Validering og implementering af en ELISA analyse, til screening af donorer for IgA mangel

Transkript

1 Validering og implementering af en ELISA analyse, til screening af donorer for IgA mangel Christine Marie Rasmussen Michael Lassen Schou Hussein Atallah Alhadidi Daniel Rodriguez Jensen Side 1 af 53

2 Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen University College Sjælland Campus Næstved Validering og implementering af en ELISA analyse, til screening af donorer for IgA mangel Udarbejdet af: Christine Marie Rasmussen - bn13s005 Michael Lassen Schou - bn13s044 Hussein Atallah Alhadidi bn13s028 Daniel Rodriguez Jensen bn13s001 Projektperiode: 10. oktober januar 2017 I-vejleder Charlotte Kamilla Leerbech Jensen Adjunkt University College Sjælland - Campus Næstved K-vejleder Solveig Irene Rosendahl Uddannelseskoordinator Klinisk Immunologisk afdeling Næstved sygehus Antal anslag: Forsidebillede fundet på: ABSORBANCE-MICROPLATE-READERS Denne opgave eller dele heraf må kun offentligøres med forfatternes tilladelse jf. Bekendtgørelse af lov om ophavsret nr. 587 af Side 2 af 53

3 Bekræftelse på, at opgaven er udfærdiget uden uretmæssig hjælp Validering og implementering af en ELISA analyse, til screening af donorer for IgA mangel. Hold: bn13s University College Sjælland Undertegnede bekræfter hermed at ovennævnte opgave er udfærdiget uden uretmæssig hjælp. Dato: 28/ Studerendes underskrift: Side 3 af 53

4 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet af 4 bioanalytikerstuderende, som afslutning på bioanalytikeruddannelsen på University College Sjælland, Campus Næstved. Projektet er en validering af en ELISA analyse til screening af donorer for IgA mangel og er udarbejdet på klinisk immunologisk afdeling, på Næstved sygehus, Region Sjælland i perioden 10 oktober, 2016 til 2. januar, Alt praktisk arbejde er foretaget på klinisk immunologisk afdeling i Næstved, som har indkøbt reagenser og materiale, samt stillet udstyr til rådighed så det har været muligt at udfører forsøg. I forbindelse med arbejdet, vil vi gerne takke klinisk immunologisk afdeling, Næstved for udlån og udlevering af maskiner og reagenser til det praktiske arbejde i laboratoriet. En særlig tak for vejledning og støtte gennem projektet skal gå til kvalitetsansvarlig Helle Wulf Johansson, molekylærbiolog, klinisk immunologisk afdeling, Næstved, samt vores kliniske vejleder Solveig Irene Rosendahl, Uddannelseskoordinator, klinisk immunologisk afdeling Næstved og institutions vejleder Charlotte Kamilla Leerbech Jensen, UCSJ Campus Næstved. Vi vil gerne takke Betina Poulsen, afdelings bioanalytiker, klinisk immunologisk afdeling, Rigshospitalet, for fremskaffelse af positiv kontrolmateriel samt fremvisning og vejledning omkring ELISA teknik og søjleagglutinationsteknik i forbindelse med IgA analyser. Side 4 af 53

5 Indhold Resume Introduktion Teori IgA mangel og blodtransfusion ELISA Validering Vores projekt Afgrænsning Problemformulering Metodiske overvejelser Krav til analysen Delforsøg Donorprøver Litteratursøgning Etiske og statistiske overvejelser Materialer og metode Forberedelse af reagenser og buffere Delforsøg 1 (opnå signal) Delforsøg 2 (optimeringsforsøg) Delforsøg 3 (Valideringsforsøg) Donorprøver Resultater Delforsøg 1 (opnå signal) Delforsøg 2 (optimeringsforsøg) Delforsøg 3 (valideringsforsøg) Donorprøver Diskussion Delforsøg 1 (opnå signal)...40 Side 5 af 53

6 4.2 Delforsøg 2 (optimeringsforsøg) Valg af opsætning Delforsøg 3 (valideringsforsøg) Donorprøver Fordele og Ulemper ved ELISA Screening af donorer for IgA mangel i region Sjælland Konklusion Perspektivering Kilder...51 Side 6 af 53

7 Resume Baggrund: For at undgå anafylaktiske reaktioner når patienter med anti-iga transfunderes, er det vigtigt at have IgA frie blodkomponenter på lager. Derfor har klinisk immunologisk afdeling i Næstved en vision om at implementere en ELISA analyse til screening af donorer for IgA mangel. Blodet fra disse donorer skal indgå i lageret af blodkomponenter, så det kan være til rådighed for patienter, der har dannet anti-iga. Formål: Formålet med dette projekt er at implementere en direkte sandwich ELISA til screening af donorer på klinisk immunologisk afdeling i Næstved. Først skal analysens optimale opsætning fastlægges, hvorefter analysen kan valideres og implementeres. Målet med valideringen er at sikre, at analysen lever op til forud defineret krav. Metode: Det er forsøgt at genskabe resultaterne fra tidligere pilotforsøg. Derefter er der blevet lavet optimeringsforsøg med forskellige fortyndinger af Anti-Human IgA (Sigma-Aldrich) som coating antistof og Anti-Human IgA/HRP (DAKO) som konjugat antistof for at finde den bedste koncentration. Derudover er der lavet forsøg med to forskellige blokerings buffere, hvor BSA og Tween 20 er anvendt. Der er medtaget kalibreringskurver ved alle forsøg, som er lavet ud fra fortyndinger af Humant IgA i2636 (Sigma-Aldrich). Først blev alle reagenser forberedt og de forskellige buffere blev fremstillet. Pladerne blev coatet med 100 µl coating buffer og blokeret med 130 µl blokerings buffer. Derefter blev der tilsat 100 µl prøvemateriale fortyndet i prøvefortyndingsbuffer og der blev konjugeret med 100 µl konjugat. Efter tilsætning af hvert reagens, blev pladen inkuberet 1 time hvorefter den blev vasket. Til sidst blev der tilsat 50 µl substrat efterfulgt af inkubation et mørkt sted minutter, hvorefter der blev tilført 50 µl stop solution. Resultat: Forsøgene viste, at den bedste opsætning, var en coating koncentration på 1: sammen med en konjugat koncentration på 1: Blokering med BSA var bedre end Tween 20. Analysens CV% var 16,5% for den intraserielle præcision og 28,1% for den intermediære præcision. Analysens måleområde er fundet til at være mellem 10,85 ng/ml og 839,4 ng/ml. Konklusion: Det var muligt at opnå signal med opsætningen fra tidligere pilotforsøg. Den bedste opsætning er en coating koncentration på 1: sammen med en konjugat koncentration på 1: samtidig med at pladen blokeres med BSA. Analysen overholder kravene for CV% ved den intraserielle præcision, men yderligere forsøg skal udføres for at analysen overholder kravet ved den intermediære præcision. Side 7 af 53

8 Introduktion 1. Introduktion 1.1 Teori I Danmark transfunderes der dagligt mere end blodkomponenter i det danske sygehusvæsen (1). For at undgå transfusionskomplikationer, når der anvendes donorblod i patientbehandlingen, bliver der stillet høje krav til testning af donorblodet, så der sikres en overførsel af forligeligt blod (2). Hvis patienter med immunglobulin (Ig) A mangel har dannet et anti-iga af IgE karakter, kan en blodtransfusion med blot få ml, af blodkomponenter indeholdende IgA, resultere i anafylaktisk schok indenfor få minutter, der kan medføre at patienten dør (3,4). Det estimeres at ca. 0,3% af den danske befolkning lider af IgA mangel (5), der betragtes som én af de hyppigste primære immundefekter. Det kan dog være svært at fastlægge det helt nøjagtige tal for, hvor mange mennesker, der lider af denne tilstand, da mange er asymptomatiske. Tilstanden kaldes også selektiv immunglobulin A defekt (3). Ordet selektiv refererer til, at man typisk mangler en enkel immunglobulinklasse i kroppen, fx IgA. Det betyder at niveauet af IgA er lavt, men niveauet af de andre immunglobulin klasser er normale (6). Selektiv IgA mangel defineres ved en IgA koncentration under 0,07 mg/ml. Referenceværdien for IgA er hos raske mennesker mellem 0,7-4 mg/ml (5). Personer som har IgA mangel, har en større risiko for at udvikle autoimmune sygdomme, astma og allergi samt infektioner i respirationssystemet (7) IgA mangel og blodtransfusion Mennesket besidder en række forsvarsmekanismer, samlet kendt som immunforsvaret. Forståelsen af immunforsvarets opbygning og funktion er vigtig i forbindelse med en blodtransfusion, for at undgå at patienten får transfusionskomplikationer. Immunforsvaret er involveret i bekæmpelsen af fremmedlegemer, som har invaderet kroppen, og kan deles op i to typer; det innate og adaptive immunforsvar (figur 1). I det følgende afsnit lægges vægt på det adaptive immunforsvar, da det har en central rolle ved anafylaktiske transfusionskomplikationer (6). Side 8 af 53

9 Introduktion Figur 1. Simpel oversigt over menneskets immunsystem, som er opdelt i det innate og adaptive immunforsvar. Det innate immunrespons består af to barrierer. Den første barriere som er hud, slim og mavesyre, samt den anden barriere bestående af bl.a. komplementsystemet og fagocyterende celler. Det adaptive immunforsvar benytter sig bl.a. af et humoralt forsvar, hvor særligt immunglobuliner har en afgørende betydning for bekæmpelse af fremmede antigener. Det er også det humorale immunrespons, der ses ved anafylaktiske reaktioner forårsaget af IgA. Det er det adaptive immunforsvar, der spiller en væsentlig rolle når en patient immuniseres med IgA holdige blodkomponenter. Dette bevirker, at patientens immunforsvar begynder at danne anti-iga, da patientens immunforsvar betragter IgA i blodkomponenter som fremmede. Dette kan forårsage kraftige transfusionskomplikationer ved efterfølgende transfusion med IgA holdige blodkomponenter (3). Det adaptive immunforsvar benytter sig af plasmacellernes evne til at producere immunglobuliner. Immunglobulinerne dannes af B-lymfocytterne, særligt i knoglemarven, lymfeknuder, slimhinder og milten. De inddeles i fem klasser kaldet IgM, IgD, IgE, IgG og IgA, hvor der i dette projekt vil blive lagt vægt på IgA (6). B-lymfocytten aktiveres via 3 signaler, og har brug for stimulering af en Th-celle og de cytokiner som Th-cellen producerer. Efter aktivering af B-cellen gennem signal 1 og 2 (figur 2), udtrykkes en række forskellige cytokinreceptorer på B-cellens overflade. Cytokinpåvirkningen under signal 3, som B-cellen udsættes for, afgør hvilken immunglobulin klasse plasmacellen ender med at producere (6). Side 9 af 53

10 Introduktion Figur 2. Figuren viser B-cellens aktiveringssignal 1 og 2. På øverste figur ses B-cellens signal 1, som fås gennem CD 79 komplekset når et antigen krydsbinder to eller flere B-celle receptorer (BCR). Signal 1 fører til optagelse af BCR/antigen komplekset, så antigen peptider efterfølgende kan præsenteres på MHC II. Samtidig sker der en opregulering af CD 80 eller CD 86. På nede rste figur ses den immunologiske synapse mellem B- og T-celle, som dannes når B-cellen møder en T-celle, der er specifik for MHC II komplekset. Her bindes MHC II komplekset til T-celle receptoren (TCR), hvorved T-cellen får sit signal 1, som resulterer i en opregulering af CD40L, der vil reagere med CD 40 på B-cellen. Interaktionen mellem CD40 L og CD40 giver B-cellen signal 2, som resulterer i en opregulering af både cytokinreceptor og CD80 eller CD86. Signal 2, modtaget gennem CD40, er nødvendigt for B-cellens Ig-klasseskift. (Billede taget fra Immunologi s , skrevet af R. Agger m.fl.) Udsættes B-cellen for TGF-beta fra Th-celler, vil den lave et immunglobulin klasseskift til en IgA secernerende plasmacelle (figur 3) (6). IgA produceres i størst mængde, og udgør 10-15% af immunglobulinerne i plasma. Der findes to subklasser af IgA; IgA1 og IgA2. I blodet findes primært IgA2 som monomer, mens IgA1 som dimer med en sekretorisk komponent findes i bl.a. spyt, tåre og bronkialsekret (3, 8). Side 10 af 53

11 Introduktion Figur 3. Figuren viser B-cellens immunglobulinklasseskift. Cytokinpåvirkningen fra Th-cellen i signal 3 afgøre hvilken type immunglobulin plasmacellen producerer. Udsættes B-cellen for TGFbeta, udvikler den sig til en IgA secernerende plasmacelle. (Billede taget fra: immunologi s. 184, skrevet af R. Agger m.fl.) I mange tilfælde skyldes IgA mangel en modningsdefekt af B-cellerne, således at disse ikke, eller i nedsat omfang producerer IgA. Abnormaliteter i cytokin kommunikationen mellem T- og B- lymfocytter, i form af mangel på en række interleukiner som bl.a. IL-4, IL-6 og IL-21, er blevet påvist i forbindelse med IgA mangel. Der er ikke blevet påvist et specifikt nedarvningsmønster hos patienter med IgA mangel. Både autosomal recessiv, autosomal dominant samt sporadiske nedarvningsmønstre er blevet observeret (8). Hvis patienter med IgA mangel transfunderes med blodkomponenter, indeholdende IgA, er der risiko for, at de provokeres til dannelse af anti-iga. Dette sker fordi, at IgA opfattes som et fremmet antigen hos patienter med IgA mangel. Ved efterfølgende transfusioner vil patienterne udvikle svære anafylaktiske reaktioner, da patientens anti-iga vil reagere med IgA fra blodkomponenter, og dermed danne immunkomplekser i blodbanen (1). Anti-IgA kan være af IgG eller IgE karakter, hvor allergiantistoffet IgE typisk er skyld i de sværeste anafylaktiske reaktioner (3). Når IgA binder til to IgE molekyler, der er bundet til IgE receptorer, på overfladen af mastceller, basofile og eosinofile Side 11 af 53

12 Introduktion granulocytter udløses en type 1 allergisk straks reaktion. Dette skyldes, at cellerne degranulerer så der udskilles histamin og enzymer, der forårsager de anafylaktiske symptomer (figur 4). Hvis reaktionen sker i blodbanen, som er tilfældet ved transfusion af IgA holdige blodkomponenter til patienter med et anti-iga, kan der inden for få minutter udvikles anafylaktisk shock, der er en livstruende tilstand, som kan medføre respirationsstop og/eller hjertestop (1). Figur 4. Billede af en type 1 allergisk reaktion. Når IgA binder til to Anti-IgA af IgE karakter, som er bundet til IgE receptorer på basofile og eosinofile granulocytter, udløses en allergisk reaktion. Bindingen af IgA bevirker, at granulocytten degranulerer så der udskilles histamin og enzymer, der forårsager anafylaktiske reaktioner. (Billede med modifikationer taget fra: For at undgå anafylaktiske reaktioner hos patienter med IgA mangel, hvor det ikke kan udelukkes, at der er dannet et anti-iga, anbefales det, at transfundere disse patienter med blodkomponenter fra donorer med IgA mangel, eller at blodet vaskes grundigt med sterilt 0,9% NaCl opløsning før transfusionen (9). Ifølge Europarådets guide til fremstilling af blodkomponenter, må en erytrocytsuspension til patienter med IgA mangel maksimalt indeholde 200 µg IgA, hvor en Side 12 af 53

13 Introduktion plasmaportion maksimalt må indeholde 700 ng/ml (10). Er det ikke muligt at skaffe IgA frit eller vasket blod til patienterne med IgA mangel, og som har dannet anti-iga, gives blodkomponenter indeholdende IgA, hvilket bevirker, at patienten skal observeres nøje af sundhedspersonalet under hele transfusionsbehandlingen. Hvis der sker en transfusionskomplikation har afdelingen, der har udført transfusionen, ansvar for at give klinisk immunologisk afdeling besked. Klinisk immunologisk afdeling har derefter ansvaret for at indberette hændelsen til sundhedsstyrelsen (11). Derudover rapporteres hændelsen til Dansk Registrering af Transfusionskomplikationer (DART) gennem Dansk Selskab for Klinisk Immunologi (DSKI). Denne rapportering gøres for at holde et overblik over transfusionskomplikationer i Danmark, så der kan laves anbefalinger til at undgå disse (12) ELISA ELISA er en speciel form for Enzyme ImmunoAssay (EIA), hvor antigen-antistof reaktionen er knyttet til en fast fase. ELISA kan udføres ved en direkte og indirekte teknik samt som sandwich princip. ELISA teknikken, i vores projekt, bygger på det direkte sandwich princip, der forløber således (figur 5) (13): Capture antistof specifikt for analytten bindes til bunden af brøndende. Efter inkubation vaskes det ubundne capture antistof væk. De umættede bindingssteder blokeres med et, for signalet, irrelevant protein for at forhindrer uspecifik binding af proteiner til brøndene. Efter inkubation vaskes det overskydende protein væk, og der tilsættes prøvemateriale indeholdende analytten. Efter inkubation vaskes pladen igen og der tilsættes et antistof, konjugeret med et enzym, som binder til analytten. Mængden af enzym i konjugatet er afgørende for signalstyrken (14). Pladen inkuberes og vaskes, hvorefter der tilsættes ex. TMB-substrat, som er et kromogen, der danner en blå farve når det oxideres med hydrogen peroxid. Processen katalyseres af Horse Radish Peroxidase (HRP), som er et enzym som antistoffet i konjugat bufferen kan være konjugeret med (15). Efter inkubation stoppes reaktionen med syre så den blå farve skifter til gul. Herefter måles pladen fotometrisk ved 450 nm (14). Side 13 af 53

14 Introduktion Figur 5. Billedet viser analyseprincippet for en direkte sandwich ELISA. Først coates pladen med capture antistof, hvorefter der blokeres med, et for signalet, irrelevant protein. Herefter tilsættes prøvemateriale indeholdende analytten, som vil binde til capture antistof. Herefter tilsættes et antistof konjugeret med enzymet Horse Radish Peroxidase (HRP). Enzymet katalyserer den reaktion der omdanner TMB substratet til en blå farve. Til sidst stoppes reaktion med syre og der sker et farveomslag fra blå til gul. (billede med modifikationer taget fra: Validering Før analyser, som projektets IgA screenings assay, kan implementeres på klinisk immunologisk afdeling skal analysen valideres. Formålet med validering af nye analyser er, at sikre, at analysen lever op til forud definerede krav i forbindelse med bl.a. kvalitetssikring og måleusikkerhed. Validering af analyser på klinisk immunologisk afdeling (KIA) i region Sjælland udføres på baggrund af en valideringsmasterplan, der bygger på retningslinjer udarbejdet af Den Danske Akkrediteringsfond (DANAK) og Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB). Validering af nye analyser er vigtigt i forhold til akkreditering af afdelingen (16). Der står i akkrediteringsstandarden DS/EN ISO 15189:2008 at: Laboratoriet må kun benytte validerede procedurer til bekræftelse af, at undersøgelsesprocedurerne er egnede til det forudsatte formål. Valideringerne skal være tilstrækkelig omfattende til at opfylde behovet for den givne anvendelse eller det givne anvendelsesområde. Laboratoriet skal registrere de opnåede resultater og den procedure, der er anvendt ved valideringen. (17). Hvis afdelingen ønsker analysen akkrediteret, skal de leve op til akkrediteringsstandarden, hvilket betyder at det er nødvendigt, at projektets IgA screenings assay er valideret. Valideringen udføres inden analysen anvendes i rutinen for at sikre, at den lever op til kravene for den ønskede brug af analysen. Da IgA screenings assayet ikke er CE-mærket, i overensstemmelse med In Vitro Diagnostik Side 14 af 53

15 Introduktion (IVD) direktivet, kræves der en fuld validering af selve analysen (16). Dog er der ifølge bekendtgørelsen om medicinsk udstyr til In Vitro diagnostik forelagt krav om, at medicinsk udstyr, her i blandt reagenser, som bruges til In Vitro diagnostik, skal være CE-IVD mærket. Producenterne af medicinsk udstyr er derfor forpligtet til at udføre en validering af deres reagenser. Derfor kan praktiske undersøgelser af anvendte reagenser undlades (18). Ved validering af en metode, som ønskes implementeret stilles der ofte krav til, at en valideringsrapport skal indeholde information om følgende punkter. Linearitet Metrologisk sporbarhed Måleinterval Robusthed Svarafgivelsesinterval Afsmitning Detektionsgrænse Præanalytiske forhold Svarformat Referenceinterval/klinisk Korrekthed beslutningsgrænse Analytisk specificitet Måleusikkerhed Intermediær præcision Punkterne bør fremgå i en valideringsprotokol, som en del af den endelige valideringsrapport. Desuden skal valideringsrapporten indeholde den endelige konklusion. Som minimum bør der opstilles krav omkring acceptabel korrekthed/bias og intermediær præcision inden for klinisk relevante koncentrationsområder (16). Valideringen sker i samarbejde mellem flere faggrupper. Den kvalitetsansvarlige medarbejder og den analyseansvarlige læge har ansvaret for at vurdere, hvilke af de ovenstående punkter, som er relevante i forbindelse med valideringen af en analyse. Her står bioanalytikerne for den praktiske udførelse af laboratoriearbejdet. I dette projekt har vi, i samarbejde med den kvalitetsansvarlige medarbejder, selv valgt hvilke punkter, der er relevante i forbindelse med valideringen af projektets IgA screenings assay (16). Side 15 af 53

16 Vores projekt 1.2 Vores projekt For at have IgA frit blod på lager til patienter med IgA mangel, der har dannet et anti-iga, er det nødvendigt at finde donorer med IgA mangel. Det gør man på nuværende tidspunkt ikke i region Sjælland, hvorfor blodkomponenter uden IgA til patienter med IgA mangel indkøbes fra rigshospitalet. Afdelingsledelsen på KIA, Næstved har en vision om at implementere en Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) analyse til screening af donorer for IgA mangel, som det gøres på rigshospitalet (Bilag 1). Formålet med projektet er: at validere og implementere en kvalitativ ELISA analyse til screening af donorer for IgA mangel i region Sjælland. Valideringen sker på baggrund af praktiske forsøg, hvor proceduren for analysen i første omgang skal opsættes efter tidligere pilotforsøg lavet på klinisk immunologisk afdeling i Næstved. Herefter skal analysen optimeres for derefter at blive valideret. at lægge op til at der på sigt kan implementeres en kvantitativ ELISA som konfirmatorisk test for at fastlægge den nøjagtige koncentration af IgA hos donorer, der ud fra screeningen, har IgA mangel. Side 16 af 53

17 Introduktion 1.3 Afgrænsning Fokus i denne opgave ligger i, at optimere og validere en ELISA opsætning på udvalgte parametre. Her er det målet at finde den optimale blokeringsbuffer samt koncentration af coating og konjugat antistof. Selvom der er andre parametre, der kan justeres og optimeres, forventes det at det kan lade sig gøre at opnå en acceptabel opsætning ved optimering af disse parametre. Efter optimering vil der blive udført en delvis validering af analysen. Der vil blive foretaget forsøg for at belyse analysens intraserielle og intermediære præcision, samt analysens linearitet for at fastlægge analysens måleområde og detektionsgrænse. Herudover foretages der forsøg for at undersøge, hvorledes præanalytiske forhold har indflydelse på analysen. Der vil på baggrund af søgt litteratur og en linearitetsundersøgelse blive besluttet en cut off, som vil blive diskuteret i forhold til transfusion af IgA frie blodkomponenter. Fordele og ulemper ved ELISA teknikken vil blive diskuteret, og der vil blive perspektiveret til andre alternativer til metoden. På baggrund af resultaterne fra valideringsforsøgene vil det blive diskuteret og konkluderet om analysen lever op til de krav, som på forhånd stilles til analysen. 1.4 Problemformulering Hvordan valideres en ELISA analyse til screening af donorer for IgA mangel, således at den kan implementeres på klinisk immunulogisk afdeling i Næstved. Hvilke fordele og ulemper medfører screeningen for patienter, donorer og klinisk immunologiske afdeling i region Sjælland. Side 17 af 53

18 Metodiske overvejelser 1.5 Metodiske overvejelser I projektet er den metodiske tilgang eksperimentel kvantitativ. Dette projekts primære fokus ligger i opsætning, optimering og validering af et kvalitativt ELISA assay, i forbindelse med screening for IgA mangel hos donorer. I første omgang er målet at opsætte analysen således, at der laves en screening, som giver et kvalitativt resultat, altså om donor er positiv eller negativ i forhold til en besluttet cut off værdi. For at kunne opsætte analysen er det nødvendigt at finde den optimale opsætning. Først når den optimale opsætning er fundet, kan der laves validerings forsøg (figur 6). Figur 6. Flowdiagrammet viser rækkefølgen af de forsøg vi har valgt at udføre i projektet Krav til analysen For at minimere risikoen for en transfusionskomplikation hos patienter med IgA mangel, der har dannet anti-iga er det vigtigt, at analysen kan detektere de små mængder IgA, som donorer med IgA mangel har i blodet. Vi har fastsat et krav om, at analysen skal kunne detektere koncentrationer under 100 ng/ml for at kunne etablere et donorpanel, af donorer med et minimum af IgA. Dette er valgt på baggrund af vores litteratursøgning. I artiklen Recombinant human immunoglobulin (Ig)A1 and IgA2 anti-d used for detection of IgA deficiency and anti-iga, skrevet af Leif K. Nielsen og Morten H. Dziegiel, beskrives det, at KIA på rigshospitalet udfører IgA analyser, heriblandt en kvantitativ Side 18 af 53

19 Metodiske overvejelser ELISA, hvor en grænse på 100 ng/ml er sat for, hvor meget IgA en blodkomponent må indeholde når den anvendes til patienter med IgA mangel. Grænsen er sat lavere end Europarådets anbefalinger for at sikre, at patienten med anti-iga, ikke får en transfusionskomplikation under blodtransfusionen (10). I vores projekt er det besluttet at den gennemsnitlige OD-værdi for den positive kontrol, fortyndet til 200 ng/ml skal bruges som cut off værdi. Derved sikres det, at alle donorer under 100 ng/ml fanges selvom analysen måske har en variation, som kan gøre at OD-værdien svinger fra dag til dag. Hvis cut off sættes højere fanges for mange donorer med en for høj koncentration af IgA i blodet, hvilket vil betyde at donor vil blive informeret om at have IgA mangel, selvom donor kun har et lavt IgA niveau, som ikke har nogle klinisk betydning ved transfusionsbehandling. Samtidig vil det betyde at der er større risiko for en transfusionskomplikation hos patienter med IgA mangel, hvis koncentrationen af IgA i blodkomponenterne er for højt når der ikke udføres en kvantitativ analyse. Sættes cut off for lavt, vil donorer med IgA mangel måske ikke blive fanget i screeningen, hvilket kan betyde at der ikke vil blive taget hensyn til donors IgA mangel, hvis donor skal transfunderes. Samtidig vil der muligvis være færre donorer registreret med IgA mangel. Det er vigtigt, at analysen har en god linearitet omkring de 200 ng/ml, da det er den koncentration den fortyndet positive kontrol har. I forhold til den intraserielle og intermediære præcision er der fastsat et krav om, at variationskoefficienten (CV%) maksimalt må være 20%. Dette krav er sat for at sikrer at analysen har en god præcision Delforsøg Der vil blive anvendt donorplasma fra en donor i region Sjælland, der har IgA mangel som negativ kontrol. Den positive kontrol vil være den samme, som der anvendes i region hovedstaden og som er plasma fra en donor i region hovedstaden med en kendt koncentration af IgA. Til kalibreringskurver anvendes humant IgA med en kendt koncentration, som købes fra Sigma-Aldrich (st. Louis, USA). I delforsøg 1 er første mål at opnå et signal med de valgte reagenser og den opsætning som er valgt på baggrund af litteratursøgning og tidligere pilot forsøg lavet på KIA Næstved. Der vil blive lavet Side 19 af 53

20 Metodiske overvejelser en kalibreringskurve, og der vil blive medtaget en høj og lav positiv kontrol samt en negativ kontrol og blanke brønde uden analyt. Delforsøg 2 bliver en afprøvning af forskellige coating- og konjugat-koncentrationer samt forskellige blokeringsbuffere, for at fastlægge den optimale opsætning. Der vil blive medtaget en kalibreringskurve samt en høj og lav positiv kontrol. Derudover vil der være en negativ kontrol samt blanke brønde uden analyt. Delforsøg 3 bliver en undersøgelse af de valgte valideringsparametre, som er linearitet, intraseriel præcision, intermediær præcision og præanalytiske forhold. Linearitets undersøgelsen vil blive udført ved, at en donorprøve fortyndes i flere intervaller så øvre og nedre målegrænse kan fastlægges. Resultaterne fra undersøgelsen indsættes i et diagram for visuelt at se om området mellem øvre og nedre målegrænse er lineært. Ud fra linearitets undersøgelsen kan analysens måleområde samt detektionsgrænse fastlægges. Der vil blive medtaget en kalibreringskurve, en negativ kontrol samt blanke brønde. Intraseriel præcision udføres ved 24 gentagne målinger på den lave positive kontrol på 200 ng/ml. Ud fra dette udregnes middelværdi, standard deviation (SD) og CV%. Der vil blive medtaget en kalibreringskurve, en negativ kontrol samt blanke brønde. Intermediær præcision vil blive fastlagt ved, at vi analyserer den lave positive kontrol 10 gange i 5 dage. Herefter vil middelværdi, SD og CV% blive beregnet. Vi vil ud fra resultaterne forsøge at lave et Levey-Jennings plot for, at se om kontrollen ligger stabilt, og ikke afviger fra den korrekte værdi med mere end en 1 SD. Der vil blive medtaget en kalibreringskurve, en negativ kontrol samt blanke brønde. Præanalytiske forhold, som afsmitning fra anden apparatur, prøvehåndtering og opbevaring vil blive testet. Dette vil vi gøre ved at opbevarer prøverne ved frost, på køl og ved stuetemperatur. Samtidig vil vi prøve at centrifugere prøverne i 5 og 10 minutter ved forskellige hastigheder. Vi vil derudover se om det har nogen indflydelse på analysen om prøveglasset først har været kørt på architect eller neo. Der vil blive medtaget en kalibreringskurve, en negativ kontrol samt blanke brønde. Side 20 af 53

21 Metodiske overvejelser Donorprøver Der køres en ELISA plade med donorprøver ved den opsætning, der findes bedst i optimeringsforsøgene. Forsøget vil blive udført på den måde som screenings assayet ønskes opsat for at afprøve om den kan anvendes efter hensigten. Der vil blive medtaget positive og negative kontroller samt blanke brønde Litteratursøgning Der er søgt videnskabelige artikler i databaserne PubMed og DEFF. Fokus har været at finde andre studier, der har arbejdet med ELISA til detektering af IgA og anti-iga. Derudover er der søgt litteratur i søgemaskinen Google og Google Scholar. Her var målet at opnå en bred viden om IgA mangel, validering, lovkrav og akkreditering. Søgeord som IgA deficiency, selektiv IgA mangel, ELISA, Anti-IgA, IgA deficiency and blood transfusion og blood donor and screening er anvendt til litteratursøgning Etiske og statistiske overvejelser Projektet er et kvalitetssikringsprojekt, hvor der ikke anvendes patientprøver. Derfor er det ikke nødvendigt at søge om tilladelse hos den nationale videnskabsetiske komité. Der anvendes donorprøver, hvortil der kommer et etisk dilemma i forhold til hvis der findes en donor med IgA mangel i dette projekt. Er dette tilfældet vil resultatet blive videregivet til den analyse ansvarlige læge,som må tage beslutning om, hvorvidt resultatet kan bruges, om donor skal informeres eller andre handlinger skal igangsættes. Data fra forsøgene vil blive behandlet statistisk for at kunne vurdere og sammenligne resultaterne. Alle resultater fra delforsøg 1 og 2 vil blive sat i et diagram for at kunne foretage en vurdering af dem. Resultater fra delforsøg 3 blive brugt til statistiske udregninger som SD og CV%. Alle statistiske beregninger og grafer udføres i Microsoft Office Excel Side 21 af 53

22 Materiale og metode 2. Materialer og metode Apparatur Kubota 4200 centrifuge fra Kubota (Tokyo, Japan) Kubota 4200 centrifuge fra Kubota (Tokyo, Japan) ELISA Washer ELX50 fra Holm & Halby (Brøndby, Danmark) ELISA Reader ELX800 fra Holm & Halby (Brøndby, Danmark) Fremgangsmåde Fremgangsmåden er den samme i alle delforsøg og forløber som på figur 7. Figur 7. Flowdiagram over fremgangsmåden ved ELISA. 2.1 Forberedelse af reagenser og buffere Reagenserne er fremstillet på samme måde i alle delforsøg medmindre andet er beskrevet. Coating buffer: Først blev 0,78g 1M NatriumChlorid (NaCl) (Cat. Nr. S G, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) opløst i 100 ml destilleret vand så der blev fremstillet en 0,135M NaCl opløsning. Herefter blev 1mg Side 22 af 53

23 Materiale og metode coating antistof Anti-Human IgA, ged (cat. Nr. I0884-1MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) opløst i 1 ml 0,135M NaCl. Coating buffer blev fremstillet ved at 10 µl Anti-human IgA 1 mg/ml blev blandet med 200 ml PBS for at opnå en koncentration på 1: Vaskebuffer og blokeringsbuffer: Vaskebuffer blev fremstillet ved at 500 µl Tween 20 blev tilsat 1 L PBS. Herefter blev blokeringsbuffer fremstillet ved at 2,5 g BSA (Cat. Nr. A G, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) blev opløst i 250 ml PBS hvorefter 1 ml 10% W/V NatriumAzid (Cat. Nr. AMPQ , AMPLIQON, Odense, Danmark) blev tilsat. Prøvefortyndingsbuffer Prøvefortyndingsbuffer består af 2,5 g BSA der blev opløst i 250 ml PBS som derefter blev blandet med 2,5 ml Phenolrød (cat.nr P ML, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og 1 ml 10% W/V NatriumAzid. Humant IgA og kontroller: Humant IgA på 1,7 mg/ml (Cat. Nr. I2636-5MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) blev fortyndet til en koncentration på 1 mg/ml ved at 588 µl humant IgA blev tilsat 412 µl PBS. Den negative kontrol (Tappe nr. 4059, Transfusionscenteret, Næstved, Danmark) tilsættes 2 ml 10% NatriumAzid og udportioneres i eppendorfrør. Der blev fremstillet en 1% BSA i PBS ved at 0,1 g BSA blev opløst i 10 ml PBS. Herefter fortyndes den positive kontrol (Cat. Nr , Rigshospitalet, København Ø, Danmark) fra en koncentration på 4,5 mg/ml til 200 ng/ml ved at 2 µl kontrolmateriale blev blandet med 2 ml 1% BSA i PBS. Derefter blev 400 µl af det fortyndede kontrolmateriale fortyndet yderligere i 8,6 ml PBS og der blev tilsat 36 µl 10% NatriumAzid. Side 23 af 53

24 Materiale og metode Konjugat buffer og stop solution: Der blev fremstillet en 5% 2-chloracetamid (Cat. Nr. C G, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ved at 25g 2-chloracetamid blev opløst i 500 ml PBS. Herefter blev den fortyndet til en 1% 2- chloracetamid ved at 100 ml 5% 2-chloracetamid blev tilsat 400 ml PBS. Konjugat bufferen blev fremstillet ved at 2,5 g BSA blev opløst i 225 ml PBS hvorefter 25 ml 1 % 2-chloroacetamide og 25 µl Anti-IgA/HRP, kanin (Cat. Nr. P0216, DAKO Denmark A/S, Glostrup, Danmark) blev tilsat for at få en koncentration på 1: Til sidst blev stop solution blandet ved at 27,8 ml koncentreret 18 molær (M) H2SO4 (96-98%) (Cat. Nr ML, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) blev fortyndet til en koncentration på 2 M i 250 ml PBS 2.2 Delforsøg 1 (opnå signal) Formålet med delforsøg 1 er at opnå et signal med opsætningen fra tidligere pilotforsøg. Inden arbejdet begyndte blev der lavet et skema, over hvad de forskellige brønde skulle indeholde (figur 8). Figur 8. Pladeopsætning for delforsøg 1. Humant IgA i2636 anvendes til kalibreringskurve. De blanke er med for at kunne trække baggrunden fra resultaterne. Den negative kontrol er plasma fra en donor i region Sjælland som har IgA mangel. Den lave positive kontrol er en fortynding af den høje positive der er plasma med en kendt koncentration af IgA. Side 24 af 53

25 Materiale og metode En ELISA NUNCmaxisorp plade (Cat. Nr. NUNC439454, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) blev coatet med 100 µl coating buffer, hvorefter pladen blev pakket ind og inkuberet i køleskab natten over. Dagen efter blev pladerne vasket på standardprogram 3 (3x vask) på ELISA washer ELX50 (serie nr ), hvorefter der blev tilsat 130 µl blokeringsbuffer til hver brønd. Pladen blev pakket ind og herefter inkuberet på shaker med ca. 50 i hastighed i en time. Imens pladen inkuberede blev der lavet en fortyndingsrække af humant IgA. Syv glas blev mærket med koncentrationerne 800, 400, 200, 100, 50, 25 og 12,5. Herefter blev der tilsat 5 ml prøvefortyndingsbuffer til glasset mærket med 800. Der blev derefter tilsat 500 µl prøvefortyndingsbuffer til de resterende glas. 4µl humant IgA med en koncentration på 1 mg/ml blev blandet i glasset mærket med 800. Til sidst blev 500 µl overført fra glas 800 til glas 400 og 500 µl fra glas 400 til glas 200 og 500 µl fra glas 200 til glas 100 osv. Efter inkubationen blev pladerne igen vasket på program 3 på ELISA washer, hvorefter der blev tilsat 100 µl fortyndet prøvemateriale til de respektive brønde. Den høje og lave positive kontrol blev fortyndet 1:2 i prøvefortyndingsbuffer hvorefter der blev tilsat 100 µl til de brønde kontrollerne skulle være i. Den negative kontrol blev ikke fortyndet så der blev tilført 100 µl direkte til hver brønd. Da alt prøvemateriale var tilsat blev pladen pakket ind og herefter inkuberet på shaker en time. Efter inkubationen blev pladen vasket på program 3 på ELISA vasker. Herefter blev 100 µl konjugat buffer tilsat hver brønd og pladen blev pakket ind og inkuberet på shaker en time. Herefter blev pladen vasket på program 3 på ELISA vasker, hvorefter der blev tilsat 100 µl TMB-substrat (kat. Nr. T ML) til alle brønde. Da TMB-substrat er lysfølsomt var det vigtigt, at pladen blev pakket mørkt ind. Pladen blev inkuberet på shaker i minutter, hvorefter 50 µl stop-solution blev tilsat til hver brønd. Efter tilsætning af stop solution blev pladerne aflæst på ELISA reader ELx800 (serie nr ) ved 450 nm. Forsøget blev gentaget flere gange for at forbedre afpipetteringsteknikken. Side 25 af 53

26 Materiale og metode 2.3 Delforsøg 2 (optimeringsforsøg) For at finde den bedste koncentration af coating og konjugat antistof i bufferne samt den bedste blokeringsbuffer, blev forskellige kombinationer af coating og konjugat koncentrationer testet i dette forsøg. Først blev der fremstillet nye coating og konjugat buffere. Coating buffer: 40 µl Anti-human IgA blev fortyndet 1:5000 i 200 ml PBS for at fremstille en af coating bufferne. Derefter blev 100 ml af 1:5000 coating bufferen fortyndet yderligere til en 1: i 100 ml PBS. Coating buffer 1: var den samme som blev anvendt i delforsøg 1. Konjugat buffer: 100 µl Anti-Human IgA/HRP blev fortyndet 1:2500 i 225 ml PBS tilsat 2,5 g BSA og 25 ml 1% 2- chloractamid for at fremstille en af konjugat bufferne. Der blev fremstillet en konjugat buffer med 50 µl Anti-Human IgA/HRP fortyndet 1:5000 i 225 ml PBS tilsat 2,5 g BSA og 25 ml 1% 2- chloracetamid. Den sidste konjugat buffer blev fremstillet ved at 12,5 µl Anti-Human IgA/HRP blev fortyndet 1: i 225 ml PBS tilsat 2,5 g BSA og 25 ml 1% 2-chloracetamid. Konjugat buffer 1: fremstilles på samme måde som i delforsøg 1. Der blev fulgt samme procedure som ved delforsøg 1 udover, at der blev lavet 4 plader med forskellige coating og konjugat koncentrationer (figur 9a+b). Side 26 af 53

27 Materiale og metode Figur 9a. Billede af pladeopsætning for plade 1. Coating buffer anvendes i koncentrationerne 1:5000, 1: og 1: kombineret med en konjugat buffer i koncentrationerne 1:2500 og 1:5000. Der køres dobbeltbestemmelser af kalibreringskurven, hvor humant IgA i2636 fortyndes til koncentrationerne 800 ng/ml, 400 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml og 12,5 ng/ml. De blanke brønde er uden analyt og den positive kontrol fortyndes til en koncentration på 200 ng/ml. Den negative kontrol er plasma fra en donor med IgA mangel. Side 27 af 53

28 Materiale og metode Figur 9b. Billede af pladeopsætning til plade 2. Begge plader er blevet kørt 2 gange. Et sæt blev blokeret med BSA, hvor det andet sæt blev blokeret med Tween 20. Der er anvendt coating buffer i koncentrationerne 1:5000, 1: og 1: i kombination med en konjugat buffer i koncentrationerne 1: og 1: Der er kørt dobbeltbestemmelse af kalibreringskurve n, der er lavet af humant IgA i2636. De blanke brønde er uden analyt, de positive kontroller er fortyndet til en koncentration på 200 ng/ml og den negative kontrol er plasma fra en donor med IgA mangel. Forsøget blev gentaget flere gange på grund af afsmitning mellem brøndende, kraftig reaktion i alle brønde samt dannelse af sort præcipitat. Der blev skiftet substrat undervejs så der blev anvendt TMBsubstrat (Cat. Nr. T0440-1L) til de sidste omkørsler. 2.4 Delforsøg 3 (Valideringsforsøg) Forskellige valideringsparametre undersøges i dette delforsøg. Der blev fremstillet mere reagens, efter samme procedure som i delforsøg 1, så der var nok til at kører de sidste forsøg. Der blev lavet skemaer over opsætningen. Linearitetsundersøgelse: Til linearitetsundersøgelsen blev der fulgt samme procedure som i delforsøg 1. På figur 10 ses pladeopsætningen for dette forsøg. Der blev kørt 8 blanke brønde uden analyt samt en dobbeltbestemt fortyndingsrække af en donorprøve der blev udført således; 18 glas mærkes med tappe nummer samt fortyndingsfaktorerne ufortyndet, 1:2, 1:4, 1:8 osv. Op til 1: Derefter blev 1000 µl plasma fra en donorprøve (tappe nr. V ) overført til glasset Side 28 af 53

29 Materiale og metode mærket ufortyndet. Der blev så overført 500 µl prøvefortyndingsbuffer til de resterende glas hvorefter 500 µl fra glasset med det ufortyndet plasma blev overført til glasset med fortyndingen 1:2. Derefter blev 500 µl fra 1:2 glasset overført til 1:4 glasset. Dette blev gjort gennem alle 18 glas. Den negative og positive kontrol blev ikke fortyndet i prøvefortyndingsbuffer, men blev direkte tilsat brøndende. Den blanke er uden analyt. Figur 10. Billede af pladeopsætningen for linearitetsforsøg. En donorprøve fortyndes ved en to-folds fortynding fra ufortyndet til 1: Der køres en kalibreringskurve lavet af humant IgA i2636 for at kunne udregne koncentrationen. Der medtages blanke brønde uden analyt samt en positiv kontrol, som er plasma med en kendt koncentration af IgA. Den negative kontrol er plasma fra en donor med IgA mangel. Forsøget er gentaget med en fortynding af humant IgA i stedet da koncentrationen kunne estimeres på forhånd, så der var en bedre kontrol med kvaliteten af forsøget. Intraseriel præcision: I dette forsøg blev der analyseret 24 gange på den positive kontrol for at finde den intraserielle præcision. Der blev fulgt samme procedure som ved delforsøg 1, men pladeopsætningen så ud som på figur 11. Side 29 af 53

30 Materiale og metode Figur 11. Billede af pladeopsætning til den intraserielle præcision. Der køres 24 målinger af den positive kontrol, der er fortyndet til 200 ng/ml. Der medtages en kalibreringskurve lavet af humant IgA for at kunne udregne en koncentration. Den intraserielle præcision skal bruges til at udregne middelværdi, SD og CV% indenfor en serie. Der er medtaget blanke brønde uden analyt samt en negativ kontrol der er plasma fra en donor med IgA mangel. Intermediær præcision: I dette forsøg blev der lavet 1 plade, hver dag i 5 dage af en ny bioanalytiker ved hver plade for at finde den intermediære præcision. Der blev fulgt samme procedure som i delforsøg 1. Dog blev der kørt 5 dobbeltbestemmelser af den positive kontrol (figur 12). Der blev overført 100 µl kontrolmateriale direkte til brøndene og der blev medtaget 2 dobbeltbestemmelser af den blanke og negative kontrol. Side 30 af 53

31 Materiale og metode Figur 12. Billede af pladeopsætning til den intermediære præcision. Der køres 5 dobbeltbestemmelser af den positive kontrol fortyndet til 200 ng/ml. Der medtages en kalibreringskurve lavet af humant IgA for at kunne udregne koncentrationen på de positive kontroller. Resultaterne skal bruges til at udregne middelværdi, SD og CV% ved dag til dag samt bioanalytiker til bioanalytiker. Denne plade opsætning køres i fem dage af en ny bioanalytiker hver dag. Den negative kontrol er plasma fra en donor med IgA mangel og de blanke er uden analyt. Præanalytiske forhold: I dette forsøg blev forskellige præanalytiske forhold testet. Centrifugering ved 5 og 10 minutter, afsmitning fra Architect i forhold til afsmitning fra NEO samt opbevaring ved køl, frys og stuetemperatur blev undersøgt. En uge inden forsøget blev plasma fra 2 prøver afpipetteret i 2 eppendorf rør hver. Et der skulle fryses og et der skulle opbevares ved stuetemperatur. Resten af prøven blev opbevaret på køl. For at teste afsmitning fra andet apparatur blev 4 prøver fra 2 forskellige donorer analyseret. Det ene glas fra hver donor havde kørt på Architecten først, det andet på NEO. Til test af centrifugering blev anvendt 4 prøver fra 2 forskellige donorer, hvor det ene glas fra hver donor blev centrifugeret i 5 minutter ved 1500 g i Kubota 4200 centrifuge (serie nr. H f000), hvor det andet blev centrifugeret i 10 minutter ved 3200 RPM i Kubota 4200 centrifuge (serie nr. J2075-M000). Der blev fulgt samme procedure som ved delforsøg 1, men pladeopsætningerne så ud som på figur 13a+b. Undersøgelse af afsmitning fra andet apparatur blev foretaget på en af pladerne til den intermediære præcision. Side 31 af 53

32 Materiale og metode Figur 13a. Billede af pladeopsætning til undersøgelse af præanalytiske forhold. Der køres 2 dobbeltbestemmelser af hver donorprøve. Plasmaet er udportioneret i 3 eppendorfrør som er blevet opbevaret på køl, frost og ved stuetempe ratur. Der medtages en kalibreringskurve lavet af humant IgA for at kunne udregne koncentrationen. Samtidig tjekke centrifugeringens indvirkning på analysen ved at der køres 2 dobbeltbestemmelser af en prøve der er centrifugeret ved 1500 g i 5 minutter og en der er centrifugeret ved 3200 RPM i 10 minutter. Prøve 1 ved hver parameter er fra samme donor, hvilket også gør sig gældende for prøve 2. Der er medtaget en positiv kontrol som er plasma med en kendt koncentration af IgA, blanke brønde uden analyt og en negativ kontrol som er plasma fra en donor med IgA mangel. Figur 13b. Billede af pladeopsætning til testning af afsmitning fra maskinerne Architect og NEO som kører virusanalyser og fænotyper. Der er kørt 2 dobbeltbestemmelser af hver prøve. Resultaterne skal bruges til at se om den ene maskiner laver større afsmitning end den anden. Det var ikke muligt at skaffe et prøveglas der ikke var brugt til en anden analyse først. Forsøget blev kørt sammen med den sidste kørsel af den intermediære præcision. Til kalibreringskurven er humant IgA anvendt, plasma med en kendt koncentration af IgA er anvendt til positiv kontrol og plasma fra en donor med IgA mangel er anvendt til negativ kontrol. De blanke brønde er uden analyt. Side 32 af 53

33 Materiale og metode 2.5 Donorprøver I dette forsøg testes projektets screenings assay med donorer. Der blev kørt med en coating koncentration på 1: sammen med en konjugat koncentration på 1: Der blev fulgt samme procedure som ved delforsøg 1, men pladeopsætningen så ud som på figur 14. Figur 14. Billede af pladeopsætning til kørsel af donorprøver. Forsøget skal afspejle sådan som analysen skal kører i rutinen. Donorprøverne fortyndes 1:2 i prøvefortyndingsbuffer ligesom kontrollerne. Der medtages 6 positive kontroller fortyndet til 2 00 ng/ml da den gennemsnitlige OD-værdi for de positive kontroller skal anvendes til cut off for, om donor har IgA mangel. Plasma med en kendt koncentration af IgA er anvendt til positiv kontrol og plasma fra en donor med IgA mangel er anvendt til negativ kontrol. De blanke brønde er uden analyt. Donorprøverne blev ikke centrifugeret, da der i forvejen var kørt virusanalyser på glassene. Efter blokering blev der tilført 50 µl prøvefortyndingsbuffer til hver brønd, hvorefter der tilsættes 50 µl prøvemateriale til de respektive brønde. Der blev kørt 6 positive kontroller, der skal bruges som cut off. Den negative og positive kontrol blev begge fortyndet i prøvefortyndingsbuffer. Side 33 af 53

34 Resultat 3. Resultater Resultaterne fra de praktiske forsøg vil, i dette afsnit, blive opsat i rækkefølgen af de delforsøg der er blevet udført. Der er blevet arbejdet med optimering af analyse opsætning, hvorefter der er blevet udført forsøg ud fra de valideringsparametre, som der er blevet valgt at arbejde ud fra. 3.1 Delforsøg 1 (opnå signal) Formålet med dette forsøg er at kunne konkludere, om vi er i stand til at få et signal med de hjemkøbte reagenser. Derfor sættes fortyndingen af coating og konjugat antistof til henholdsvis 1: og 1: samtidig med, at der laves en kalibreringskurve. På figur 15 ses det, at den negative kontrol har en højere OD-værdi end den høje positive kontrol og den lave positive kontrol har en lavere ODværdi end de blanke. Det ses at den høje positive kontrol har en forholdsvis stor SD på 0,72. Kalibreringskurven har en OD-værdi på 2,5. Der er anvendt middelværdien for dobbeltbestemmelsen af kalibreringskurven, samt middelværdien for de 4 målinger af hver kontrol og de blanke, til at lave grafen. Figur 15. Grafen viser en kalibreringskurve lavet af humant IgA. Der er medtaget en høj og lav positiv kontrol samt en negativ og blank. Data for punkterne er gennemsnittet af dobbeltbestemmelsen. Side 34 af 53

35 Resultat Der blev kørt med en ny fortyndingsrække og på figur 16 ses det at OD-værdien for kalibreringskurven her ligger på 1,531. Den høje positive kontrol ligger højere end kalibreringskurven og den lave positive kontrol har ifølge kalibreringskurven en koncentration mellem ng/ml. Det ses også at både den negative og den blanke har en OD-værdi tæt på 0. SD er lille ved alle målinger. Figur 16. Grafen viser en kalibreringskurve lavet ved en fortynding af humant IgA. Der er medtaget en høj og lav positiv kontrol samt en negativ kontrol. Derudover er der medtaget blanke brønde uden analyt. Punkterne er den gennemsnitlige OD-værdi af de enkelte målinger. 3.2 Delforsøg 2 (optimeringsforsøg) Formålet med delforsøg 2 var at bestemme den mest optimale koncentration af henholdsvis coating og konjugat antistof. Derfor undersøges forskellige fortyndinger af coating og konjugat antistof. Coating antistof fortyndes 1:5000, 1: og 1: Konjugat antistof fortyndes 1:2500, 1:5000, 1: og 1: samtidig med at der laves en kalibreringskurve. På figur 17 ses der uspecifikke reaktioner ved høje koncentrationer af coating og konjugat antistof. De fleste kalibreringskurver ligger på en OD-værdi over 1,500. De 3 kalibreringskurver med de laveste OD-værdier har kombinationerne coating 1:10.000/ konjugat 1:20.000, coating 1:20.000/ konjugat 1: og coating 1:20.000/ konjugat 1: Der ses lavere OD-værdier ved en coating koncentration på 1: fremfor 1: Side 35 af 53

36 Resultat Figur 17. Grafen viser kalibreringskurver, udført med humant IgA, ved forskellige coating og konjugat koncentrationer ved blokering med BSA. Punkterne er den gennemsnitlige OD-værdi af dobbeltbestemmelser af hver måling. Data brugt til grafen er fra første kørsel af delforsøg 2. Ydermere undersøgte vi effekten af to blokeringsbuffere. På figur 18 ses store udsving i kalibreringskurven ved blokering med Tween 20, hvor kurven ligger mere stabilt ved blokering med BSA. Særligt punktet på 25 ng/ml ved blokering med Tween 20 har en høj SD, som ligger på 0,563. Det ses, at de lave positive kontroller ud fra kalibreringskurven, har en koncentration på ng/ml. I de første omkørsler af delforsøg 2 havde den positive kontrol en koncentration mellem ng/ml hvor den i de sidste omkørsler havde en koncentration mellem ng/ml. Side 36 af 53

37 Resultat Figur 18. Grafen er lavet på resultater fra anden kørsel af delforsøg 2. Kalibreringskurverne er lavet ud fra fortyndinger af humant IgA. Der er medtaget positive kontroller i dette diagram. De negative og blanke er udeladt da de ikke har haft samme koncentration af coating og konjugat antistof. 3.3 Delforsøg 3 (valideringsforsøg) Formålet med valideringsforsøgene er at undersøge om analysen lever op til de fastsatte krav. Linearitetsundersøgelsen bruges til at finde analysens måleområde samt detektionsgrænse. Den positive kontrol er fortyndet ved en to-folds fortynding fra ufortyndet til en fortynding på 1: På figur 19 ses det, at analysen kan måle en IgA koncentration fra 10,85 ng/ml til 839,400 ng/ml. Det ses, at kurven flader ud omkring 255 ng/ml og en OD-værdi omkring 1,2. Det kan ses, at donorprøven ligger inden for kalibreringskurven ved en fortynding fra 1:254 til 1: Resultaterne er fra forsøget, som er kørt med fortyndinger af den positive kontrol. Side 37 af 53

38 Resultat Figur 19. Grafen er et x/y-plot der viser hvordan den positive kontrol fordeler sig i forhold til kalibreringskurven lavet med humant IgA. Kurven viser analysens måleområde. Den positive kontrol er fortyndet ved en to-folds fortynding fra ufortyndet til en fortynding på 1: Den intraserielle præcision er udført for at beregne middelværdi, SD og CV% ud fra 24 gentagne målinger på den positive kontrol. Middelværdien af den positive kontrols IgA koncentration er beregnet til 76,594 ng/ml, SD er beregnet til 12,671 og CV% ligger på 16,5%, se tabel 1. Da der ses afsmitning i den ene brønd med en koncentration over 300 ng/ml er denne udtaget af beregningerne for middelværdi, SD og CV%. Tabel 1. En sammenligning af SD og CV% for den intraserielle samt intermediære præcision. Beregningerne er lavet ud fra koncentrationen af den positive kontrol. Formålet med den intermediære præcisions forsøg var at se CV% ved dag til dag variationer samt bioanalytiker til bioanalytiker. Der blev målt 5 positive kontroller hver dag i 5 dage. På figur 20 ses det at kontrollen svinger i OD-værdi fra dag til dag samt fra bioanalytiker til bioanalytiker. Den beregnede middelværdi for den positive kontrol er en IgA koncentration på 114,027 ng/ml. SD er beregnet til 32,07 og CV% ligger på 28,1%, se tabel 1. Side 38 af 53

39 Resultat Figur 20. Billedet viser et kontrolkort lavet ud fra resultaterne i den intermediære præcision. Kontrolkortet er lavet på ODværdierne for den positive kontrol fortyndet til 200ng/ml. Undersøgelsen af de forskellige præanalytiske forhold viste, at der ved sammenligning af afsmitning fra Architect og NEO ikke var nogen betydelig forskel. Det samme så sig gældende ved testning af centrifugering ved 1500 g i 5 og 3200 RPM i 10 minutter. I forhold til opbevaringen ses der en ODværdi der er 0,100 lavere ved opbevaring på frost. Ellers ses der ikke nogen betydelig forskel. 3.4 Donorprøver Der blev kørt en plade med 40 donorprøver for at afprøve screenings assayet efter valideringsforsøgene. Der blev målt 6 positive kontroller, hvor den gennemsnitlige OD-værdi skal bruges som cut off. Den gennemsnitlige OD-værdi lå på 0,134, hvilket betyder at ingen donorprøver var negative for IgA. Donorprøverne havde en OD-værdi mellem 0,187-1,329 hvoraf de fleste har en OD-værdi under 0,500 samtidig ses der en lav CV% i dobbeltbestemmelserne af donorprøverne. Kun en enkelt havde en CV% på 24% mellem de to bestemmelser af prøven. Side 39 af 53

40 Diskussion 4. Diskussion 4.1 Delforsøg 1 (opnå signal) Formålet med delforsøg 1 var at opnå et signal med den plade opsætning, som har været anvendt ved tidligere pilotforsøg udført på KIA, Næstved. Opsætningen virkede, og vi opnåede signal. Det ses dog, at den lave positive kontrol har en lavere OD-værdi end den blanke, mens den negative kontrol ligger højere end den høje positive kontrol. OD-værdien for den høje positive kontrol i de enkelte målinger varierer mellem 0,3-1,85 hvilket giver en SD på 0,72, som er forholdsvis højt. Årsagen til dette kunne være, at der er afpipetteret forkert, i forhold til det skema vi har udarbejdet, så der er sket en forbytning. Således at den lave positive kontrol, faktisk er den negative kontrol, mens den høje positive kontrol faktisk er den lave positive kontrol og den negative kontrol så er den høje positive kontrol. Det ses at den anvendte kalibreringskurve ved den laveste koncentration, har en OD-værdi på 1,7 hvilket er højere end det vi vil acceptere. Vi ser generelt at analysen er mere uspecifik ved høje OD-værdier. Da der i forsøget er anvendt reagenser direkte fra køleskabet kan det have indflydelse på den høje OD-værdi, da anvendelse af kolde reagenser kan medføre svingende OD-værdier (19). Hertil kommer at punkterne i kurven ikke stiger som forventet, hvilket kan tyde på at kalibreringskurven ikke er fortyndet korrekt. Da vi under arbejdet ikke har været særligt stringente i forhold til at skifte pipettespidser mellem alle afpipetterings trin kan det have indflydelse på kurvens form. Afpipettering med eller uden dødvolumen kan have en indflydelse på resultatet. Hvis der ikke bliver anvendt samme teknik ved hver afpipettering er det en varierende faktor, der kan påvirke mængden af analyt i brøndende og dermed påvirke reaktionsstyrken. I den sidste omkørsel af delforsøg 1 ses der en lavere OD-værdi samt SD for de enkelte målinger end ved første kørsel. Dette kan skyldes, at der blev skiftet pipettespidser efter hver afpipettering hele processen igennem. Der blev samtidig anvendt samme afpipetteringsteknik gennem hele processen. Den lave positive kontrols koncentration passer med den estimerede værdi og den høje positive kontrol ligger over kalibreringskurven, hvilket viser at kurven ikke er mættet ved de 800 ng/ml. Da den høje positive kontrol har en estimeret IgA koncentration på 2,25 mg/ml i brønden, men kun ligger lidt højere end kalibreringskurvens punkt på 800 ng/ml kan det ses at analysen bliver mættet, og dermed ikke kan binde mere analyt. De blanke har en OD-værdi lavere end 0,2, hvilket er godt da ELISA Development Guide udarbejdet af R&D systems anbefaler en OD-værdi under 0,2 for de blanke brønde (19). Det ses desuden at den negative kontrol ligger under de blanke. Vi formoder at Side 40 af 53

41 Diskussion prøvefortyndingsbufferen kan være med til at give en uspecifik reaktion, i de blanke brønde. Dette formodes, da der ikke er blevet anvendt prøvefortyndingsbuffer til de negative kontroller, og her ses en lavere reaktion end i de blanke. Da der er kørt negative kontroller fortyndet i prøvefortyndingsbuffer, i en af vores omkørsler af delforsøg 2, hvor reaktionen for den negative kontrol stadig ligger lavere end den blanke er det muligt at proteiner i plasmaet, der er anvendt til negativ kontrol, kan være med til at blokere yderligere og dermed forhindre uspecifik binding forårsaget af prøvefortyndingsbuffer. En anden forklaring på at den negative kontrol ligger lavere end de blanke kan være, at der kun er halvt så meget prøvefortyndingsbuffer i den negative kontrol som i de blanke. Det vellykkede resultat, i omkørslen af delforsøg 1, skyldes formentligt, at der er arbejdet mere stringent da fortyndingsrækken blev lavet samtidig med, at der har været stort fokus på at undgå afsmitning fra brønd til brønd ved afpipettering. Derudover er der anvendt samme afpipetteringsteknik gennem hele processen samtidig med, at der er skiftet pipettespidser efter hver afpipettering. Ud fra vores resultater kan det ses, at analysen er mest specifik ved lave OD-værdi, hvor der ses mindre reaktion i de blanke brønde. Det er vigtigt at have en stringent arbejdsmetode for at undgå for store variationer samtidig med, at det er vigtigt at reagenserne anvendes når de har stuetemperatur. Dette medvirker til lavere baggrundsstøj så uspecifikke reaktioner mindskes. 4.2 Delforsøg 2 (optimeringsforsøg) Formålet med delforsøg 2 var at optimere screenings assayet. Ved at afprøve forskellige koncentrationer af coating og konjugat antistof, samt to forskellige blokeringsbuffere, er der mulighed for at afgøre, hvilken opsætning, der er optimal i forhold til screenings assayet. Forsøget er blevet gentaget adskillige gange. Der var generelt ujævne kalibreringskurver ved høje koncentrationer af coating og konjugat antistof. Dette kan skyldes, at der ikke kan bindes mere analyt ved høje koncentrationer af IgA i prøven, som gør at analysen begynder at være mættet. Det viser sig at analysen bliver mere uspecifik ved høje koncentrationer af IgA samt ved høje OD-værdier. Det viste sig at de uspecifikke reaktioner ved de høje koncentrationer af coating og konjugat antistof, forekom ved alle omkørsler, hvilket viser at reaktionen ved de høje koncentrationer af coating og konjugat antistof er så kraftige, at ELISAreaderen ikke kan aflæse brøndende korrekt. Kalibreringskuverne var generelt mere uspecifikke, ved de plader, som blev blokeret med Tween 20, hvilket kan indikere, at denne blokering ikke er lige så god som blokering med BSA. Den høje SD på 0,563 ved kalibreringskurvens punkt på 25 ng/ml ved Side 41 af 53

42 Diskussion blokering med Tween 20 er en årsag til at kalibreringskurven er mere ujævn ved blokering med Tween 20 end ved blokering med BSA. I den ene omkørsel var der en kraftig reaktion i alle brøndende på den ene plade blokeret med BSA (figur 21). Dette formodes at være sket på grund af en afsmitning under vasken, hvor ELISA-washer meldte fejl (19). Det kan også skyldes, at der blev anvendt nyt TMB-substrat med et andet lot.nr, da vi ved anvendelse af dette substrat i de efterfølgende omkørsler oplevede dannelse af sort præcipitat i brøndende. Figur 21. Billede af en kraftig reaktion i alle brønde efter anvendelse af nyt substrat med et andet lot. Nr. Særligt ved høje koncentrationer af coating og konjugat antistof var der dannet præcipitat (figur 22). Dette kan skyldes, at analysen har været så mættet, at det bundfælder. Præcipitatet medførte nogle meget upålidelige resultater, da det har haft indflydelse på farveaflæsningen af brøndende da ELISA readeren ikke kan aflæse den gule farve korrekt når der er sort præcipitat i bunden, hvor lyset skal igennem. Det betyder også at vi ikke har kunne anvende disse resultater, til at vurdere, hvilke koncentrationer af coating og konjugat antistof, der er optimale i forhold til IgA screenings assayet. Side 42 af 53

43 Diskussion Figur 21. Billedet viser dannelse af sort præcipitat som ses ved anvendelse af nyt substrat med nyt lot. nr. Efter en undersøgelse af årsager til, hvorfor der dannes præcipitat, ved brug af det nye substrat, fandt vi ud af, at det anbefales, at man nedsætter inkubationstiden og aflæser pladerne med det samme efter tilførelse af stop solution (20). Det virkede tilsyneladende, da der ved efterfølgende kørsler ikke blev dannet præcipitat. Der skal dog tages forbehold for, at der, i de efterfølgende kørsler, er anvendt en coating koncentration på 1: sammen med en konjugat koncentration på 1:10.000, hvilket kan have haft en indflydelse. Ifølge ELISA technical guide and protocols udgivet af Thermo scientific, kan dannelse af præcipitat skyldes, for meget konjugat antistof, hvilket kan være en af grundende til at vi ser størst dannelse af præcipitat på pladerne med høje koncentrationer af konjugat antistof (14). Ud fra resultaterne i delforsøg 2 ses det at det bør tilstræbes at få lave OD-værdier for at minimere risikoen for uspecifikke reaktioner. Lave OD-værdier kan opnås ved at fortynde coating og konjugat mellem 1: og 1: Ved de koncentrationer sikres det at analysen ikke bliver så mættet at der ses dannelse af præcipitat. Da der først ses dannelse af præcipitat efter skift af TMB-substrat bør der laves en afprøvning af reagenserne når der anvendes nye lot.nr. Det er vigtigt at pladerne aflæses direkte efter tilførsel af stop solution for at minimere chancen for dannelse af præcipitat ved høje koncentrationer af IgA i prøven. Det ses at den optimale koncentration af coating og konjugat er Side 43 af 53