller patienttilpassede prøver erstattet efter behov for at sikre, at alle mutationer blev repræsenteret. 78 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

79 Der blev pooled flere DNA-ekstraheringer fra hver prøve for at generere DNAlagre. DNA-lagrene blev derefter normaliseret til at opnå målet for kontrolreaktionens CT-værdier på 26. Normaliserede mutant-dna-ekstrakter blev fortyndet med normaliserede vildtype-dna-ekstrakter af tilsvarende hentningstype til at oprette ekstrakter med samme niveau af samlet DNA, der kan forstærkes, men med en mutationsprocent, der er lig LOD for den pågældende analyse. I del 1 (FFPE-cellelinjer) viste alle 60 gyldige replikater af FFPE-cellelinjer for hver prøve, der blev vurderet, 100 % påvisning for deres respektive mutationsreaktion ved den LOD, der blev vurderet. De nøjagtige øvre ensidede 95 % konfidensgrænser for alle prøver var 100 % og påviste, at de tidligere påviste LOD-værdier er gældende for NSCLC-væv (se tabel 33). Tabel 33. Observeret procentdel og nøjagtige konfidensgrænser for prøver, der er mutationspositive for del 1 (FFPE-cellelinjer) Prøvemutation Antal gyldige datapunkter Påvisning i procent Nøjagtig øvre ensidet 95 % konfidensgrænse (%) 12ALA 60/ ASP 60/ ARG 60/ CYS 60/ SER 60/ VAL 60/ ASP 60/ I del 2 (kliniske FFPE NSCLC/FFPE-cellelinjer/patienttilpassede prøver), 96 gyldige replikater for 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12VAL og 13ASP viste 100 % korrekt bestemmelse med nøjagtige øvre ensidede 95 % konfidensgrænser på 100 %. Analyserne for 12CYS og 12SER viste 95,8 % påvisning ved LOD med nøjagtige øvre ensidede 95 % konfidensgrænser på 98,6 %. Dette påviser, at de tidligere påviste LOD-værdier er bekræftede for alle mutationsanalyser ved vurdering af de kliniske FFPE NSCLC/FFPE-cellelinjer/ patienttilpassede prøver (se tabel 34). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

80 Tabel 34. Observeret procentdel og nøjagtige konfidensgrænser for prøver, der er mutationspositive for del 2 (kliniske FFPE NSCLC-prøver/FFPE-cellelinjer) Prøvemutation Antal gyldige datapunkter Påvisning i procent Nøjagtig øvre ensidet 95 % konfidensgrænse (%) 12ALA 96/ ASP 96/ ARG 96/ CYS 96/96 95,8 98,6 12SER 96/96 95,8 98,6 12VAL 96/ ASP 96/ DNA-input og linearitet Effekten af DNA-inputniveau på CT-værdier Når prøver ved forskellige samlede DNA-niveauer indeholder den samme fordeling af mutant-dna, forventes det, at de målte CT-værdier forbliver ensartede. Målet med undersøgelsen var at vise, at ydelsen i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er konstant over det samlede DNA-inputområde (kontrollens CT) i analysen. DNA ekstraheret fra 9 FFPE-prøver (3 kliniske FFPE NSCLC-prøver, 4 FFPE-cellelinjer og 2 kliniske vildtype-ffpe NSCLC-prøver) blev brugt til at forberede pools af DNA med den lavest mulige værdi for kontrolreaktionens CT (høj input-dna). Koncentrerede DNA-lagre blev efterfølgende fortyndet for at generere DNAlagre med en kontrolreaktion CT, som dækker arbejdsområdet. I alt 5 fortyndinger blev forberedt inklusive det første koncentrerede lager. For hver fortynding blev der forberedt tilstrækkeligt materiale til at udføre 6 replikattest. Fortyndingsområdet og den gennemsnitlige CT-værdi fra resultaterne er vist i tabel 35. For hver mutation, der er påvist af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, opfyldte de CT-værdier, der blev målt ved forskellige samlede DNA-inputniveauer i analysens arbejdsområde, de forudindstillede godkendelseskriterier for undersøgelsen. 80 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

81 Tabel 35. Effekten af DNA-input på CT-værdier inden for inputkontrolreaktionens CT-område NSCLC FFPE-prøver Analyse Fortynding 1 ~20-21 C T Fortynding 2 ~23-24 C T CT Fortynding 3 ~26-27 C T Fortynding 4 ~29-30 C T Fortynding 5 ~32-33 C T 12ALA 3,40 3,25 3,11 2,90 3,31 12ASP 3,63 2,92 2,55 2,46 * 12ARG 2,49 2,22 2,25 2,23 1,40 12VAL 1,34 1,23 1,18 1,13 0,97 12SER 5,34 4,50 4,30 3,92 * 12CYS 1,70 1,71 1,70 1,77 1,01 13ASP 6,24 5,36 5,14 4,87 * * Ingen mutationsreaktion C T blev returneret på grund af en lav koncentration af DNA, og derfor blev ingen C T beregnet. De overordnede CT-værdier er konstante inden for arbejdsområdet for therascreen KRAS RGQ PCR-kittet for alle analyser, hvilket påviser, at DNAinputniveauet ikke påvirker nøjagtigheden i prøvemutationsbestemmelsen. Linearitets-/forstærkningseffektiviteten som en funktion i DNA-input Linearitets- og forstærkningseffektiviteten i PCR for hver mutationsreaktion i forhold til kontrolreaktionen, inden for arbejdsområdet i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet blev påvist. Forstærkningseffektiviteten blev beregnet for hver mutationsreaktion, og kontrolreaktionen som [2(-1/hældning)] -1. Forstærkningseffektiviteten af kontrollen sammenlignet med mutantreaktionen angiver, at CT, og således mutationsbestemmelsen, er ensartet inden for arbejdsområdet i analysen (se tabel 36). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

82 Hældning, nedre tosidet 95 % CL -0,19-1,20-0,09-0,96-0,17-1,00-0,14-1,03-0,10-0,99-0,07-1,01 0,001-1,00 Hældning, øvre tosidet 95 % CL -0,11-0,93-0,05-0,96 0,08 0,95 Tabel 36. Forstærkningseffektiviteten i kontrol- og mutationsreaktioner Beregnet hældning Hældning, standardfejl Skæringspunkt, standardfejl Skæringspunkt 0,02-0,15 0,04 22,74 0,07-1,06 0,16 24,11 Kontrol-CT 12ALA CT 12ALA 0,01-0,07 0,03 21,92 0,01-0,98 0,02 24,44 Kontrol-CT 12ASP CT 12ASP -0,02-0,13 0,05 21,73 0,01-0,97 0,03 22,69 Kontrol-CT 12ARG CT 12ARG 0,01-0,11 0,04 21,73 0,01-1,01 0,03 22,77 Kontrol-CT 12CYS CT 12CYS 0,02-0,06 0,05 23,03 0,01-0,97 0,03 25,34 Kontrol-CT 12SER CT 0,02-0,03 0,04 22,13 0,03-0,95 0,08 23,34 Kontrol-CT 12VAL CT 0,01-0,02 0,02-0,08-0,99-0,02 0,94 0,01 22,63 0,03-0,94 0,07 25,14-0,88 0,04-0,88 Forstærkningseffektivitet 0,94 1,01 0,94 1,04 0,96 0,96 0,98 1,00 0,97 1,09 0,92 0,91 0,94 1,01 Forskel i forstærkningseffektivitet 0,069 0,093-0,001 0,019 0,127 0,011 0,066 Prøver 12SER 12VAL Kontrol-CT 13ASP CT 13ASP 82 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

83 Linearitets-/forstærkningseffektiviteten som en funktion i mutation i procent Formålet med denne undersøgelse var at evaluere effekten på forstærkningseffektiviteten af serielt fortyndet mutantpositive prøver på baggrund af vildtype- DNA. DNA blev ekstraheret fra 12 FFPE-prøver: 3 kliniske FFPE NSCLC-prøver, 4 FFPE-cellelinjer og 4 kliniske vildtype-ffpe NSCLC-prøver. Prøverne blev først vurderet af OD-aflæsninger, før PCR blev udført med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. DNA-lagre blev forberedt til en kontrolreaktions CT svarende til ca. 23. Lagrene blev serielt dobbeltfortyndet ved hjælp af vildtype-dna for at holde det samlede vildtype-dna konstant, mens procentdelen af mutant-dna i skabelonen varieres. Hver genereret skabelon havde den samme absolutte kvantitet og koncentration af DNA, men forskellige forhold af vildtype- til mutant-dna. Pools af tilstrækkeligt DNA til 6 replikater pr. mutation blev forberedt. CT- og CT-data for hver mutation ved hver af de 5 fortyndingspunkter blev beregnet. Mutationsreaktionens CT-værdier blev plottet, og effektiviteten blev beregnet. Kontrolreaktionens CT-værdier var konstante i fortyndingsserien for hver mutation. En lineær regressionsmodel blev forsynet med mutationsreaktionens CT i forhold til log2 DNA-inputfortynding. Hældningen og 95 % konfidensintervaller blev rapporteret (se tabel 37). Undersøgelsen viste fortyndingen af mutationer på en baggrund af en konstant koncentration af vildtype-dna, der resulterede i forstærkningseffektiviteter, som ikke varierede betydeligt uden for de værdier, der blev bestemt i ovenstående linearitetsundersøgelse. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

84 Tabel 37. Forstærkningseffektiviteter for mutationsanalysen Skæringspunkt, standardfejl Skæringspunkt Mutation Hældning, standardfejl Beregnet hældning Hældning, nedre tosidet 95 % CL 12ALA 24,11 0,16-1,06 0,07-1,20 12ASP 24,44 0,02-0,98 0,01-0,96 12ARG 22,69 0,03-0,97 0,01-1,00 12CYS 22,77 0,03-1,01 0,01-1,03 12SER 25,34 0,03-0,97 0,01-0,99 12VAL 23,34 0,08-0,95 0,03-1,01 13ASP 25,14 0,07-0,94 0,03-1,00 Hældning, øvre tosidet 95 % CL -0,93-0,96 0,95-0,99 0,94-0,88-0,88 Forstærkningseffektivitet 1,01 1,04 0,96 1,00 1,09 0,91 1,01 Interfererende stoffer Formålet med denne undersøgelse var at evaluere påvirkningen fra potentielt interfererende stoffer fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet på therascreen KRAS RGQ PCR-kittets ydelse. Hvert stofs påvirkning af CT-værdier og mutationsstatus for testprøver blev analyseret ved hjælp af tilsætningseksperimenter ved tre koncentrationer af det potentielt interfererende stof. Potentielt interfererende stoffer fra den DNA-ekstraheringsproces, der blev testet, var: Buffer AL, buffer ATL, ethanol, paraffinvoks, proteinase K, vaskebuffer 84 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

85 AW1, vaskebuffer AW2 og xylen. Den endelige elutionsbuffer fra kittet, buffer ATE, blev også testet som tom kontrol. Otte FFPE-cellelinjer, som repræsenterede hver af de 7 mutationer (3x LOD), og en vildtype-prøve blev brugt i denne undersøgelse. Alle prøver blev testet ved et input-dna-niveau, som gav en kontrolrekation-ct på ca. 27 (hvilket repræsenterer det midterste niveau i arbejdsområdet). Alle FFPE-cellelinjer blev testet med hvert af de potentielt interfererende stoffer ved den højeste overførselskoncentration (1x). To yderligere niveauer af et potentielt interfererende stof blev også vurderet, svarende til 10x og 100x den højeste forventede overførsel. Koncentrationen af potentielt interfererende stoffer på hvert af de niveauer, hvor de blev testet, er vist i tabel 38. Tabel 38. Koncentrationen af potentielt interfererende stof i den endelige elutionsvolumen ved 1x, 10x og 100x den højeste forventede koncentration Interfererende stof Forventet maksimal mængde i 120 µl eluat (µl) [1x] [10x] [100x] Buffer AL 2,00 x ,02 0,2 Buffer ATL 1,80 x ,80 x ,18 Ethanol 1,00 x ,01 0,1 Paraffinvoks 1,00 x ,00 x ,01 Proteinase K 2,00 x ,00 x ,02 Vaskebuffer AW1 0,05 0,5 5 Vaskebuffer AW2 0, Xylen 1,00 x ,00 x ,01 Mutant 3x LOD-prøverne blev testet ved hjælp af 8 replikater, og vildtype blev testet ved hjælp af 4 replikater. Hver mutation blev kun testet med dens respektive reaktionsblanding, dvs. at 12ALA-prøver blev testet med 12ALAreaktionsblanding. Undersøgelsen påviste, at stoffer identificeret fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet som potentielt interfererende, ikke havde nogen negativ indvirkning på ydelsen i en analyse ved 1x niveauet af det interfererende stof. Den korrekte bestemmelse blev altid givet for hver prøve-/stofkombination. Dvs., at mutant-3x LOD-prøver viste Mutation Detected (Mutation påvist), som forventet, og vildtypeprøver viste No Mutation Detected (Ingen mutation påvist), som forventet. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

86 Tilstedeværelsen af 1x interfererende stof havde ingen statistisk indvirkning på 58/64 testede prøveforhold. For de 6 forekomster, som viste en væsentlig statistisk forskel, var den observerede forskel mindre end 2x SD for analysen, som beregnet under repeterbarheds- og reproducerbarhedsundersøgelsen. Undersøgelsen påviste også, at therascreen KRAS RGQ PCR-kittet var tolerant over for højere niveauer af de testede stoffer. Den korrekte mutationsbestemmelse blev udført, hvor det interfererende stof var tilstede ved 10x den højeste forventede koncentration. Hvor det interfererende stof var tilstede ved 100x den højeste forventede overførselskoncentration, blev den korrekte bestemmelse desuden stadig udført. Buffer AW2 ved 100x koncentration medførte, at analyse ikke producerede nogen CT-værdier for hverken HEX- eller FAM-kanaler, og i disse tilfælde blev analyserne korrekt bestemt som invalid (Ugyldig). Eksklusivitet/krydsreaktivitet therascreen KRAS RGQ PCR-kittet består af 8 separate reaktioner; én enkelt kontrolreaktion, der påviser et ikke-polymorfe område i KRAS-genet og syv mutationsspecifikke reaktioner. Der er ingen reaktion, som specifikt måler vildtype-kras-sekvensen ved codon 12 eller 13. KRAS-resultatet No Mutation Detected (Ingen mutation påvist) (dvs. vildtype) bestemmes fra manglen på en af de 7 mutationer, der giver et positivt mutationsresultat. For at sikre, at der ikke opstår falske positive resultater, er det derfor nødvendigt at påvise mængden af uspecifik forstærkning eller krydsreaktivitet i hver reaktion, hvor overskydende mængder af KRAS-vildtype-DNA er tilstede. På samme måde evalueres uspecifik forstærkning af KRAS-mutationer, som ikke skal påvises af analysen. Dette viser, at krydsreaktiviteten mellem mutantreaktioner ikke resulterer i fejlagtige mutationsbestemmelser, hvis der er overskydende mængder mutant-dna. Prøver blev genereret fra cellelinjer til vurdering af mutationens krydsreaktivitet, og kliniske resektionsprøver blev brugt til vurdering af vildtypens krydsreaktivitet. Uspecifik forstærkning/krydsreaktivitet (vildtype-kras-dna) Formålet med denne undersøgelse var at vurdere niveauet af baggrundsforstærkningen i vildtypeprøver, som har en høj koncentration af input-dna (kontrolreaktions-ct på ca. 22,00-23,00) inden for arbejdsområdet for therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (kontrolreaktions-ct 21,92-32,00). I alt 60 gyldige replikater af pooled klinisk operationsresektions-ffpe NSCLCvildtypeprøver blev brugt til at vurdere baggrundsforstærkningen med hensyn til højt input-dna-niveau (kontrolreaktions-ct på ca. 22,00-23,00). 86 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

87 Alle 60 replikater af vildtypeprøven blev testet med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og viste CT-værdier, som oversteg analysens cut-off-værdier. Alle 60 replikater af NSCLC-vildtypeprøven blev bestemt som vildtype ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Godkendelseskriteriet for denne undersøgelse blev derfor opfyldt, da mindst 95 % ( 57 ud af 60) vildtypereplikater blev korrekt bestemt. Uspecifik forstærkning/krydsreaktivitet/eksklusivitet: mutationspositivt KRAS DNA Syv FFPE NSCLC-cellelinjeprøver, én for hver af de 7 mutationer, som blev påvist af KRAS-kittet, blev brugt i denne undersøgelse. DNA fra FFPE-cellelinjeprøverne blev fortyndet til en kontrolreaktions CT-værdi på ca. 23,00. Ud af disse fortyndinger blev 6 replikater pr. mutation forberedt. Én replikat pr. mutantprøve blev testet på hver enkelt PCR-kørsel. Hver prøve blev testet med alle 8 reaktionsblandinger i therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Dataene fra denne undersøgelse er præsenteret i tabel 39 og viser, at der er krydsreaktivitet mellem mutationsreaktioner i et antal kombinationer. Den laveste gennemsnitlige CT-værdi for krydsreaktion er påvist med 12SER-mutantreaktion i 12ALA-positivt DNA, en forskel i værdien på 2,26 CT. I alle testsager blev den korrekte mutation bestemt med den tilsvarende mutationsreaktion, dvs. den laveste CT-værdi var den korrekte mutationsbestemmelse. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

88 Tabel 39. Krydsreaktivitet ( CT) mellem mutationsreaktioner ved hjælp af FFPEcellelinje-DNA Mutant- DNA Cut-off Analyse CT 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 8 1,31* 12,8 IR 5,01 2,26 5,57 12,65 12ASP 6,6 12,61 1,66* IR IR IR 10,3 12,6 12ARG 8 12,98 11,08 0,81* 11,24 IR 12,66 12,62 12CYS 8 IR 12,22 7,84 0,56* IR 13,06 11,84 12SER 8 IR 12,87 13,21 IR 1,93* 13,25 12,93 12VAL 7,5 5,93 14,29 IR IR 13,14 0,45* 12,39 13ASP 7,5 IR IR IR IR IR IR 2,02* * C T-værdier fra tilsvarende reaktioner. IR: Ingen krydsreaktion. C T fra krydsreagerende reaktioner under cut-off. Repeterbarhed og reproducerbarhed Formålet med denne undersøgelse var at påvise nøjagtigheden af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet i interne laboratorietest (repeterbarhed) og eksterne laboratorietest (reproducerbarhed). Undersøgelsesdesignet var baseret på to CLSI-dokumenter, EP12-A2 (28) og EP05-A2 (29). Både korrektheden i resultaterne af mutationsbestemmelsen og nøjagtigheden af CT-værdierne (forskellen i CT-værdier mellem en mutationsreaktion og kontrolreaktionen) er rapporteret. For hver af de 7 KRAS NSCLC-mutationer blev der brugt 3 prøver, som repræsenterede hver af de 3 typer prøvehentningsmetoder (resektion, CNB og FNA). Der blev brugt yderligere 6 kliniske vildtypeprøver og 2 prøver, som repræsenterede hver af de 3 typer prøvehentningsmetoder, til at oprette vildtype-dna-fortyndede pools. Der blev foretaget flere ekstraheringer for vildtypeprøver og for hver af de 21 mutationsprøver for at producere tilstrækkelige mængder DNA. Ekstraheringerne blev pooled for hver af mutationsprøverne for at oprette en enkelt prøvepool pr. mutation. Hver pool af mutationsprøven blev fortyndet for at generere testprøver på mutationsniveauer på 1x LOD og 3x LOD. For at sikre at prøve-dna-inputniveauerne forblev konstante, blev mutant-dna'et fortyndet med vildtype-dna 88 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

89 fra den tilsvarende hentningsmetode og derefter normaliseret til den samme kontrolreaktions CT-værdi. De laboratorier, der blev anvendt i denne undersøgelse, lå på 3 forskellige steder. Laboratorieforholdene varierede for hvert sted ved brugen af 2 Rotor- Gene Q-instrumenter, 2 operatører, 2 lot fra therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og 2 kørsler pr. dag (pr. operatør) over 16 ikke-fortløbende dage. Præcisionsestimaterne for reproducerbarhed og repeterbarhed for alle mutationer er vist i tabellerne 40 og 41. Derudover blev procentdelen af korrekte bestemmelser beregnet pr. mutation. Disse resultater sammen med de tosidede 90 % konfidensintervaller (CI) vises i tabel 42. Tabel 40. Præcisionsestimater for reproducerbarhed (% CV) %CV for CT % CV for mutant-ct % CV for kontrollens CT Analyse 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 12ALA 5,36 6,55 0,81 1,23 0,77 0,77 12ARG 9,51 7,31 0,94 1,07 0,68 0,86 12ASP 11,6 9,69 2,08 2,01 1,52 1,49 12CYS 7,21 5,6 0,9 0,97 0,74 0,8 12SER 9,87 7,77 1,2 1,19 0,74 0,76 12VAL 8,99 6,22 0,95 0,97 0,95 0,78 13ASP 10,21 8,22 1,31 1,18 0,83 0,8 Tabel 41. Præcisionsestimater for repeterbarhed (% CV) % CV for CT % CV for mutant-ct % CV for kontrollens CT Analyse 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 3x LOD 1x LOD 12ALA 4,88 5,43 0,71 1,04 0,73 0,64 12ARG 10,2 7,71 0,9 0,99 0,67 1,04 12ASP 12,9 9,88 2,13 2,08 1,47 1,51 12CYS 7,68 5,97 0,89 0,96 0,82 0,72 12SER 9,92 8,49 1,08 1,23 0,69 0,81 12VAL 7,73 6,08 0,88 0,99 0,76 0,77 13ASP 10,87 7,43 1,47 1,02 0,93 0,71 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

90 Tabel 42. Korrekte bestemmelser for 1x LOD, 3x LOD og vildtype Mutationsniveau Analyse Korrekte bestemmelser % korrekte bestemmelser Nedre tosidet 90 % CI 12ALA 288/ ,97 12ARG 288/ ,97 12ASP 288/ ,97 1x LOD 12CYS 284/ ,85 12SER 284/ ,85 12VAL 288/ ,97 13ASP 288/ ,97 12ALA 288/ ,97 12ARG 288/ ,97 12ASP 288/ ,97 3x LOD 12CYS 284/288 98,61 96,85 12SER 284/288 98,61 96,85 12VAL 288/ ,97 13ASP 287/ ,96 Vildtype 285/ ,95 For alle analyser og prøvekombinationer gav mindst 284 ud af 288 replikater den korrekte mutationsbestemmelse. Den samlede fordeling af korrekte bestemmelser fra alle analyser for 1x LOD-gruppen var 100 % (2008/2008). Den samlede fordeling af korrekte bestemmelser fra alle analyser for 3x LODgruppen var 99,6 % (2007/2015). Den samlede fordeling af korrekte bestemmelser for prøver uden påvisning af mutation (vildtype) var 100 % (285/285) (se tabel 42). Variabilitet i håndtering af prøver Formålet med denne undersøgelse var at vurdere effekten af prøvehåndteringens variabilitet, især DNA-ekstrahering, på therascreen KRAS RGQ PCRkittet. Denne undersøgelse supplerer undersøgelsen af repeterbarheden og reproducerbarheden ved at analysere variabiliteten i prøvehåndteringen, når 90 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

91 de samme kliniske FFPE NSCLC-sektioner og FFPE-cellelinjesektionerne blev behandlet på 3 steder efterfulgt af test med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. 13 kliniske NSCLC-prøver (3 x 12ASP, 3 x 12CYS, 4 x 12VAL og 3 vildtype) og 4 FFPE-cellelinjeprøver (12ALA, 12ARG, 12SER og 13ASP) blev brugt i denne undersøgelse. De 13 kliniske NSCLC-prøver inkluderede 3 forskellige typer kliniske KRAS NSCLC-prøver, som havde forskellige hentningsmetoder: operationsresektion, FNA eller CNB. Hver mutation og vildtypeprøve blev repræsenteret ved hjælp af en resektions-, FNA- og CNB-prøve. Der var ikke tilstrækkelige kliniske prøver, så patienttilpasset klinisk FFPE NSCLC-væv blev brugt til alle CNB- og FNA-prøver. Der blev brugt cellelinjer til at repræsentere sjældne mutationer, hvor der ikke var tilgængeligt klinisk NSCLC-væv. I alt 60 FFPE-sektioner blev forberedt pr. mutationstype, hvilket resulterede i 8 sæt 60 FFPE-sektioner. Hvert sæt af kliniske prøver bestod af 20 FNA, 20 resektioner og 20 CNB. For de sjældnere mutationer blev der forberedt 60 sektioner af FFPE-cellelinjen. Sekventielle FFPE-sektioner for hver prøve blev placeret i 10 sæt af 6. Et sæt var en gruppe af 6 sekventielle FFPE-sektioner. To FFPE-sektioner fra hvert sæt af 6 blev tilfældigt placeret i et batch og dannede 3 batches. De 3 batches med 20 FFPE-sektioner blev derefter tilfældigt fordelt på de tre 3 steder. På hvert af de 3 steder blev DNA-ekstrahering udført på et batch med 20 FFPE-sektioner (dvs. 10 par) pr. mutation og vildtype. Mutationsstatussen for de kliniske prøver var kendt, da prøverne tidligere var testet ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og bidirektional Sangersekventering. Alle prøver var blindede, så mutationsstatussen var ukendt for operatørerne på hvert sted. For at resultaterne af denne undersøgelse skal være acceptable, skal mutationsbestemmelsen på hvert sted være den samme for hver prøve, der blev testet. Hvor alle prøveforberedelser på 3 individuelle teststeder blev testet med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet, blev hver af de 7 mutationer og vildtypeprøverne identificeret med den korrekte mutationsbestemmelse. Den overordnede bestemmelse for hver af de 7 mutationer og vildtypeprøverne var 100 %, hvilket påviste konsekvens mellem stederne ved DNA-ekstrahering og mutationspåvisning ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet (tabel 43 og tabel 44). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

92 Tabel 43. De gennemsnitlige CT-værdier og mutationsbestemmelser, der blev rapporteret fra 3 teststeder ved hjælp af de samme prøver og kit Mutation Prøvekilde Præcision 95 % konfidensinterval C T Nedre tosidet Øvre tosidet Gns. %CV 12ALA Cellelinje 0,22 0,17 0,29 1,36 15,76 FNA 0,39 0,27 0,72 3,09 12,679 12ASP CNB 0,39 0,27 0,75 2,24 17,49 Resektion 0,17 0,11 0,30 4,26 3,86 12ARG Cellelinje 0,20 0,16 0,27 0,81 24,32 CNB 0,30 0,20 0,54 3,87 7,63 12CYS FNA 0,11 0,08 0,21 1,71 6,57 Resektion 0,17 0,12 0,31 2,71 6,35 12SER Cellelinje 0,55 0,44 0,75 2,10 26,24 CNB 0,24 0,17 0,44 2,98 8,04 12VAL FNA 0,37 0,26 0,68 3,53 10,58 Resektion 0,2 0,18 0,47 1,93 13,21 13ASP Cellelinje 0,23 0,18 0,31 2,24 10,32 Tabel 44. Mutationsbestemmelser ved mutation på 3 steder i kombination Analyse Korrekte bestemmelser % korrekte bestemmelser Nedre tosidet 90 % CI 12ALA 29/ ,19 12ARG 29/ ,19 12ASP 30/ ,5 12CYS 30/ ,5 12SER 29/ ,19 12VAL 30/ ,5 13ASP 29/ ,19 Vildtype 29/ ,19 92 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

93 Ækvivalens i prøvehentningsmetoder Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om mutationsbestemmelsen for de NSCLC-prøver, der blev bestemt med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet var påvirket af prøvehentningsmetoden. De 3 prøvehentningsmetoder, som er vurderet i denne undersøgelse, var resektion, CNB og FNA. Til denne undersøgelse blev de patienttilpassede CNB- og FNA-prøver hentet fra kirurgisk resecerede tumorprøver, så den samme tumor kan indsamles ved hjælp af de 3 hentningsmetoder. I alt 169 resecerede tumorprøver var tilgængelige for denne undersøgelse, hvor hver af disse prøver gav en resektionsprøve, en CNB-prøve og en FNA-prøve, i alt 169 resektionsprøver, 169 CNB-prøver og 169 FNA-prøver. Hver prøve blev ekstraheret og testet med KRAS-kontrolanalysen. Hver prøve, der gav et gyldigt resultat (169 resektioner, 169 CNB og 164 FNA), blev testet med alle 8 KRAS-analyser. For hver af de kliniske FFPE NSCLC-prøver blev den ekstraherede DNA, der blev brugt til therascreen KRAS RGQ PCR-kittets analyse, også vurderet ved hjælp af bidirektional Sanger-sekventering for at bestemme niveauet af overensstemmelse mellem therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og bidirektional Sanger-sekventering. Den overordnede parvise overensstemmelse mellem hentningstyper som vist i tabel 45. Resultaterne fra denne undersøgelse påviste, at therascreen KRAS RGQ PCRkittet giver ækvivalente resultater på tværs af de 3 undersøgte indsamlingsmetoder, der er angivet via den overordnede parvise overensstemmelse i procent: CNB i forhold til FNA 97,52 (konfidensgrænser 94,41-99,15) CNB i forhold til resektion 96,39 (konfidensgrænser 92,99-98,41) FNA i forhold til resektion 98,76 (konfidensgrænser 96,14-99,78) Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

94 Tabel 45. Sammenligning af prøvehentningsmetode og mutationsbestemmelse Analyse Hentningsmetoder Frekvenser Procentdel af overensstemmelse CNB i forhold til FNA 161/ ,16 Nøjagtig binomial nedre tosidet 90 % CI 12ALA CNB i forhold til RES* 166/ ,21 FNA i forhold til RES 161/ ,16 CNB i forhold til FNA 160/161 99,38 97,09 12ARG CNB i forhold til RES 165/166 99,4 97,17 FNA i forhold til RES 161/ ,16 CNB i forhold til FNA 160/161 99,38 97,09 12ASP CNB i forhold til RES 165/166 99,4 97,17 FNA i forhold til RES 161/ ,16 CNB i forhold til FNA 157/161 97,52 94,41 12CYS CNB i forhold til RES 160/166 96,39 92,99 FNA i forhold til RES 159/161 98,76 96,14 CNB i forhold til FNA 161/ ,16 12SER CNB i forhold til RES 166/ ,21 FNA i forhold til RES 161/ ,16 CNB i forhold til FNA 161/ ,16 12VAL CNB i forhold til RES 166/ ,21 FNA i forhold til RES 161/ ,16 CNB i forhold til FNA 161/ ,16 13ASP CNB i forhold til RES 166/ ,21 * RES: resektion. FNA i forhold til RES 161/ ,16 94 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

95 På tværs af alle prøvetyper påviser therascreen KRAS RGQ PCR-kittet mutationsstatus nøjagtigt i forhold til bidirektional Sanger-sekventering med en procentdel af den overordnede overensstemmelse på 96,96 % (tabel 46). Tabel 46. Overensstemmelsen i mutationsstatus mellem therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og bidirektional Sanger-sekventering for NSCLC 90 % konfidensgrænse Grad af overensstemmelse Hyppighed Procentdel af overensstemmelse Nøjagtig binomial nedre tosidet Nøjagtig binomial øvre tosidet Procentdel af overordnet overensstemmelse Procentdel af positiv overensstemmelse Procentdel af negativ overensstemmelse 478/493 96,96 95,35 98,12 87/ , /406 96,31 94,37 97,71 Lottenes indbyrdes udskiftelighed Formålet med denne undersøgelse var at fastlægge, at brugen af forskellige lot af QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet og therascreen KRAS RGQ PCR-kittet ikke havde nogen indvirkning på prøvemutationens status for en testet prøve (dvs. at påvise lottenes indbyrdes udskiftelighed ved hjælp af konsekvensen i therascreen KRAS RGQ PCR-kittets mutationsbestemmelse). Denne undersøgelse brugte 24 NSCLC-prøver, 3 for hver af de 7 mutationer, der blev påvist ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet plus 3 vildtypeprøver. De 24 NSCLC-prøver bestod af 6 kliniske FFPE NSCLC-prøver, 7 FFPEpatienttilpassede prøver og 11 FFPE-cellelinjer. For hver prøve (mutation og vildtype) blev 12 FFPE-sektioner tilfældigt fordelt til ét af de 3 batches. Prøver i hvert batch af FFPE-sektioner blev ekstraheret ved hjælp af et andet lot fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet. I alt 6 separate DNA-ekstraheringer blev forberedt for hver af de 24 prøver (2 ekstraheringer pr. lot x 3 lot fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Mutationspositive FFPE NSCLC-prøver blev derefter testet med kontrolreaktionsblandingen og den tilsvarende mutationsreaktionsblanding fra 3 forskellige lot fra therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Alle DNA-ekstraheringer blev testet med hver af de 3 lot fra therascreen KRAS RGQ PCR-kittet inden for den samme PCRkørsel på Rotor-Gene Q-instrumentet. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

96 NSCLC-vildtypeprøverne blev testet med alle 8 reaktionsblandinger ved hjælp af 3 forskellige lot fra therascreen KRAS RGQ PCR-kittet på Rotor-Gene Q- instrumentet. Når CT-værdier og mutationsbestemmelser blev indsamlet, blev den korrekte mutationsbestemmelse returneret for alle prøver. Brugen af forskellige lot fra QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet og therascreen KRAS RGQ PCR-kittet har ikke nogen indflydelse på den korrekte bestemmelse af KRAS-mutationsstatus. Referencer 1. Hilger, R.A., Scheulen, M.E., Strumberg, D. (2002) The Ras-Raf-MEK-ERK pathway in the treatment of cancer. Onkologie 25, Bachireddy, P., Bendapudi, P.K., Felsher, D.W. (2005) Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res. 11, Han, S.-W. et al. (2006) Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-ras mutation, and AKT phosphorylation. Clin Cancer Res. 12, Pao, W. et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PloS Medicine 2, Lievre, A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Benvenuti, S. et al. (2007) Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res. 67, De Roock, W. et al. (2007) KRAS mutations preclude tumor shrinkage of colorectal cancers treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Finocchiaro, G. et al. (2007) EGFR, HER2, and Kras as predictive factors for cetuximab sensitivity in colorectal cancer. J Clin Oncol. 25, Di Fiore, F. et al. (2007) Clinical relevance of KRAS mutation detection in metastatic colorectal cancer treated by cetuximab plus chemotherapy. British Journal of Cancer 96, Khambata-Ford, S. et al. (2007) Expression of Epiregulin and Amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

97 11. Lièvre A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Lièvre A. et al. (2008) KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 26, Bokemeyer, C. et al., (2008) K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 4000). 14. Van Cutsem, E. et al. (2008) K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 2). 15. Tejpar, S. et al. (2008) Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mcrc), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 4001). 16. Karapetis C. et al. (2008) KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, Amado, R.G. (2008) Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 26, De Roock, W. et al. (2007) KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann. Oncol. Nov Thelwell, N. et al. (2000) Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Newton, C.R. et al. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 17, Whitcombe, D. et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, 804. Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

98 22. Catalog of Somatic Mutations in Cancer ( 23. Reckamp, K.L. et al. (2014) A phase 2 trial of dacomitinib (PF ), an oral, irreversible pan-her (human epidermal growth factor receptor) inhibitor, in patients with advanced non-small cell lung cancer after failure of prior chemotherapy and erlotinib. Cancer Feb Chaft, J.E. et al. (2013) Phase II trial of neoadjuvant bevacizumab plus chemotherapy and adjuvant bevacizumab in patients with resectable nonsquamous non-small-cell lung cancers. J. Thorac. Oncol. 8, Dingemans, A.M. et al. (2013) A phase II study of sorafenib in patients with platinum-pretreated, advanced (Stage IIIb or IV) non-small cell lung cancer with a KRAS mutation. Clin. Cancer Res. 3, Jänne, P.A. et al. (2013) Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced non-small-cell lung cancer: a randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet Oncol. 1, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation: Approved Guideline. CLSI Document EP17-A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). 28. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2008). User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance: Approved Guideline, 2nd ed. CLSI Document EP12-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). 29. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004). Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods: Approved Guideline, 2nd ed. CLSI Document EP05-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). 98 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

99 Symboler Følgende symboler kan evt. findes på emballagen og etiketten: <N> Indeholder tilstrækkelige reagenser til <N> reaktioner Anvendes inden Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik Katalognummer Lot-nummer Materialenummer Komponenter Indeholder Antal Rn R står for revision af håndbogen og n er revisionsnummeret Temperaturbegrænsning Producent Se de informationer, der er angivet i håndbogen Forsigtig Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

100 Kontaktoplysninger For teknisk bistand og yderligere information henvises til vores tekniske supportcenter på ring på , eller kontakt en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden, eller besøg Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

101 Appendiks: Installation af therascreen KRAS Assay Package therascreen KRAS RGQ PCR-kittet er udviklet til brug sammen med Rotor- Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet med en rotor med 72 brønde. therascreen KRAS Assay Package fås separat på cd (katalognr ). Pakken indeholder therascreen KRAS QC Locked Template og therascreen KRAS Locked Template. Cd'en indeholder printbare pladediagrammer, som kan bruges til at registrere eksperimenter og kørselsskabeloner, der definerer PCR-protokoller til FFPE-prøveforberedelse ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet, DNA-prøvevurdering ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCRkittet og påvisning af KRAS-mutationer ved hjælp af therascreen KRAS RGQ PCR-kittet. Bemærk: therascreen KRAS Assay Package fungerer kun sammen med Rotor- Gene Q-softwareversion (build 9). Kontrollér, at den korrekte version af Rotor-Gene Q-softwaren er installeret, før installationen af therascreen KRAS Assay Package fortsættes. Procedure 1. Bestil therascreen KRAS RGQ Assay Package CE CD (katalognr ), som fås separat fra QIAGEN. 2. Sæt cd'en i cd-drevet på den bærbare computer, som er tilsluttet Rotor- Gene Q-instrumentet. 3. Start installationen ved at dobbeltklikke på filen therascreen_kras_assay_package_ exe. 4. Installationsguiden vises. Klik på Next (Næste) for at fortsætte (figur 21). Figur 21. Dialogboksen Setup (Opsætning). 1 = knappen Next (Næste). Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

102 5. Læs licensaftalen i dialogboksen License Agreement (Licensaftale), og accepter aftalen ved at markere erklæringen I accept the agreement (Jeg accepterer aftalen). Klik på Next (Næste) for at fortsætte (figur 22). Figur 22. Dialogboksen License Agreement (Licensaftale). 6. Installationen af skabelonen starter automatisk, og den sidste dialogboks Setup (Opsætning) vises. Klik på Finish (Udfør) for at afslutte installationsguiden (figur 23). Figur 23. Afslutning af installationsguiden. 7. Genstart computeren. Der oprettes automatisk genveje til både therascreen KRAS QC Locked Template og therascreen KRAS Locked Template, som vises på skrivebordet. 102 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

103 Bestillingsinformation Produkt Indhold Kat. nr. therascreen KRAS RGQ PCR-kit (24) Til 24 reaktioner: 1 kontrolanalyse, 7 mutationsanalyser, positiv kontrol, vand, Taq-DNA-polymerase therascreen KRAS Assay Package CD Softwareprotokolpakke til brug sammen med therascreen KRAS RGQ PCR-kittet og QIAGEN Rotor-Gene Q 5plex HRM- eller MDx-instrumentet med en rotor med 72 brønde Rotor-Gene Q og tilbehør Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Real-time PCR-cyklusanordning og højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, lilla) samt HRM-kanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti mod håndværksmæssige og materielle defekter; installation og uddannelse er ikke inkluderet Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Real-time PCR-cyklusanordning og højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, lilla) samt HRM-kanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti mod håndværksmæssige og materielle defekter; installation og uddannelse Real-time PCR-cyklusanordning og højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, lilla) samt HRM-kanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti mod håndværksmæssige og materielle defekter; installation og uddannelse er ikke inkluderet Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

104 Produkt Indhold Kat. nr. Rotor-Gene Q 5plex HRM System Real-time PCR-cyklusanordning og højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, lilla) samt HRM-kanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti mod håndværksmæssige og materielle defekter; installation og uddannelse Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Aluminiumsblok til manuel opsætning af reaktioner med enkeltkanalspipette i 72 x 0,1 ml rør 250 bånd a 4 rør og hætter til reaktioner 10 x 250 bånd a 4 rør og hætter til reaktioner QIAamp DNA FFPE Tissue Kit til oprensning af genomisk DNA fra paraffinindstøbt væv. QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) Til 50 DNA-klargøringer: QIAamp MinElute -kolonner, proteinase K, buffere og indsamlingsrør (2 ml) For opdateret licensinformation og produktspecifikke ansvarsfraskrivelser henvises til den aktuelle QIAGEN kit-håndbog eller brugermanual. QIAGEN kit-håndbøger og brugermanualer kan fås via eller kan rekvireres hos QIAGEN Technical Services eller den lokale distributør. 104 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

105 Denne side er tom med vilje Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/

106 Denne side er tom med vilje 106 Håndbog til therascreen KRAS RGQ PCR-kit 08/2014

107 Varemærker: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene, Scorpions, therascreen (QIAGEN Gruppen); ARMS (AstraZeneca Ltd.); FAM, HEX (Life Technologies, Inc.). Registrerede navne, varemærker osv., der bruges i dette dokument, er beskyttet af den relevante lovgivning, også når disse ikke er specifikt markeret som sådan. Må ikke bruges med afføringsprøver. Må ikke bruges med urinprøver. Må ikke bruges med ekstracellulær nukleinsyre fra blodprøver. Må ikke bruges med cellefri knoglemarvsprøver. Må ikke bruges med spytprøver. MED KØBET AF DETTE PRODUKT ERHVERVER BRUGEREN RETTIGHEDER UNDER VISSE ROCHE-PATENTER TIL AT ANVENDE DET TIL DIAGNOSTISKE TJENESTER INDEN FOR HUMAN IN VITRO-DIAGNOSTIK. KØBET GIVER INGEN GENERELLE PATENT- ELLER ANDRE LICENSRETTIGHEDER END DENNE SPECIFIKKE RET TIL BRUG. Aftale om begrænset licens til therascreen KRAS RGQ PCR-kittet Brug af dette produkt betyder, at enhver køber eller bruger af produktet accepterer følgende vilkår: 1. Produktet må kun anvendes i overensstemmelse med protokoller leveret med produktet og denne håndbog og kun med de komponenter, der er i kittet. QIAGEN giver ingen licens, under nogen intellektuel ejendomsret, til at bruge eller inkludere komponenterne i dette kit med komponenter, der ikke er inkluderet i dette kit, undtagen som beskrevet i de protokoller, der følger med produktet, denne håndbog og andre protokoller, der er tilgængelige på Nogen af disse andre protokoller er stillet til rådighed af QIAGEN-brugere for QIAGEN-brugere. Disse protokoller er ikke grundigt testet eller optimeret af QIAGEN. QIAGEN hverken garanterer for dem eller for, at de ikke overtræder tredjeparts rettigheder. 2. Ud over de udtrykkeligt givne licenser giver QIAGEN ingen garanti for, at dette kit, og/eller brugen af det, ikke overtræder tredjeparts rettigheder. 3. Dette kit og dets komponenter er under licens til engangsbrug og må ikke genbruges, genoprettes eller videresælges. 4. QIAGEN afviser specifikt alle andre licenser, udtrykte eller underforståede, end dem, der udtrykkeligt er angivet. 5. Køberen og brugeren af kittet indvilliger i ikke at tage, eller lade andre tage, skridt der kunne føre til, eller fremme, handlinger der forbydes ovenfor. QIAGEN kan håndhæve forbuddene i denne begrænsede licensaftale ved enhver domstol og vil inddrive alle undersøgelses- og retsomkostninger, herunder advokatsalærer, i ethvert søgsmål for at håndhæve denne begrænsede licensaftale samt alle deres intellektuelle ejendomsrettigheder i forbindelse med kittet og/eller komponenterne deri. For opdaterede licensbetingelser henvises til Aug-14 HB-XXXX QIAGEN, alle rettigheder forbeholdes.

108 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK USA DA Sample & Assay Technologies