TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Til detektering af 7 mutationer i K-RAS-genet

Transkript

1 TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Til detektering af 7 mutationer i K-RAS-genet Til brug i Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (Katalognr ) Og Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (Varenummer: ) Inkluderer brugermanual til LightCycler Adapt Software v1.1 fra Roche Diagnostics (katalognr ) til TheraScreen : K-RAS Mutation Kit CE-IVD Brugsvejledning Produktkoder Kitstørrelse DxS-produktkode Roche Diagnostics bestillingsnummer 20 reaktioner KR reaktioner KR Instruktionsversion: DU001g Revisionsdato: maj 2009 Opbevares ved -18 C til -25 C Side 1 af 38

2 Indhold 1. Tilsigtet brug / brugsindikationer Opsummering og forklaring af testen Teknologiske principper Reagenser ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Opbevaringsforhold, stabilitet og forsendelsesbetingelser Instrument Prøver K-RAS Mutationsdetekteringsprotokol Procedurebegrænsninger Karakteristika for analyseydelse Teknisk assistance Fabrikant- og distributørinformation Dato for udstedelse af seneste revision Referencer Information til køber: Side 2 af 38

3 VIGTIGT: Læs disse instruktioner grundigt igennem, og blive bekendt med alle K-RAS-kittets komponenter, inden udstyret tages i brug. 1. Tilsigtet brug / brugsindikationer Tilsigtet brug DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (K-RAS-kit) er en in vitro diagnostisk test, der er beregnet til påvisning af syv somatiske mutationer i K-RASonkogenet, og som vil give en kvalitativ vurdering af mutationsstatus. K-RAS-kittet skal anvendes af uddannet laboratoriepersonale i et professionelt laboratoriemiljø med DNA-prøver, der er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejret colorektalvæv. Brugsindikationer Resultaterne af K-RAS-kittet er beregnet til at hjælpe lægen med at identificere patienter med colorektal cancer, som måske ikke vil have gavn af behandling med antiepidermal vækstfaktor (EGFR) som panitumumab eller cetuximab. K-RAS-kittet er ikke beregnet til diagnosticering af colorektal cancer. Det er beregnet som et supplement til andre relevante prognostiske faktorer, der anvendes til udvælgelse af egnede patienter til behandling med anti-egfr behandlinger, baseret på patientens mutationsstatus. Patientens mutationsstatus vil sammen med andre sygdomsfaktorer blive vurderet af en kliniker for at træffe beslutning om behandling. Der bør ikke træffes nogen behandlingsbeslutninger for cancerpatienter, der alene er baseret på K-RAS-mutationsstatus. 2. Opsummering og forklaring af testen KRAS-kittet er CE-mærket diagnostisk udstyr i overensstemmelse med EU s Direktiv 98/79/EC om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik. Mutationer i K-RAS-onkogenet findes hyppigt ved human cancer (1-4). Tilstedeværelsen af disse mutationer falder sammen med en manglende respons på visse cancerbehandlinger med EGFR-hæmmere hos patienter med metastatisk colorektal cancer (5-10) (14-21). Det er muligt at detektere syv mutationer i K-RAS-genet i en baggrund af vildtype genomisk DNA i en real-time PCR-analyse, baseret på DxS Scorpions -teknologi. Denne metode er meget selektiv. Forudsat at der er tilstrækkelige kopier af DNA, er det muligt at påvise cirka 1% mutant i en baggrund af vildtype genomisk DNA. K-RAS-kittet påviser syv K-RAS-mutationer i codon 12 og 13 af K-RASonkogenet som vist i Tabel 1 nedenfor. Side 3 af 38

4 Tabel 1: K-RAS-mutationer påvist med DxS-kittet Kosmisk ID stammer fra Catalogue of Somatic Mutations in Cancer Mutation Basisændring Kosmisk ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) Teknologiske principper K-RAS-kittet kombinerer to teknologier, ARMS og Scorpions (11, 12, 13), til detektering af mutationer i real-time PCR-analyser. ARMS Allele- eller mutationsspecifik forstærkning opnås ved ARMS. Taq DNApolymerase er ekstremt effektiv til at skelne mellem en match og en fejlmatch i 3 -enden af en PCR-primer. Specifikke muterede sekvenser kan forstærkes selektivt, selv i prøver hvor størsteparten af sekvenserne ikke bærer mutationen som: Når primeren er fuldstændig matchet, fortsætter forstærkningen med fuld effektivitet. Når 3 -basen ikke er matchet, forekommer der kun baggrundsforstærkning på et lavt niveau. Scorpions Påvisning af forstærkning udføres med Scorpions. Scorpions er bifunktionelle molekyler, der indeholder en PCR-primer, der er kovalent kædet til en probe. Fluoroforen i proben reagerer med en quencher, der også er indeholdt i proben, hvilket reducerer fluorescensen. Under en PCR-reaktion, når proben binder sig til amplikonen, bliver fluoroforen og quencheren adskilt. Det fører til en forøget fluorescens i reaktionsrøret. Dataanalyse: Ct-metode Scorpions real time-analyser anvender det antal PCR-cyklusser, der er nødvendige for at påvise et fluorescerende signal over et baggrundssignal som mål for, hvor mange mål-molekyler der er til stede ved starten af reaktionen. Det punkt, hvorved signalet detekteres over baggrundsfluorescensen, kaldes for Cyklus-tærskelværdien (Ct). Prøvens Ct-værdier kalkuleres som forskellen mellem mutationsanalyse- Ct og kontrolanalyse-ct fra den samme prøve. Side 4 af 38

5 Prøverne klassificeres som mutationspositive, hvis de giver en Ct, som er lavere end 1% Ct-værdien for den analyse. Over denne værdi kan prøven enten indeholde mindre end 1% mutation (ud over analysens grænser), eller den er mutationsnegativ. Ved brug af ARMS-primere kan der forekomme en vis ineffektiv priming, hvilket giver en meget sen baggrunds-ct fra DNA, der ikke indeholder mutationen. Alle Ct-værdier, der kalkuleres fra baggrundsforstærkning, vil være højere end 1% Ct-værdierne, og prøven vil blive klassificeret mutationsnegativ. K-RAS-kittet er CE-mærket til in vitro-diagnostisk brug på enten Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler 480 Instrument) 96 brøndformat, Roche varenummer: eller Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System, varenummer (ABI7500). For LightCycler 480 Instrumentet skal K-RAS-kittet anvendes sammen med LightCycler Adapt Software v1.1 til TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Denne software er udviklet til at automatisere bestemmelse af et positivt eller negativt forstærkningsplot og beregner en passende tærskel, hvorfra der skal hentes Ct-værdier. De anvendes til at beregne prøvens Ct-værdier, som sammenlignes med 1% cut-off-værdierne. Softwaren rapporterer et positivt eller negativt mutationsresultat og fjerner eventuel subjektivitet fra analysen og fortolkningen af K-RAS-kittets data. K-RAS-kittets format Der leveres otte analyser med K-RAS-kittet. En kontrolanalyse Syv mutationsanalyser Alle reaktionsblandinger indeholder en exogen kontrolanalyse (intern kontrol) mærket med HEX (til detektering af JOE-detektoren på ABI7500). Den kontrollerer tilstedeværelse af hæmmere, der kan medføre falsknegative resultater. Kontrolanalyse Kontrolanalysen, der er mærket med FAM, anvendes til vurdering af den totale DNA i prøven. Kontrolanalysen forstærker en region af exon 4 af K-RAS-genet. Primere og probe er designet, så alle kendte K-RAS-polymorfismer undgås. Mutationsanalyser Hver mutationsanalyse, der er mærket med FAM, indeholder en Scorpion plus en ARMS-primer for at skelne mellem vildtype-dna og den mutante DNA, der detekteres af en real-time PCR-analyse. Side 5 af 38

6 4. Reagenser Dette K-RAS-kit indeholder reagenser nok til udførelse af kvalitetsvurdering af prøver og køre KRAS-analyser til op til 20 eller 80 reaktioner, afhængig af kittets størrelser. Kitstørrelse DxS produktkode Roche Diagnostics ordrenummer 20 reaktioner KR reaktioner KR Antallet af prøver, som kan testes, afhænger af prøvernes batchstørrelse. Tabel 2: K-RAS-kittets indhold Leverede reagenser 20 reaktioner 80 reaktioner Rør Volumen Volumen Kontrolreaktionsblanding 1300 µl 5200 µl 1 12ALA reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 2 12ASP reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 3 12ARG reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 4 12CYS reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 5 12SER reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 6 12VAL reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 7 13ASP reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 8 Blandingsstandard 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA-polymerase 60 µl 240 µl 10 Udstyr og reagenser, der ikke leveres med K-RAS-kittet Brugeren skal have følgende udstyr og forbrugsstoffer: LightCycler 480 Instrument eller ABI7500 Real-time PCR Machine, som kan foretage cycling som defineret i afsnit 9; K-RAS Mutation Detection Protocol. LightCycler Adapt Software v1.1 fra Roche Diagnostics (Katalognr ). 0,2 ml DNAse-fri PCR-plader (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96, katalognummer eller ABI MicroAmp Optical 96-brønd reaktionsplade, varenummer med MicroAmp Optical Adhesive Film, varenummer ). Sterile rør til forberedelse af masterblandinger. Dedikerede pipetter til klargøring af PCR-blanding. Dedikerede pipetter til dispensering af DNA-skabelon. Sterilt, nuklease-frit H 2 0. Side 6 af 38

7 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro-diagnostisk brug. K-RAS-kittet er ikke beregnet til screening for, eller diagnosticering af, nogen som helst form for cancer, herunder colorektal cancer. Det er beregnet til anvendelse som et supplement til andre prognostiske faktorer, der aktuelt anvendes til udvælgelse af patienter, som ikke ville have gavn af anti-egfr cancerbehandling. Behandling af cancerpatienter bør ikke alene baseres på K-RASgenmutationsstatus. En kliniker bør vurdere mutationsstatus for patienten sammen med andre sygdomsfaktorer. K-RAS-kittets indhold kan nedfryses og optøs op til 8 gange uden negativ indvirkning på analysens ydeevne. K-RAS-kittets reagenser MÅ IKKE nedfryses og optøs mere end 8 gange. Bemærk, at tumorprøver er uhomogene, og data fra en tumorprøve muligvis ikke vil være samstemmende med data fra andre præparater fra den samme tumor. Tumorprøver kan også indeholde ikketumorvæv. DNA fra ikke-tumorvæv forventes ikke at indeholde de K-RAS-mutationer, der detekteres af K-RAS-kittet. Alle analyser i K-RAS-kittet genererer korte PCR-produkter. K-RASkittet fungerer imidlertid ikke på meget fragmenteret DNA. DNA-bedømmelser skal baseres på PCR og kan afvige fra kvantificering baseret på optiske densitetsaflæsninger. Der leveres yderligere kontrolreaktionsblanding for at gøre det muligt at vurdere kvalitet og kvantitet af DNA i prøver før kørsel med K-RAS-kittet. Reagenser til K-RAS-kittet er fortyndet optimalt. Yderligere fortynding af reagenserne anbefales ikke og vil medføre tab af ydelse. Brug af mindre end 25 µl reaktionsvolumen anbefales ikke og vil øge risikoen for falsk-negative resultater. Alle reagenser i K-RAS-kittet er formuleret specifikt til brug sammen med de angivne test. Reagenserne i K-RAS-kittet bør ikke erstattes, hvis den optimale ydelse skal bevares. For at sikre optimal aktivitet og ydelse bør Scorpions-primere (som det er tilfældet med alle fluorescens-mærkede molekyler) beskyttes mod lys for at undgå fotoblegning. Udvis ekstrem forsigtighed for at forhindre forurening af PCRreaktioner med syntetisk kontrolmateriale. Det anbefales, at der anvendes separate, dedikerede pipetter til opsætning af reaktionsblandinger og tilføjelse af DNA-skabelon. Klargøring og dispensering af reaktionsblandinger bør udføres i et område, som er adskilt fra skabelontilføjelsen. Rør bør aldrig åbnes efter en PCR-reaktion. Side 7 af 38

8 De enkelte analyser i K-RAS-kittet har deres egne unikke karakteristika. Beregning af resultatet skal ske med reference til de korrekte analyseparametre (se afsnittet om fortolkning af rapport/data). Mutations-Ct-værdier på 38 eller derover skal scores som negative eller som liggende under kittets grænser. Analyserne indeholder en exogen kontrolreaktion (intern kontrol) ud over reaktionen af interesse (se afsnittet Teknologiske principper). Hvis begge analyser mislykkes, skal dataene kasseres, da der kan være hæmmere til stede, som kan medføre falsk-negative resultater. Fortynding af prøven kan mindske hæmmernes effekt, men det bør bemærkes, at dette også vil nedfortynde DNA'et. Almindelige laboratorieforholdsregler skal overholdes, herunder men ikke begrænset til: a) Der må ikke pipetteres med munden b) Der må hverken ryges, spises eller drikkes på områder, hvor prøver og kittets reagenser håndteres c) Vask hænderne grundigt, efter at testen er udført Anvend kun den Taq-polymerase (Taq), som leveres med kittet. Taq må ikke erstattes med andre kit af den samme eller en anden type eller med Taq fra en anden leverandør. Optø kun de reagenser, der skal bruges til hver enkelt kørsel. Undgå at optø hele kittet hver gang for at minimere antallet af nedfrysninger/ optøninger. Sikkerhedsinformation Forsigtig: Alle kemikalier og alt biologisk materiale skal betragtes som potentielt farligt. Prøver er potentielt infektiøse og skal behandles i overensstemmelse hermed. K-RAS-kittet bør kun anvendes af personer, der har fået undervisning i passende laboratorieteknikker. Ved arbejde med komponenterne i dette K-RAS-kit skal der altid bruges egnet laboratoriekittel, engangshandsker og sikkerhedsbriller. Efter brug skal K-RAS-kittets komponenter bortskaffes som klinisk affald. 6. Opbevaringsforhold, stabilitet og forsendelsesbetingelser Opbevaringsforhold Alt indhold i K-RAS-kittet skal umiddelbart efter modtagelsen opbevares mørkt ved en temperatur på mellem -18 C og -25 C i en fryser med konstant temperatur. Undgå unødvendig nedfrysning/optøning af K-RASkittets indhold. Side 8 af 38

9 Stabilitet Anvend ikke K-RAS-kittet efter den angivne udløbsdato. K-RAS-kittets indhold er stabilt indtil udløbsdatoen, hvis det opbevares under de anbefalede forhold og i den originale emballage. K-RAS-kittets indhold kan nedfryses og optøs op til 8 gange uden negativ indvirkning på analysens ydeevne. K-RAS-kittets reagenser MÅ IKKE nedfryses og optøs mere end 8 gange. Forsendelsesbetingelser Indholdet af K-RAS-kittet transporteres på tøris og bør stadig være frosset ved levering. Hvis K-RAS-kittet ikke er i frosset ved levering, hvis den ydre emballage har været åbnet under transporten, hvis forsendelsen ikke indeholder en følgeseddel, brugsanvisning eller reagenserne, bedes du kontakte det lokale Roche Diagnostics-kontor. Se afsnit 12, Teknisk assistance, for kontaktdetaljer. 7. Instrument Der henvises til instrumentets brugermanual for fuld vejledning om installation og brug af real-time PCR-instrumentet. 8. Prøver Prøvemateriale skal være humant genomisk DNA, ekstraheret fra formalinfikserede, paraffinindlejrede colorektale tumorprøver. Prøveindsamling og klargøring 1. Transport af prøver: Standard patologisk metodik for at sikre prøvernes kvalitet. 2. Anbefalet proces til ekstrahering af prøver: DNA-ekstrahering med Qiagen QIAamp DNA FFPE-vævskit (katalognummer 56404). Følgende ændringer til Qiagen-protokollen skal benyttes: FFPE-præparater skal indsamles på objektglas. Overskydende paraffin skal skrabes bort rundt om vævsprøverne med en frisk, steril skalpel. Skrab vævspræparatet ind i mikro-centrifugeringsrør med en frisk skalpel for hver prøve, der ekstraheres. Proteinase K-fordøjelse skal fortsættes til afslutning. Det kan tage op til 48 timer. Prøverne skal elueres i 200 µl ATE-buffer fra Qiagenekstraheringskit. Eventuelle alternative metoder til klargøring af prøver skal valideres af slutbrugeren. Side 9 af 38

10 3. Opbevaring af ekstraheret DNA: Opbevares ved -20 C før analysering. Prøvevurderingsprotokol Den ekstra kontrolanalyseblanding, der leveres med K-RAS-kittet, skal anvendes til vurdering af den totale DNA i prøven. Denne kontrolanalyse forstærker en region af exon 4 af K-RAS-genet. Prøver bør kun sættes op med kontrolanalysen med den blandede standard som en positiv kontrol og vand som ikke-skabelon-kontrol. Bemærk, at prøver skal være samlede i batch for at opnå den optimale anvendelse af reagenser i K-RAS-kittet. Alle prøvekørsler skal indeholde kontroller. Hvis prøver testes individuelt, bruger det flere reagenser og reducerer antallet af prøver, som kan testes med K-RAS-kittet. Opsætningen af protokolplade til prøvevurdering 1. Optø kontrolreaktionsblandingen og den blandede standard fra K-RASkittet. Bland hver opløsning efter optøning ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokaliserede saltkoncentrationer. Klargør tilstrækkelige blandingsmængder til DNA-prøverne, én blandet standardreaktion og én kontrolreaktion uden skabelon samt 2 ekstra reaktioner. 2. Masterblandingen klargøres ved at benytte den mængde reagenser pr. reaktion, som er opgivet i Tabel 3. Tabel 3: Masterblandingsmængder til kontrolanalyse Analyse Masterblanding Reaktionsblanding Taq (µl)x1 (µ)x1 Kontrolanalyse 19,8 0,2 3. Taq og andre reaktionsblandinger, der indeholder Taq, MÅ IKKE vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. 4. Kontrollér, at Taq har stuetemperatur før brug. Centrifugér hætteglasset for at sikre, at alt Taq er samlet i bunden af hætteglasset, og pipettér derefter ved at placere pipettens spids lige under overfladen af Taq, for at minimere risikoen for, at spidsen bliver dækket af overskydende Taq. 5. Bland masterblandingen ved at pipettere forsigtigt op og ned. 6. Tilsæt straks 20 µl af kontrol-masterblandingen i hver reaktionsbrønd. 7. Tilføj straks 5 µl af prøven, blandet standard eller vand (til kontrollerne uden skabelon) til reaktionsbrøndene. 8. Pladen skal være sat op med den blandede standard tilsat brønd A1 og ingen skabelonkontrol (vand) tilsat A2. Alle andre brønde i brug skal indeholde prøverne. Side 10 af 38

11 9. Forsegl og centrifugér PCR-pladen kortvarigt for at samle reagenserne i bunden af brøndene. 10. Følg instrumentopsætningen for den relevante platform. Prøvevurderingsprotokol Opsætning LightCycler 480 Instrument 1. Placer straks pladen i LightCycler 480 Instrument. 2. Vælg ikonen for LightCycler 480 Software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Log på softwaren, og vælg fra skærmbilledet Overview New Experiment from Template. Vælg K-RAS LC480II Run Template fra de opførte kørselsskabeloner. Denne skabelon har følgende parametre: 1. Detekteringsformat er DxS IVD Assays. 2. Reaktionsvolumen er Et indledende holdetrin på 95 C i 4 minutter. 4. En 2-trins forstærkning for 45 cyklusser med en denaturering på 95 C i 30 sekunder og anneale ved 60 C i 1 minut. Fluorescensdetektion er en enkelt detektion ved 60 C-trinnet. 3. Vælg fanen Sample Editor, og vælg afkrydsningsfeltet Abs Quant under Step 1: Select Workflow. Kontrollér, at begge filtre er valgt ( nm og nm) under Select Filter Combinations. Opsæt prøvenavne under Trin 2 og Trin 3. Quantification Sample Type skal indstilles til unknown. Replikatkolonnen skal ikke udfyldes. 4. Vælg knappen Experiment, og klik på knappen Start Run for at gemme eksperimentet og begynde at køre cyklussen. 5. Når kørslen er afsluttet, vælges fanen Analysis og derefter Abs Quant/2nd Derivative Max fra vinduet Create New Analysis. Acceptér standarderne fra skærmbilledet Create New Analysis. Kontrollér, at knappen Filter Comb er , og vælg knappen Calculate. Ctværdier vises i tabellen Samples. 6. Vælg knappen Filter Comb, og skift filtre til nm. Vælg knappen Calculate, og indhent de exogene Ct-kontrolværdier fra tabellen Samples. Opsætning til prøvevurderingsprotokol ABI7500 Instrument 1. Placer straks pladen i ABI7500-instrumentet. 2. Vælg ikonen for 7500 System Software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Åbn en ny kørselsfil fra filmenuen i 7500 Sequence Detection Software version 1.4. Side 11 af 38

12 3. Under Assay vælges Standard Curve (Absolute Quantification). Under Run Mode vælges Standard Gå til detektor-opsætningsvinduet ved at vælge knappen Next. Tilføj en FAM- og en JOE-detektor med quencher indstillet til none på detektorlisten. Vælg knappen New Detectors, hvis disse detektorer ikke allerede findes, og sæt en FAM- og en JOE-detektor op med quencher indstillet til none. 5. Indstil Passive Reference til None, og vælg knappen Next. 6. Vælg hele pladen, og afkryds feltet for FAM- og JOE-detektorer for at sikre, at begge farver monitoreres i hver brønd. Vælg knappen Finish. 7. Opsæt cycling som vist i Tabel 4 under fanen Instrument. Tabel 4: ABI7500 cyklustilstande Temperatur Tid Cyklusser Dataindsamling Stadium 1 95 o C 4 min 1 Stadium 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 8. Vælg knappen Start for at gemme prøven og påbegynde cyklussen. 9. Sørg for, når kørslen er afsluttet, at den passive reference er indstillet på none på brøndinspektionsskærmen. Vælg alle de brønde, der er i brug, i fanen Amplification Plot, og vælg farve JOE fra detektorrullemenuen. 10. Kontrollér JOE-signalet fra hver prøve, og sammenlign med JOEsignalet i NYC-brønden. Notér eventuelle prøver med en senere forstærkningskurve eller mislykket forstærkning for den exogene kontrol sammenlignet med NTC. 11. Vælg alle de brønde, der er i brug, i fanebladet Amplification Plot, og vælg FAM-farve fra detektor-rullemenuen. Brug den automatiske baseline-indstilling og manuel Ct, og indstil derefter tærskelværdien manuelt i midten af den eksponentielle fase med logskalaen til Y-aksen, som beskrevet i brugervejledningen til ABI Vælg knappen Analyse for at få vist Ct-værdier. Side 12 af 38

13 Tolkning af prøvebedømmelse Bedøm NTC Ct-værdier for at sikre, at der ikke er nogen kontaminering, som giver positiv forstærkning i FAM-kanalen (Ct mindre end 40) eller en mislykket exogen kontrolreaktion i HEX-kanalen (ingen Ct), som tyder på et opsætningsproblem. Den blandede standard bør give en kontrolanalyse Ct (FAM-kanal) på på ABI7500 og 29 på LightCycler 480 Instrumentet. Data må ikke anvendes, hvis en af disse to kørselskontroller er mislykket. Kontrolanalyse Ct 29-35: Fortolkes med forsigtighed, da meget lave mutationsniveauer måske ikke detekteres. Kontrolanalyse Ct 35-38: Der er kun få kopier af DNA i prøverne, der kan forstærkes, og mutationer vil sandsynligvis kun blive set, hvis de fleste kopier muteres. Kontrolanalyse Ct 38: Afvis prøven, da der er minimalt DNA til stede, og K-RAS-kittet ikke kan påvise mutationer. Bemærk, at hvis en prøve giver en sen kontrolanalyse-ct, skal prøvens exogene kontrol-ct sammenlignes med den exogene kontrol fra NTC. Hvis den exogene kontrol fra prøven er forsinket eller negativ sammenlignet med NTC, kan der være en hæmmer til stede. Det er muligt at reducere hæmmerens effekt ved at fortynde prøven, selvom dette også fortynder DNA et. Fortynding af prøven: En kontrol-ct på < 24 overbelaster mutationsanalyserne. Prøver med en kontrol-ct på < 24 skal fortyndes. Bemærk, at for LightCycler 480 Instrument kan Ct-værdier indhentet via den 2. derivatmetode være en smule forskellig fra værdierne, som fremkom via LightCycler Adapt Software. Det anbefales, at koncentrerede prøver fortyndes for at falde inden for området > 24 men < 29 (Ct-værdier baseret på 7500 Sequence Detection Software eller LightCycler 480 Instrument Software) med den basis, at ved at fortynde ½ stiger Ct med K-RAS Mutationsdetekteringsprotokol Læs disse instruktioner grundigt igennem, og blive bekendt med alle K-RAS-kittets komponenter, inden udstyret tages i brug. For at bruge K-RAS-kittet effektivt skal prøver samles i batchstørrelser på 10 (for at fylde en plade med 96 brønde). Mindre batchstørrelser betyder, at der kan testes færre prøver med K-RAS-kittet. Prøveopsætning af LightCycler 480 Instrument For hver DNA-prøve skal kontrol- og mutationsanalyser analyseres i samme PCR-kørsel for at undgå variationer mellem kørslerne. Side 13 af 38

14 1. Optø reaktionsblandingerne og den blandede standard fra K-RASkittet til stuetemperatur. Bland hver opløsning efter optøning ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokaliserede saltkoncentrationer. Forbered tilstrækkelige blandinger til DNA-prøverne, den blandede standard og kontroller uden skabelon samt 2 ekstra reaktioner pr. blanding, som vist i Tabel 5. Tabel 5: Mængder til K-RAS-masterblandinger Analyse Reaktionsblanding (µ)x1 Masterblandinger Reaktionsblanding Taq (µl)x1 (µl) pr. plade (x14) Taq (µl) pr. plade (x14) Kontrolanalyse 19,8 0,2 277,2 2,8 Mutationsanalyser 19,8 0,2 277,2 2,8 2. Taq og andre reaktionsblandinger, der indeholder Taq, MÅ IKKE vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. 3. Kontroller, at Taq har stuetemperatur før brug. Centrifugér hætteglasset for at sikre, at alt Taq er samlet i bunden af hætteglasset, og pipettér derefter ved at placere pipettens spids lige under overfladen af Taq for at minimere risikoen for, at spidsen bliver dækket af overskydende Taq. 4. Bland masterblandingerne ved at pipettere forsigtigt op og ned. 5. Tilføj straks 20 µl af masterblandingerne i reaktionsbrøndene. 6. Tilføj straks 5 µl af prøven, blandet standard eller vand (til kontrollerne uden skabelon) til reaktionsbrøndene. Hver DNA-prøve skal testes med både kontrol- og alle mutationsanalyser. Opsætning af pladen vises i Tabel 6. Side 14 af 38

15 Tabel 6: K-RAS-kit pladelayout layout ved 96 brønde Analyse A Kontrol B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve Forsegl og centrifugér PCR-pladen kortvarigt for at samle reagenserne i bunden af brøndene. 8. Placer straks pladen i LightCycler 480 Instrument. Opsætning for LightCycler 480 Instrument 1. Vælg ikonen for LightCycler 480 Instrument software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Log på softwaren, og vælg fra oversigtssiden New Experiment from Template. 2. Vælg K-RAS LC480II Run Template fra listen Run Templates (se afsnittet LightCycler 480 Instrument prøvebedømmelse for detaljer). 3. Vælg fanen Sample Editor under Step 1: Select Workflow og vælg afkrydsningsfeltet Abs Quant. Kontroller, at begge filtre er valgt ( nm og nm) under Select Filter Combinations. Opsæt prøvenavne under Step 2 og Step 3. I kolonne 1 skal prøvenavnet være Mixed Standard. I kolonne 2 skal prøvenavnet være NTC. I kolonne 3-12 skal prøvenavnene indtastes. Navnene skal være identiske for alle brønde i 1 kolonne. Quantification Sample Type skal indstilles til unknown. Replikatkolonnen skal ikke udfyldes, da LightCycler Adapt Software ikke tager replikater i betragtning. 4. Vælg knappen Experiment, og klik på knappen Start Run for at gemme prøven og begynde at køre cyklussen. LightCycler 480 Instrument prøveanalyse 1. Når LightCycler 480 Instrument-kørslen er afsluttet, eksporteres prøven (.ixo fil) ved hjælp af navigator-vinduet til en egnet placering, hvortil LightCycler Adapt Software kan få adgang. Side 15 af 38

16 2. VIGTIGT: LightCycler Adapt Software er godkendt til brug på et enkeltcomputersystem defineret som en enkelt kontrolenhed (arbejdsstation) leveret af Roche Diagnostics til brug sammen med et enkelt LightCycler 480 Instrument II. Denne godkendelse af LightCycler Adapt Software er aktuelt kun gældende for kontrolenheden, som er en standalone computer (dvs. ikke del af et netværk). Det er ikke tilladt at benytte nogen anden computer, da softwaren måske ikke vil fungere efter hensigten. 3. Åbn LightCycler Adapt Software ved at klikke på ikonen LightCycler Adapt Software på arbejdsstationens skrivebord, og udfyld feltet til brugernavn. Dette navn indtastes som rapportforfatter. 4. Brug browserknappen i hovedvinduet for at vælge en enkelt LightCycler 480 Instrument kørselsfil (for at fjerne et valg skal softwaren lukkes og åbnes igen). 5. Vælg en rapporttype (pdf eller csv). Hvis csv vælges, oprettes der også automatisk en pdf-version. 6. Vælg Analyse for at oprette resultatrapporten. Rapporten gemmes automatisk i folderen med kørselfilen og får det samme navn som kørselsfilen. 7. Rapporten vises automatisk. 8. De rapporterede resultater vises i kolonnen Mutation Status i tabellen Sample Result Table. LightCycler Adapt Software rapportfortolkning 1. LightCycler Adapt Software-rapporten indeholder generel information om analysen Rapportforfatteren er personen, som har kørt softwaren og oprettet rapporten Dato og tidspunkt for analysen vises. 2. Rapporten giver en oversigt over analysen med detaljer om det anvendte kørselsfilnavn plus algoritmedefinitionsfil og algoritmesekvens. Algoritmedetaljerne er faste og kan ikke ændres. 3. Resultatafsnittet indeholder det fulde navn og filstien for LightCycler 480 Instrument-kørslen samt følgende detaljer: 3.1. LightCycler 480 Instrument-serienummer Instrument Name-identifikatior for LightCycler 480 Instrument i LightCycler 480 Instrument Software Run Date-Dato og tid for LightCycler 480 Instrument-kørsel Run Operator-navnet på personen, som var logget på LightCycler 480 Instrument-softwaren, da prøven blev kørt Experiment Name-Kørslens filnavn Software Version-version af den software, som er anvendt på LightCycler 480 Instrument. Side 16 af 38

17 3.7. Lot Number-fra feltet Lot No i prøvens opsætningsskærm i LightCycler 480 Instrument-softwaren. 4. Pladens layout opgives med prøvenavne fra LightCycler 480 Instrument softwarens prøveeditor-skærmbillede. 5. Der opgives et Run Summary Result, hvor kørslen mærkes med Valid eller Invalid. Dette afhænger af kørselskontrollerne i kolonnerne 1 og Kørselskontroller 6.1. LightCycler Adapt Software beregner automatisk Ct-værdien for den blandede standard ved hjælp af formlen Mutation Ct-Kontrol Ct= Ct 6.2. LightCycler Adapt Software sammenligner værdierne i de forventede værdier i Tabel 7. Tabel 7: LightCycler Adapt Software forventede Ct-værdier Analyse Blandet standard Ct 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0, Ct- og Ct-værdierne rapporteres Følgende Flag/Advarsler rapporteres for kørselskontrollerne i kolonne 1 og 2: Tabel 8: LightCycler Adapt Software Flag/Advarsler for kørselskontrollerne Flag/Advarsler CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Betydning FAM Ct for kontrolanalyse er uden for måleområde For den blandede standard er den exogene kontrol- Ct<30 eller er negativ, når FAM-resultaterne er negative Mutations- Ct-værdier er uden for det indstillede område. Den exogene kontrolreaktion er mislykket i en NTC FAM-reaktionen har en positiv Ct-værdi i en NTC Betydningerne af Flag/Advarsler findes mere detaljeret nedenfor: CT_OUT_OF_RANGE-Kontrolanalysen for den blandede standard skal have en Ct-værdi på 26,60 ± 2. Side 17 af 38

18 Hvis analysen er uden for måleområdet, vises Flag/Advarsel for alle blandede standardbrønde, da Ctværdier ikke beregnes, og den blandede standard er ugyldig. Det betyder, at kontrolanalysen ikke fungerer korrekt EXO_FAIL-Flag/Advarsel vises, hvis den exogene kontrolanalyse i en af de blandede standardbrønde ligger under 30, da det kan tyde på, at der er PCRkontaminering i denne blanding. Hvis den exogene kontrolanalyse mislykkes, når en FAM-reaktion mislykkes i en af de blandede standardbrønde, vises EXO_FAIL Flag/Advarsel også. Det betyder, at der er et problem med denne analyse, som kan medføre falsknegative resultater. Den blandede standard er allerede ugyldig på grund af den mislykkede FAM DELTA_CT_OUT_OF_RANGE-Hvis de blandede standard Ct-værdier ligger inden for ±2,00 af værdierne i Tabel 7, rapporterer softwaren en gyldig status. Hvis Ct er uden for det forventede område, er status ugyldig, og Flag/Advarsel vises. Det tyder på et problem med en analyse, som kan føre til falske negative resultater EXO_CONTROL_INVALID-I kontrolbrøndene uden skabelon skal den exogene kontrolanalyse give et positivt resultat i alle 8 brønde (Ct < 41). Hvis der opstår et negativt resultat, vises Flag/Advarsel og der vises en ugyldig status. Det tyder på et problem med en analyse, som kan føre til falske negative resultater TARGET_CHANNEL_INVALID-I de 8 kontroller uden skabelon skal FAM-resultaterne være negative (Ct > 38). En hvilken som helst forstærkning er tegn på kontaminering. Et positivt resultat medfører, at Flag/ Advarsel vises og gør kontrollen uden skabelon ugyldig I tilfælde af en ugyldig status for en af brøndene med blandet standard eller brønde uden skabelonkontrol vil Run Summary Result være Run Invalid. I Sample Result Table rapporteres prøvenavne og kontrol-ct-værdier, men mutationsstatus rapporteres som invalid. Den blandede standard viser, at alle analyser fungerer korrekt. Hvis dette viser sig ikke at være tilfældet, kan det medføre en falsk positiv eller falsk negativ mutationsbestemmelse. Kontrollen uden skabelon viser, at der ikke er nogen kontaminering i masterblandingerne, og at den exogene kontrol fungerer som forventet Se Afsnit 12 Teknisk assistance i det usandsynlige tilfælde, at LightCycler Adapt Software viser en fejlmeddelelse. 7. Prøveresultater 7.1. Sample Result Table viser prøvenavne taget fra LightCycler 480 Instrument software, samt Ct-værdier for kontrolanalysen. Side 18 af 38

19 7.2. LightCycler 480 Adapt Software beregner Ct-værdier og fastlægger, om en prøve er mutationspositiv eller negativ baseret på 1% cut-off-værdier i Tabel 9. Tabel 9: LightCycler Adapt Software 1% cut-off-værdier Analyse 1% delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9, Hvis en mutation Ct-værdi for en prøve ligger under den tilsvarende 1% Ct-cut-off-værdi, kaldes prøven mutationspositiv. LightCycler Adapt Software rapporterer, hvilken mutation det drejer sig om, men rapporterer kun en enkelt mutation. Hvis der er 2 positive Ct-værdier, rapporteres den mindste værdi. Det antages, at den anden værdi er fremkommet via krydsreaktivitet mellem en mutationsprimerbinding og priming fra en anden mutation. I sjældne tilfælde, hvor der er en dobbeltmutation, er den kliniske beslutning den samme som tilfældet med en enkelt mutation Hvis prøvens Ct-værdier er større end 1% Ct-værdier, rapporteres prøven som mutationsnegativ (kan indeholde en mutation, men på et niveau som er under kittets grænser) Flag/Advarsler LightCycler Adapt Software rapporterer et antal Flag/ Advarsler for prøverne i Sample Result Table som beskrevet i Tabel 10. Tabel 10: LightCycler Adapt Software prøve-flag/advarsler Flag/Advarsler Betydning REP_DILUTION Kontrol-Ct er under 24 CONF_LEVEL Kontrol-Ct er højere end 28,9, og der er ikke rapporteret mutation LIMITED Kontrol-Ct er over 35 EXO_FAIL Den exogene kontrolanalyse er ugyldig, når FAM-reaktionen også er ugyldig i en mutationsreaktion, eller den exogene kontrol-ct er mindre end 30. FAIL Softwaren kan ikke bestemme en kurve som positiv eller negativ Betydningerne af Flag/Advarsler findes mere detaljeret nedenfor: REP_DILUTION-Kontrol-Ct < 24. Analyserne er kontrolleret til et DNA-niveau, som giver en kontrol-ct på 24 eller derover. Side 19 af 38

20 Hvis en prøve giver en lavere kontrolanalyse-ct, skal den fortyndes for at sikre, at den falder inden for det gyldige arbejdsområde CONF_LEVEL-Kontrol-Ct > 28,9. CONF_LEVEL Flag/ Advarsel vises i en negativ prøve med en kontrol-ct > 28,9. Mutations-Ct-værdier klassificeres som negative eller uden for kittets grænser, når de er større end eller lig med 38. Det er nødvendigt at have en kontrol-ct på 28,9 eller derunder for at få tilstrækkeligt DNA til at gøre det muligt at detektere 1% mutation med cut-off-værdier på 1% og Ct cut-off-værdi på 38. Hvis kontrol-ct er højere end 28,9, og der påvises en mutation, vises den positive mutation, og Flag/Advarsel vises ikke, da denne prøve indeholder en definitiv mutation. Hvis kontrol-ct imidlertid er større end 28,9, og prøven ser ud til at være mutationsnegativ, vises Flag/Advarsel for at advare om, at mutationer med lave niveauer kan være overset. Når kontrol-ct stiger til over 28,9, falder mutationspåvirkningens følsomhed LIMITED-Kontrol-Ct > 35. Dette viser, at der er meget lidt DNA tilgængeligt til forstærkning, således at kun mutationer med en høj procentdel kan påvises. Hvis en positiv mutation giver en Ct < 38 i LIMITED-prøver, får mutationen stadig tildelt en gyldig status og rapporteres. Tilstedeværelse af mutationer i lavt niveau i en prøve med et negativt resultat og LIMITED Flag/Advarsel kan ikke lades ude af betragtning EXO_FAIL- Softwaren kontrollerer forstærkning af den exogene kontrolanalyse for at fastslå, om der kan være en hæmmer, som kan give falsk negative resultater. Følgende logik kan benyttes:- a. Den exogene kontrolreaktion bedømmes kun i mutationsreaktionsbrøndene, ikke i kontrolanalysebrønden, med undtagelse af den blandede standard og NTC-kolonner (se punkt 6), eller hvis der er en exogen kontrol-ct < 30. b. Hvis der er et positivt mutationsresultat, men den exogene kontrolanalyse er ugyldig i den mutationspositive brønd, vises EXO_FAIL Flag/Advarsel ikke, da der kan være konkurrerende hæmning fra FAMreaktionen. Mutationsstatus er gyldig. c. Hvis der er en positiv mutationsmeddelelse for en prøve i én mutationsbrønd og en ugyldig exogen kontrolanalyse i en anden mutationsbrønd for samme prøve, vises mutationen i første brønd, og resultatet er godkendt. Der vises imidlertid EXO_FAIL Flag/ Advarsel. Side 20 af 38

21 Det betyder, at der er et problem med analysen i brønden med den mislykkede exogene kontrolanalyse, og en mutation kan være blevet overset i denne brønd. Det er muligt, at den viste mutation er en krydsreaktion mellem analyserne snarere end den sande mutation, som er overset. Imidlertid forbliver mutationsstatus i analysen, som rapporterer den positive mutationsbestemmelse, gyldig, da der er en klar mutation, og den kliniske beslutning er den samme, uanset hvilken mutation der er tale om. d. Hvis prøven vises som negativ, men en exogen kontrolreaktion er ugyldig i en hvilken som helst af mutationsanalyserne, vises EXO_FAIL Flag/Advarsel, og status er ugyldig. Det er muligt, at en mutation kan være overset. e. Hvis den exogene kontrolanalyse-ct er < 30 i en af de 8 brønde, vises EXO_FAIL Flag/Advarsel, og status er ugyldig. Det er muligt, at der er PCR-produktkontaminering i denne analyse. f. LightCycler 480 Instrument kørselsfilen kan kontrolleres for at fastlægge den mulige årsag til mislykket exogen kontrolanalyse. Hvis alle de exogene kontrolreaktioner i en kolonne er ugyldige, kan der være en hæmmer til stede. Hvis den kun er ugyldig i 1 brønd, kan det være et problem med opsætningen af pladen FAIL- Der vises FAIL Flag/Advarsel, når softwaren ikke kan bestemme en forstærkningskurve som positiv eller negativ, for eksempel hvis kurven har en unormal form LightCycler Adapt Software kontrollerer, at prøvenavnet i en kolonne er identisk for at sikre, at mutation- og kontrolanalyse-ct-værdierne, som er anvendt til beregning af Ct-værdierne, er fra samme prøve. Prøvenavnene er taget fra LightCycler 480 Instrument prøveredigeringsskærmen i prøvekørselsfilen. Hvis der længere nede i kolonnen er en værdier, som ikke passer sammen, rapporterer softwaren SAMPLE MISMATCH i kolonnen Sample Name i tabellen Sample Result Table. I pladelayoutet rapporterer softwaren prøvenavnet efterfulgt af (MISMATCH). Hvis dette er en skrivefejl, kan navnet ændres i LightCycler 480 Instrument kørselsfil, og dataene kan analyseres igen med LightCycler Adapt Software. Side 21 af 38

22 ABI7500 Prøveopsætning For hver DNA-prøve skal kontrol- og mutationsanalyser analyseres i samme PCR-kørsel for at undgå variationer mellem kørslerne. 1. Optø reaktionsblandingerne og den blandede standard fra K-RASkittet til stuetemperatur. Bland hver opløsning efter optøning ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokaliserede saltkoncentrationer. Forbered tilstrækkelige blandinger til DNAprøverne, den blandede standard og kontroller uden skabelon samt 2 ekstra reaktioner pr. blanding, som vist i Tabel 11. Tabel 11: Mængder til K-RAS-masterblandinger Analyse Reaktions-blanding (µ)x1 Masterblandinger Reaktionsblanding Taq (µl)x1 (µl) pr. plade (x14) Taq (µl) pr. plade (x14) Kontrolanalyse 19,8 0,2 277,2 2,8 Mutationsanalyser 19,8 0,2 277,2 2,8 2. Taq og andre reaktionsblandinger, der indeholder Taq, MÅ IKKE vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. 3. Kontroller, at Taq har stuetemperatur før brug. Centrifugér hætteglasset for at sikre, at alt Taq er samlet i bunden af hætteglasset, og pipettér derefter ved at placere pipettens spids lige under overfladen af Taq for at minimere risikoen for, at spidsen bliver dækket af overskydende Taq. 4. Bland masterblandingerne ved at pipettere forsigtigt op og ned. 5. Tilføj straks 20 µl af masterblandingerne i reaktionsbrøndene. 6. Tilføj straks 5 µl af prøven, blandet standard eller vand (til kontrollerne uden skabelon) til reaktionsbrøndene. Hver DNA-prøve skal testes med både kontrol- og mutationsanalysen. Opsætning af pladen vises i Tabel 12. Side 22 af 38

23 Tabel 12: ABI7500 K-RAS pladelayout layout ved 96 brønde Analyse A Kontrol B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve Forsegl og centrifugér PCR-pladen kortvarigt for at samle reagenserne i bunden af brøndene. 8. Placer straks pladen i ABI7500-instrumentet. Opsætning af ABI7500 Instrument 1. Vælg ikonen for 7500 System Software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Åbn en ny kørselsfil fra filmenuen med 7500 Sequence Detection Software version Under Assay vælges Standard Curve (Absolute Quantification). Under Run Mode vælges Standard Gå til detektor-opsætningsvinduet ved at vælge knappen Next. Tilføj en FAM- og en JOE-detektor med quencher indstillet til none på detektorlisten. Vælg knappen New Detectors, hvis disse detektorer ikke allerede findes, og sæt en FAM- og en JOE-detektor op med quencher indstillet til none. 4. Indstil Passive Reference til None, og vælg knappen Next. 5. Vælg hele pladen, og afkryds feltet for FAM- og JOE-detektorer for at sikre, at begge farver monitoreres i hver brønd. Vælg knappen Finish. 6. Opsæt cycling som vist i Tabel 13 under fanen Instrument. Side 23 af 38

24 Tabel 13: ABI7500 cyklustilstande Temperatur Tid Cyklusser Dataindsamling Stadium 1 95 o C 4 min 1 Stadium 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 7. Vælg knappen Start for at gemme prøven og påbegynde cyklussen. ABI7500 prøveanalyse 1. Kontrollér, at den passive reference er indstillet på none på brøndinspektionsskærmen. 2. Kontrollér, at hver brønd giver et JOE-signal fra den exogene kontrolanalyse. a. Hvis den exogene kontrolanalyse giver et positivt resultat, fortsættes analysen. b. Hvis den exogene kontrolanalyse er mislykket, men FAMreaktionen er kraftigt forstærket, fortsættes analysen, da FAMreaktionen har udkonkurreret den exogene kontrolreaktion. c. Hvis både FAM og de exogene kontrolreaktioner er mislykkede, skal dataene kasseres, da der kan være hæmmere til stede. Disse hæmmere kan medføre falsk-negative resultater. 3. Vælg alle de brønde, der er i brug, i fanebladet Amplification Plot, og vælg FAM-farve fra detektor-rullemenuen. Brug den automatiske baseline-indstilling og manuel Ct, og indstil derefter tærskelværdien manuelt i midten af den eksponentielle fase med logskalaen til Y-aksen, som beskrevet i ABI7500-brugervejledningen. 4. Analysér dataene, og beregn Ct-værdier som følger: [prøvemutationsanalyse Ct] [prøvekontrolanalyse Ct] = Ct Data kan eksporteres til Microsoft Excel for at gøre dem nemmere at analysere. ABI7500 datafortolkning 1. Kontrol-Ct-værdier: 1.1. Kontrol-Ct-værdien skal være 24 for at undgå overbelastning af analysen Kontrol-Ct < 29: K-RAS-kittet er i stand til at påvise ned til 1% mutation i disse prøver I prøver med en kontrol-ct 29 påviser kittet ikke mutation ned til 1%, men vil stadig kunne påvise mutationer på højere niveau Kontrol-Ct 35 der er kun få kopier af DNA, der kan forstærkes, i prøven, og mutationer vil sandsynligvis kun blive set, hvis de fleste kopier muteres Kontrol-Ct 38, DNA er begrænset, og data må ikke anvendes. Side 24 af 38

25 2. Blandet standard Ct-værdier 2.1. Blandet standard- Ct-værdier skal være som angivet i Tabel 14 nedenfor, men der kan forekomme en variation på ±2 pga. forskellige tærskelværdiindstillinger på forskellige instrumenter. Tabel 14: ABI7500 Blandet standard Ct-værdier og 1% cut-off-punkter Analyser Blandet standard Ct Blandet standard acceptabelt område Prøve 1% Ct 12ALA -0,70-2,70 to 1,30 6,5 12ASP -1,04-3,04 to 0, ARG -0,02-2,02 to 1, CYS -0,98-2,98 to 1, SER 0,02-1,98 to 2, VAL -0,19-2,19 to 1,81 6,5 13ASP -1,12-3,12 to 0, Prøve- Ct-værdier: 3.1. Hvis prøve- Ct er større end 1%-værdien (som angivet i Tabel 14), klassificeres DNA-prøven som mutationsnegativ eller som liggende under K-RAS-kittets grænser Hvis prøvens Ct er mindre end 1%-værdien, klassificeres DNAprøven som mutationspositiv Mutation Ct-værdier på 38 eller derover skal scores som negative eller som under kittets grænser. 10. Procedurebegrænsninger Der skal være en prøvekontrolanalyse Ct på <29 på ABI7500 og <28,9 på LightCycler 480 Instrument for at påvise 1% mutation på en baggrund af vildtype DNA. Analyserne kan ikke påvise 1% mutation i prøver med større kontrol-ct-værdier, og sensitiviteten for mutationspåvisning falder, når kontrol-ct stiger over disse værdier. Kontrol-Ct-værdien for prøve-dna er baseret på koncentrationen bestemt ved PCR. Værdier baseret på optiske densitetsaflæsninger svarer ikke til kontrolanalysens Ct-værdier i fragmenterede DNA-prøver. Yderligere kontrolreaktionsblanding leveres for at gøre det muligt at vurdere prøve- Ct erne, før kittet køres. Hvis en prøve giver et mutationspositivt resultat, hvor mutations-ct 38, skal analysen scores som negativ eller under kittets grænser. Det foregår automatisk med LightCycler Adapt Software Der kan forekomme nogen krydsreaktivitet mellem mutationsreaktioner. Hvis der f.eks. ses en 12 ALA mutation på højt niveau, vil nogle af de andre mutationsreaktioner også give et positivt resultat. Det skyldes ARMSprimere, som påviser andre mutationer i nogle få af hinandens baser. Side 25 af 38

26 Med syntetisk kontrolmateriale danner krydsreaktiviteten et aflæseligt mønster på ABI7500, som gør det muligt at bestemme den sande positive fra adskillige signaler (se Tabel 15). Tabel 15: Krydsreaktivitetsmønster på ABI7500 fra syntetisk kontrolmateriale Ja indikerer det sande signal. Tal angiver det omtrentlige antal cyklusser efter det sande signal, hvor der kan ses et krydsreaktivitetssignal. Der er ikke anført mere end 9 cyklusser, da disse vil være i den negative zone. Positiv prøve 12ALA signal 12ASP signal 12ARG signal 12CYS signal 12SER signal 12VAL signal 13ASP signal 12ALA Ja ASP 9 Ja ARG - - Ja CYS Ja SER Ja VAL Ja - 13ASP Ja Bemærk: Krydsreaktivitetsmønstret kan være forskelligt for forskellige DNA-prøver, som f.eks. paraffinindstøbte DNA-prøver. K-RAS-kittet er designet til at påvise én mutation i en DNA-prøve. Hvis en anden mutationsanalyse giver et positivt resultat, er dette sandsynligvis krydsreaktivitet. Selvom det er sjældent, er der imidlertid observeret dobbeltmutanter. Hvis mønstret ikke passer til krydsreaktivitetsmønstret, kan det være nødvendigt at foretage yderligere undersøgelser. 11. Karakteristika for analyseydelse Analyseydelsen er karakteriseret for K-RAS-kittet på ABI7500 og LightCycler 480 Instrument (med LightCycler Adapt Software til at indhente Ct-værdier.) Der er foretaget flere forskellige test på hvert instrument. Resultaterne af disse test resumeres nedenfor. 1% cut-off validering: LightCycler 480 Instrument: Påvisning af 1% mutation i en baggrund af DNA med K-RAS mutationsnegativ cellelinje blev fastlagt på et område med tre forskellige koncentrationer af cellelinje-dna for at tildele en cut-off Ct-værdi for hver mutationsanalyse. For hver analyse blev 1% standarder testet tredobbelt ved 3 separate kørsler for både kontrol- og mutationsanalysen. Det blev gentaget af 3 forskellige operatører. Ct-værdier blev indhentet fra LightCycler Adapt Software. 1% Ct-værdierne blev beregnet ud fra alle kombinationer af mutations- og kontrol-ct-værdier i replikaterne inden for en kørsel. Side 26 af 38

27 Cut-off Ct-værdierne blev indstillet som middelværdien for alle kørsler og koncentrationer. Resultaterne af denne testning er opsummeret i afsnittet om datafortolkning. ABI7500: For hver analyse blev 1% fortyndinger testet tredobbelt for hver 3 kit-lots, ved 3 separate kørsler for både kontrol- og mutationsanalysen. Den blandede standard blev anvendt på hver plade for sikre, at analyserne var inden for de specificerede kriterier. 1% Ct-værdierne blev beregnet ud fra gennemsnitlige Ct-værdier over replikaterne inden for en kørsel og lot. Cut-off Ct-værdierne blev sat som den gennemsnitlige værdi (til den nærmeste 0,5) over alle lots, kørsler og koncentrationer for koncentrationer, hvor alle replikater gav en Ct-værdi. Resultaterne af denne testning er opsummeret i Tabel 16 nedenfor. Tabel 16: ABI7500 valideringsresultater for 1% cut-off-værdier Gns 1% Ctværdier Analyse 12ALA 6,68 6,5 12ASP 8,2 8 12ARG 8, CYS 6, SER 8, VAL 7,67 7,5* 13ASP 8,89 9 * 1% cut-off for 12VAL blev ændret til 6,5 på basis af gennembrudsundersøgelsen. Se redegørelse nedenfor. Ct-fastlæggelse for blandet standard: LightCycler 480 Instrument: Ct-værdierne for den blandede standard er middelværdier fra 50 kørsler, hvor den blandede standard var testet. Ctværdier blev indhentet fra LightCycler 480 Adapt Software. De forventede Ct-værdier for den blandede standard er vist i datafortolkningsafsnittet. ABI7500: Værdier for blandede standarder er indstillet med et gennemsnit på 422 Ct-værdier. De er beregnet over mange forskellige kit-lots og kørsler. De forventede Ct-værdier for den blandede standard er vist i datafortolkningsafsnittet. Validering af gennembrud: Gennembrud defineres som den uspecifikke forstærkning i mutationsanalyser af et vildtype DNA-mål i en bestemt prøve. Det giver et målbart niveau af baggrundsstøj. Gennembruddet fra vildtype DNA blev vurderet for hver mutationsanalyse. Gennembrudsundersøgelsen sikrede, at de tidligere etablerede 1% cut-off-værdier lå under gennembrudsniveauet og ville forhindre rapportering af et falskpositivt resultat. Side 27 af 38

28 LightCycler 480 Instrument: Ti K-RAS-mutationsnegative cellelinje- DNA-prøver ved forskellige koncentrationer, 5 FFPE K-RAS mutationsnegative prøver og 5 FFPE K-RAS mutationspositive prøver blev testet dobbelt på 5 plader. De mutationspositive prøver var positive for en enkelt mutation, og de andre mutationer blev anvendt til at teste gennembrud. Ctværdierne blev indhentet fra LightCycler Adapt Software, og alle kombinationer af Ct-værdier blev anvendt til beregning af Ct-værdier. Resultater fra cellelinie-dna og FFPE-prøver med mutationsnegative analyser gav Ct-værdier, som alle lå over 1% cut-off-værdierne, hvilket indikerer, at 1% cut-off-værdierne er robuste. Tabel 17 viser de dårligste gennembrudsniveauer fra de 5 kørsler. Tabel 17: Gennembrudsresultater Dårligste Ctgennembrudsværdier Analyse 12ALA 12,35 12ASP 11,36 12ARG Intet gennembrud 12CYS Intet gennembrud 12SER 11,74 12VAL 12,29 13ASP 11,29 ABI 7500: Gennembrud er bedømt med pooled cellelinje-dna fra K-RASmutationsnegative cellelinjer på 3 forskellige DNA-niveauer. Tre identiske PCR-plader blev testet. Hver plade bestod af 3 lots med reagenser. Den blandede standard blev anvendt som positiv kontrol. Desuden blev positive FFPE-prøver testet to gange. Størstedelen af de mutationspositive prøver er kun positive for én mutation. De øvrige mutationsanalyser kan anvendes til at bedømme gennembrud (selvom der forventes nogen krydsreaktivitet mellem nogle analyser og positive mutationer. Dette frembringer imidlertid et kendt mønster). Ct-værdier og Ct-værdier er indhentet og sammenlignet med 1% cut-off-værdier. Data fra cellelinje-dna og FFPE-prøver gav Ct-værdier, som alle lå over 1% cut-off-værdierne, bortset fra én FFPE-prøve, som gav en Ct lige under (6,84) cut-off-værdien på 7,5. Da 1% cut-off for fastlæggelse af dataområde dækkede 6,84, blev 1% Ct-værdien for 12VAL-analysen ændret fra 7,5 til 6,5 for at eliminere risikoen for et falsk positivt resultat. Tabel 18 nedenfor viser de aktuelle 1% Ct-værdier, der er baseret på valideringsresultater af gennembrud. Side 28 af 38

29 Tabel 18: Valideringsresultater af gennembrud Analyse 1% Ctværdier 12ALA 6,5 12ASP 8 12ARG 8 12CYS 7 12SER 9 12VAL 6,5 13ASP 9 Præcisionsvalidering: LightCycler 480 Instrument: Præcisionen blev testet med 1% syntetiske kontroller på 3 forskellige områder af K-RAS mutationsnegativ cellelinje- DNA. Hver kontrol blev testet tredobbelt for den relevante analyse på en plade, som også indeholdt dobbelt blandet standard og enkelte NTCreaktioner for at sikre, at reaktionerne fungerede inden for specifikationerne. Den samme plade blev gentaget 54 gange på 6 dage. Denne kørselsmatrix omfattede brug af 3 instrumenter, 3 reagenslot og 3 operatører. Ct-værdierne blev indhentet fra LightCycler Adapt Software, og alle kombinationer af Ct-værdier blev anvendt til beregning af Ct-værdier. Alle Ct-værdier, som oversteg tre gange det interkvartile område, blev betragtet som liggende udenfor og blev fjernet fra analysen. Gennemsnit, standardfejl og standardafvigelser blev beregnet, og dataene blev grupperet efter kit-lot, instrument eller operatør for at bedømme den variation, disse variable forårsagede. Analysernes samlede repeterbarhed blev også bedømt. Dataene tyder på, at den samlede variabilitet i analyserne er lav, og 2 standardafvigelser omkring middeltallet dækker et område på ±1,4 cyklusser fra middeltallet for analysen med den maksimale standardafvigelse. For hver test lå middel- Ct for hver operatør inden for 0,15 cyklusser af det samlede middeltal for hele datasættet. Forskelle mellem operatører oversteg ikke 0,2 Ct. Det viser, at variationen mellem operatørerne ikke var højere end variationen inden for hele datasættet, og analyserne er robuste nok til at modstå variabilitet mellem operatørerne. For hver test var forskellen mellem middeltallene for de enkelte instrumenter og det samlede middeltal ±0,097, og forskellen mellem middeltallene for individuelle instrumenter oversteg ikke ±0,186. Dette viser, at variationen mellem instrumenterne ikke var større end variationen inden for hele datasættet, og analyserne er robuste nok til at modstå variabilitet mellem instrumenterne. For hver test var de største forskelle mellem et enkelt lot og det samlede middeltal ± 0,195, og den største forskel mellem lots var ± 0,38. Dette viser, at variationen mellem lots ikke var større end variationen i hele datasættet, og analyserne er robuste nok til at modstå variabilitet mellem lots. Side 29 af 38

30 ABI7500: Der blev foretaget forsøg for at fastlægge præcisionsydelsen for hver analyse ved at gentage én PCR-place med et antal prøver med høj og lav DNA-koncentration og højt og lavt mutationsniveau for 3 reagenslots på en dag, mellem dage, mellem operatører og mellem instrumenter. En envejs ANOVA blev anvendt til bedømmelse af variationen mellem replikater, reagenslots, kørsler, testdage, instrument og operatør. Nulhypotesen var, at middelværdierne på tværs af kategorier var de samme. Samlede middelværdier, standardafvigelse og procentuel variationskoefficient blev ligeledes beregnet for Ct-værdierne. Ingen af analyserne udviste signifikant afvigelse ved niveauet p=0,05 fra nulhypotesen at middeltallet var det samme i kategorierne. Det betyder, at analyserne er tilstrækkeligt robuste til at modstå variationer fra instrument til instrument, operatør til operatør, lot til lot, dag til dag og kørsel til kørsel. Validering af nøjagtighed: LightCycler 480 Instrument: Nøjagtigheden er bedømt med 92 FFPEprøver og 28 mutationspositive cellelinjefortyndinger. De er testet med K-RAS-kittet og er også sekventeret med Sanger-sekventering. K-RASmutationsbestemmelser er sammenlignet i de 2 metoder. Der var 18 afvigende resultater (5 FFPE er og 13 cellelinjer), hvor sekventering tydede på et negativt resultat, men prøven var positiv med DxS-analysen. For at bekræfte tilstedeværelsen af en mutation i disse 18 prøver fik hver af dem regionen omkring mutationerne klonet. Tilstedeværelsen af en mutationspositiv klon er anvendt til at løse afvigelsen. ABI 7500: Nøjagtigheden blev vurderet med syntetiske kontroller, der blev fortyndet til 2 niveauer af K-RAS-mutationsnegativ cellelinje-dna for at give 3 forskellige mutationsprocenter, der dækker både positive og negative mutationsniveauer. For hver mutation blev der kørt tre identiske plader, der alle anvender 3 reagenslots. 25%, 5% og 0,5% mutationsniveauer blev testet. (25%- og 5%-prøverne skulle give et mutationspositivt resultat ( Ct under 1% cut-off-værdierne); 0,5%-prøven skulle give et mutationsnegativt resultat ( Ct over 1% cut-off-værdierne)). Resultaterne er opsummeret i Tabel 19 nedenfor. Side 30 af 38

31 Tabel 19: ABI7500 Resultater for validering af nøjagtighed Analyse 25% 5% 0.5% Analyse 100% 100% 94% 12ALA 100% 100% 100% 12ASP 100% 100% 100% 12ARG 100% 100% 100% 12CYS 100% 100% 100% 12SER 100% 100% 100% 12VAL 100% 100% 100% 13ASP 100% 100% 100% Reduktionen i nøjagtighed for 12ALA-analysen skyldes variation mellem replikater på ét DNA-niveau. Validering af linearitet: LightCycler 480 Instrument: Linearitet er bedømt ved brug af syntetiske standarder ved 100%, 1% og 0% mutationsniveau for hver analyse. Ved hver procentdel mutation er der foretaget en seriel fortynding for at bevare mutationsniveauet, men reducere den samlede DNA-mængde. Der er produceret standardkurver ved at køre hver fortynding tre gange på 3 replikatplader til kontrolanalysen og relevant mutationsanalyse. Ctværdier er fremkommet ved hjælp af LightCycler Adapt Software. For hver mutation er der dannet et diagram (data ikke vist), hvor kontrolanalyse-ct og mutationsanalyse-ct er plottet mod hinanden, og der er udført en regression for hvert mutationsniveau. 95% konfidensintervaller er også plottet for hvert enkelt mutationsniveau. Der blev ikke indhentet mutations-ct-værdier fra 0%-testen. Diagrammerne for 100% og 1% viste, at der var en tydelig diskrimination mellem datasættene, og kurvernes hældning var i høj grad de samme. Det tyder på samme forstærkningseffektivitet i flere mutationskoncentrationer. ABI7500: Denne undersøgelse vurderede effektiviteten af hver af mutationsanalyserne på tværs af en række DNA-koncentrationer i en baggrund af vildtype DNA og i vand. Hver mutationsanalyse skulle have en effektivitet på % (100% + 10%). Standardkurver blev sat op med en 5 gange seriel fortynding, og én PCRplade med tre batch kitreagenser blev kørt for hver analyse. 100% mutationsstandarderne blev testet med 50 ng, 10 ng, 2 ng og 0,4 ng DNA ved hver af mutationsanalyserne ved at fortynde i vand. Mutationsanalyserne blev også testet med en 5 gange seriel fortynding i 10 ng/µl cellelinje DNA for at bedømme effekten af gennembrud. Standardkurver blev genereret for hver mutationsanalyse fra forsøgsdataene. PCR-effektiviteterne blev beregnet med ligningen: 100((10-1/Slope )-1) Side 31 af 38

32 Det højere gennembrudsniveau i 10 ng/µl-cellelinjefortyndingerne gav effektiviteter over 100%. De samlede effektiviteter på tværs af reagensbatches blev beregnet. Alle værdier var de samme og lå inden for 10% af kontrolanalysens effektivitet. Parallelle standardkurver mellem kontrolanalysen og mutationsanalyser betyder, at Ct-analysemetoden er brugsegnet. Lineariteten blev bibeholdt på et acceptabelt niveau over området fra 0,4 ng DNA til 50 ng DNA. Validering af krydsreaktivitet: LightCycler 480 Instrument: Der er ikke udført validering af krydsreaktivitet, da LightCycler Adapt Software kun rapporterer en enkelt mutation med den mindste Ct. ABI7500: Da alle mutationer påvist af K-RAS-kittet forekommer inden for en region på 5 basepar, forventes det, at der vil forekomme nogen krydsreaktivitet mellem primere. Denne undersøgelse fastlagde krydsreaktivitetsmønstret for K-RAS-kittet. Der blev foretaget test med syntetiske mutationskontroller for at fastlægge, hvor mange cyklusser efter en sandt positiv der kan påvises et krydsreaktivitetssignal. Hver mutationsreaktionsblanding blev kørt med seks replikater af de syv individuelle 100% mutationskontroller. Herudover blev hver kontrol analyseret med den matchende reaktionsblanding og alle andre reaktionsblandinger i den samme kørsel. Krydsreaktivitetsmønsteret blev fastlagt ved at beregne forskellen mellem den reelle forstærkede Ct-værdi fra den matchede kassette og krydsreaktivitetsignalet fra hver anden primer. Det forventede krydsreaktivitetsmønster er vist i Tabel 20 nedenfor. Det er blevet påvist, at krydsreaktivitetsmønsteret er konsistent og gør det muligt for brugeren at aflæse et forstærkningsmønster, hvis mere end én analyse giver et positivt resultat, for at få det korrekte analyseresultat. Antallene i hver celle viser det omtrentlige antal af cyklusser, efter at det sande positive signal er påvist, hvor man kan se et krydsreaktivitetssignal. Værdier over 9 cyklusser er ikke inkluderet, da disse er klassificeret som mutationsnegative resultater. Side 32 af 38

33 Tabel 20: ABI7500 Valideringsresultater for krydsreaktivitet Positiv prøve 12ALA signal 12ASP signal 12ARG signal 12CYS signal 12SER signal 12Val signal 13ASP signal 12ALA Ja ASP 9 Ja ARG - - Ja CYS Ja SER Ja VAL Ja - 13ASP Ja Cyklustolerancevalidering: LightCycler 480 Instrument: Disse undersøgelser fastlagde mutationsanalysernes tolerance over for variationer i temperaturen ved cykluskørsler. Da annealingtemperaturen er den mest kritiske temperatur, som påvirker analyseydelsen, er annealingtemperaturen den parameter, som blev varieret. Cyklustolerancen er bedømt med 1% syntetiske standarder i 3 forskellige DNA-niveauer. For hver mutation er disse prøver kørt tre gange sammen med dobbelt blandet standard og enkelte NTC-reaktioner for at sikre, at analysernes ydelse lå inden for specifikationerne. Hver plade blev testet ved 59 C, 60 C og 61 C annealingtemperatur. 60 C er den optimale temperatur for analysen, men variation på tværs af eller mellem PCR-blokke betyder, at analysen skal være robust inden for det givne område. Hver plade blev kørt tre gange ved hver temperatur. Ctværdierne blev indhentet fra LightCycler Adapt Software, og alle kombinationer af kontrol- og mutations-ct-værdier for hver prøve blev anvendt til beregning af Ct-værdier. Alle analyser opfyldte acceptkriteriet, at værdierne ved 59 C og 61 C ikke må være forskellig fra middelværdien ved 60 C ± standardafvigelsen ved 60 C. Det betyder, at analyserne er tilstrækkeligt robuste til at modstå en afvigelse på 1 C i annealingtemperatur. ABI7500: Tre identiske PCR-plader, der alle indeholdt alle 3 kitreagenslots, blev kørt ved hver enkelt annealingtemperatur. Den blandede standard blev testet ligesom 50 ng pooled mutationsnegativ cellelinje-dna. Da 60 C er den anbefalede annealingtemperatur, blev pladerne kørt ved 58 C, 60 C og 62 C. Hvis analyserne var tilstrækkeligt robuste til at kunne tåle prøvetemperaturerne, skulle de blandede standard Ct-værdier ligge inden for +1,5 af de fastsatte værdier for den blandede standard, og pooled cellelinje- Ct-værdier skulle være over 1% cut-off-punkterne. 12ASP udviste den største følsomhed over for temperaturudsving. Men alle analyserne lå acceptabelt ved de 3 temperaturer og viste, at analyserne er robuste, når de køres ved temperaturer, som ligger 2 C højere eller lavere end det optimale. Side 33 af 38

34 Taq-tolerancevalidering: LightCycler 480 Instrument: Disse undersøgelser fastslog mutationsanalysernes tolerance over for variationer i niveauet af Taq-polymerase, en potentiel kilde til brugervariation, da det tilsættes af brugeren. Analysernes tolerance over for de forskellige niveauer af Taq blev bedømt med 1% syntetiske standarder i 3 forskellige DNA-niveauer. Hver prøve blev testet tre gange for et højt, normalt og lavt niveau af Taq (højt niveau er 20% ekstra Taq, lavt niveau er 20% mindre Taq end det, der normalt anvendes). Dobbelt blandet standard og enkelte NTC-reaktioner blev også kørt for at sikre, at analyserne fungerede inden for specifikationerne. Der blev udført tredobbelte kørsler for hver plade, og testet 3 forskellige lots af Taq. Ct-værdierne blev indhentet fra LightCycler Adapt Software, og alle kombinationer af Ct-værdier fra replikater på en plade blev anvendt til beregning af Ct-værdier. Alle analyser overholdt acceptkriterierne, at middelværdierne fra de høje Taq- og de lave Taq-prøver ikke adskiller sig fra middeltallet i det normale Taq-niveau med mere end 1 standardafvigelse fra de normale Taq-data. ABI7500: Tre identiske PCR-plader, der hver indeholdt alle 3 reagenslot, blev kørt for hver mutationsanalyse, og taq-polymerase blev varieret med +10% og -10% fra den anbefalede mængde. Den anbefalede mængde blev også testet. Den blandede standard blev testet ligesom 1% standarder i 2 niveauer af DNA og 50 ng mutationsnegativ cellelinje-dna. Analysedataen blev analyseret for middelværdi, standardafvigelse og variationskoefficient. Resultaterne viste en lille variation (ækvivalent standardafvigelse mellem analyser, %CV <10%) inden for analyseresultater, når Taq-mængden blev varieret med +10%, hvilket viser, at analysen kan tolerere helt op til 10% variation i Taq-polymeraseniveauer. 12. Teknisk assistance Kontakt din Roche-distributør vedrørende teknisk assistance og yderligere informationer. En liste over Roche distributører og kontaktinformation for disse er anført i Afsnit 13. Side 34 af 38

35 13. Fabrikant- og distributørinformation STOR- BRITANNIEN FRANKRIG SPANIEN DxS Limited 48 Grafton Street, Manchester M13 9XX, Stor-Britannien Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA A Member of the Roche Group Roche Diagnostics Charles Avenue Burgess Hill, West Sussex, Stor-Britannien RH15 9RY Roche Diagnostics S.A. 2 Avenue du Vercors BP 59, Meylan Cedex, Roche Diagnostics S.L. Av. de la Generalitat, s/n Sant Cugat del Valles Barcelona, E TYSKLAND SCHWEIZ ITALIEN Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstr. 116 Dept. VM-G Mannheim, D-68298, Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestr. 7 Rotkreuz, CH-6343 Roche Diagnostics Italy V. le G.B. Stucchi 110 Monza (MI), I Hvis dette kit er købt i et land, som ikke er anført i listen over Roche Diagnostics kontorer ovenfor, bedes du kontakte Roche Diagnostics GmbH i Mannheim, Tyskland på nedenstående adresse. CENTRALT DISTRIBUTIONS- CENTER Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D Mannheim 14. Dato for udstedelse af seneste revision Dato for seneste version: februar 2009 Ændringsresumé: Ændring af værdier i tabel 5 og 11. Enkelte mindre typografiske ændringer. Side 35 af 38

36 15. Referencer 1. R.A. Hilger, M.E. Scheulen, D. Strumberg. (2002). The Ras-Raf-MEK- ERK Pathway in the Treatment of Cancer. Onkologie 25: Pavan Bachireddy, Pavan K. Bendapudi, Dean W. Felsher. (2005). Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res 11(12): Sae-Won Han, Tae-You Kim, Yoon Kyung Jeon, Pil Gyu Hwang, Seock- Ah Im, Kyung-Hun Lee, Jee Hyun Kim, Dong-Wan Kim, Dae Seog Heo, Noe Kyeong Kim, Doo Hyun Chung, Yung-Jue Bang. (2006). Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation, K-ras Mutation, and AKT Phosphorylation. Clin Cancer Res 12(8): William Pao, Theresa Y. Wang, Gregory J. Riely, Vincent A. Miller, Qiulu Pan, Marc Ladanyi, Maureen SF. Zakowski, Robert T. Heelan, Mark G. Kris, Harold E. Varmus. (2005). KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib. PloS Medicine 2(1): Astrid Lievre, Jean-Baptiste Bachet, Delphine Le Corre, Valerie Boige, Bruno Landi, Jean-Francois Cote, Gorana Tomasic, Christophe Penna, Michel Ducreux, Philippe Rougier, Frederique Penault-Llorca, Pierre Laurent-Puig. (2006). KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer. Cancer Res 66 (8): Silvia Benvenuti, Andrea Sartore-Bianchi, Federica Di Nicolantonio, Carlo Zanon, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Salvatore Siena, Alberto Bardelli. (2007). Cancer Res 67 (6): W. De Roock, J. De Schutter, G. De Hertogh, M. Jannsens, B. Biesmans, N. Personeni, K. Geboes, C. Verslyp, E. Van Cutsem, S. Tejpar. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): G. Finocchiaro, F. Cappuzzo, P.A. Janne, K. Bencardino, C. Carnaghi, W.A. Franklin, M. Roncalli, L. Crino, A. Santoro, M. Varella-Garcia. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): F. Di Fiore, F. Blanchard, F. Charbonnier, F. Le Pessot, A. Lamy, M.P. Galais, L. Bastit, A. Killian, R. Sesboue, J.J. Tuech, A.M. Queuniet, B. Paillot, J.C. Sabourin, F. Michot, P. Michel, T. Frebourg (2007). British Journal of Cancer 96: Shirin Khambata-Ford, Christopher R. Garrett, Neal J. Meropol, Mark Basik, Christopher T. Harbison, Shujian Wu, Tai W. Wong, Xin Huang, Chris H. Takimoto, Andrew K. Godwin, Benjamin R. Tan, Smitha S. Krishnamurthi, Howard A. Burris III, Elizabeth A. Poplin, Manuel Hidalgo, Jose Baselga, Edwin A. Clark, David J. Mauro. (2007). Journal of Clinical Oncology 25(22): Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C et al. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res. 17 (7): Whitcombe, D., Theaker J., Guy, S.P., Brown, T., Little, S. (1999). Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17: Side 36 af 38

37 13. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection. Nucleic Acids Research 28(19): De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, Janssens M, De Hertogh G, Personeni N, Biesmans B, Van Laethem JL, Peeters M, Humblet Y, Van Cutsem E, Tejpar S. KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol. 2007, Nov Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F, Laurent- Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66: Lièvre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, Ychou M, Bouché O, Landi B, Louvet C, André T, Bibeau F, Diebold MD, Rougier P, Ducreux M, Tomasic G, Emile JF, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 2008;26: C. Bokemeyer et al., K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4000) 18. E. Van Cutsem et al., K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 2) 19. S. Tejpar et al., Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mcrc), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4001) th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, "KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care". Christos Karapetis et al. 21. Rafael G. Amado, Michael Wolf, Marc Peeters, Eric Van Cutsem, Salvatore Siena, Daniel J. Freeman, Todd Juan, Robert Sikorski, Sid Suggs, Robert Radinsky, Scott D. Patterson and David D, Chang. Wild- Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: Side 37 af 38

38 Information til køber: Hverken dette produkt, TheraScreen K-RAS Mutation, eller nogen af produktets dele må videresælges eller på anden vis overføres eller modificeres til gensalg uden skriftlig godkendelse fra DxS Limited. TheraScreen og Scorpions er registrerede varemærker, som tilhører DxS Limited. ARMS er et registreret varemærke, som tilhører AstraZeneca UK Limited. LIGHTCYCLER og ROCHE er varemærker, som tilhører Roche. ABI7500 er et varemærke, som tilhører Applied BioSystems. Dette produkt er CE-mærket diagnostisk udstyr i overensstemmelse med EU s Direktiv 98/79/EC om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik. Med købet af dette produkt medfølger en begrænset licens, som ikke kan overføres til andre, til at anvende ARMS og Scorpions teknologier udelukkende til in vitro-diagnostisk brug. ARMS er dækket af US-patent og EP ; Scorpions af US patent og EP Information i dette dokument er under forbehold for ændringer. DxS Limited påtager sig intet ansvar for fejl, som kan findes i dette dokument. Under ingen omstændigheder kan DxS Limited på nogen måde holdes ansvarlig (hverken under kontrakt eller uden for aftaleforhold, herunder uagtsomhed) for nogen fordring, som opstår i forbindelse med eller på grund af brug af dette produkt. Intet i dette dokument udelukker eller begrænser noget ansvar, som det er ulovligt for DxS Limited at udelukke eller begrænse. Copyright DxS Limited. Med forbehold for alle rettigheder. DxS Limited, 48 Grafton Street, Manchester, M13 9XX Stor-Britannien Side 38 af 38