Cancerbehandling: Vaccination med dendritiske celler

Transkript

1 Cancerbehandling: Vaccination med dendritiske celler P4-projekt udarbejdet af gruppe 407, 4. semester 2009 Medicin med Industriel Specialisering Aalborg Universitet, Danmark

2

3 Det Ingeniør-, Natur- og Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Medicin med Industriel Specialisering Frederik Bajers Vej 7, 9220 Aalborg Ø Synopsis Titel: Cancerbehandling: Vaccination med dendritiske celler Tema: Cancer Projektperiode: P4 (2. februar-28. maj 2009) Projektgruppe: 407 Deltagere: Ann K. Stausholm-Møller Lise Boel-Christensen Maja Høegh Christensen Maria Klit Muldbak Roer Maria Kristensen Vejleder: Ralf Agger, lektor, Ph.D., Laboratorium for Immunologi, Aalborg Universitet. Oplagstal: 7 Sideantal: 51 Bilagsantal og -art: Appendix A og B samt CD-rom med kilder fra referencelisten. Afsluttet: 28. maj 2009 Omkring danskere havde i år 2004 diagnosen cancer, og hvert år stiger incidens en. De behandlingsmetoder, der i dag benyttes, har mange bivirkninger og er ofte ikke tilstrækkelige, når canceren opdages i et sent stadie eller er for aggressiv. Der forskes derfor i nye cancerbehandlinger. Immunterapi er et af de lovende områder, der undersøges, og især kliniske forsøg med vacciner indeholdende antigenpræsenterende dendritiske celler har givet positive resultater i kampen mod cancerceller. I denne rapport analyseres resultaterne fra 21 undersøgelser, udgivet i perioden år , omhandlende vacciner med dendritiske celler som cancerbehandling. Hensigten med rapporten er at klarlægge fordelene ved vaccinerne samt beskrive, hvor langt forskningen til dags dato er nået på området. Der fokuseres på teorien bag og fremstillingen af vacciner med dendritiske celler, og dette sammenholdes med nuværende resultater hos cancerpatienter. Det vil blive diskuteret, hvilke tiltag der skal foretages for at gøre behandlingen mere effektiv. Ud fra undersøgelsernes resultater kan det konkluderes, at vaccinerne i nogle tilfælde har givet et immunrespons. På trods af dette er resultaterne forbundet med store usikkerheder og de kliniske resultater og overlevelsesstatistikker er ikke overbevisende. Det skal i fremtiden fastlægges, hvorvidt vaccinerne virker på patienter på et tidligt sygdomsstadie samt hvilke recall-antigener, der kan give et bedre respons. Ydermere gives bud på forbedringer i kommende vacciner med dendritiske celler. Vacciner med dendritiske celler er en potentiel cancerbehandling, men på nuværende tidspunkt er der lang vej igen, før disse vacciner vil blive en primær, permanent del af det danske cancerbehandlingsforløb. Rapportens indhold er frit tilgængeligt, men offentliggørelse (med kildeangivelse) må kun ske efter aftale med forfatterne.

4

5 Forord Denne rapport er udarbejdet af gruppe 407, studerende fra Medicin med Industriel Specialisering ved det Ingeniør-, Natur- og Sundhedsvidenskabelige fakultet, Aalborg Universitet. Projektet er skrevet i P4- perioden fra 2. februar til 28. maj Det overordnede tema for dette projekt er cancer, og gruppen har valgt at fokusere på vaccination med dendritiske celler som cancerbehandling. Målgruppen for rapporten er studerende på uddannelsen Medicin med Industriel Specialisering, studerende på andre relaterede uddannelser og andre interesserede. Rapporten er udarbejdet under vejledning af Ralf Agger, lektor, Ph.D., Laboratorium for Immunologi, Aalborg Universitet. Gruppen takker for godt samarbejde. Projektgruppe 407 Aalborg Universitet, maj 2009 Læsevejledning Rapporten indledes med en teoretisk del, hvor der redegøres for de vigtigste celler i immunsystemet i forbindelse med cancerbekæmpelse. Dernæst fremhæves en af de mest almindelige måder, hvorpå en vaccine med dendritiske celler fremstilles. Herefter fremstilles resultaterne fra en række undersøgelser omhandlende vaccinebehandling med dendritiske celler ved forskellige cancertyper. Undersøgelserne er udgivet i perioden år 2006 til år I diskussionen vil undersøgelserne blive holdt op mod hinanden, resultater sammenlignes og diskuteres, for til slut at kunne konkludere på effektiviteten af nuværende cancervaccine. Fremtidens muligheder indenfor denne behandlingsform fremlægges til slut i en perspektivering. Referencelisten, som findes bagest i rapporten er udarbejdet fra Vancouver-modellen. 1 Mange termer og begreber, som benyttes i rapporten, bliver alle forklaret første gang, de nævnes i teksten og er efterfølgende angivet som en forkortelse. Bagest i rapporten, efter referencelisten, findes en ordforklaring (Appendix A), hvor disse forkortelser samt begreber udskrives og eventuelt forklares. Umiddelbart efter Appendix A, vil Appendix B fremgå. Appendix B indeholder en kort sammenfatning af undersøgelsernes resultater på tabel-form. Figurer og tabeller nummereres efter det afsnit, de findes i. Første figur i afsnit 3 hedder derfor Figur 3.1., næste Figur 3.2. osv.

6 Indholdsfortegnelse 1. Indledning... 6 T-celler... 8 B-celler... 9 Natural Killer celler... 9 Dendritiske celler Cancer Mutationer, tumor-suppressor gener og onkogener Cancercellers invasive karakteristika Cancer-immunologi Immunovervågningsteorien MHC og tumorantigener Immunsupprimerende celler Tolerogene dendritiske celler Regulatoriske T-celler Myeloidt deriverede suppressor celler Inflammation og immunologisk sans for fare Immunsuppressive faktorer Vaccination med dendritiske celler Fremstilling af vacciner med dendritiske celler Modning Ladning af antigen Fra vaccine til in vivo Licensering Resultat-sammenfatning: Undersøgelser med dendritiske celler i cancervaccine Tumorevaluering Delayed type hypersensitivity og interferon-γ Resultater Melanom Myelom og leukæmi Prostatacancer Renalcellekarcinom Colorectal cancer Adenokarcinom Hepatocellulært karcinom Ikke-småcellet pulmonal cancer Undersøgelse af forskellige cancertyper Diskussion Konklusion... 33

7 10. Perspektivering Referencer Appendix A. Ordforklaringer og forkortelser Appendix B... 44

8 1. Indledning Danskerne bliver ældre og ældre. Dette skyldes både bedre levestandard og udviklingen indenfor den medicinske verden. Dog ses stadig nye tilfælde af cancer hvert år. Fra 2002 til 2006 var der nye cancertilfælde pr. år, og ved udgangen af 2004 var antallet af danskere med diagnosen cancer ca En årsag til den stigende incidens af cancertilfælde er danskerens tilvalgte livsstil såsom rygning, solbadning og overvægt. Hovedårsagen er imidlertid til dags dato ukendt. Det vides dog, at cancer oftest rammer befolkningen over 65 år, og der formodes derfor at være en sammenhæng mellem høj alder og øget risiko for cellemutation. 2 På nuværende tidspunkt tilbydes forskellige behandlingsmetoder til cancerpatienter, alle med mange bivirkninger og begrænsninger. De fleste patienter følger en forudbestemt behandlings-procedure kaldet et pakkeforløb, der ender i opfølgende kontrol. Under pakkeforløbet vil patienten undergå op til flere behandlinger, der typisk er kirurgiske, medicinske og strålebehandlinger. Hovedsageligt benyttes bahandlingsmetoderne for at fjerne cancer, men formålet med disse kan være forskelligt fra patient til patient grundet forskellige sygdomsstadier og cancerformer. 3, 4 Tabel 1.1. giver et overblik over de forskellige behandlingsstrategier. Behandling Kurativ Adjuverende Formål Gives med henblik på at fjerne al cancersygdom. Anvendte metoder er kirurgi, strålebehandling og kemoterapi. Gives generelt som medicinsk behandling (hormon- eller kemoterapi). Forebyggende (profylaktisk) behandling til patienter, der har været behandlet radikalt, men som har en stor risiko for at udvikle metastase. Understøttende Gives, så patienten lettere kan gennemgå den kurative behandling. For eksempel forbedring af ernæringstilstanden, indtag af kvalmemidler, reduktion af infektioner og stimulation af sundt væv med vækstfaktorer. Recidiv Gives til tidligere kurativt behandlede patienter med tilbagefald. Er oftest medicinsk med hensigten at mindske knude og metastaser. Gør det muligt at stabilisere sygdommen i lang tid, og at symptomerne aftager og almentilstanden bedres. Palliativ Gives til patienten, der ikke kan kureres, for at forhindre smerte og sikre bevægelighed, give psykosocial støtte til såvel patient som pårørende, så livsforløbet gøres så acceptabelt som muligt. Tabel 1.1. Oversigt over de forskellige behandlingsstrategier, der på nuværende tidspunkt tilbydes cancerpatienter. 3 De nuværende behandlingsmetoder har ikke vist sig så effektive, at overlevelsesprocenten er faldet markant. Fra år 2002 til år 2006 var antallet af cancerdødsfald pr. år. 2 Overlevelsesprocenten og antallet af nye cancertilfælde hvert år begrunder behovet for nye og mere effektive behandlingsmetoder 6

9 indenfor cancerbehandling. En af løsningerne på dette problem er muligvis behandling med immunterapi i form af cytokiner, specifikke T-celler eller antigen-præsenterende dendritiske celler (DC). Immunterapi, hvor cytokiner, eksempelvis interleukin-2 (IL-2), injiceres i patienterne, har vist sig at give gode resultater mht. bekæmpelse af cancer, men tilfører samtidig meget alvorlige, influenza-lignende symptomer. Disse symptomer kan bevirke, at patienter, der i forvejen er i en kritisk tilstand, ikke kan gennemføre behandlingen. 5 Immunterapi af melanom med T-celler har vist sig at være svær at udvikle til en effektiv vaccine, da miljøet ex vivo, hvor T-cellerne aktiveres, viser sig at være meget forskelligt fra miljøet in vivo. Flere resultater viser, at de kunstigt aktiverede T-celler ikke er så effektive som T-celler aktiveret i kroppen, og derfor er yderligere forskning på området nødvendig, hvis denne immunterapi skal blive aktuel som en behandling af cancer. 6 Vacciner med DC ser imidlertid lovende ud, hvorfor denne rapport vil omhandle dette emne. DC er i stand til at præsentere antigener for blandt andre T-celler og derved igangsætte en kaskade af immunresponser mod en fremmed substans, eksempelvis virus eller fremmed celle. 5 Dette åbner muligheder for, at DC kan præsentere tumorantigener, som i teorien er fremmede for kroppen og derved bekæmpe cancer. Denne rapport vil omhandle problemstillinger og status for udviklingen af DC-vacciner, immunresponser, kliniske responser, bivirkninger samt fremtidsudsigterne for brugen af denne immunterapi. 7

10 2. Immunforsvarets celler I dette afsnit gennemgås nogle af de vigtigste aktører i immunresponser genereret af antigenpræsenterende DC. Gennemgangen vil give et indblik i cellernes funktion samt i cellernes interaktion. T-celler T-lymfocytter er uddifferentieret fra lymfoide stamceller, og udgør % af blodets lymfoide celler. T- lymfocytterne er navngivet efter deres modning i thymus og kaldes også for T-celler. T-celler har hovedsageligt to funktioner i immunsystemet. Den ene funktion er interaktion med blandt andet antistofproducerende B-celler, hvor de kontrollerer typen og størrelsen af et immunrespons. Den anden funktion er at dræbe kroppens egne celler, som er blevet inficeret af intracellulære mikroorganismer. T-cellerne har såkaldte T-celle receptorer (TCR), som genkender antigener præsenteret på et MHC I/II molekyle. Karakteristisk for T-celler er, at de alle bærer et CD3-kompleks på overfladen. Uden dette kompleks fungerer TCR ikke. 5 T-celler inddeles i hjælper (Th) T-celler, cytotoksiske (Tc) T-celler og regulatoriske (Treg)T-celler. Th-celler er karakteriseret ved, at de har overflademarkøren, CD4, som reagerer med, MHC II på en antigenpræsenterende celle. Deres funktion er at aktivere og regulere immunreaktioner. Th-celler er medhjælpende til, at B-celler differentierer til antistofproducerende plasmaceller. Som reaktion på aktiveringssignaler fra en antigenpræsenterende celle (APC) begynder Th-celler at producere IL-2. IL-2 kan binde sig til en IL-2-receptor på T-celler, hvilket blandt andet fører til T-celle proliferation. Når Th-celler er aktiveret, producerer de en lang række forskellige cytokiner. På baggrund af denne cytokinproduktion bliver Th-celler inddelt i Th1 og Th2. Disse underklasser er gensidigt hæmmende på hinanden og har en tendens til en positiv feedback mekanisme. 5 Tc-celler kan gå direkte til angreb på inficerede celler. De er karakteriseret ved, at have overflademarkøren CD8, som reagerer med MHC I på APC. Aktivering af Tc-celler svarer til aktiveringen af Th-celler, her er overflademolekylet ikke CD4, derimod CD8. Den modne DC, som præsenterer antigenet for Tc-celler, producerer interleukin-12 (IL-12). IL-12 fremmer differentieringen af Tc-celler til effektor-celler og øger derudover Tc-cellers og Natrual killer cellers (NK-celler) evne til drab. Få timer efter, at Tc-cellerne er blevet aktiveret, producerer de højaffinitets-il-2-receptorer. Binding af IL-2, produceret af Th-celler, til Tccellernes recptorer inducerer proliferation af Tc-cellerne. For differentiering af Tc-celler til en cytotoksisk celle, er Tc-cellen afhængig af en række cytokiner fra Th-celler. Når en Tc-celle er aktiveret og har bundet sig til målcellen, secernerer den perforin, som laver et hul i målcellens membran. Dette medfører, at væske fra interstitial-rummet kan flyde ind i cellen. I sammenhæng med dette frigiver Tc-cellen cytotoksiske substanser direkte ind i målcellen. Næsten med det samme svulmer målcellen op, og normalt går den i apoptose kort tid efter. Tc-cellen fjerner sig fra mål cellen så snart, den har frigivet sit perforin og cytotoksiske substanser, så den kan vandre videre og slå flere celler ihjel. 7 Der findes to typer Treg-celler, som efterhånden er forholdsvis velkarakteriserede, disse kaldes naturlige Treg-celler og inducerede Treg-celler. Den naturlige Treg-celle forekommer spontant, altså uden 8

11 forudgående antigenstimulerende aktivitet. Denne celle findes både i blodet og i lymfoide organer som en CD25 + subpopulation af CD4 + Treg-celler. Funktionen af naturlige Treg-celler er blandt andet at inhibere andre cellers IL-2-produktion og inducere apoptose. Inducerede Treg-celler stammer fra CD25 - CD4+ og CD8+ T-celler. Disse kræver antigenstimulerende aktivitet og hæmmer blandt andet udviklingen af Th1 celler og antistofproduktion fra B-celler. 5 Betydningen af Treg-celler i immunsystemet er endnu ikke helt klarlagt, men meget tyder på, at de naturlige Treg-celler spiller en væsentlig rolle i opretholdelse af tolerans over for selv-antigener, mens de inducerede Treg-celler er involveret i styring af et aktivt immunforsvar, når det først er sat i gang. 5 B-celler B-lymfocytter er ligesom T-celler uddifferentieret fra lymfoide stamceller, og udgør 5-10 % af blodets lymfocytter. B-lymfocytter modnes i knoglemarven og er kendetegnet ved, at der findes membranbundet immunglobulin på deres celleoverflade. Disse molekyler fungerer som B-cellernes antigenspecifikke receptorer. Efter stimulering gennem receptorerne differentierer B-celler til antistofproducerende plasmaceller. Der findes relativt få plasmaceller, men de kan opretholde en produktion på tusinder af immunglobuliner pr. sekund. Efter den store produktion af immunglobulin dør de fleste plasmaceller, dog overlever nogle i længere tid, specielt i knoglemarven. 5 En B-celle fungerer som en APC, der aktiveres af en Th-celle gennem signaler. Det første aktiveringssignal, signal 1, får B-cellen af reaktionen mellem B-celle-receptoren og antigenet. For at få det andet signal, signal 2, skal B-cellen aktivere en Th-celle. Th-cellen skal ligledes modtage både signal 1 og 2, og når Th-cellen er aktiveret, giver den B-cellens signal 2. Dette medfører, at B-cellen aktiveres, prolifererer og begynder at producere forskellige cytokinreceptorer. 5 Natural Killer celler NK-celler er den tredje hovedcelletype, som er uddifferentieret fra lymfoide stamceller. I humant blod består 5-31 % af lymfocytterne af NK-celler. NK-celler er i stand til at dræbe cancerceller og celler inficeret med vira uden, at organismen tidligere har stiftet bekendtskab med celletyperne eller infektionerne. NKceller er ikke MHC-afhængige, da de direkte med deres overflademolekyler reagerer på strukturer på målcellen. NK-celler har dog MHC I receptorer, som ved binding med molekyler på andre cellers overflader kan skabe genkendelse af egne celler og forhindre celledrab. Dette sker ved, at NK-cellens aktiveringssignaler blokeres gennem MHC I. Hos NK-celler inducerer IL-2 proliferation og kraftig drabseffektivitet. Denne kraftige aktivering af NK-celler ved hjælp af IL-2, anses som væsentlig i forhold cancerbehandling, hvorfor der er lavet undersøgelser med IL-2-baserede immunterapier. 5 9

12 Dendritiske celler DC er karakteriseret ved deres stærkt forgrenende opbygning med mange slanke udløbere (se Figur ). Alle organismens væv indeholder DC. 9 Cellegruppen, som er i stand til at vandre gennem væv, er beslægtet med monocytter og makrofager, og dannes ligeledes i den røde knoglemarv. Mange DC er af myeloid oprindelse og kan udvikle sig fra et stadium som monocytter. De fleste monocytter kan udvikle sig til DC, hvis de udsættes for Granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-4 (IL-4) in vitro. 5 DC anses for at være den mest potente APC i immunforsvaret, da de effektivt kontrollerer aktiveringen af B- og T-celler. Muligvis er DC de eneste celler, som effektivt kan aktivere hvilende T- celler. I deres umodne form bidrager de til den naturlige immunitet og fungerer som en slags mæglere for den specifikke immunitet. Andre medlemmer af denne cellegruppe er Langerhanske celler i epidermis og slørceller ( veiled cells ) i afferent lymfe. 5 Der skelnes mellem to hoveddifferentieringstrin af DC. Disse er nyligt dannede, ustimulerede (umodne) DC og stimulerede (modne) DC. Umodne Figur 2.1. En dendritisk celle med tydelige, lange udløbere i kommunikation med en anden af immun- DC findes vidt udbredt i kroppens organer og er meget effektive til antigenoptagelse ved hjælp af et systemets celler. 8 middelhøjt antal MHC I og II på deres overflade. Det vides, at umodne DC kan inducere tolerans og opregulere Treg-celler in vivo. 5 I de sekundære lymfoide væv modnes og udrustes DC til at tiltrække, påvirke og aktivere T-celler og igangsætte et primært immunrespons. I perifert væv optager de umodne DC antigen, behandler det og undergår modning. Derefter migrerer DC til lymfeknuderne, hvor de møder aktiverede T-celler. Det vides nu, at modningsstadiet af DC, mikromiljøet og typen af patogenet i det perifere væv afgør typen af immunresponset. DC trænger ind i lymfeknuderne efter antigenoptagelse og præsenterer der de opsamlede antigener og aktiverer eventuelt antigen-specifikke celler. DC præsenterer antigenet gennem MHC I og II. Modne DC har høj ekspression af både MHC I og II, forskellige adhæsionsproteiner og costimulatoriske molekyler. Antigenoptagelsen hos den modne celle er dog nedreguleret i forhold til den umodne DC. 5 Det aktiveringssignal, som T-cellen modtager gennem interaktionen med et antigent peptid på en DC er ikke tilstrækkeligt til at aktivere T-cellen til cytokinproduktion og proliferation. For at T-cellen skal aktiveres, skal den modtage yderligere et co-stimulatorisk signal. Dette signal modtager T-cellen primært ved interaktion mellem T-cellens molekyler (CD28) og overflademolekyler på en APC (CD80/CD86). CD80 og CD86 findes især på modne DC. DC er også i stand til at aktivere NK-celler og kan producere store mængder af interferon under et møde med virale patogener, og er derfor et link mellem det medfødte og erhvervede immunforsvar. Endvidere kan DC omdanne et signal fra MHC II til MHC I, kaldet krydspræsentation. Dermed 10

13 kan DC tilpasse sig den celle, de skal interagere med, eksempelvis Tc-celler og Th-celler, som reagerer med henholdsvis CD8 og CD4. 5 Funktionen af DC, NK-celler, T-celler og B-celler er nu blevet klarlagt, og for at forstå kravene til en DCvaccine som behandling mod cancer, er det nu oplagt at se på cancer og de immunologiske processer, der ligger bag udviklingen af cancer. 5 11

14 3. Cancer Kommende afsnit vil belyse baggrunden for udviklingen af cancer samt årsagen til, at muterede celler kan overleve og udvikle sig til metastaserende tumorer. Mutationer, tumor-suppressor gener og onkogener Cancer er en malign cellevækst, som selvstændigt kan proliferere og metastasere i kroppen, og som ubehandlet i de fleste tilfælde vil medføre døden. Cancer er oftest forårsaget af mutationer i genomet. De hyppigste er punktmutationer, hvor et eller flere nukleotider i et gen rammes, enten i form af en substitution, deletion eller insertion. 10 De hyppigste årsager til disse mutationer er ioniserende stråling, karcinogener, fysisk irritation samt virus. Disse faktorer samt en arvelig tendens til cancer, dvs. nedarvede, muterede gener, kan resultere i celler, hvor mitose og proliferation ikke kontrolleres, og cancer er en følge heraf. 7 Tumor-suppressor gener, også kaldt anti-onkogener, koder for proteiner, der regulerer proliferation ved at supprimere eller hæmme denne. I modsætning hertil findes de såkaldte onkogener, som er muterede, tumorfremkaldende gener. I ikke-muteret tilstand kaldes de for proto-onkogener. Funktionen af protoonkogener er at danne grundlag for produktion af proteiner, der kontrolleret accelererer proliferation. 7, 11 Eftersom tumor-suppressor gener og proto-onkogener spiller væsentlige roller i kontrollen af proliferation, har mutationer i heri stor betydning i forhold til udviklingen af cancer. Selvom onkogener aktiveres ved en mutation, vil der være tumor-suppressor gener til stede til at hæmme vækst. Total inaktivering af tumorsuppressor generne kræver, at der sker hele to mutationer én i hvert allel. Altså skal der være mutationer til stede flere steder i genomet, for at uhæmmet proliferation og cancer kan forekomme. 7, 11 Mange cancerformer kræver mutationer i seks adskilte områder af cellekontrollen under celleudviklingen. 11 De fleste muterede celler har dårligere overlevelsesevne end normale celler og dør derfor uden at have skadet organismen. Ydermere forårsager kun få af de muterede celler, der overlever, cancer, da de ofte har normal feedback kontrol angående proliferation og mitose. 7 Muterede celler, der har evne til at overleve og potentielt kan give cancer, dræbes derudover oftest af immunforsvaret. Ændringer i genomet manifesterer sig ved produktion af fremmede proteiner, som kan identificeres af immunsystemets celler og igangsætte en kaskade af processer resulterende i celledrab. 7 Cancercellers invasive karakteristika Cancerceller har andre karakteristika end normale celler. De seks områder af cellekontrol, der nævnes herunder, er alle områder, hvori mutationer oftest er krævet for udvikling af cancer. 11 Cancerceller skal have mutationer, der tillader cellerne at proliferere selv under mangel på eksterne vækstfaktorer. Derfor kan cancerceller i nogle former for cancer være selvforsynende og stimulere sig selv til vækst ved autokrin stimulation. Ved andre cancerformer opreguleres antallet af vækstfaktor-receptorer, så cellen selv ved lave mængder vækstfaktor kan stimuleres til vækst. 11 Adskillige anti-vækstfaktorer fra cellens miljø fører hos normale celler til, at proliferationen stoppes eller hæmmes. Cancerceller er imidlertid insensitive overfor denne signalering for eksempel 12

15 grundet en mutation i et tumor-suppressor gen eller på grund af en øget aktivering af de proteinkinaser, der styrer cellecyklus. 11 Normalt vil celler, hvis vækst er unormal stor, eller hvor checkpoints i cellens cyklus er blevet overset, være selv-destruktive og dø ved programmeret celledød, apoptose. Hos mange cancerformer er tumor-suppressor genet, p53, muteret med forhindring af apoptose til følge. 11 Mutationer i p53 er fundet i næsten alle tumorer. Proteinet, kodet af p53, er det cellulære 53kDa fosfoprotein, som spiller en rolle i DNA-reparation og syntese samt i kontrollen af cellecyklus, differentiering og apoptose. 12 En meget karakteristisk egenskab ved cancerceller er, at de er i stand til at dele sig ubegrænset. Normalt kan kun kønsceller foretage et ubegrænset antal celledelinger, da kun disse har enzymet telomerase. Telomerase genopbygger telomere, der hos andre celler forkortes for hver deling og betyder et begrænset antal celledelinger. Cancerceller kan tilsyneladende aktivere telomerase og derved skabe grundlag for uendeligt mange celledelinger. 11 Avancerede cancerformer producerer angiogenetiske faktorer, så nydannede blodkar kan forsyne den fortsat voksende tumor med ilt og næringsstoffer. Et eksempel på en angiogenetisk faktor er Vascular Endothelial Growth Factor. Denne tumorangiogenese betyder, at normale celler dør grundet mangel på næringsstoffer, tumoren får mere plads og kan vokse sig større. 11 Cancerceller metastaserer til andre væv via blodcirkulationen og lymfesystemet og kan på den måde finde nye, gunstige områder at sprede sig i. 11 Udviklingen af metastase-kolonier afhænger af forholdet mellem cancercellerne og miljøet i det nye væv og kan vise sig som organ-specifikke metastase-mønstre. Derudover kan cancercellers evne til metastase influeres af den genetiske 10, 13 variation, polymorfi, hos cancerpatienter. Efter denne gennemgang af cancercellers grundlæggende invasive karakteristika er det væsentligt også at se på immunsystemets kamp mod cancercellers forsvar. Dette omhandles derfor i næste afsnit. 13

16 4. Cancer-immunologi Tumorimmunologi består af to elementer: immunovervågningsteorien, som er kroppens angreb mod cancerceller, samt cancercellers immunologiske overlevelsesmekanismer, bestående af celler, cytokiner og receptorer. Herunder beskrives de to elementer nærmere for at give en redegørelse af, hvordan cancerceller kan udnytte immunforsvarets egenskaber med udvikling af tumorer og metastase til følge. 14 Immunovervågningsteorien Cancer er en af de farligste sygdomme i vor tid, og forskningen på dette område er stor. Der foreligger flere videnskabelige resultater, som viser en sammenhæng mellem et svækket immunforsvar og cancer. På baggrund af dette, er der opstillet en teori, immun-overvågningsteorien. Teorien siger, at der hele tiden opstår cancerceller i kroppen, men at immunsystemet opdager og dræber disse celler, og derved opstår tumorer ikke. Er immunsystemet svækket, eller kan cancercellerne gøre sig usynlige overfor immunsystemet, er det dog muligt for cancercellerne at undgå elimination. 5 Der findes mange argumenter for og imod denne teori. Et af argumenterne imod teorien er, at såkaldte nøgne mus, der vokser op under sterile omgivelser, ikke har en højere frekvens af spontane tumorer end normale mus. Et argument for denne teori er, at såkaldte knock-out mus, hvor nøglemolekyler i immunsystemet er sat ud af funktion, har en højere forekomst af spontane tumorer end normale mus. Det har desuden vist sig, at knock-out mus har en større følsomhed overfor nogle cancerfremkaldende stoffer. 5 Om immunovervågningsteorien er sand eller ej, hersker der stadig tvivl om. Én teori siger, at immunovervågning er med til at slå de fleste cancerceller ihjel, men at de stærkeste cancerceller derved overlever og har gode betingelser for overlevelse og vækst. 5 MHC og tumorantigener De immunologiske overlevelsesmekanismer består som nævnt af receptorer, celler og cytokiner. Disse beskrives i de kommende afsnit. Et af de store spørgsmål er, hvorfor immunsystemet ikke kan eliminere alle cancerceller. Der findes mange hypoteser på dette område, og der er mange faktorer som spiller ind. En del af forklaringen er, at cancerceller er genetisk ustabile, og mutationer kan føre til, at cancercellen ophører med at udtrykke de tumorantigener, som immunforsvaret kan genkende. Dette sker ved, at cancercellen ikke længere udtrykker MHC I i store mængder og derved ikke kan genkendes af blandt andre Tc-celler, og cancercellerne kan dele sig uhæmmet. Ofte opdages denne vækst ikke før, at cancercellen undergår 6, 15, nekrose, og derved udskiller cytoplasmatisk materiale, som blandt andre DC kan detektere og eliminere. 16 Et forsøg med melanom-patienter bekræftede, at immunterapi i form af en autolog tumor-vaccine førte til størst skader på de metastaser, der fremviste størst antal normal MHC I. Virkningen var mindre ved metastaser, hvis celler ingen eller mindre præsentation med MHC I havde på celleoverfladen. 17 Ligeledes kan cancercellens produktion af antigener nedreguleres i forbindelse med angreb fra immunforsvaret. Udover, at mængden af antigener kan nedreguleres, så ligner antigenerne præsenteret på spontant opståede tumorer ofte normale cellers antigener og opdages tilsyneladende ikke af 14

17 immunsystemet. Dog har forskellige cancerformer forskellige genekspressioner, som i nogle tilfælde kan aktivere det specifikke immunforsvar. 5 Immunsupprimerende celler Naturligt findes der immunsuppressive celler i kroppen, som har til formål at kontrollere T-celle-responset. Autoimmune sygdomme forekommer på baggrund af dysfunktion hos disse immunsuppressive celler. Disse celler er for eksempel tolerogene DC, Treg-celler og myeloidt deriverede suppressor celler. 18 Tolerogene dendritiske celler Problemet med umodne DC er, at de akkumulerer i tumoren, hvilket kan inducere T-celle-tolerans overfor cancerceller, da de umodne DC ikke kan aktivere T-celler. 18 Kontakt mellem cancerceller og DC kan føre til, at DC bliver tolerogene, transforming growth factor-β (TGF-β)-secernerende celler, der fremmer aktiviteten af Treg-celler (for TGF-β, se Tabel 4.1.). Dermed menes DC at have en direkte betydning for, om en tumor udvikles eller ej. 19 Regulatoriske T-celler En af Treg-cellers funktioner er, at de producerer immunsupprimerende cytokiner, eksempelvis interleukin- 10 (IL-10) og TGF-β. Det er desuden blevet vist, at der er en interaktion mellem DC og Treg-celler, som spiller en rolle i induktionen af perifer tolerance. Dette kan ikke kun direkte ske ved at have effekt på Tcceller og Th-celler, men også ved at fremme differentiationen af naive T-celler til Treg-celler. 18 Myeloidt deriverede suppressor celler Myeloidt deriverede suppressor celler (MDSC) er en heterogen population af myeloide celler som for eksempel umodne makrofager, granulocytter og DC. Kendskabet til funktionen af MDSC er sparsomt, men i dyreforsøg har det vist sig, at MDSC bidrager til tumor-associeret immundysfunktion. Denne funktion bliver på nuværende tidspunkt undersøgt hos cancerpatienter. 18 Inflammation og immunologisk sans for fare Det postulereres i fare -teorien 20, at et møde mellem et antigen og DC i et inflammatorisk miljø udløser modningen af DC, hvilket fremkalder et stærkt adaptivt immunrespons. Modsætningsvis, når DC optager et antigen i et ikke-inflammatorisk miljø, mislykkes aktiveringen af T-celler, hvilket kan føre til T-celletolerance. Der findes en balance mellem stimulerende og inhiberende signaler, som styrer dette immunologiske udfald. Det har vist sig, at tumormiljøet virker til fordel for det ikke-inflammatoriske miljø ved at secernere immunsuppressive stoffer fra maligne celler og ved cancer-medieret rekuttering af supprimerende immun-celler

18 Immunsuppressive faktorer Cancerceller kan secernere faktorer udskilt ved exocytose af mikrovesikler og udnytte, at andre celler secernerer faktorer, der hæmmer immunsystemet. Listen af disse faktorer er lang, og derfor gennemgås de væsentligste og mest kendte i Tabel 4.1. herunder. Immunsuppressiv faktor Transforming growth factor-β (TGF-β) Interleukin 10 (IL- 10) Prostaglandin-E2 (PGE2) Vascular endothelial growth factor (VEGF) Makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og interleukin 6 (IL-6) Granulocytmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) Interleukin-23 (IL- 23) Gangliosider Reaktive oxygenmetabolitter (ROM) Indoleamine 2,3- dioxygenase (IDO) Sekretion og funktion af faktoren Et cytokin, som normalt secerneres af T-celler og monocytter, og som virker anti-inflammatorisk og anti-proliferativt på mange celletyper. TGF-βsecerneres celler kan øge antallet af Treg-celler, samt inhibere IL-2-18, 19 produktionen og dermed aktiveringen af Tc-celler. Et cytokin, som blandt andet secerneres af T-celler og makrofager. Har en inhibitorisk effekt på funktionen af DC samt en anti-inflammatorisk rolle og 18, 19 har forskellige antagonistiske funktioner på APC. PGE2 medierer muligvis polarisation af Th-2, har proangiogenetiske effekter og secernerer cytokinet IL-10. Bidrager muligvis til tumorigenese ved at 19, 21 hæmme DC-diffentiering. En faktor, secerneret af tumoren, der hæmmer DC i deres differentiering fra monocytter og får endotelceller til at proliferere og danne neovaskulatur i 18, 19 tumorer. Fibroblaster og makrofager secernerer M-CSF, mens T-celler og makrofager 18, 19 secernerer IL-6. Begge hæmmer modningen af monocytter til DC. GM-CSF udskilles af makrofager og T-celler og er blevet associeret med tumorinduceret dysfunktion af myelopoiese, hvilket er dannelsen og udviklingen af granulocytter i knoglemarven. 19 IL-23 findes i forhøjede niveauer i tumorer. IL-23 regulerer lokal inflammatorisk respons i tumormiljø, mindsker T-celle-inflitration og øger angiogenese. 22 Gangliosider er involveret i regulationen af cellulær proliferation og differentiation. Øget mængde er associeret med cancerceller. 23 ROM har den funktion at regulere proliferation og cellulær signalering i normale celler. Øget mængde af ROM er blevet observeret i cancerceller og menes at føre til konstant aktivering af transkriptionsfaktorer. 19 IDO, et enzym, der udskilles af makrofager og regulerer immunresponset ved at undertrykke T-cellers proliferation. Det er blevet fundet, at IDO er opkoncentreret ved cancerceller. 24 Tabel 4.1. Oversigt over faktorer, blandt andet cytokiner og enzymer, der virker immunsupprimerende og dermed er medvirkende til cancercellers invasive karakteristika. I dette afsnit er immunforsvarets rolle i udviklingen af cancer blevet gennemgået. Her er det blevet beskrevet, hvordan immunsystemet hæmmes af cancerceller, og at dette har en stor indflydelse på cancerudviklingen. Kommende afsnit omhandler vaccination med DC som cancerbehandling, eftersom det menes, at behandling gennem immunforsvaret skaber et godt grundlag for at oprette balancen og bekæmpe cancer. 16

19 5. Vaccination med dendritiske celler Vacciner med DC (DC-vacciner) er en specifik form for immunterapi. I prækliniske og kliniske forsøg er det blevet påvist, at immunforsvaret kan aktiveres til en specifik reaktion mod cancerceller. Med en DC-vaccine er det muligt via en målrettet aktivering af immunsystemet at eliminere cancerceller og samtidig skåne kroppens raske celler. Den specifikke immunreaktion er mulig, eftersom cancerceller indeholder tumorantigener, som principielt er fremmede for kroppen. Hos mange cancerpatienter er der fundet tegn på, at immunsystemet på et tidspunkt har genkendt og reageret på tilstedeværelsen af tumorantigen, men at immunsystemet ikke har været i stand til at nedkæmpe cancercellerne grundet toleransudvikling. 25 Som før nævnt er DC meget potente APC, og de ses derfor som et middel til at præsentere tumorantigener for immunsystemets celler og igangsætte en kaskade af reaktioner resulterende i tumorregression. Det unikke ved en DC-vaccine er, at vaccinen ikke er forbyggende, men derimod skal bekæmpe noget allerede eksisterende. Af denne grund er det ofte nødvendigt at behandle med vaccinen i kombination med andre cancerbehandlinger, eksempelvis kemoterapi, for at starte et aggressivt angreb mod cancercellerne. 5 DC anvendt i cancervacciner fremkommer fra monocytter, der modnes i cellekulturer og tilsættes antigen specifikt for tumoren før injektion. Derved flyttes antigenoptagelsen og aktiveringen af DC fra in vivo til in vitro. Dette er en modsætning til forebyggende vacciner, hvor optagelsen af antigen er mere diffus og sker via flere slags celler, som for eksempel makrofager, B-celler og DC in vivo. Ofte er de tilsatte antigener syntetisk fremstillede peptider. 25 Udtagningen af monocytter kan ske fra patientens eget blod, eksempelvis ved hjælp af et leukafereseapparat, som udskiller de hvide blodlegemer fra tappet blod. 5, 10 Monocytter isoleres, og ved stimulation med cytokiner videreudvikles de til umodne dendritsike celler. Ved yderligere tilsætning af andre cytokiner kan den sidste aktivering/opmodning opnås. Tidligere blev umodne DC brugt i vaccinen, men da resultater har vist, at disse kan inducere tolerans overfor tumoren i stedet for immunitet, anvendes nu oftest modne DC. Ved måling af overflademarkører og cytokiner med betydning for den stimulatoriske kapacitet vurderes kvaliteten af de modnede DC, og det vurderes derved, om fremstillingen af vaccinen er lykkedes. 21 Modne DC, som har fået påført et antigen, kan blive injiceret enten subkutant, intradermalt eller intravenøst. Hvis vaccinen gives intravenøst, akkumulerer DC primært i lungerne og bliver derefter redistribueret til leveren, milten og knoglemarven. Modne DC migrerer derimod til de regionale lymfeknuder ved intradermal og subkutan injektion. 21 Vaccinen er blevet afprøvet på flere forskellige cancerformer, herunder er malignt melanom, renalcellekarcinom, mammacancer, colorectal cancer, og pulmonal cancer de sygdomsgrupper, hvorom der er lavet mange studier med DC-vaccinationsterapi. Den største bekymring ved brug af DC-vaccination er, at eftersom de fleste tumorantigener også er selv-antigener, er det måske muligt, at terapien kan inducere autoimmunitet. De mest gennemgående bivirkninger er lokale reaktioner ved injektionsstedet, feber, tumorsmerter og diare, hvilket må siges at være tålelige bivirkninger i forhold til eksempelvis kemoterapi. 25 Hidtil har studierne været præget af store variationer i anvendte metoder til fremstilling og administration af DC-vaccinerne. Behandlingen er fortsat eksperimentel, og der findes derfor ikke i Danmark et standardbehandlingstilbud på nuværende tidspunkt. 25 Vaccinen kan derfor ikke på nuværende tidspunkt 17

20 erstatte de eksisterende cancerbehandlinger såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling og anvendes typisk først ved fremskreden sygdom, når de øvrige behandlingsformer er forsøgt. 25 DC-vaccinen har inden for behandlingen af cancer fået tiltagende opmærksomhed de seneste år, da den ikke kun har potentiale som cancerbehandling. DC-behandling af kroniske infektioner er et andet spændende område under udvikling. Ud over kronisk hepatitis er DC-vaccination forsøgt til behandling af HIV-infektion. 26 Kommende afsnit omhandler fremstillingen af DC-vacciner, herunder modningen fra monocytter til DC, påføringen af antigen samt injektionen af vaccinen. Gennemgangen er generel, og det skal siges, at der er gjort mange forskellige forsøg på at modne DC samt påføre antigenerne

21 6. Fremstilling af vacciner med dendritiske celler Det stigende behov for mere effektive behandlingsmetoder af cancer har medført, at der udføres utallige kliniske forsøg med cancervacciner. Metoderne og protokollerne er mange, og der foreligger endnu mange usikkerheder på området. Blandt andet diskuteres det, hvordan DC bedst modnes samt hvilken adjuvante terapi (støttebehandling), der skal anvendes. Derfor vil dette afsnit omhandle de hyppigst anvendte metoder. Modning Til fremstillingen af DC kan der anvendes forskellige monocytter fra kroppen. Fra det perifere blod udtages CD34 + hæmopoietiske stamceller eller CD14 + monocytter, og disse dyrkes in vitro til DC. 27, 28 Den mest anvendte dyrkningsmetode af DC er at dyrke CD14 + monocytter i et serumfrit medium, hvor der tilsættes GM-CSF og IL-4 (se Figur 6.1.). 27 GM-CSF er en faktor, der stimulerer vækst, mens IL-4 øger proliferation og spiller en rolle i differentieringsfasen. 5,29 De CD14 + monocytter dyrkes efter udtagelsen i fem til syv dage. Her differentierer de til umodne DC, hvorved de mister deres CD14-ekspression og udtrykker et moderat til lavt niveau af CD40, CD80 og CD Nye protokoller benytter en 2-dages dyrkning af monocytterne og denne dyrkning tyder på at være lige så effektiv som den oprindelige metode. 21 Figur 6.1. Oversigt over en dendritisk celles modning fra en CD14+ monocyt til moden dendritisk celle. Rød CD80/CD86 angiver moderat til lavt niveau af disse overflademolekyler på en umoden dendritisk celle. Blå CD80/CD86 illustrerer, at disse overflademolekyler er opreguleret på en moden dendritisk celle. 27 De umodne DC bliver fuldt ud modnet ved dyrkning i yderligere timer ved hjælp af flere biologiske stoffer, mest anvendt er TNF-α, IL-6, interleukin-1β (IL-1β), og PGE2 (se Figur 6.1.). 27 Denne kombination kaldes populært for standard modnings-cocktail (SMC). IL-6 og IL-1β tilhører kategorien af cytokiner, som stimulerer protein- og mrna-syntese. IL-6, IL-1β og TNF-α er vigtige feberfremkaldende, immunaktiverende stoffer. 5 PGE2 menes at fremme migrationskapaciteten for DC ved at opregulere ekspressionen af kemokinreceptor, CCR7. Ulempen ved PGE2 menes at være, at dette prostaglandin er medvirkende til sekretion af det immunsupprimerende cytokin, IL

22 Modne DC opregulerer CD40, CD80 og CD86 og inducer de novo-syntese af CCR7 (se Figur 6.1.). 27 De modne DC defineres ud fra funktionskriterierne, migrationskapacitet, deres evne til at inducere antigenspecifikke T-celle-responser og deres IL-12-produktion. 21 IL-12 er vigtig, da dette interleukin fremmer differentieringen af CD8 + T-celler til effektorceller og øger både CD8 + T-cellers og NK-cellers evne til drab. 5 En forbedret protokol for modning af DC kaldet multicytokin cocktail (MCC) er sammensat af TNF, IL-1β, IFN-α, PolyI:C samt IFN-γ. PolyI:C er et syntetisk fremstillet RNA, der stimulerer antivirus-aktiviteter i det medfødte immunsystem, herunder cytokin-produktion og feber. 30 Derudover bevarer den DC s evne til sekundært at secernere IL-12 under modning. 31 IFN-α har antiviral aktivitet, hvorimod IFN-γ og IL-1β stimulerer protein- og mrna-syntese. 5 IFN-γ øger vævscellers ekspression af MHC I og II (se mere om IFN-γ i afsnit 7). 29 MCC er immunogent overlegen i forhold til SMC. MCC skaber en vedvarende migrationskapacitet in vitro til lymfeknuderne uden tilsætningen af PGE2. Der mangler imidlertid kliniske forsøg med MCC til at dokumentere effektiviteten in vivo. 21 Ladning af antigen Antigen-ladning sker enten i det umodne eller modne stadie af DC. 27 Antigenet kan blive ladet på forskellige måder, enten i form af peptider, hele proteiner, tumorlysater og apoptotiske cancerceller. Antigenladning kan ske ved fusion af DC og cancercelle. Ladningen kan også ske ved endogen transfektion med mrna- eller cdna-indkodning af antigenet. En transfektion er at indføre DNA i en celle, dette kan for eksempel ske ved 21, 29 mikroinjektion eller elektroporation. Elektroporation er en attraktiv måde, hvorpå mrna tilføres DC. Udviklingen af en effektiv elektroporationsprotokol har gjort denne teknik klinisk passende. Denne metode bevirker, at antigenerne lever længere end ved peptid- og proteinmetoden. Der er muligvis er en sammenhæng mellem antigenets vedholdende i DC og størrelsen af immunresponset. 21 De tumorspecifikke peptider er lette at producere i store mængder, og aminosyrerne i dem kan ændres, så potensen kan forbedres. Peptider har dog den ulempe, at de er MHC-specifikke, og dette har den konsekvens at vaccinerne med peptider begrænset til en subpopulation af patienterne, der har det pågældende MHC. 21 Tumorlysater og apoptotiske cancerceller præsenterer en bred vifte af protein, hvilket gør anvendelse af disse fordelagtig uanset MHC-type. Transfektion af DC med mrna, kan kode for enten specifikke antigener eller hel tumorcelle-mrna. Denne metode omgår problemerne med MHC og introducerer et bredt spektrum af epitoper førende til adskillige T-celle-responser. 21 Fra vaccine til in vivo Som adjuvans bruges IL-2 ofte. 21 IL-2 inducerer proliferation af CD8 + T-celler og NK-celler. 5 Desuden fremmer IL-2-differentationen af T-celler til effektorceller. En høj dosis IL-2 fremmer ekspansionen af Tregceller, hvilket kan føre til et begrænset antigenspecifikt immunrespons. Forskning viser, at behandling med lav dosis IL-2 over en periode på 14 dage giver en forøgelse af CD4 + CD25 + Treg-celler in vivo

23 Til vaccinen kan også tilsættes mikrobielle komponenter, såsom tetanustoksin (TT), hepatitis B virusantigen og keyhole limpet hemocynin (KLH). KLH er et fremmed, immunogent carrier -protein udtaget fra snegle, som in vivo resulterer i KLH-antigenspecifikt immunrespons. 10, 32 I sammenhæng med et tumorlysat, kan KLH forstærke et Th1-type-tumor-respons. Dette indikerer, at Th-epitoperne i KLH muligvis kan øge DC s evne til at inducere Tc-celle-respons. 21 De mikrobielle komponenter kan reagere med TLR, hvilket spiller en vigtig rolle i den medfødte immunitet og fremmer cytokinsekretion samt inflammation. 21 Licensering De modne DC migrerer til den drænerende lymfeknude, hvor de møder CD4 + T-celler. Når DC præsenterer deres antigen for T-celler, kobles CD40 på DC og CD40L udtrykt på aktiverede CD4 + T-celler. Dette inducerer yderligere differentiering af modne DC, kaldet licensering. De licenserede DC opregulerer overflademolekyler, specielt liganderne OX40L og 4-1BBL, hvor antigenet præsenteres for CD8 + T-celler. 4-1BBL formidler co-stimulering gennem 4-1BB på den antigenaktiverede CD8 + T-celle. Denne co-stimulering fremmer overlevelsen og den proliferative kapacitet hoscd8 + T-cellen. Ligeledes fremmer co-stimulering, medieret af OX40L, overlevelse og proliferativ kapacitet hos den aktiverede CD4 + T-celle (se Figur 6.2.). 27 Figur 6.2. DC efter migration til den drænende lymfeknude, som undergår licensering efter antigenpræsentation til CD4 + og CD8 + T-celler. 27 Efter denne gennemgang af fremstillingen af DC-vacciner, vil kommende afsnit gennemgå eksisterende undersøgelsers resultater på området. 21

24 7. Resultat-sammenfatning: Undersøgelser med dendritiske celler i cancervaccine Dette afsnit vil indeholde resultaterne fra de benyttede undersøgelser. Inden gennemgangen af de konkrete resultater vil metoden til tumorevaluering blive gennemgået. Hernæst vil de elementer, der benyttes til at bekræfte et immunrespons blive forklaret. Tumorevaluering Mange af de undersøgelser, som er benyttet til udfærdigelse af resultatafsnittet (og Appendix B), benytter sig af Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST), som beskriver kliniske responser, opnået under kliniske forsøg. 33 Resultatafsnittet bliver derfor her indledt af en kort beskrivelse af RECIST. I 1979 udviklede World Health Organisation (WHO) nogle kriterier til beskrivelse af det objektive tumorrespons. WHO s kriterier er imidlertid ikke fyldestgørende i dag, da teknologien har udviklet sig siden. Det har derfor været nødvendigt at videreudvikle kriterierne, dermed nu kaldet RECIST. 34 RESIST er ikke definitive, og der tages ikke hensyn til eksempelvis tumormetabolisme, altså tumorens udviklingspotentiale. Derudover kan kun patienter med målbar sygdom inkluderes i undersøgelser. Hvis der mindst forefindes én målbar læsion, defineres sygdommen som målbar, og dermed kan yderligere ikke målbare læsioner sagtens være til stede. Alle målbare læsioner måles inden og efter den pågældende behandling og omfatter alle involverede organer. Til udregning af RECIST måles diameteren på én eller flere læsioner, og responset ses som ændring af diameter-summen fra start af behandling til fire uger efter. Der må maksimum måles diameter på fem læsioner pr. organ og maksimum op til ti læsioner fordelt på flere organer. Alle andre, yderligere læsioner skal betragtes som non-target læsioner. Disse skal ved begyndelsen noteres som værende til stede og afslutningsvis noteres som værende tilstede/ikke tilstede. Derfor skal nødvendigvis ikke alle læsioner være forsvundet for at opnå CR, men kun target-læsionerne. Altså siger et tumorrespons ud fra RECIST noget om target-læsionernes udvikling, ikke nødvendigvis noget om patientens tilstand og prognose som helhed. 35 De nye kriterier, RECIST, for karakterisering af det objektive tumorrespons samt WHO s kriterier kan ses i Tabel 7.1. Bedste respons Komplet Respons (CR) Partiel Respons (PR) WHO: Ændring i tumorstørrelse (samlet summe af target-læsioner) RECIST: Ændring i tumorstørrelse (sum af længste diametre hos targetlæsioner) Forsvinden: Konfirmeret efter 4 uger Forsvinden: Konfirmeret efter 4 uger 50 % formindskelse i størrelse. Forsvinden: Konfirmeret efter 4 uger 30 % formindskelse i størrelsen. Forsvinden: Konfirmeret efter 4 uger Stabil sygdom (SD) Progressiv Sygdom (PD) Passer hverken på PR eller PD kriterierne 25 % forøgelse i størrelse Passer hverken på PR eller PD kriterierne 20 % forøgelse i størrelse Tabel 7.1. Oversigt over begreber, der anvendes til at beskrive et tumorrespons fra WHO og RECIST. Alle referenceevalueringer 33, 34 skal måles så tæt på behandlingen som muligt, men ikke mere end 4 uger før behandlingen. 22

25 Nogle undersøgelser ser på hele patientens sygdom, altså om der findes metastaser, inden de vælger en kategori for responset, mens andre udelukkende fokuserer på den tumor, der behandles mod. Dette skal tages i betragtning i sammenligningen af undersøgelsernes resultater. Der skal tages forbehold for, at kriterierne har ændret sig igennem tiden og varierer fra studie til studie, da mange har tilpasset kriterierne til deres specifikke undersøgelse. Derfor kan grundlaget for undersøgelsernes evaluering af tumorresponset være forskelligt. Det vigtigste er dog at se tendenserne i udviklingen af sygdommen, og derfor kan responserne i undersøgelserne anvendes som vejledende. Delayed type hypersensitivity og interferon-γ I dette afsnit forklares begrebet, delayed type hypersensivity (DTH), og årsagen til/betydningen af øgede IFN-γ-værdier. Undersøgelserne, der indgår i resultatafsnittet, benytter sig ofte af DTH og IFN-γ til at beskrive immunresponset. Dette afsnit giver et indblik i mekanismen bag og forklarer, hvordan de to nævnte kan ses som et udtryk for aktivitet i immunsystemet. Cellulær immunitet er en T-celle-medieret forsvarsmekanisme mod mikrober, som kan inficere kroppens celler. Opdagelse af inficerede celler eller fagocytter, der har optaget en mikrobe, igangsætter T-cellemedieret aktivering af fagocytter. Denne aktivering af fagocytter er afhængig af IFN-γ, som er et stort cytokin produceret af Th 1 -celler og NK-celler. IFN-γ er en vigtig aktivator for makrofag- og monocytcellelinjerne, og opregulerer blandt andre højaffinitets-t-celle-receptoren for IL-2, IL-2Rα. Foruden dette fremmer IFN-γ differentiering af Th 1 -celler og undertrykker Th 2 -differentiering. IFN-γ virker også på B-celler 5, 36 ved at fremme immunglobulin-skift, som faciliterer fagocytotisk respons. Klinisk bruges IFN-γ ELISpot til at teste IFN-γ-sekretionen fra T-celler in vitro. Testen angiver, hvorvidt der sker en antigenspecifik aktivering af T-cellerne, hvorfor denne test er foreslået som en standard test udført in vitro til at bestemme cancervaccinernes immunogene effektivitet in vivo. 21 Et DTH-respons er en aktivering af fagocytter og inflammation forårsaget af en cellemedieret immunitet, som kan føre til vævsskade. Et respons kan derfor angive, om der er sket en cellemedieret immunitet in vivo. Ved DTH-testen bliver et kendt, fremmed antigen introduceret igen ved intradermal injektion. For at få et positivt DTH respons skal patienten forud for DTH-testen være udsat for det pågældende antigen, senest 4-6 uger inden DC-vaccinen. Er responset positivt, vil dette komme til udtryk som induration og erytem timer efter injektionen. 36 Er der ikke et respons til antigenet, indikerer dette, at DC ikke har været i stand til at aktivere T-celler (i tilfælde af, at antigenet har siddet på DC og ikke er givet via adjuvant behandling) eller, at der muligvis er T-celle-dysfunktion eller mindsket T-celle aktivitet grundet anden sygdom