Humane embryonale stamcellers udvikling til osteoblaster

Transkript

1 Elise Hoffmann Munk Nielsen STAMCELLER 1097 Humane embryonale stamcellers udvikling til osteoblaster Og hepatocytter samt etiske overvejelser vedrørende embryonets status Dette er den sidste af 5 artikler, der gør status over de senere års resultater inden for human embryonal stamcelleforskning. Artiklerne beskriver først forskning inden for en specifik vævstype, dernæst gives et generelt perspektiv på det, såsom terapeutisk kloning, teratomdannelse, transplantatsafstødning og etiske problemstillinger. Her ses på dels på osteocyt- og hepatocytlignende celler og på fosteranlæggets etiske status. biografi: Forfatteren er turnuslæge. Hun har som lægestuderende i samarbejde med endokrinologisk afdeling på Odense Universitetshospital lavet et literaturstudie om de seneste års udvikling inden for stamcelleforskning. forfatters adresse: Nørrebrogade 164A, 5. sal, 2200 København N. eniel99@student.sdu.dk Forskning i stamceller rummer et enormt potentiale for fremtidig behandling, og tvinger os samtidig til at genoverveje fundamentale etiske værdier. I denne den sidste artikel om stamcelleforskning vil jeg efter en gennemgang af resultaterne inden for forskning i osteocyt- og hepatocytlignende celler, belyse problemstillingen vedrørende den etiske værdi af embryonet. Jeg vil forsøge at give et overblik over debatten ved at fremlægge Det Etiske Råds overvejelser herover. Diskussionen blusser jævnligt op i forskellige sammenhænge og synes til tider at udspille sig i spændingsfeltet mellem tilpasningsetik og dommedagsprofeti. Osteoblaster Endnu en terapeutisk relevant celletype, som humane embryonale stamceller forsøges dirigeret til, er osteoblaster. Osteoblasters skeletdannende evner har potentielt relevans i forbindelse med behandling af udviklingsanomalier, infektioner eller tumorer i skelettet samt degenerative knoglesygdomme. forskning i stamceller Inden for skeletderiverende væv er man længst fremme med forskningen i voksne stamceller. I den færdigudviklede krop findes i knoglemarven en voksen stamcelle den multipotente mesenkymale stamcelle eller human knoglemarvsstromacelle (hmsc). In vitro kan denne differentiere til osteoblaster, karakteriseret bl.a. ved ev-

2 1098 nen til at mineralisere. Man forsker i øjeblikket i, hvorvidt denne celle kan benyttes til transplantation. Blandt ulemperne ved disse celler er, at de kun kan isoleres ved knoglemarvsaspiration, og at de ligesom andre voksne stamceller er svære at provokere til proliferation in vitro (1). forskning i embryonale stamceller I 2003 offentliggjorde forskere en protokol for udviklingen af hes-celler til osteoblastlignende celler (Fig. 1). Forsøgets målsætning er at belyse effekten af embryoid body medium (EBD), (bestående af bl.a. L-glutamin, nonessential amino acids og beta-mercaptoetanol) samt effekten af osteogenetisk supplement OS (bestående af askorbinsyrefosfat, beta-glycerofosfat og dexametason). Cellegruppe 1 sammenlignes med grupperne 2 og 3. I første gruppe udvikles embryoid bodies (EB) ved at lade humane embryonale stamceller (hes) vokse i suspension. Alle hes, der vokser uden feeder layer, altså uden en adhærent overflade at klæbe sig til (i suspentson), begynder at klumpe sig sammen og danne EB, indeholdende celler, der spontant differentierer til forskellige celletyper. Disse celleaggregater overflyttes til et EBM-medie, som tilsættes OS. Til gruppe 2 tilsættes EBM og OS direkte til hes-kulturerne, og i gruppe 3 tilsættes kun EBM til hes. Mineraliseringsgraden, dvs. deponering af calcium og fosfat, undersøges ved mærkning af de fremdyrkede celler med henholdsvis Alizarin red og Von Kossa. Mineralisering er udtryk for differentiering af cellerne til osteoblastlignende celler. Udviklingen af denne egenskab var mest udpræget for gruppen af EB behandlet med OS (gruppe 1). Også hes behandlet direkte med OS mineraliserede (gruppe 2), men knap så effektivt som den første gruppe. Gruppe 3-celler evnede kun minimal mineralisering. For at dokumentere effektiviteten af gruppe 1-cellernes uddifferentieringsevne, sammenlignes denne med hmscs, samt en kontrolgruppe af humane embryonale nyreepitelceller. Kun de to første grupper evner mineralisering. Man formoder derfor, at mineraliseringens evnen er et resultat af uddifferentiering til osteoblastlignende celler. Mineralisering forløber tidsmæssigt ens for hes og hmscs, hvilket indikerer, at uddifferentieringen er lige effektiv for disse to celletyper, når de behandles ens. De fra hes udviklede celler mineraliserer altså lige så godt som de voksne stamceller, der hidtil har været eneste kendte celler med denne egenskab. Via røntgenanalyse afsløres endvidere, at de udviklede cellers krystaller ligner hydroxyapatitkrystaller, hvilke udgør størstedelen af knoglevævets matrix. Via revers transkriptase-polymerasechain reaction (RT-PCR) afslører forskerne, at ekspression af Oct4 falder i takt med uddifferentieringen, hvorimod ekspression

3 1099 Tre forskellige kombinationer af behandling af humane embryonale stamceller sammenlignes. EBM og OS er forskellige vækstmedier indeholdende adskillige forskellige stoffer. Gruppe 1: hes udvikles til embryoid body der overflyttes til EBM-medie som tilsættes OS. Gruppe 2: EBM og OS tilsættes direkte til humane embryonale stamceller. Gruppe 3: Kun EBM tilsættes til humane embryonale stamceller. Cellerne fra gruppe 1 evner bedst at deponere calcium og fosfat. Gruppe 1-cellers mineraliseringsgrad sammenlignes med MSC og nyreepitelceller. Kapacitet og tidsmæssig udvikling for hes og MSC er ens. RT-PCR: fald i Oct4-ekspressionen samt stigning i ekspressionen af transkriptionsfaktorer for osteogenesen og mineraliseringsprocessen, samt balp. Røntgenanalyse: Hydroxyapatitkrystaller som dem der udgør knoglevævets matrix. hes EB EBM Osteoblaster 1 OS hes EBM OS Osteoblaster hes EBM Celler 3 1 RT-PCR Røntgen 2 Mineraliserer som MSC Oct4 Transkriptionsfaktorer balp Hydroxyapatitkrystaller Fig. 1. Osteoblaster. af flere markører for bl.a. transkriptionsfaktorer for osteogenese, heriblandt osteocalcin, øges. Ligeledes registreres en forøgelse i udtrykket af markører for mineraliseringsprocessen som funktion af behandlingen med OS. Via RT-PCR registreres yderligere en lav men afgørende ekspression af bonespecific alkaline phosphatase activity (balp). Ændringerne i ekspression af disse faktorer indikerer alle, at cellerne udvikler sig fra umodne celler til celler med osteocytegenskaber. Denne artikel præsenterer data, der viser hes s differentiering til celler med osteogen karakter. Forskerne arbejdede her med tre forskellige cellelinjer, og den videre forskning må efterprøve teknikken på endnu flere cellelinjer. Protokollen må endvidere forbedres, således at bl.a. ekspressionen af balp øges. Metoden må endelig underkastes funktionelle forsøg, før cellerne endelig kan afprøves på dyr (1). Hepatocytter Mange leversygdomme skyldes destruktion eller nedsat funktion af patientens hepatocytter. Sådanne sygdomme kan potentielt behandles ved transplantation med nye leverceller, evt. udviklet fra stamceller. Man har opnået en del resultater inden for forskning med føtale og voksne stamcellers differentiering til hepatocytter, men kan endnu ikke komme ud over den problematik, at cellerne i processen ofte ændrer sig både fænotypisk og genotypisk. forskning i embryonale stamceller Humane embryonale stamceller kan potentielt anvendes til dyrkning af hepatocytter. I en artikel fra 2003 sammenlignes således hepatocytlignende celler (differentieret fra

4 1100 Natriumbutyrat- og DMSO-påvirkning af human embryonale stamceller medfører hepatocytlignende celler. Humane embryonale stamceller udviklet til hepatocytlignende celler, med eller uden embryoid body-stadiet, sammenlignes og vurderes morfologisk og funktionelt ligeværdige. Immunhistokemisk: påvisning af albumin, alfa-1-antitrypsin, cytokeratin 8+18, men ingen AFP <=> ingen galdevejsceller. RT-PCR: primitive hepatocytter. Cellerne ophober glykogen. CYP1A2-aktivitet som udtryk for tilstedeværelse af cytokrom p450- isoenzymer registreres via EROD-test. hes Non-adhærent Natriumbutyrat kultur med EB samt DMSO Kollagenase EB hes+ DMSO tilsættes natriumbutyrat Hepatocytlignende celler Tilstedeværelse af albumin, alfa-1-antitrypsin, cytokeratiner Ophober glykogen Producerer albumin CYP1A2-aktivitet registreres via EROD Fig. 2. Hepatocytter. hes-celler), som er fremdyrket med eller uden dannelse af EB undervejs i processen (Fig. 2). I det første tilfælde høstes hes-celler via kollagenase, hvorefter cellerne dyrkes i non-adhærente kulturer, hvilket medfører dannelse af EB. Disse plantes i et medie indeholdende natriumbutyrat, der menes at inducere celledød og samtidig stimulere dannelse af hepatocytlignende celler blandt overlevende celler. Mediet indeholder endvidere dimethylsulfoxid (DMSO), et stof der tidligere er vist at inducere differentiering til hepatocytter. Ved den direkte differentiering dyrkes hes-cellerne først med DMSO i 4 dage, hvorefter natriumbutyrat tilsættes, men der er ingen dyrkning i adhæsionsfrit medie. Celler fra de to kulturer testes og sammenlignes med hensyn til markører og funktionalitet svarende til hepatocytter. Cellerne er morfologisk og i mange andre relevante sammenhænge lige funktionelle, hvorfor det konkluderes, at mellemtrinnet EB er overflødigt. Via immunohistokemisk undersøgelse testes med antistoffer mod albumin, alfa-1- antitrypsin, cytokeratin 8 og 18 samt alfaføtoprotein (AFP). Heraf var kun den sidste negativ, hvilket antyder, at cellerne er ganske højt differentierede. Cellerne udtrykker faktorer karakteristiske for leverceller, men udtrykker ikke AFP, en markør for celler, der kan differentiere både til hepatocytter og til galdevejssystemets celler. Via RT-PCR påvises et ekspressionsmønster svarende til primitive hepatocytter. Det vises endvidere, at cellerne ophober glykogen og producerer albumin, to funktioner karakteristiske for hepatocytter. En anden karakteristisk funktion er metabolisering af lægemidler via cytokrom p450- isoenzymer. CYP1A2-aktiviteten måles via EROD. EROD består i, at man inkuberer cellerne med et stof, der via CYP1A2 omdannes til et fluorescerende stof. Fluoresceringsgraden måles og sammenlignes med en standardkurve. CYP1A2-aktiviteten er størst, hvor mediet er tilsat natriumbutyrat, formodentligt fordi den herved inducerede

5 1101 cellevækst-stopfase giver mulighed for udvikling af cytokrom p450 (2). Forsøget viser en metode til differentiering af hes-celler til hepatocytlignende celler. Man må videre forske i optimering af denne direktion, samt undersøge natriumbutyrats virkningsmekanisme. Endvidere ved man endnu ikke, hvordan cellerne fungerer som transplantat, hverken på dyr eller mennesker, på kort eller lang sigt. Bliver det i fremtiden muligt at stimulere stamceller til differentiering til fuldgode leverceller, vil sådanne kunne benyttes til afprøvning af lægemidlers toksicitet. På nuværende tidspunkt testes potentielle lægemidler på dyr, men direkte testning på humane celler vil naturligvis kunne give et bedre billede af lægemidlets bivirkningsprofil. Embryonets etiske værdisætning I marts 2003 udgav Det Etiske Råd et interessant høringssvar i forbindelse med et forslag til lovændring (3), samt et debat oplæg om»menneskelivets begyndelse og fosteranlæggets etiske status«(4). I debatoplæggets kapitel 3, fremlægger Rådet 4 forskellige holdninger til»embryonets rettighed og krav på beskyttelse«samt heraf følgende overvejelser over, hvilke begrænsninger forskningen bør underlægges. Det første synspunkt som forsøges forsvaret er,»at embryon og barn ikke har samme etiske status, hvorfor forskning inden for lovgivende rammer bør tillades«. Fig. 3. Celler med osteocytlignende egenskaber fremdyrket fra hes-celler. Teksten argumenterer for, at embryon og foster alene har gener til fælles, og at barnets etiske status er bestemt ved mange andre forhold end dets gener. Endvidere pointeres det forhold, at samfundet tillader abort og nedfrysning af æg, men ikke skadelige forsøg på mennesker eller eutanasi, hvilket tages som udtryk for, at samfundet heller ikke i dag sidestiller embryonets og menneskets rettigheder. Endvidere fremføres det nytteetiske argument, at fællesskabet får større gavn af at forske i æggene end ved at kassere dem. Endelig lægges der vægt på implantationen i livmoderen som afgørende for embryonets udvikling. Dette argument understreger den biologiske forskel på menneskeliv og embryonet som mulighed herfor. Det pointeres, at embryonet repræsenterer muligheden for liv, hvorfor det bør beskyttes mod overgreb ved love. Herefter præsenteres synspunkt 2, nemlig at»embryonets etiske status er stigende fra befrugtningen frem mod fødslen, svarende til moderens bevidsthed om barnet«. Teksten fremhæver ligeledes vigtigheden af implantationen i livmoderen og andet sam-

6 1102 spil mellem mor og foster for fosterets udvikling. Det etiske dilemma mellem embryonets ret og forskningens fordele vurderes nytteetisk til fordel for forskningen, hvorefter vigtigheden af en stram lovgivning pointeres. Det tredje synspunkt er mere vanskeligt tilgængeligt og mindre klart i sin konklusion. Indledningsvis fastslås, at mennesket nødvendigvis må nyttiggøre verden for at leve i den, men samtidig at mennesket handler under dom, hvorfor det bliver væsentligt at handle etisk korrekt. Som grundtese antages det, at menneskelivet har krav på beskyttelse, men hvornår begynder menneskelivet? Fordi det ikke biologisk er muligt præcist at angive, hvornår befrugtningen sker, opstår livet i en gråzone mellem befrugtning og implantation, mener forfatteren. Vanskeligheden ved at definere begyndelsen opstår, fordi»naturvidenskabelig tankegang rækker ganske enkelt ikke til at kunne begribe denne flertydighed«. Dernæst fastslås den grundtese, at fosteranlæggets etiske status svarer til et barns. En kvindes lovgivende ret til at vælge et barn fra i form af abort, kan tolkes flertydigt i relation til embryonets rettigheder. Umiddelbart synes lovgivningen at indikere, at det tidlige foster har en lavere etisk status end det højere udviklede. I forsvaret for dette tredje synspunkt tolkes loven som en tilkendegivelse af kvindens ret til selvbestemmelse, på trods af fosterets etiske ret. Fordi følelsesmæssigt engagement er forudsat for kvindens ret til at bestemme over fosterets skæbne, kan kvinden ikke frasige sig denne bestemmelsesret, ved f.eks. at sælge embryonet eller fosteret. Heraf følger, at det ikke er muligt at tale om ejerskab eller patentrettigheder i forbindelse med embryoner. Teksten understreger, at nogen forskning bør tillades, men at udfordringen ligger i»at beskytte det lille fosteranlæg og dets mor. Men også at beskytte vores samfund mod den forråelse, der følger af at leve i en verden, som lader sig reducere til rene naturvidenskabelige og biologiske processer«. Det fjerde synspunkt, som forsvares, er, at»forskning med embryoner ikke må tillades, fordi menneskelivet skal forsvares fra befrugtningstidspunktet«. Forfatteren erkender, at der ikke eksisterer noget bevis for, at menneskelivet har krav på beskyttelse, men hævder, at det er en alment accepteret grundantagelse. Fordi denne fundamentale grundantagelse er så udbredt, kræver forfatteren, at bevisbyrden tilfalder dem, der fremfører et andet synspunkt. Hidtil påpeger teksten ikke forhold, som ikke alle medlemmer af Det Etiske Råd tilsyneladende kan erklære sig enige i. Det fjerde synspunkt adskiller sig ved at hævde, at der ikke findes holdbare argumenter for, at embryonet, fosteret og barnet adskiller sig i tilstrækkelig grad til at differentiere deres etiske status. Således

7 1103 konkluderes det etisk uforsvarligt at tillade forskning med embryoner. I diskussioner af grundlæggende etisk karakter må man forsøge at identificere de grundværdier, som udgør fundamentet for diskussionen. I en vestligt orienteret filosofi vil respekten for den enkelte og dennes rettigheder, heriblandt retten til liv, være af en sådan karakter. Grundlæggende for vores menneskeforståelse er, at det individuelle menneske i sig selv er værdifuldt, ikke fordi det gør godt eller opfattes som sådan af andre, men fordi det rummer en værdifuldhed. Denne livsopfattelse bunder i en subjektiv forståelse og argumentation, der ikke kan verificeres eller efterprøves videnskabeligt, man alligevel er det opfattelsen, som er meget grundlæggende i den vestlige kultur. At forsvare det modsatte synspunkt, nemlig at det enkelte individ ikke rummer en iboende værdi, vil være et brud med den nuværende vestlige verdens etiske fundament, en opgave der synes uoverskuelig. At den modsatte påstand synes uoverskuelig at forsvare, er naturligvis ikke et bevis for at den oprindelige påstand at individet rummer en iboende værdi er korrekt. Accepteres det enkelte individs ret til liv, hvilket er tilfældet for alle medlemmer af Det Etiske Råd, må det næste spørgsmål være: hvornår der er tale om et individ, der således har krav på beskyttelse af sine rettigheder og sit liv. Traditionelt opfattes befrugtningstidspunktet som den biologiske begivenhed, der er af væsentligst karakter for livets begyndelse. I dag kan befrugtningen af en oocyt også foregå i reagensglas eller ved kloning; forhold der i sig selv rokker ved vores forståelse at befrugtningen som begyndelsen til liv. I forbindelse med in vitro-fertilisering og efterfølgende implantation i livmoderen, har man erfaret, at implantationen af ægget i livmoderen er en vanskelig men afgørende forudsætning for det potentielle livs fortsatte udvikling. Flere processer er forudsætninger, men ikke i sig selv nok til at livsprocessen fortsætter. Det forhold, at mange befrugtede æg går til grunde, strider mod vores opfattelse af befrugtningen som livets begyndelse. En ansvarsbevidst forholden til forskningens visioner og forhåbninger vedrørende stamcellers rolle inden for fremtidens behandlingsmuligheder fordrer overvejelser og eftertænksomhed. Debatten er til tider ophedet, og dette skyldes naturligvis dens fundamentale karakter og dens afgørende rolle for forskningens fremtid. Forskningen viser os mødet mellem nutiden og fremtiden, men fordrer en balancegang mellem den humanistiske og den videnskabelige tankegang. Interessekonflikter: ingen angivet.

8 1104 litteratur 1. Sottile V, Thomson A, Mcwhir J. In vitro osteogenic differentiation of human ES cells. Cloning and stem cells 2003; 5: Rambhatla L, Chiu C-P, Kundu P, Peng Y, Carpenter MK. Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells. Cell Transplantation 2003; 12: Høring over lov om ændring af lov om kunstig befrugtning i forbindelse med lægelig behandling, diagnostik og forskning m.v. Det Etiske Råd, Menneskeligt livs begyndelse og fosteranlægets etiske status. Et debatoplæg. Det Etiske Råd, 2003.