Identifikation af kandidat referencegener til en mir-375 qpcr-analyse - Opsætning og optimering af en mikrorna qpcr-analyse
|
|
- Dagmar Krog
- 8 år siden
- Visninger:
Transkript
1 Identifikation af kandidat referencegener til en mir-375 qpcr-analyse - Opsætning og optimering af en mikrorna qpcr-analyse Forfatter: Niklas Follend Lauritsen, Bachelorprojekt periode: Forår Uddannelsessted: Bioanalytikeruddannelsen, PH Metropol København. Vejledere: Lene Gredal og Christina Kjær Tegn (uden mellemrum): 54986
2 Forord Dette bachelorprojekt er udarbejdet på Klinisk Biokemisk Afdeling, Hvidovre Hospital. Jeg vil gerne takke alle, der har hjulpet mig gennem hele projektet. Deriblandt overlæge Mogens Fenger som tilbød mig, at arbejde med dette projekt. Samtidig vil jeg takke biokemiker Rikke V. Grønlund for hjælp til praktisk udførelse i laboratoriet samt vejledning af tekniske elementer i processen. Til sidst vil jeg gerne takke mine to vejledere Lene Gredal og Christina Kjær for god og konstruktiv vejledning samt feedback. 04/ Underskrift: Niklas Follend Lauritsen, Forside illustration: 2
3 Resume Introduktion På Hvidovre Hospital KBA vil man opsætte en mir-375 (mikrorna) qpcr-analyse. Diabetes mellitus type 2 er muligvis forårsaget af mir-375, da en overekspression af mir-375 associeres med en hæmning af insulinproduktion og sekretion. Med en bedre forståelse af sygdommens patofysiologi vil man evt. kunne udvikle nye behandlingsmetoder af diabetes mellitus type 2. I dette projekt er formålet at opsætte og optimere en qpcr-analyse til detektion af mir-375. Opsætningen af mir-375 qpcr-analysen omhandler følgende analyseparametre: optimal ROX koncentration og optimalt RNA-input til cdna-syntesen samt mindskning af CV% af replikater. Endvidere er det nødvendigt at identificere endogene referencegener til normalisering af mir-375 analyseresultater for at begrænse den analytiske variation. Metode Jeg anvender syntetiske spike-in kontroller til at teste den optimale ROX konc.. RNA-inputet optimeres ved øgning af RNA-inputet til cdna-syntesen samt ved tilsætning af et carrier-rna til oprensningen af mirna. Mindskning af CV% af replikater gøres vha. robotafpipettering samt ved at øge PCR-reaktionsvolumen. Vha. softwareprogrammet GeNorm finder jeg de bedst egnede referencegener til normalisering af mir-375 analyseresultater. Resultater og konklusion En ROX konc. på 30 nm er mest optimal at anvende da den med målte ct-værdier på 18,6 () og 34,5 (), er tættest på spike-in kontrollernes referenceværdier. Et 4 µl RNA-input til cdna syntesen viser et fald på ca. 4 ct-værdier i forhold til anvendelse af et 2 µl RNA-input. Et 10 µl PCR-reaktionsvolumen giver en gennemsnitlig CV% af replikater på 2,5%, mens et 20 µl PCRreaktionsvolumen giver en gennemsnitlig CV% af replikater på 1,0%. Dermed mindsker et større PCR-reaktionsvolumen variationen af replikaterne. Af de referencegener jeg har testet er,, mir-30 og mir-103 fundet mest stabile i de serumprøver jeg har anvendt til projektet. Nøgleord: mikrorna, diabetes mellitus type 2, qpcr-analyse, analyseoptimering, referencegener, normalisering 3
4 Indholdsfortegnelse 1 Introduktion Forklaringer Problembaggrund Problemformulering Teori mirna Diabetes melitus type 2 og mir Analyseprincip detektion af mirna Resultatbehandling ROX passiv reference Metodevalg og afgrænsninger Metodevalg Afgrænsninger af projektet Materialer og metode Materialer Prøvemateriale Kontroller Reagenser og apparatur Metode Forsøgsforløb (flowdiagram) Udførelse af forsøg Kvalitetssikring Valg af kandidat referencergener til analysering af stabilitet på pre- og postoperative prøver Vurdering af resultater Etiske overvejelser Resultater Udvalgte kandidat referencegener ROX ROX testet ved forskellige koncentrationer Validering af ROX ved 30 nm koncentration Optimering af RNA-input µl RNA-input til cdna syntesen Tilsætning af carrier-rna
5 3.4 Mindskning af CV% af replikater Valg af referencegener Ekskludering af referencegener i forsøgsforløbet Mest stabile referencegener Optimalt antal referencegener til normalisering Normalisering af mir Diskussion Udvælgelse af referencegener ROX RNA-input CV% af Replikater Referencegener og normalisering af mir Konklusion Perspektivering Referencer Bilag Bilag Bilag
6 1 Introduktion 1.1 Forklaringer 3 UTR: 3 Unstranslated Region. Kort ikke-proteinkodende basesekvens der er lokaliseret i 3`enden af et mrna Antisense oligonukleotider: syntetiske enkeltstrengede RNA-molekyler hvis formål er at blokere/hæmme translationen af mrna β-celle apoptose: programmeret celledød af β-cellerne DM2: diabetes melitus type 2. Sygdom karakteriseret ved at de insulinafhængige celler ikke kan optage glukose, samtidig med at β-cellerne i pancreas er dysfunktionelle eller delvis destrueret Fluorocrom: molekyler der udsender lys (fluorescens) ved lysfotometri. Gastric bypass operation: fedmeoperation mirna: mikrorna, mir. Korte enkeltstrengende RNA-molekyler der kan regulere genekspressionen ved binding til 3 UTR-delen af mrna mrna: messengerrna. RNA-molekyle der viderebringer den genetiske information fra DNA qpcr: kvantitativ real-time PCR-analyse. Mængdebestemmende PCR-analyse. Pri-miRNA: primary mirna Pre-miRNA: precurser mirna Pre: preoperativ blodprøve Post: postoperativ blodprøve RISC: RNA-induced silencing comlex. Et kompleks af et mirna molekyle og forskellige proteiner der binder sig komplementært til et mrna og dermed nedbryde/hæmme det ROX: passiv reference fluorocrom der normaliser SYBR Green fluorescenssignal under PCR-reaktionen Supernatant: væsken der efter centrifugering af en prøve ligger som et lag over bundfaldet 6
7 1.2 Problembaggrund På Hvidovre Hospital KBA er man interesseret i at opsætte en qpcr-analyse (kvantitativ real-time PCR) hvor man vil måle på mikrorna (mirna) mir-375. mirna er korte enkeltstrengede molekyler på ca. 21~23 nukleotider der kan regulere genekspressionen ved at binde sig til 3 UTRdelen af mrna og dermed bl.a. hæmme translationen af mrna til protein [1]. mir-375 er et af de bedst beskrevne mirna [2] og er undersøgt i flere forskellige studier i henhold til dens rolle i diabetes mellitus type 2 (DM2) [2,3]. mir-375 regulerer insulinproduktion og -sekretionen i β- cellerne i pancreas [3], og findes samtidigt cirkulerende ekstracellulært i plasma [1]. På Hvidovre Hospital KBA har man en hypotese om at netop mir-375 koncentration i plasma hos DM2 patienter ændres efter en gastric bypass operation (fedmeoperation). Hypotesen er bygget på at patienters HBA1C (HBA1C: primær biomarkør diabetes[1,4]) koncentration er faldet efter de har gennemgået gastric bypass operationen. mir-375 forårsager muligvis den ændrede HBA1C konc. efter operationen, da en overekspression af mir-375 associeres med en hæmning af insulinproduktionen og sekretion [2,3]. Ved at sammenligne DM2 patienters mir-375 koncentration henholdsvis før og efter gastric bypass operationen, vil det være muligt at undersøge om den ændrede HBA1C konc. evt. skyldes et fald i mir-375 konc.. Dermed vil man evt. opnå en bedre forståelse af mir-375 patofysiologiske rolle i DM2. Med en bedre forståelse af sygdommen kan en terapeutisk intervention af DM2 evt. etableres, inden de komplikationer som DM2 medfører opstår. I den sammenhæng kan mir-375 evt. anvendes som biomarkør for DM2, da mir-375 muligvis ses forhøjet i blodet inden andre nuværende DM2 biomarkører (HBA1C, P-glukose mm.[1]). mirna er samtidig generelt interessante i forhold til at anvende som en biomarkør da de findes i plasma/serum prøver, er stabile ved opbevaring og det er muligt at detektere dem specifikt ved bl.a. en qpcr-analyse [1]. Etablering af en standardiseret metode til at detektere mir-375 på Hvidovre KBA er derfor essentiel for at undersøge hypotesen om mir-375 nærmere. Inden man måler mirna ved en qpcr- analysemetode er det nødvendigt at optimere forskellige analyseparametre således at mir-375 analyseresultaterne er pålidelige og brugbare til vurdering. Analysens optimering omhandler bl.a. korrekt koncentration et såkaldt passiv reference fluorokrom (ROX) samt en optimering af qpcrreaktionerne. Samtidig er det nødvendigt at identificere et eller flere endogene kandidat referencegener til normalisering af mir-375 [5]. Referencegenet virker som en intern kontrol for præanalytiske og analytiske faktorer da referencegenet er udsat for præcis de samme forhold (fx opbevaring) som ens målegen [6]. For at referencegenet kan anvendes til kvalitetssikring skal det 7
8 være stabilt udtrykt uafhængigt af patientens tilstand [5] som i dette tilfælde er fedme, et operativt indgreb og DM2. Normalisering af mir-375 analyseresultater skal sikre en begrænsning af den analytiske variation, således den sande biologiske variation af mir-375 konc. er mere pålidelig [6]. Formålet med dette projekt er dermed 1. Analyseoptimering af mir-375 qpcr-analysen. 2. Identificere kandidat referencegener til mir-375 qpcr-analysen. 3. Normalisering af mir-375 analyseresultater ud fra kandidat referencegener. 1.3 Problemformulering Hvilke kandidat referencegener viser sig bedst egnet i en mir-375 mirna qpcr-analyse ved optimering og validering af følgende qpcr analyseparametre: ROX (passiv reference fluorocrom), RNA-input til cdna-syntesen samt mindskning af CV% af replikater? Hypoteser: mir-375 plasmakoncentration ændres efter en gastric bypass operation. ROX (passiv reference) vil i høje koncentrationer virke hæmmende på qpcr-reaktionerne. Et større RNA-input til cdna-syntesen vil resultere i en lavere ct-værdi som sikrer en større sensitivitet af qpcr-analysen. Et for højt RNA-input vil have en hæmmende effekt på cdna-syntesen. Ved tilsætning af et carrier-rna til oprensningen vil der ekstraheres en større mængde RNA. Større PCR-reaktionsvolumen mindre variation af replikater. Det er muligt at anvende kandidat referencegener til normalisering af mir-375 analyseresultater. 8
9 1.4 Teori mirna mirna er små ikke-proteinkodende enkeltstrengede RNA-molekyler der kan virke nedregulerende på den post-transkriptionelle fase af proteinsyntesen. mirna binder sig til 3 UTR-delen af mrna hvorved den kan hæmme translationen af mrna til protein og/ eller degradere mrna [7]. mirna syntetiseres ud fra egne transkriptionelle gener og/eller fra introns i proteinkodende gener (se figur 1) [1]. Èt mirna molekyle kan have flere forskellige mrna de kan binde sig til [7], og man mener at de regulerer ca. 1/3 af menneskets samlede genom [8]. Figur 1. Biogenese af mirna [9]. I cellekernen dannes først et enkeltstrenget RNA-molekyle som kaldes pri-rna. Transskriptionen af pri-mirna sker vha. enzymet polymerasae II. Efterfølgende formes pri-mirna som et stemloop / hairpin der er ca. 120 nukleotider langt (1). De to enzymer Drosha og DGCR8 danner, ved at kløvning af 5` og 3 enden pri-mirna, et 70 nukleotider langt pre-mirna (2). Pre-miRNA bliver transporteret fra cellekernen til cytoplasmaet via protein/enzymkomplekset exportin 5-Ran-GTP (3). I cytoplasmaet bliver stemp-loopet kløvet af enzymerne dicer og TRTP. Dermed dannes et mirna-mirna* kompleks der er ca nukleotider langt (4). mirna-mirna* komplekset består af en guide RNA-streng og en komplementær passenger RNA-streng. Passenger RNA-strengen bliver oftest nedbrudt (5) mens guide-rna strengen bliver til det færdigdannede mirna produkt (6). Det færdigdannede mirna produkt vil sammen med proteinet argonaut danne et RISC (RNA-induced silencing complex). RISC kan til binde sig komplementært til 3 UTR-delen af et eller flere mrna, og dermed enten hæmme eller nedbryde det [1,7]. 9
10 1.4.2 Diabetes mellitus type 2 og mir-375 I Danmark er ca personer diagnosticeret med diabetes og ca skønnes af kunne udvikle sygdommen [10]. DM2 er klart den mest udbredte af de to hovedtyper (DM1 og DM2) og udgør ca. 90 % af tilfældene [7]. DM2 skyldes primært genetiske forhold. Livsstilsfaktorer som fedme, kost og mangel på motion er samtidig med til at øge risikoen for at udvikle DM2 [1]. DM2 er en tilstand hvor de perifere insulinafhængige celler ikke længere kan optage glukose, samtidig med at β-cellerne i pancreas er dysfunktionelle eller delvis destrueret [11]. Samlet resulterer det i at insulinproduktion i β-cellerne ikke kan opretholde det øgede insulinbehov i kroppen [11,12]. Det resulterer i en glykæmisk tilstand hvilket er årsag til en række alvorlige komplikationer (følgesygdomme) hos patienten, som fx hjertekarsygdomme, nefropati (nedsat nyrefunktion), neuropati (nerveskader) og blindhed [13]. Ændring af bl.a. usunde kostvaner, rygestop og medicinsk indgriben vil øge chancerne for ikke at udvikle følgesygdommene [4]. I det tidlige stadie af sygdommen er de dysfunktionelle β-cellers funktion desuden reversibel, og med medicinske medikamenter er det derfor stadig muligt at genvinde funktionen af β-cellerne [11]. En tidlig diagnosticering af DM2 er derfor afgørende for at undgå følgesygdommene. mir-375 har vist sig på flere måder at have en indvirkning på β-cellernes funktion i pancreas. Ved en lipidinduceret β-celle apoptose (initieret celledød) hæmmer mir-375 mrna translationen af genet myotrophin [14]. Myotrophin er et vigtigt protein for forskellige regulatoriske cellemekanismer som fx insulin exocytose (insulin sekretion) og celleprofilering [2,3,14]. Yan Li et al har vist at ved hæmning af mir-375 vha. syntetiske antisense oligonukleotider, at mytrophonin koncentrationen i β-cellerne bliver opretholdt ved en induceret lipidapoteose [14]. mirna-375 har ligeledes vist sig at have en hæmmende effekt på PDK1 genet. PDK1 er kinase der er en del af PDE-1 signalvejen i β-cellerne. mirna-375 binder sig til PDK1 s mrna 3 UTR-del, hvilket medfører en blokering af signalvejen således at både ekspression af insulingenet samt β- celleprofileringen bliver reduceret [2,3,12]. 10
11 1.4.3 Analyseprincip detektion af mirna qpcr baseret mirna identifikation består af tre dele: isolation af mirna, cdna-syntese og specifik qpcr amplifikation. Step 1. Isolation af mirna Målet med isolationen (oprensningen) af mirna (eller korte RNA-molekyler) er at ekstrahere de enkeltstrengede RNA-molekyler fra blodplasma/serum. Isolationen af mirna forløber således (reagenser; se Materialer, fremgangsmåde; se Udførsel af forsøg ) [15]: o Celler og andre komponenter i plasmaet lyseres vha. Lysis Solution BF. o Uønskede proteiner udfældes ved at tilsætte Protein Precipitation Solution BF til supernatanten. o Isopropanol tilsættes og supernatanten bliver nu afpipetteret i en spin-column (se figur 2). o RNA binder sig specifikt til spin-colunm og uønskede urenheder, der evt. skulle sidde på spin-column, bliver afvasket med med Wash Solution I og II (under centrifugering/spin down). o Til sidst tilsættes vand og RNA elueres i en nyt eppendorfrør (under centrifugering/spin down). o Carrier-RNA: Ved tilsætning af et carrier-rna kan udbyttet af oprenset mirna optimeres. Da mirna er meget små molekyler som let kan gå tabt under oprensningen, kan et carrier-rna molekyle aggregere sig til mirna og danne et precipat. Precipatet af mirna og carrier-rna har større sandsynlighed for at elueres end et fritstående mirna molekyle [16]. Figur 2. Spin-column [17,18]. Spin-column indeholder et filter der filtrerer mirna således det efterfølgende kan elueres i eppendorføret ved tilsætning af H 2 O. 11
12 Step 2. cdna-syntese af mirna-template For at et mirna kan opformeres i en qpcr reaktion skal det syntetiseres til et dobbeltstrenget DNA også kaldet cdna (komplementær DNA) (se figur 3) [19]. Dermed kan fluorokromet SYBR Green interkalere imellem de to komplementære strenge (se figur 4) og gøre cdna fluorescerende så at det kan detekteres i en efterfølgende qpcr-reaktion. Der bliver dannet cdna uspecifikt fra alle mirna i prøven. Et højere RNA-input fra oprensningen medfører mere syntese af cdna højere samlet cdna koncentration til kvantificering i qpcr-analysen. Et for højt RNA-input kan dog virke hæmmende på cdna-syntesen [20]. Figur 3. cdna-syntese [20] Et enkeltstrenget mirna syntetiseres til cdna ved at en poly-a hale binder sig til template-mirna fra ekstraktionen (step 1, A). Poly-T-primere binder sig specifikt til poly-a-halen ved hjælp af 5 universal tag og 3 degenerate anchor (step 1, B) [20]. Den komplementære streng bliver til sidst transkripteret, vha. enzymet reverse transkriptase, og det dobbeltstrenget cdna produkt syntetiseres [21]. Step 3. qpcr amplifikation cdna opformeres nu i en klassisk PCR-reaktion (se figur 4), og detekteres i den eksponentielle fase af opformeringen [22]. Specifikke primere bestemmer hvad der bliver opformeret i PCR-reaktionen. Figur 4. Første cyklus i PCR-reaktionen [18]. Under qpcr reaktionen denatureres først alt cdna. Derefter binder (anealing) mir-specifikke forward og reverse primere sig til det specifikke cdna Efterfølgende forlænges (elongeres) det enkeltstrengede DNA af enzymet polymerase II. Ved kontant at denaturere, aneale og elongere cdna bliver der efter hver endt PCR-cyklus eksponentielt dannet dobbelt så meget produkt. SYBR Green interkalerer i mellem det opformeret cdna så det kan detekteres vha. lysfotometri [22]. 12
13 1.4.4 Resultatbehandling I qpcr-analysen foregår analysen real-time (direkte) og analysen måler den kvantitative mængde af et specifikt ønsket mirna (som er syntiseret til cdna). Værdien for den kvantitative mængde af mirna betegnes som en ct-værdi (ct = cyklus tærskelværdi). Ct-værdien udregnes på baggrund af mængden af detekteret fluorescens (y-aske) og antal cyklusser (x-akse) (Se figur 5). Det sted på kurven, hvor der sker en størst eksponentiel stigning af fluorescens, og dermed eksponentiel opformering af cdna, udregnes (automatisk) som en tærskelværdi. På x-aksen findes den cyklus hvor den eksponentielle tærskelværdi er opnået og ct-værdien kan nu findes. Jo højere koncentration af mirna i prøven jo hurtigere vil der ske en eksponentiel stigning af fluorescens. Dermed vil en lav ct-værdi være udtryk for en høj koncentration af cdna [19,22]. Ct-værdien bliver automatisk fundet af det anvendte PCR- apparatur. Vuderingen af ct-værdi [23]: Ct-værdier < 29: Indikerer et højt indhold af mirna i prøven. Ct-værdier mellem 30-37: Indikerer et moderat indhold af mirna i prøven Ct-værdier > 38-40: Indikerer et lavt indhold af mirna i prøven. Ct-værdi Figur 5. Tolkning af Ct-værdi. [19] Y-akse: mængde af fluorescens. X-akse: antal cyklusser. En hurtigere stigning af fluorescens vil resultere i en lavere ct-værdi. Den blå kurve (S1) har fx et betydeligt højere indhold af mirna i prøven end den grønne kurve (S5) ROX Passiv reference I en qpcr-analyse er det nødvendigt at anvende et fluorocrom der bruges til normalisering af ikke PCR-relaterede faktorer. Fluorocromet kaldes ROX, og er en passiv reporter (P) der måles fotometrisk ved en anden bølgelængde end det fluorocrom der bliver anvendt til måling af mirna [24]. Ikke PCR-relaterede faktorer er fx afpipetterings fejl, optisk forskel fra lyskilden til afstanden til brøndene på PCR-pladen og ændringer i koncentration eller volumen i de enkelte brønde under selve PCR-reaktionen. Det fluorocrom der måler mirna betegnes som en reporter (R) og er fx 13
14 SYBR Green. Ved at dividere hvert signal fra SYBR Green (N) med hvert signal fra ROX (P) fås et normaliseret forhold mellem de to signaler. Det normaliserede forhold betegnes Rn. Baggrundssignalet (baseline) subtraheres til sidst fra Rn, og RnΔ er den endelige normaliserede fluorescens (se figur 6) [24,25]. ROX tilsættes til master:primer mixet (Se Udførelse af forsøg ). Ifølge Exiqons protokol vil en for høj koncentration af ROX have en hæmmende effekt på qpcr analyseresultaterne [19]. ~ RnΔ = Rn Baseline Figur 6. Eksempel på normaliseret signal af ROX. Til venstre ses fluorescenssignalet af SYBR Green (grøn kurve) og ROX (rød kurve). ROX koncentration er konstant da den ikke er påvirket af PCR-reaktionen. Til højre ses det normaliserede signal, Rn Baseline =. RnΔ, på y-aksen. SYBR Green fluorescenssignal bliver normaliseret under hele PCR-reaktionen. 1.5 Metodevalg og afgrænsninger Metodevalg Valget af en valid metode til at detektere mir-375 er gjort vha. artikelsøgning, og i samråd med en overlæge og en biokemiker på Hvidovre KBA. En lang række kommercielle biofirmaer udbyder analyse kits til at isolere og detektere mirna. Et analyse kit indeholder de nødvendige reagenser til dette formål samt en protokol for fremgangsmåden. Inden valg at et analyse kit er faktorer som tilgængelighed, pris og en velbeskrevet fremgangsmåde (protokol) overvejet. Der findes ingen sammenligninger af forskellige potentielle analyse kit, hverken fra firmaer eller søgninger i 14
15 PubMed. Exiqon har dog udviklet to kits der opfylder mine krav til valg af analyse kit: mircury TM RNA Isolation Kit - Biofluids og mircury LNA TM Universal RT microrna PCR. Kittet er testet i et pilotforsøg der viser tilfredsstillende resultater. De to kits er dermed brugt til forsøgene i dette projekt. Jeg vil benytte spike-in kontroller til at vurdere den optimale ROX koncentration og det optimale RNA-input til cdna-syntesen. Jeg vil samtidig benytte statiske udregninger som SD, middelværdi og CV % til at vurdere qpcr-replikaternes variation. Jeg vil anvende software programmet GeNorm til at identificere de mest optimale referencegener til mir-375 qpcr-analysen. GeNorm benytter sig af en algoritme der er udarbejdet til specifikt, at finde de bedst egnede referencegener til normalisering af målegenet [5] Afgrænsninger af projektet Valg af antal af prøver og referencegener til projektet er begrænset da omkostningerne til qpcranalysen (reagenser og materialer) er forholdsvis høje. 15
16 2 Materialer og metode 2.1 Materialer Prøvemateriale Til alle forsøg er der brugt patientprøver fra Hvidovre Hospitals Biobank. Hver patient har fået taget to blodprøver (serum + plasma) preoperativt (pre) før gastric bypass operationen og to blodprøver (serum + plasma) igen postoperativt (post) efter gastric bypass operationen. De postoperative prøver er taget ca. 3 måneder efter operationen. Efter prøvetagning er prøverne centrifugeret og 2 ml plasma/serum (supernatant) er derefter udportioneret i nye glas/rør. Prøverne er opbevaret ved -80 grader i biobanken og hver prøve er markeret med et 2-4 langt specifikt KBA nr.. Til dette projekt blev der kun anvendt serumprøver fra i alt 9 patienter (samlet 18 prøver pre- og postoperatitvt) (se bilag 2). Patient 1-5 er overvægtige og diagnosticeret med DM2 (HBAC1 = >48). Patient 5-9 er overvægtige og ikke diagnosticeret med DM2 (HBA1C = <48) Kontroller Syntetiske oligonukleotider, og (spike-ins), er brugt som kontrol af mirna oprensningen, cdna-syntesen og PCR-reaktionen [26]. NTC (= No Template Control) er samtidig anvendt i alle forsøg Reagenser og apparatur Reagenser og materialer til isolationen af mirna, cdna-syntesen, PCR-analysen samt primere er alle fra Exiqon. ROX (passiv reference) er fra Life Technologies og MS2 carrier-rna er fra Roche. Andre nødvendige materialer og apparaturer til udførelsen af forsøget tilhører Hvidovre KBA. mirna-primere: hsa-mir-375 LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-16a LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-23a LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-30c LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-93-5p LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-103a-2-5p LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-124-3p LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.:
17 hsa-mir-191-5p LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-423-5p LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-425-3p LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: hsa-mir-let-7i LNA TM PCR primer set, unirt (200 reaktioner, 10 µl) Lot nr.: (Spike-in) Lot nr.: (Spike-in) Lot nr.: mircury TM RNA Isolation Kit - Biofluids indeholder følgende reagenser og materialer: Kittet indeholder Lot nr.: 14/10/001 Lysis Solution BF Lot nr.: Protein Precipitation Solution BF Lot nr.:57697 Reaction buffer for rdnase Lot nr.: rdnase, RNase-free (lyophilized) Lot nr.:57771 Wash Solution 1 BF Lot nr.:57708 Wash Solution 2 BF Lot nr.:57688 RNase-Free Water Lot nr.:57677 microrna Mini Spin Columns BF Lot nr.:sp Collection Tuber (1,5 ml) Lot nr.: Collection Tuber (2 ml) Lot nr.: COLO01371 Collection Tuber med låg Lot nr.: isolationer 15 ml 5 ml 3 ml 1 vial (forbehandles) 10 ml 20 ml + 80 ml ethanol (forbehandles) 5 ml 50 stk 50 stk 50 stk 50 stk Brugte reagenser og materialer der ikke medfølger i kittet (tilhører Hvidovre KBA): Mini centrifuge: Mini-Star, VWR. Pipettespidser (RNase-free) 10 µl - Lot nr.: 3200A0 100µl - Lot nr.: µl - Lot nr.: 5004A1 17
18 1000µl - Lot nr.: C113268R2643 Vortexer: Vortex Genie-2, Scientific industries, Holm og Halby. 99% ethanol - Lot nr.: Isopropanol - Lot nr.: SZBB240BV 1,5 ml Eppendorf rør, rnasef-fri - Lot nr.: El3Ø8Ø86, Greiner bio-one. PCR 0,2 ml rør - Lot nr.: AB-0337, Thermo Sceintific. rdnase opbevares ved -20 C. Alle andre reagenser opbevares ved stuetemperatur. mircury LNA TM Universal RNA Spike-in kit Kittet indeholder Lot nr.: UniSp2, UniSp4, template mix M2 carrier-rna 50 reaktioner 160 fmol, 1,6fmol, 0,016 fmol 50 ng (0,625 ng/µl) mircury LNA TM Universal RT microrna PCR (består af universal cdna synthsis kit II + ExiLENT SYBR Green master mix, 2,5 ml) indeholder følgende materialer: Universal cdna synthesis kit II Kittet indeholder Lot nr.: x Reaction buffer Lot nr.: Enzyme mix Lot nr.: Nuclease free water Lot nr.: , RNA Spike-in template Lot nr.: reaktioner, 10 µl 128 µl, 64 µl, 10x concentrated 1 ml 12 fmol, dried down ExiLENT SYBR Green master mix, 2.5 ml Kittet indeholder Lot nr.: ExiLENT SYBR Green master mix, 2x concentr Lot nr.: Nuclease free water Lot nr.: RNA Spike-in control primer set v2 Lot nr.: 500 reaktioner, 10 µl reaktion 2 x 1,25 ml, 2x concentrated 2 x 1,25 ml 500 µl, 10x concentrated 18
19 Nødvendige reagenser og materialer der ikke medfølger i kittet Nukleasefri PCR tuber eller plates Eppendorfcentrifuge: Picofuge, Stratagene. Heatingblock: Peltier Thermal Cycler, PTC-200, MJ research. Real-time PCR instrument: QauntStudio 6 flex, Applied Biosystems, Life Technologies. Andre reagenser: MS2 (RNA-carrier) - Lot nr.: ROX - Lot nr.: Alle reagenser og primere opbevares ved -25 til -15 C. 19
20 2.2 Metode Forsøgsforløb Der er i alt udført 14 mirna qpcr-analyser med forskellige forsøgsopsætninger. Hvert forsøg har til formål at teste for forskellige analyseoptimeringsparametre samt at teste forskellige udvalgte mirna referencegener. Nogle forsøg tester for optimering og referencegener samtidigt (se flowdiagram). Præcise opsætninger af forsøgene findes i bilag 1. Forsøgsforløbet ser således ud: Indledende fase Forsøg 1: Pilotforsøg Forsøg 2: Pilottest af udvalgte referencegener (mislykket) Test af ROX konc. Forsøg 3: test af 500 nm og 50 nm konc. Forsøg 4: test af 20 nm, 30 nm og 40 nm. konc. Forsøg 5: Validering af 30 nm konc. Test af referencegener Forsøg 6: Pilottest af to referencegener mir-93 og mir-103. Forsøg 10: Pilottest af tre referencegener mir-23, -30 og 425. Forsøg 12: Pilottest af to referencegener og let-7i. Forsøg 13: Test af seks referencegener + to kontroller på 9 pre-post patienter. (fire PCR-analyser i alt) Forsøg 14: Test af mir-375 på 9 pre-og postoperative DM2 patienter Udførelse af forsøg qpcr-analyse optimering ecreting NIT-1 cells by repressing Forsøg 7: Optimering af RNA-input myotrophin vha. 4 µl RNA-input (V1) protein til cdnasyntesen. expression Int J Clin Exp Pathol 2010, 3(3); Forsøg 8: Mindskning af replikaternes CV% vha. robot afpipettering + pilottest af referencegen mir-124 [15] Exiqon; mircury TM RNA Isolation Kit - Biofluids protokol: Forsøg 9: Mindskning af replikaternes CV% vha. 20 µl PCRreaktion + pilottest af referencegen /Scientific/RNA-Isolation-biofluidsmanual.pdf mir-423 og mir-191 [16] Forsøg Gallagher 11: Optimering ML, Burke af RNA-input WF Jr. et vha. tilsætning af carrier-rna til al oprensningen Carrier RNA af mirna. enhancement of recovery of DNA from dilute solutions. Biochem Biophys Res Commun. 1987; 144(1): s [17] Spin-colunm 1 (billede, figur 2)): 20
21 Udførelsen af forsøget foregår i 3 step: Oprensning af mirna, cdna-syntese og qpcramplifikation. Step 1 - mirna oprensning (isolation af mirna) Der blev i alt foretaget 5 oprensninger på 9 forskellige patienter (se patienter, bilag 2). Overblik over udførte oprensninger: Opr. 1: 17/02. Patient 1: 2 prøver (pre + post). Anvendt i forsøg 1. Opr. 2: 05/03. Patient 1: 2 prøver (pre + post). Tilsætning af spike-in kit. Anvendt i forsøg 2-10 og Opr. 3: 19/03. Patient 1: 2 prøver (pre + post). Tilsætning af carrier-rna. Anvendt i forsøg 11. Opr. 4: 25/03. Patient 2-5: 8 prøver (pre + post). Brugt i forsøg Opr. 5: 27/03. Patient 6-9: 8 prøver (pre + post). Brugt i forsøg En oprensning á 50 µl RNA kan bruges til flere cdna-syntese reaktioner, da der kun bruges 2-4 µl oprenset RNA til én cdna-syntese reaktion. Derfor er én oprensning brugt i flere forsøg. Udførelse af oprensning: Exiqon har lavet en standardprotokol for udførelse af mircury TM RNA Isolation Kit - Biofluids. Jeg følgede samme protokol [15]: Forbehandling Generelt ved første gang brug af isolationskittet (udført ved opr.1) rdnase: 3 ml buffer afpipetteres til rdnase tuben, og derefter frosset ned i 6 portioner á 500 µl for at undgå fremtidig fryse/optø ved brug af af blandingen. 20 ml Wash Solution 2 blandes med 80 ml 99% ethanol. Opbevares ved stuetemperatur. Generelt ved første gang brug af spike-in kittet (udført ved opr. 2) Spike-in kittet bliver re-suspenderet ved tilsætning af 80 µl vand, og derefter udportioneret i 8 portioner af á 10 µl for at undgå fremtidig fryse/optø ved brug af blandingen. 21
22 Fremgangsmåde Efter optøning af patientprøver centrifugeres disse ved 3000 x g i 5 min 200 µl supernatant fra patientprøven (serum) overføres til en Collection Tube. 60 µl af Lysis Solution BF tilsættes til supernatanten. hvirvles i 5 sek. og inkuberes derefter i 3 min ved stuetemperatur. Opr. 2,3,4 og 5: tilsætning af 1µl spike-in kit pr. 60 µl Lysisbuffer. Afhængig af hvor mange prøver der oprenses fremstilles et premix af spike-in + Lysis Buffer BF. Eks.: 2 prøver: 2µl spike-in + 120µl Lysis buffer BF. Der udportioneres derefter 61µl til hver prøves supernatant. Opr 3: tilsætning af 1,2 µl Carrier-RNA kit pr. 60 µl Lysisbuffer. Afhængig af hvor mange prøver der oprenses fremstilles et premix af spike-in + Lysis Buffer BF. Eks.: 2 prøver: 2,4µl Carrier-RNA µl Lysis buffer BF. Der udportioneres derefter 63,4 µl (1µl spike-in også tilsat) til hver prøves supernateant Der afpipetteres 20 µl Protein Precipitation BF. Prøven hvirvl i 5 sek. og inkuberes 1 min ved stuetemperatur. Prøven centrifugeres derefter i 3 min ved 11,000 x g Supernatant overføres til en ny tube (2 ml) Der afpipetteres 270 µl Isopropanol. Prøven hvirvles i 5 sek. Der placeres en MicroRNA Mini Spin Column i en ny Collection tube og derefter afpipetteres supernatanten fra den anden tube heri. Prøven centrifugeres i 30 sek. ved 1000 x g Der afpipetteres 100 µl Wash Solution 1 BF til Mini Spin Column og der centrifugeres derefter igen i 30 sek. ved x g Der afpipetteres 700 µl Wash Solution 2 BF til Mini Spin Column og der centrifugeres derefter igen i 30 sek ved x g Der afpipetteres 250 µl Wash Solution 2 BF til Mini Spin Column og der centrifugeres derefter i 2 min ved x g. MicroRNA Mini Spin Column flyttes til en ny Collection tube på 1 ml. Der afpipetteres 50 µl RNAse fri vand direkte på membranen af Mini Spin Column. Prøvem inkuberes i 1 min og til sidst centrifuger ved x g. 22
23 Step 2- cdna-syntese 2 µl eller 4 µl oprenset mirna (fra step 1.) bruges til cdna-syntesen. Forsøget er forsat ved at følge protokollen for mircury LNA TM Universal RT microrna PCR. Jeg følger samme protokol [20]: Forbehold og forbehandling Reagenserne til forsøget optøs og holdes derefter på is gennem hele forsøget. Forbehandling af spike-in: RNA-spike-in template (som følger med i Universal cdna synthesis kit II ) re-suspenderes ved at afpipettere 80 µl nuklease vand til tuben. Derefter bliver blandingen udportioneret i 8 portioner af á 10 µl for at undgå fryse/optø ved fremtidig brug af blandingen Enzyme Mix tages ud af fryseren umiddelbart lige før brug. Alle reagenserne centrifugeres inden brug. Fremgangsmåde 5x Reaction buffer, Nuclease-free water, enzyme mix, spike-in template og template RNA blandes på følgende måde pr. prøve: Reagenser Volume RT reaction, µl 5x Reaction buffer 2 Nuclease-free water Enzyme mix 1 Spike-in template () 0,5 Template RNA (fra oprensning, Step 1) 2 (eller 4) Total 10 4,5. (2,5 ved 4 µl RNA input) Ved flere prøver Afhængig af hvor mange prøver der skal analyseres dannes et premix af Reaction buffer, Nucleasefree water, Enzyme mix og spike-in template (). Denne premix sættes på is. Bagefter udportioneres den samlede volumen 6 µl eller 8 µl (afhængig af RNA-input) i x antal tubes. Til sidst afpipetteres 2 eller 4 µl mirna (RNA input) fra hver prøve til x antal 6 µl eller 8µl udpotioneret premix. Prøverne centrifugeres inden varmebehandling. 23
24 Eks. på premix: Fremstilling af premix til 2 forskellige patientprøver med 2 µl RNA-input. Det 10 % overskydende volumen skal sikre tilstrækkelig udportionering af 8 µl premix. 5x Reaction buffer: 2x 2 µl + 10% Nuclease-free water: 2x 4,5 µl + 10% Enzyme mix: 2x 1µl + 10% Spike-in (): 2x 0,5 µl + 10% Total 4,4 µl 9,9 µl 2,2 µl 1,1 µl 17,6 µl Varmebehandling udført på Peltier Thermal Cycler (Heating block) Prøven/prøverne inkuberes i 60 min ved 42 C Enzymet reverse transkriptase inaktiveres ved opvarmning til 95 C Prøverne nedkøles straks til 4 C Prøvernes fryses ned eller opbevares ved 4 C Step 3- qpcr-analyse: Primerer: 220 µl milleporevand tilsættes det specifikke primer Mix. 9 primere er brugt (se materialer). Blandingen hvirvles og centrifugeres, og sættes på is i minutter inden brug. Primeropløsningen opbevares ved -18 C. ROX ROX bliver leveret fra biofirmaet Life Technoliges i en 25 µmol/l, 50x koncentration. For at finde ud af hvor mange µmol/l ~ µm ~ nm ROX indeholder er følgende udregning fortaget: 25µmol/l ~ 0, µmol/µl ~ 0, µmol/50µl ~ 0, µmol/µl ~ 0,5 µmol/l ~ 0,5 µm ~ 500 nm. Exiqon oplyser anbefalet mængde af ROX i nm så derfor var denne udregning nødvendig. For at fortynde ROX ned i lavere koncentrationer med milleporevand er følgende udregning foretaget: 50 nm: 500 nm/50 = 1:10 40 nm: 500 nm/40 = 1:12,5 30 nm: 500 nm/30 = 1:16,7 24
25 20 nm: 500 nm/20 = 1:20 ROX anbefaler man bruger 1 µl per 50 µl PCR reaktioen. Mængde af ROX der skal bruges til en bestemt PCR reaktion er følgende: 0,2 µl ROX per 10 µl reaktion, 0,3 µl per 15 µl reaktion og 0,4 µl per 20 µl reaktion. Den bestemte koncentration og mængde af ROX bliver afpipetteret til premix (se senere). Generelt cdna, Nuclease-free vand, primere og Green Master mix sættes på is i min. Reagenser og prøver holdes på is gennem hele forsøget og må ikke udsættes for lys. Reagenserne hvirvles og centrifugeres inden brug. Fremgangsmåde cdna fra (step 2) fortyndes 1:40 med millporevand (eks. 1 µl cdna + 39 µl vand). Afhængig af hvor mange PCR-reaktionener der skal køres dannes det samlede volumen fortyndet cdna. Eks.: 8 reaktioner af 4 µl cdna skal bruge 32 µl fortyndet cdna (10 µl PCR-reaktion). I dette eks. er 1µl cdna + 39µl vand derfor tilstrækkeligt. Overskydende cdna kan opbevares ved -80 grader til evt. senere forsøg. Til dette projekt er både anvendt PCR-reaktioner á 10µl, 15 µl og 20 µl 10 µl PCR reaktion 15 µl PCR reaktion Master mix 5 µl Master mix 7,5 µl Primer mix 1 µl Primer mix 1,5 µl Fortyndet cdna 4 µl Fortyndet cdna 6 µl ROX 0,2µl ROX 0,3 Total 10,2 µl Total 15,3 µl 20 µl PCR reaktion Master mix 10 µl Primer mix 2 µl Fortyndet cdna 8 µl ROX 0,4 µl Total 20,4 µl 25
26 Der fremstilles et premix af mastermix + primermix + ROX til hvert mirna der skal analyseres (se bilag forsøgsopsætninger). Volumen af premixet dannes afhængig af hvor mange reaktioner der i alt skal køres (trippelbestemmelser, pre+post osv.). 10% overskydende volumen skal sikre nok premix til hver reaktionen. OBS: Der er ikke udregnet 10% overskydende volumen af ROX konc.. Eks. på premix af 8 reaktioner á 10 µl PCR-reaktioner: Mastermix: 8x 5 µl mastermix + 10 % = 40 5 µl. Primer mix: 8x 1 µl PCR mix + 10 % = 8,8 µl. ROX: 30 nm: 8x 0,2 µl = 1,6 µl 6,2 µl af det samlede premix bliver afpippeteret i 8 brønde. 4 µl fortyndet cdna bliver efter følgende af pippetereret til de 8 udportionerede premix qpcr-amplifikation udført på QauntStudio 6 Flex, Applied Biosystems, Life Technologies. PCR opsætning i det tilhørende softwareprogram [20]: Aktivering af polymerase: 95 C, 10 min. 40 PCR-cyklusser af Denaturation: 95 C, 10 s Anneling: 60 C 1 min Ramp-rate: 1,6 C/s Kvalitetssikring Spike-in reference værdier Syntetiske RNA Spike-ins, og, er fabrikantfremstillede (af Exiqon) oligonukeotider der har til formål at teste kvaliteten af mirna oprensningen, cdna-syntesen og qpcr-reaktionen. En kendt mængde template bliver afpipetteret til oprensningen, og tester hvor godt udbyttet af mirna der er oprenset. En kendt mængde template bliver afpipetteret til cdnasyntesen. tester om der har været elementer fra oprensningen, der har virket hæmmende på cdna-syntesen [20, 26]. Exiqon har på deres hjemmeside oplyst referenceværdierne på de to spike-ins (afbilledet på en figur) [27]. Jeg har aflæst ct-værdien på figuren til at være: Ct-værdi: ca. 34 ved 2 µl RNA-input. Ca. 31 ved 4 µl RNA-input (justeret værdi, se afsnit 3.3.1) Ct-værdi: ca. 18,5 26
27 NTC No Template Control Der er brugt 1 NTC prøve til hvert forsøg. Ved opsætningen af PCR-reaktionerne tilsættes der i én brønd 4 µl vand (i stedet for 4 µl cdna). Primeren der måles i prøven er vilkårlig. NTC prøven tester om der evt. er sket en kontaminering af vandet (der bruges til cdna fortyndingen) eller mastermixet. NTC prøven tester samtidig for dannelsen af primer-dimer i prøven [29]. I begge tilfælde kan resultatet være, at der bliver opformeret uønskede produkter i PCR-reaktionen. Smeltekurveanalyse Efter qpcr-reaktionen er fuldført bliver der udført en smeltekurveanalyse. Da SYBR Green interkalerer mellem alle dobbeltstrengede produkter kan man vha. en smeltekurveanalyse se om uspecifikke produkter er opformeret i qpcr-reaktionen, De uspecifikke produkter har en anden smeltetemperatur end det specifikke produkt man måler, og kan ses som et ekstra fluorescens peak på smeltekurven (se figur 7). Et uspecifikt produkt kan fx være oprenset genomisk dsdna (dobbeltstrenget DNA) fra patientprøven eller dannede primer-dimerere [22,29]. Figur 7. Smeltekurveanalyse [30]. Fluorocenssignalet ses på y-aksen. X-aksen indikerer smeltetemperaturen for det dobbeltstrengede produkt. Den øverste grønne smeltekurve indikerer der kun der amplificeret ét specifikt PCR-produkt i PCR-reaktionen. Den nederste røde smeltekurve indikerer at der amplificeret et uspecifikt produkt (flere toppe). 27
28 2.2.4 Valg af kandidat referencegener til analysering af stabilitet på pre- og postoperative patientprøver Vha. litteratursøgning undesøger jeg hvilke referencegener der evt. kan anvendes som et referencegen til mir-375 qpcr analysen. Kriterierne for et egnet referencegen er at det skal være udtrykt uafhængigt af patientens tilstand. Mange mirna har vist sig at være involveret i DM2 og fedme [1,3], og da der hos patienterne ses en ændring i netop disse to tilstande efter en gastric bypassoperation, udvælger jeg mirna referencegener der ikke er påvirket af DM2 og fedme. Ligeledes har jeg ikke udvalgt mirna der er påvirket af et operativt indgreb [31]. På baggrund min litteraturøgning udvalgte jeg 10 mulige kandidat referencegener (se tabel 3) til mir-375 qpcr-analysen. Kandidat referencegenerne er også valgt på baggrund af andre studiers brug af referencegener til deres forsøg samt anbefalede standard mirna referencegener fra Exiqon. Jeg har så hvidt muligt udvalgt referencegener der ikke er påvirket af DM2 vha. søgning på mir disease databasen Under forsøgsløbet er de udvalgte kandidat referencegener pilottestet sideløbende med optimering. Kravet til om et referencegen er egnet til yderligere analysering er, at det skal have en ct-værdi på under ca. 35 samt være forholdsvis stabilt i den pre- og postoperative prøve Vurdering af resultater ROX Jeg bruger og referenceværdier til at teste hvilken ROX koncentrationen der er mest optimal at anvende til qpcr-analysen. RNA-input til cdna-syntesen Ved øgning af RNA-input til cdna syntesen, vurderer jeg om ct-værdien er blevet lavere (højere konc. af mirna). og mir-103 er brugt til denne vurdering. er samtidig analyseret for at teste om det øgede RNA-input har haft en hæmmende effekt på CDNA-syntesen. Tilsætning af carrier-rna er i forsøg 11 også foretaget med henblik på at øge udbyttet af oprenset mirna, således ct-værdien bliver lavere. PCR-reaktion variation af replikater Følgende forsøg er udført på at mindske variationen af replikater: Forsøg 8: Automatisk robotafpipettering. Forsøg 9: Øgning af PCR-reaktionsvolumen fra 10 µl til 20 µl. 28
29 Desuden er det udregnet om tilsætning af carrier-rna, i forsøg 11, har haft en negativ indflydelse på variationen af replikaterne. Variationen af replikaterne er i alle tilfælde udregnet i CV%:. Derefter er middelværdien udregnet for alle af de enkelte CV% afhængig hvilket opsæt der er brugt (10 µl, robotafpippetering osv.) (se bilag 1). 10 µl Robotafpipet- 20 µl Carrier-RNA (standard) tering Enkelte CV% er udregnet i Forsøg 6 og 7 Forsøg 8 Forsøg 9 og 10 Forsøg 11 Anvendte replikater til udregning af enkelte CV% 7x4 2x2 og 2x3 1x2 og 7x3 6x3 Tabel 1. CV% af replkater. Middelværdien af alle CV% er udregnet i de 4 PCR-reaktions opsæt. GeNorm GenNorm er et softwareprogram der er designet til at udregne de mest stabile referencegener der er anvendt i et referencegenforsøg [32]. I forsøg 13, som er referencegenforsøget i dette projekt, måles stabiliteten af alle referencegener samt de to spike-in kontroller på 9 patienter. Prøvernes ct-værdier (middelværdi af replikater) overføres (kopieres) til GeNorm (se bilag 3). GeNex (program der indeholder GeNorm) udregner automatisk ct-værdier om til relative værdier, som er påkrævet som resultatinputværdier til GeNorm [33]. Mest stabile målegen GeNorm benytter en algoritme, der måler den parvise variation, V, mellem to gener. Log 2 tages til ratioen mellem to gener i hver prøve, og V er SD af alle prøver log 2 ratio (se tabel 2). Stabilitet, M, udregnes for det enkelte gen ved at tage gennemsnittet af V i alle de kombinationer hvor genet indgår. Genet med højeste m-værdi (højeste middelværdi af V størst variation) bliver efterfølgende ekskluderet fra forsøget (de beholder deres udregnede m-værdi), og en ny udregning af m-værdierne for de tilbageværende referencegener udregnes. Dette fortsættes indtil der kun er to referencegener tilbage, og derfor har de sidste to referencegener altid den samme m- værdi. Til sidst rangeres referencegenerne fra mest ustabilt til mest stabilt på baggrund af deres m- værdier. Jo lavere m-værdi desto mere stabilt er genet [32]. 29
30 Eks. Gen A Gen B Udregning af V Prøve 1 a1 b2 log2(a1/b1) Prøve 2 a2 b2 log2(a2/b2)... Prøve n an bn log2(an/bn) Tabel 2. Middel af V AB +, V AC + V AD.= M-værdi af gen A. Manuel omregning til reaktive værdier SD = V for gen A og B Inden jeg udregner en normaliseringsfaktor er det nødvendigt at udregne alle mine ct-værdier om til relative værdier (kvantitativ data). Dette gøres på følgende måde: (mindstect prøvect) Q = E Q: er relativ Ct-værdi E: amplifikation effektivitet (er ikke udregnet i dette projekt). E er sat til 2 som er 100% effektivitet. Den laveste relative ct-værdi af de 18 prøver er sat til 1, og de relative ct-værdier er derefter udregnet efter overstående ligning [34]. Dette er gjort for alle referencegener + målegenet (mir- 375). Antal referencegener til normalisering Jeg har manuelt udregnet hvor mange referencegener som er bedst egnet til normalisering af mir- 375 analyseresultater. Princippet er udregning af den parvise variation mellem normaliseringsfaktorer [32]. Ved at udregne den geometriske middelværdi af mindst to geners relative ct-værdier findes en normaliseringsfaktor, NF, for hver af de 18 prøver. På baggrund af de forinden rangerede referencegener udregnes først NF for de to mest stabile gener, NF n. Derefter lægges det næste gen i rækken (af mest stabile referencegener) til, NF n+1. Den parvise variation bliver nu udregnet mellem NF n og NF n+1 på samme måde som i tabel 1 (SD af log 2 (NF n /NF n+1 ) af alle prøver) (se bilag 3). Den parvise variation betegnes som V n /V n+1. Hvis V n /V n+1 er blevet mindre ved at lægge et ekstra mindre stabilt gen til i ligningen har det optimeret normaliseringsfaktoren 30
31 [34]. GeNorm har samtidig sat en anbefalet V n /V n+1 værdi på mindst 0,15. Hvis fx V 2/3 er 0,25 er det nødvendigt at bruge mindst tre referencegener til udregning af normalieringsfaktoren. Hvis derimod V 3/4 er 0,14 er det ikke nødvendigt at bruge fire referencegener til udregning af normaliseringfaktoren, da forholdet mellem at bruge tre og fire referencegener i dette eksempel kun er på 0,14. mir-375 normalisering Efter udregning af hvilke referencegener der er mest stabile og det optimale antal referencegener til udregning af NF, normaliserer jeg mine mir-375 resultater fra forsøg 14. Dette gør jeg ved at tage forholdet af hver prøves mir-375 analyseresultat og prøvens tilsvarende NF [34]: Normaliseret mir-375 prøve x: Egen vurdering af referencegen Som supplering til GeNorm s resultater har jeg selv opsat et overblik over stabiliteten af de enkelte gener (se bilag 3). Jeg vurderinger om delta pre-post forskellen på hver af de 9 patienters prøver er acceptabel. Jeg har fastlagt nogle subjektive grænser for delta pre-post forskellen af hver af prøverne: Under 0,500: acceptabel Under 1,000: god (under overvejelse) Over 1,000: ikke acceptabel Etiske overvejelser Prøver til projektet er fra biobank på Hvidovre Hospital. Prøverne er anonymiseret og projektet er godkendt af videnskabsetisk komite, Region Hovedstaden. 31
32 Ct-værdi Niklas Follend Lauritsen Resultater 3.1 Udvalgte kandidat referencegener Referencegener Reference mir-16a [36,37] mir-23a [41] mir-30c [41] mir-93-5p [36,40] mir-103a-2-5p [41] mir-124-3p [41] mir-191-5p [40] mir-423-5p [40] mir-425-3p [40] Let-7i [39] Tabel 3. Referencegener der er udvalgt på baggrund af litteratursøgning og anbefalede referencegener fra Exiqon. 3.2 ROX ROX testet ved forskellige koncentrationer Test af optimal ROX koncentration ved 5 forskellige koncentrationer. er anvendt til alle af de fremviste resultater. Resultater er middelværdi af replikater og er fra forsøg 3 og 4. 30,5 ca. 18,5 20,1 18,4 20,0 19,3 referenceværdi 20 nm 30 nm 40 nm 50 nm 500 nm Figur 8. Sammenligning referenceværdi fra Exiqon (rød søjle) med ved forskellige tilsatte koncentrationer (blå søjler). Anvendte ROX koncentrationer er angivet på x-aksen og resultatet er angivet i ct-værdi ovenover den enkelte ROX konc. respektive søjle. 32
33 Ct-værdi Niklas Follend Lauritsen Validering af ROX ved 30 nm koncentration ROX ved brug 30nM koncentration. Resultater er middelværdi af replikater og er fra forsøg 5. Èn outlier fjernet (høj ct-værdi 37,5) ca , ca. 18,5 18, referenceværdi referenceværdi Figur 9. ROX ved 30 nm konc. (blå søjler). og referenceværdi fra Exiqon (røde søjler) er angivet for sammenligning. 3.3 Optimering af RNA-input µl RNA-input til cdna-syntesen mir µl 4 µl Figur 10. Sammemligning af 2 µl- og 4 µl RNA-input. mir-103 (blå linje) ct-værdi er middelværdien af replikater med brug af henholdsvis 2 µl- og 4 µl RNA-input til cdna-syntesen. Resultater er fra henholdsvis forsøg 6 og 7 Forskel i Ct-værdi: 2 µl 4 µl 34,1-28,7 = 5,4. (rød linje) ct-værdi er middelværdien af replikater med brug af henholdsvis 2 µl- og 4 µl RNA-input til cdna-syntesen. Resultater er fra henholdsvis forsøg 5 og 7. Forskel i Ctværdi: 2 µl 4 µl 34,5-31,2 = 3,3. Rød linje viser ændringen af ct-værdi og blå linje viser ændringen af mir-103 ct-værdi. kontrol er i forsøg 7 udregnet til 18,6 (ikke vist på figur). 33
34 3.3.2 Tilsætning af carrier-rna Resultater fra forsøg 10 og pre post mir-30 pre mir-30 post mir-425 pre mir-425 post Uden carrier Med carrier Figur 11. Tilsætning af carrier-rna. Blå søljer er resultater fra forsøg 10 (uden carrier-rna), og lilla søjler er resultater fra forsøg 11 (med carrier-rna). Ct-værdierne er angivet på y-aksen. 3.4 Mindskning af CV% af replikater 10 µl Robotafpipettering, 10 µl Carrier RNA, 20 µl 20 µl 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Middeværdi af alle målte CV% af replikater Figur 12. Middelværdien af alle de enkelte udregnede CV% fra hver af de 4 forskellige PCR-reaktions opsæt. 34
35 M-værdi Niklas Follend Lauritsen Valg af reference gener Ekskludering af referencegener i forsøgsforløbet Forsøg 8: mir-93 ekskluderes. Forsøg : mir-124 ekskluderes. Forsøg 11: mir-191 ekskluderes. Forsøg 12: mir-425 ekskluderes. De resterende seks mirna referencegener,,, mir-30, mir-103, mir-423 og let-7i bliver brugt til udvidet test for stabilitet i forsøg Mest stabile referencergener Overblik over hvilke referencegener der er mest stabile ved udregning af GeNorm. og mir- 30 har den mest stabile med en m-værdi på 0,60. Patient 4 og 7 resultater er ekskluderet fra forsøget på baggrund af værdier. 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 mir-423 let-7i mir-103 ogmir-30 M-værdi 0,96 0,86 0,80 0,70 0,60 mest ustabile gener < > mest stabile gener Figur 13. Kurven viser de enkelte referencegeners stabilitet fra lav mod høj. Y-akse: m-værdi af referencegen. X-aske: seks anvendte referencegener i forsøg
Laboratorieprotokol for manuel isolering af DNA fra 0,5 ml prøve
Laboratorieprotokol for manuel isolering af DNA fra 0,5 ml prøve Til isolering af genomisk DNA fra indsamlingssætserierne Oragene - og ORAcollect. Du kan finde flere sprog og protokoller på vores webside
Læs mereGAPDH PCR modul Manual
GAPDH PCR modul Manual Katalog nr. 166-5010EDU explorer.bio-rad.com Kopiering kun tilladt til undervisningsbrug Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende
Læs merePCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA
PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA PCR til at opkopiere bestemte DNA-sekvenser i en prøve er nu en af genteknologiens absolut vigtigste værktøjer. Peter Rugbjerg, Biotech Academy PCR (Polymerase
Læs mereTest dit eget DNA med PCR
Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA sekvens,
Læs mereProtokol for genetisk bestemmelse af ABO blodtyper
Page1 Udarbejdet i samarbejde mellem: Kåre Lehmann, Annabeth Høgh Petersen, Anne Rusborg Nygaard og Jørn M. Clausen Page2 VIGTIGT: SKIFT PIPETTE SPIDSER/TIPS EFTER HVER GANG!! Så undgår du at forurene
Læs mereAppendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning. Faktor mellem total antal celler og antal celler der ønskes udsås:
Appendix Appendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning Fortyndingsfaktor: Efter trypsinering og centrifugering af celler fra cellestokken, opblandes cellerne i 1 ml medie. For at lave en
Læs mereDNA origami øvelse DNA origami øvelse
DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der
Læs mereDNA origami øvelse. Introduktion. DNA origami øvelse 3 timer 2018
DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der
Læs mereValiditetserklæring for NPU02497 P-Insulin;stofk.
Valideringsperiode: December2010- Januar 2011 Arbejdsgruppe: Udstyr: Specialist bioanalytiker Britta Lende Poulsen Bioanalytiker underviser Britta Nielsen Kvalitetsleder Karin Heidemann Advia Centaur XP
Læs mereVelkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere:
Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin,
Læs mereTest dit eget DNA med PCR
Test dit eget DNA med PCR Forsøgsvejledning Navn: Side 1 af 7 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA
Læs mereSpm. A: Hvad viser data i Figur 1?
Opgave 1 Leptin er et plasma proteinhormon der primært produceres af og secerneres fra fedtceller (adipocytter). Leptin, der er kodet af ob (obecity) genet, er 16 kda stort. Leptins fysiologiske funktion
Læs mereTest dit eget DNA med PCR
Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA-sekvens,
Læs mereTest dit eget DNA med PCR
Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA
Læs mereDNA origami øvelse 2013. DNA origami øvelse
DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der
Læs mereTest dit eget DNA med PCR
Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA-sekvens,
Læs mereEn forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et:
F2011-Opgave 1. En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: Forward primer: 5 CC ATG GGT ATG AAG CTT TGC AGC CTT
Læs mereBiotechnology Explorer
Biotechnology Explorer Oprensning af genomisk DNA fra plantemateriale Manual Katalog nr. 166-5005EDU explorer.bio-rad.com Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen, Nærum Gymnasium, februar 2009
Læs mereKvalitetskontrol i molekylærbiologisk rutinediagnostik
i molekylærbiologisk rutinediagnostik Respirationsvejsvirus som model Mette Høgh, cand. scient, ph.d. Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hvidovre Hospital Mette.hoegh@hvh.regionh.dk Oversigt Introduktion
Læs mereDNA origami øvelse DNA origami øvelse
DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der
Læs mereVestsjællands Amtssygehus Klinisk Biokemisk Afdeling Centralsygehuset i Slagelse
Bilag D Vestsjællands Amtssygehus Klinisk Biokemisk Afdeling Centralsygehuset i Slagelse INTERN RAPPORT Afprøvning af Immunofixation af M-komponenter (Bestemmelse af immunoglobulin-klasse og -type) på
Læs mereBiomarkører ved neurologiske sygdomme. Thomas Christensen
Biomarkører ved neurologiske sygdomme Thomas Christensen Biomarkører ved neurologiske sygdomme Identificere diagnostiske og prognostiske biomarkører for neurologiske sygdomme Biobank oprettet Samarbejde
Læs mereB i o k e m i ø v e l s e 1 Regulatoriske mekanismer i det intermediære stoftskifte Udarbejdet af: Matilda Lantz og Elif Bayram
Regulatoriske mekanismer i det intermediære stoftskifte Udarbejdet af: Matilda Lantz og Elif Bayram Dato: 20. November 2011 Underskrifter: Godkendt: Dato Regulatoriske mekanismer i det intermediære stofskifte
Læs mereOPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6.
OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6. Bachelorprojekt Udarbejdet af Sandra Reinholt Nielsen 14.08.1981 Projektperiode: 6. April 9.juni 2009 Vejledere: Søren Jensen, Lektor, Professionshøjskolen
Læs mereDeltagermateriale 43230 OGM. PCR-teknikker 1
Deltagermateriale 43230 OGM PCR-teknikker 1 POLYMERASE KÆDE REAKTION (PCR) Indholdsfortegnelse 04/02 2 af 36 1. INDLEDNING... 4 DNA's opbygning... 5 DNA-replikation.... 7 2. PCR METODEN... 10 PCR en oversigt...
Læs mereRegulatoriske mekanismer i energistofskiftet
Regulatoriske mekanismer i energistofskiftet Regulatoriske mekanismer i energistofskiftet Resultatskemaer: Biopsi Muskel- 0 Muskel- 1 Muskel- 2 Muskel- 3 Vægt [g] 1,32 1,82 1,35 1,58 PCA tilsat [ml] 12,42
Læs mereCYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm)
Opgave 1 Leveren spiller en central rolle i lipid metabolismen og i opretholdelse af lipid homeostasen i hele kroppen. Lipidmetabolismen er fejlreguleret hos blandt andet svært overvægtige personer samt
Læs mereRegnskovens hemmeligheder
Center for Undervisningsmidler, afdeling København Regnskovens hemmeligheder Øvelsesvejledning Formål Et gen for et kræfthelbredende protein er blevet fundet i nogle mystiske blade i regnskoven. Forskere
Læs mereartus EBV QS-RGQ-kit Ydelsesegenskaber Maj 2012 Sample & Assay Technologies Analysefølsomhed plasma artus EBV QS-RGQ-kit, Version 1,
artus EBV QS-RGQ-kit Ydelsesegenskaber artus EBV QS-RGQ-kit, Version 1, 4501363 Kontroller, om der er nye revisioner med elektronisk mærkning på www.qiagen.com/products/artusebvpcrkitce.aspx inden udførelse
Læs mereBiologi opgave Opsamling: Cellebiologi (Bioanalytiker modul3)
1 Delphine Bonneau Biologi opgave Opsamling: Cellebiologi 1-6 Pelle har spist en kæmpe stor kage, og efterfølgende stiger hans blodsukker. Derfor sender kroppen besked til de endokrine kirtler i bugspytkirtlen
Læs mereAndrostenon-indol-skatol-protokol.
Androstenon-indol-skatol-protokol. Indholdsfortegnelse: 1. Formål side 2 2. Teori side 2 2. Prøvebehandling side 2 3. Materialer side 2 3.1 Apparatur side 2 3.2 Kemikalier side 3 3.3 Reagenser side 3 4.
Læs mereTissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP
August 2015 QIAsymphony SPprotokolark Tissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP Dette dokument er Tissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP QIAsymphony SPprotokolark, R2, til kitversion 1. QIAsymphony
Læs mereSpm. 1.: Hvis den totale koncentration af monomer betegnes med CT hvad er så sammenhængen mellem CT, [D] og [M]?
DNA-smeltetemperaturbestemmelse KemiF2-2008 DNA-smeltetemperaturbestemmelse Introduktion Oligonucleotider er ofte benyttet til at holde nanopartikler sammen med hinanden. Den ene enkeltstreng er kovalent
Læs mereStatusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik
Bilag 2 Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik ved forsker Mogens Nicolaisen, Danmarks JordbrugsForskning,
Læs mereSOP for håndtering af standardsæt blod Regionernes Bio- og GenomBank
SOP for håndtering af standardsæt blod Regionernes Bio- og GenomBank Introduktion Følgende standard operating procedure (SOP) beskriver arbejdsgangen i forbindelse med indsamling og håndteringen af blod
Læs mereKRIMINALDETEKTIVEN GERNINGSSTEDETS GÅDE PCR
KRIMINALDETEKTIVEN GERNINGSSTEDETS GÅDE Elevvejledning PCR PCR trin for trin PCR involverer en række gentagne cykler, der hver består af følgende tre trin: Denaturering, primer påsætning og forlængelse
Læs mereVelkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Sebastian, Louise og Ana
Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Sebastian, Louise og Ana Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Dagens program 9:00 10:00 Introduktion
Læs mereOptimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik
Afgangsprojekt for Den Sundhedsfaglige Diplomuddannelse Professionspraksis Optimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik Et kvalitetsudviklingsprojekt Udarbejdet
Læs mere[BESØGSSERVICE INSTITUT FOR MOLEKYLÆRBIOLOGI OG GENETIK, AU]
Enzymkinetik INTRODUKTION Enzymer er biologiske katalysatorer i alle levende organismer som er essentielle for liv. Selektivt og effektivt katalyserer enzymerne kemiske reaktioner som ellers ikke ville
Læs mereGener, biologiske markører og valg af den rigtige behandling
Gener, biologiske markører og valg af den rigtige behandling Et spørgsmål om at udnytte viden, teknologi og sundhedsresurser optimalt Vi oplever i disse år en sand revolution i udviklingen af nye teknologier
Læs mereMetodevalidering af High Sensitive C- Reaktive Protein
2013/- 2014 Metodevalidering af High Sensitive C- Reaktive Protein BACHELOROPGAVE UGE 41/2013 TIL UGE 01/2014 PH METROPOL KØBENHAVN BIOANALYTIKER UDDANNELSE HEIDI RAVN FØDT: 090277-1972 HOVEDVEJLEDER:
Læs mereBestemmelse af kroppens fysiske tilstand
Bestemmelse af kroppens fysiske tilstand Forsøg udført af Nicolaj Seistrup, Christian Starcke, Kim, mark og Henrik Breddam Rapport skrevet af Henrik Breddam den 2006-10-25 Rapport længde 7 sider Side 1
Læs mereSOP #1, HÅNDTERING AF BLOD
Introduktion Følgende standard operating procedure (SOP) beskriver arbejdsgangen i forbindelse med indsamling og håndteringen af blod til opbevaring i (DRB). Blod tappes fra reumatologiske patienter én
Læs mereBIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU
STUDENTEREKSAMEN 2007 2007-BT-1 BITEKNLGI HØJT NIVEAU Torsdag den 31. maj 2007 kl. 9.00 14.00 Sættet består af 1 stor og 2 små opgaver samt 1 bilag i 2 eksemplarer. Det ene eksemplar af bilaget afleveres
Læs mereDet Teknisk-Naturvidenskabelige Fakultet
Analyse af geners ekspressionsprofil i arkiveret lymfoidt materiale: Undersøgelse af metode til kvalitetsbaseret udvælgelse af tumorvæv, der er fikseret i formalin og indstøbt i paraffin Afgangsprojekt
Læs mereGener, biologiske markører og valg af den rigtige behandling. Et spørgsmål om at udnytte viden, teknologi og sundhedsresurser optimalt
Gener, biologiske markører og valg af den rigtige behandling Et spørgsmål om at udnytte viden, teknologi og sundhedsresurser optimalt Vi oplever i disse år en sand revolution i udviklingen af nye teknologier
Læs mereValiditetserklæring for NPU04073 P-Homocystein;stofk.
Valideringsperiode: April Maj 2011 Arbejdsgruppe: Udstyr: Specialist bioanalytiker Britta Lende Poulsen Bioanalytiker Birgitte Riber Christoffersen Kvalitetsleder Karin Heidemann Advia Centaur XP Serienummer:
Læs mereBiotechnology Explorer
Biotechnology Explorer Genes in a Bottle Kit DNA Extraction Module Lav et halssmykke med dit eget DNA Katalognr.: 166-2000EDU Dertil kan man købe ekstradele, hvis der skal laves halskæder til eleverne.
Læs mereVidenskabsetisk komite og biobanker. Dansk Selskab for Good Clinical Practice 28. januar 2015 Lone Gundelach
Videnskabsetisk komite og biobanker Dansk Selskab for Good Clinical Practice 28. januar 2015 De videnskabsetiske komiteer Anmeldelsespligtigt: Forsøg hvor man ønsker at opnå viden om menneskets biologi
Læs mereValiditetserklæring for NPU27547 P-Thyrotropin (TSH); arb. stofk.
Valideringsperiode: Januar 2011 Arbejdsgruppe: Udstyr: Specialist bioanalytiker Britta Lende Poulsen Bioanalytiker underviser Britta Nielsen Kvalitetsleder Karin Heidemann Advia Centaur XP Serienummer:
Læs mereØvelse med tarmkræftceller i kultur.
Øvelse med tarmkræftceller i kultur. Baggrund Hver 3. dansker bliver ramt af kræft, inden de er blevet 75 år. Tyktarmskræft er den 3. hyppigste kræftform hos både mænd og kvinder, hvor henholdsvis 7.3
Læs mereDette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia.
Transformation af E.coli K 12 Version 3. marts 2009 (C) Claudia Girnth-Diamba og Bjørn Fahnøe Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages
Læs mereQIAsymphony RGQ-protokolark
QIAsymphony RGQ-protokolark Indstillinger til kørsel af artus CT/NG QS- RGQ-kittet (Rotor-Gene Q-software.) Kontroller, om der er nye reviderede udgaver af elektronisk mærkning på www.qiagen.com/products/artusctngqsrgqkitce.aspx,
Læs mereValiditetserklæring for NPU19923 P-troponin I, hjertemuskel;massek.
Valideringsperiode: Marts April 2011 Arbejdsgruppe: Udstyr: Specialist bioanalytiker Britta Lende Poulsen Bioanalytiker underviser Britta Nielsen Kvalitetsleder Karin Heidemann Advia Centaur XP Serienummer:
Læs mereForsøgsprotokol til larveforsøg: Tilsætning af 3 dage gamle larver til gødning inficeret med patogene bakterier
Forsøgsprotokol til larveforsøg: Tilsætning af 3 dage gamle larver til gødning inficeret med patogene bakterier Formål: at undersøge udviklingen i mængden af tilsatte patogene bakterier til hønsegødning.
Læs mereHvad er en biobank? Hvad skal vi forvente af regionernes biobanker? Hvorfor har og får de en rolle?
Hvad er en biobank? Hvad skal vi forvente af regionernes biobanker? Hvorfor har og får de en rolle? Estrid Høgdall Regionernes Biobank Sekretariat Patologiafdelingen, Herlev Hospital Biobank har en rolle
Læs mereKønsbestemmelse af foster ved blodprøve fra mor
Kønsbestemmelse af foster ved blodprøve fra mor - Optimering og validering af qpcr bestemmelse af YRS (Y-chromosome Repetetive Sequence) på cellefrit føtalt DNA oprenset fra maternelt plasma https://www.linkedin.com/pulse/20141006141514-218661923-is-no-result-on-maternal-fetal-dna-a-pregnancy-marker
Læs mereMetodeblad for P-Insulinantistof
Quality Sheet Metodeblad for P-Insulinantistof C2 Ensure and Monitor Customer and Stakeholder Satisfaction Metodeblad for P-Insulin-antistof; arb.stofk.(proc.) Indikation Forberedelse af patient Præanalytiske
Læs mereNitrat sticks AquaChek 0-50 Bilag 3 Nitrat sticks
Notat SEGES P/S SEGES Planter & Miljø Test af måleudstyr til måling af nitrat i drænvand Ansvarlig KRP Oprettet 12-10-2016 Projekt: [3687, TReNDS] Side 1 af 5 Test af måleudstyr til måling af nitrat i
Læs mereVidenskabsetisk komite og biobanker. Dansk Selskab for Good Clinical Practice 3. november 2014 Lone Gundelach
Videnskabsetisk komite og biobanker Dansk Selskab for Good Clinical Practice Forskningsbiobank Samling af personhenførbart biologisk materiale Indgår som integreret del af konkret forskningsprojekt Opbevares
Læs mereSiemens Healthcare Diagnostics Inc. Dato: 23. april 2013. Vigtig information om DCA HbA1c reagenskit, varenummer 6162000.
Dato: 23. april 2013 Vigtig information om DCA HbA1c reagenskit, varenummer 6162000. Siemens Healthcare Diagnostics er glade for at kunne introducere en ny anvendelse af Hæmoglobin A1c reagenset til DCA
Læs mereTestet i udlandet. Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 11-11-2013. Forfatter: Janus Vang, Ph.D.
11-11-2013 Testet i udlandet Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 Forfatter: Janus Vang, Ph.D. ANSVARLIG: REGIN W. DALSGAARD, BESTYRELSESFORMAND FOR VINNUFRAMI INTRODUKTION Færøernes
Læs mereEksamen den 7. april 2006. Cellulær og Integrativ Fysiologi
1 Eksamen den 7. april 2006 Cellulær og Integrativ Fysiologi Sættet indeholder 5 sider. Der må ikke medbringes bøger og noter. Svarene kan være på dansk eller engelsk. Dee er 4 hovedspørgsmål i sættet.
Læs meredobbelt strenget DNA hvor de enkelte nukleotider er komplementære. Tm: Smeltetemperaturen for en given DNA sekvensmængde hvoraf 50% er denatureret.
Titel: Sporadiske DNA mutationer og sensitiviteten af målemetoder. Undertitel: Screening af DNA for sporadiske mutationer stiller store krav til sensitiviteten af de anvendte målemetoder. I en prøve der
Læs mereBIOPAC PROJEKTET Translationel forskning med henblik på nye biomarkører ved pancreas cancer
BIOPAC PROJEKTET Translationel forskning med henblik på nye biomarkører ved pancreas cancer Julia S. Johansen Onkologisk afd. og Medicinsk afd. Herlev Hospital Ten Leading Cancer Types for Estimated New
Læs mere[BESØGSSERVICE INSTITUT FOR MOLEKYLÆRBIOLOGI OG GENETIK, AU]
Enzymkinetik INTRODUKTION Enzymer er biologiske katalysatorer i alle levende organismer som er essentielle for liv. Selektivt og effektivt katalyserer enzymerne kemiske reaktioner som ellers ikke ville
Læs mereOptimering af Real-time High Resolution Melt analyse til detektion af H275Y i Influenza A
Optimering af Real-time High Resolution Melt analyse til detektion af H275Y i Influenza A Af Sacha Piil Haagensen Modul 14 Professionsbachelor 2014 Bioanalytikeruddannelsen K-vejleder: Bioanalytikerunderviser
Læs mereBy- og Landskabsstyrelsens Referencelaboratorium Interferens fra chlorid ved bestemmelse af COD med analysekit
By- og Landskabsstyrelsens Referencelaboratorium Interferens fra chlorid ved bestemmelse af COD med analysekit By- og Landskabsstyrelsen Rapport Februar 2008 Interferens fra chlorid ved bestemmelse af
Læs mereBanan DNA 1/6. Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje.
Banan DNA Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje. Baggrundsviden: Om vi er mennesker, dyr eller planter, så har alle organismer DNA i deres celler.
Læs mereEffekt af resveratrol på UCP2 mrna ved blokering af mtor og SIRT1 signalvejene i INS-1E celler
Integreret speciale projekt i medicinal og molekylærbiologi Udført af Jákup A. Hofgaard Under vejledning af Associate professor Ph.d. Louise T. Dalgaard Associate professor Ph.d. Ole Vang Effekt af resveratrol
Læs mereBiomarkører. Lars P. Nielsen Professor, overlæge Speciallæge i klinisk mikrobiologi, Statens Serum Ins>tut, Biomarkørlaboratoriet. LPN@ssi.
Biomarkører Lars P. Nielsen Professor, overlæge Speciallæge i klinisk mikrobiologi, Statens Serum Ins>tut, Biomarkørlaboratoriet. LPN@ssi.dk Biomarkører Molekyler, som afspejler forekomst og udvikling
Læs mereGenetiske Aspekter af HCM hos Kat. - en introduktion til forskningsprojektet
Genetiske Aspekter af HCM hos Kat - en introduktion til forskningsprojektet Cand. scient. Mia Nyberg, ph.d. stud. mnje@life.ku.dk IMHS, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, Klinisk Biokemisk
Læs mereRumfang af væske i beholder
Matematikprojekt Rumfang af væske i beholder Maila Walmod, 1.3 HTX Roskilde Afleveringsdato: Fredag d. 7. december 2007 1 Fru Hansen skal have en væskebeholder, hvor rumfanget af væsken skal kunne aflæses
Læs mereBrugsanvisning for SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD
1 Producent Brugsanvisning for SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD for DHPLC systemer Læs venligst denne brugsanvisning grundigt igennem, før dette produkt anvendes. Gem denne brugsanvisning til
Læs mereOpgave 1 Listeria. mørkviolette bakteriekolonier, se figur 1a. og b. 1. Angiv reaktionstypen for reaktion. 1 vist i figur 1b.
Opgave 1 Listeria Bakterien Listeria monocytogenes kan være sygdomsfremkaldende for personer, der i forvejen er svækkede. For at identificere Listeria kan man anvende indikative agarplader. Her udnyttes
Læs mereAdnaTest ProstateCancerSelect
AdnaTest ProstateCancerSelect Berigelse af tumorceller fra blod fra prostatacancerpatienter til genekspressionsanalyse Til in vitro-diagnostisk brug Vejledning T-1-520 Indhold Bestillingsinformation...
Læs mereStudienummer: MeDIS Exam 2015. Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen
MeDIS Exam 2015 Titel på kursus: Uddannelse: Semester: Videregående biokemi og medicinudvikling Bachelor i Medis 5. semester Eksamensdato: 26-01-2015 Tid: kl. 09.00-11.00 Bedømmelsesform 7-trin Vigtige
Læs mereBrugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD
1 Producent Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC systemer Læs venligst denne brugsanvisning grundigt igennem, før dette produkt anvendes. Gem denne brugsanvisning til senere
Læs mereBetydning af revision af en DS/EN ISO standard
By- og Landskabsstyrelsens Referencelaboratorium Betydning af revision af en DS/EN ISO standard Bestemmelser af total cyanid og fri cyanid i vand med flow analyse By- og Landskabsstyrelsen Rapport Juni
Læs mereForsvar mod meldug i byg 8/1-07
Forsvar mod meldug i byg 8/1-07 Meldugsvampens angreb på bygplanten aktiverer en række interessante gener der fungerer i reguleringen af plantens forsvar. Modtagelig David B. Collinge, Michael K. Jensen
Læs mereMenneskets væskefaser
Menneskets væskefaser Mennesket består af ca. 60% væske (vand) Overordnet opdelt i to: Ekstracellulærvæske og intracellulærvæske Ekstracellulærvæske udgør ca. 1/3 Interstitielvæske: Væske der ligger mellem
Læs mereTrin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid)
Trin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid) (Denne del tager ca. 3 timer, max 14 prøver) ELEVVEJLEDNING forsøgskasse nr. 1 AAU Oprensning af DNA-prøven foregår gennem fem trin, se figur 1:
Læs mereTeknisk anvisning for marin overvågning
NOVANA Teknisk anvisning for marin overvågning 2.3 Klorofyl a Britta Pedersen H Afdeling for Marin Økologi Miljøministeriet Danmarks Miljøundersøgelser 2.3-1 Indhold 2.3 Klorofyl-a 2.3-3 2.3.1 Formål 2.3-3
Læs mereElevvejledning pglo transformation
Introduktion til transformation Elevvejledning pglo transformation I denne øvelse skal du lære fremgangsmåden ved genetisk transformation. Husk på, at et gen er et stykke DNA, der indeholder informationer
Læs mereVejledning om patientregistrering i DD2 til brug i praksis: Registreringsskema, blod- og urinprøver
December 2018 Vejledning om patientregistrering i DD2 til brug i praksis: Registreringsskema, blod- og urinprøver Brug DD2 s hjemmeside Log på www.dd2.nu med det brugernavn og den adgangskode, som fremgår
Læs mereQIAsymphony SP Protokolside
QIAsymphony SP Protokolside Cellfree500_V3_DSP protokol Generel information Til in vitro-diagnostisk brug. Kit Prøvemateriale Protokolnavn QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit Plasma, serum og CSF Cellfree500_V3_DSP
Læs mereFaktor V Leiden mutation
Faktor V Leiden mutation Formål: finde ud af om individ har mutation i faktor V Leiden gen (missense: arginin glutamin) Materiale: oprens DNA fra leukocytter Metode: PCR med specifikke primere, oprens,
Læs mereValiditetserklæring for NPU01700 P-Cobalamin; stofk.
Valideringsperiode: Marts 2011 Arbejdsgruppe: Udstyr: Specialist bioanalytiker Britta Lende Poulsen Bioanalytiker Birgitte Riber Christoffersen Kvalitetsleder Karin Heidemann Advia Centaur XP Serienummer:
Læs mereDe livsvigtige vitaminer og mineraler af John Buhl www.nomedica.dk
5 Indholdsfortegnelse Forord 6 Indledninig 7 Lidt grundlæggende om vitaminer og mineraler 8 De enkelte vitaminer og mineraler 15 De fedtopløselige vitaminer (A, D, E og K) 16 A-vitamin 16 D-vitamin 19
Læs mereHæmofili A Hæmofili B Von Willebrands sygdom
Koagulationsforstyrrelser Pensum fra bogen Hæmatologi af H. Karle og analyseforskrifterne Arvelige Koagulopatier Erhvervede Koagulopatier Hyperfibrinolyse DICsyndrom Øget Trombose beredskab Analyser Arvelige
Læs mereDiagnosticering af Clostridium perfringens type C infektion i neonatale grise
Diagnosticering af Clostridium perfringens type C infektion i neonatale grise med real-time PCR og ELISA DVHS 3. maj 2013 Speciale af cand.med.vet. Camilla Bjørn Olesen 1 De næste 25 min Baggrund Formål
Læs mereAnvendelse af Enzymer i Fødevarer
SRP-øvelse ved Det Natur- og Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet Anvendelse af Enzymer i Fødevarer Øvelsesvejledning 2013 Henriette Erichsen, Anni Bygvrå Hougaard, Karsten Olsen og Jeanette
Læs mereC V C. Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF-40-02. Revision 2. Juli 2014
DOT131v1 Instructions for Use Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF-40-02 Side 1 af 7 Vejledning i brug af Biofortuna SSPGo TM HLA No Template Control Kit BF-40-02 Revision 2 Juli 2014 DOT131v1
Læs mereSammendrag Den mest effektive måde til at nedbringe forekomst af Salmonella på mørbrad er at undgå kontamination på slagtegangen.
Rapport Optimering af hygiejne ved håndtering af mørbrad 23. december 2015 Proj.nr.:2003021-15 Version 1 VHR/HCH Fedtendeskubber indflydelse på kimtal på mørbrad og i bækkengang Vinnie H. Rasmussen & Hardy
Læs mereDet lyder enkelt, men for at forstå hvilket ærinde forskerne er ude i, er det nødvendigt med et indblik i, hvordan celler udvikles og specialiseres.
Epigenetik Men hvad er så epigenetik? Ordet epi er af græsk oprindelse og betyder egentlig ved siden af. Genetik handler om arvelighed, og hvordan vores gener videreføres fra generation til generation.
Læs mereBioteknologi A. Gymnasiale uddannelser. Vejledende opgavesæt 1. Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40. 5 timers skriftlig prøve
Vejledende opgavesæt 1 Bioteknologi A Gymnasiale uddannelser 5 timers skriftlig prøve Vejledende opgavesæt 1 Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40 Side 1 af 8 sider pgave 1. Genmodificeret ris Vitamin
Læs mereKvægKongres 24. feb. 2014 Den bedste start med den bedste råmælk
KvægKongres 24. feb. 2014 Den bedste start med den bedste råmælk Mette Marie Løkke, Postdoc, Institut for Fødevarer, Aarhus Universitet Rikke Engelbrecht, Kalveekspert, Vestjysk Landboforening Mere fokus
Læs mereEvaluering af Biogas som Bæredygtig Energikilde til Masanga hospitalet
2008 Evaluering af Biogas som Bæredygtig Energikilde til Masanga hospitalet Lars Rønn Olsen DTU biosys Ingeniører Uden Grænser Udarbejdet for Masangas Venner Introduktion Som behovet for bæredygtig energi
Læs mereUdarbejdet af Anna-Alexandra Grube Hoppe
METODER - BIOKEMI For medicinstuderende - Panuminstituttet UDARBEJDET AF ANNA-ALEXANDRA GRUBE HOPPE RESTRIKTIONSENZYM ANALYSE (E: 329-330) Restriktionsenzym analyse er en metode, der bruges til at kortlægge
Læs mereFormål At analysere for myosin i muskelvæv fra fisk ved brug af western blotting
Center for Undervisningsmidler, afdeling København Western blotting Øvelsesvejledning Formål At analysere for myosin i muskelvæv fra fisk ved brug af western blotting Teori Proteomik er studiet af celleproteiners
Læs mere