Metodevalidering af High Sensitive C- Reaktive Protein

Transkript

1 2013/ Metodevalidering af High Sensitive C- Reaktive Protein BACHELOROPGAVE UGE 41/2013 TIL UGE 01/2014 PH METROPOL KØBENHAVN BIOANALYTIKER UDDANNELSE HEIDI RAVN FØDT: HOVEDVEJLEDER: ULLA T. MOL KLINIK VEJLEDER: DORTE HØYER

2 2

3 FORORD Denne bacheloropgave er blevet udført ved Bioanalytikeruddannelsen København i samarbejde med Biokemisk afdeling på Herlev Hospital. Dette projekt er udført i perioden 7. oktober, 2013 til 2. januar, 2014, hvor der blev udført forsøg i laboratoriet i perioden 9. oktober til 31. november, Jeg vil gerne takke mine to vejledere Ulla Tüschow Mol og Dorte Høyer, for god vejledning gennem hele projektet. Jeg vil også rette en tak til personalet på afdelingen for support og støtte, ved udførelse af projektet i laboratoriet, og tak til afdelings bioanalytikeren, Kristina Rasmussen, for friheden til brug af diverse reagenser og forsøgsmateriale. Opgavens faglige niveau er lagt således, at den primært henvender sig til andre bioanalytiker studerende, der har gennemført modul 14 af bioanalytikeruddannelsen eller biokemisk interesserede personer med en faglig baggrund, svarerende til en bachelorgrad i medicinsk laboratorieteknologi. Opgaven forudsætter at læseren har et kendskab til C Reaktivt Proteins opbygning, funktion I teksten skrives kildehenvisninger til artikler og bøger således: [forfatterens efternavn, årstal]. Herefter kan de slås op i litteraturlisten, som er opbygget med en overskrift, der ligner kildehenvisningen. I så fald, der er flere kilder til et givent afsnit, adskilles kilder med ; f.eks. [kilde; kilde; kilde]. Heidi Ravn 3

4 RESUMÈ Formålet: For denne opgave er formålet at udføre en delvis metodevalidering af P- høj Sensitiv C- Reaktive Protein massek; ved at analysere patient prøver på Cobas6000 fra Roche, BN Prospec fra Siemens og Kone30i fra Thermo, og derefter sammenligne resultaterne parvis. Dette vil give et overblik, over om der er en forskel på de tre analyseapparaters måde at analysere hscrp på. Derudover vil projektet undersøge om der kan forekomme antigen excess ved at udsætte hscrp analysen på apparaterne for en prøve med en CRP koncentration > 250 mg/l. Metoder: Der blev ved metodesammenligning analyseret 50 patient blodprøver. Prøverne blev først analyseret på Kone30i og derefter på BN Prospec. Hvorefter det var muligt at sammenligne resultaterne med Cobas6000. Ved linearitetsforsøget blev de udførte fortyndingsrækker dannet ved en sekvens fortynding med apparatets egen dilluent. Der blev anvendt 25 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Ved Intraseriel præcision blev der indsamlet fem blodprøver ved hver koncentration, som var; [0 mg/l], [5 mg/l], [10 mg/l], [1 mg/l] og [3 mg/l], og dannet serum pool, som blev analyseret på Cobas6000, BN Prospec og Kone30i. Ved antigen excess blev der anvendt en høj CRP konc. i en prøve på 270 mg/l. Prøven blev analyseret på Kone30i. derefter Cobas6000 og til sidst analyseret på BN Prospec. Resultat: Metodesammenligning mellem Cobas6000 overfor BN Prospec er der beregnet en skæring på -0,2098, og en hældning på 1,1879. R 2 på 0,9927. resultatet for BN Prospec overfor Kone30i blev der beregnet en skæring på -0,6621, og en hældning på 1,0604, og R 2 på 0,9935. For Cobas6000 overfor kone30i. blev der beregnet en skæring på -0,8954, og en hældning på 1,2626, og en R 2 på 0,9909. Linearitetsforsøget for Cobas6000 er der beregnet en skæring på - 0,0535, og hældning på 0,9749, og en R 2 på 0,9956. For BN Prospec blev beregnet en skæring på 0,4184, og en hældning på 0,9986, og en R 2 på 0,9991. Kone30i Blev beregnet en skæring på 0,504, og en hældning på 1,0091, og en R 2 på 0,9974. Intraseriel præcision blev CV % beregnet for Cobas6000 ved alle fem koncentrationer og lå mellem 0,56 % - 1,92 %. For BN Prospec blev CV % beregnet til 0,94 % til 7,57 %. Og Kone30i lå mellem 1,28 % til 3,52 %. Antigen excess Cobas6000 målte CRP prøven til 355 mg/l, BN Prospec fik et resultat på 276 mg/l og Kone30i målte CRP i prøven til 421 mg/l. Konklusion: Ved metodesammenligning af Cobas6000, BN Prospec og Kone30i vurderes det at der er en forskel i de tre apparaters måde at analysere hscrp på, men der ses en tendens til lineær sammenhæng ved sammenligning parvis af alle tre apparater i det lave område, da R 2 - værdierne ligger tæt på 1, for alle apparaterne når de sammenlignes parvis. Der er ved linearitetsforsøget lineær sammenhæng for alle tre apparater ved analysering af hscrp, da korrelationsværdien var tættest på 1 ved analysering af hscrp på alle tre analyse apparater. Der ses en tendens til at Cobas6000 og BN Prospec måler med en lille forskel, men for alle tre apparater ligger de tæt, i forhold til apparaternes måde at analysere hscrp ved Intraseriel præcision. Det er derfor ikke muligt at vurdere hvilket analyseapparat der analyserer hscrp med den bedste præcision. Ved antigen exces har det ikke været muligt at detektere antigen excess for Cobas6000, BN Prospec eller Kone30i, ved måling af en høj hscrp koncentration på 270 mg/l. 4

5 Indholdsfortegnelse Problembaggrund... 7 Formål... 9 Problemformulering Hypoteser Begrebsdefinitioner Teori C- Reaktivt Protein Analyseprincip Måleprincipper Metodevalg Præanalyse: Etiske overvejelser Metodeopsætning Kvalitets kontrol Kalibrering og kontroller Metodesammenligning Linearitet Intraseriel præcisions Antigen excess Afgrænsning Metode og materialer materialer Apparatur Reagenser Prøvemateriale Metode Kvalitetssikring

6 Metodesammenligning: Linearitet: Intraseriel præcision: Antigen excess Resultater Kvalitetssikring Metodesammenligning Linearitet: Intraseriel Præcisions Antigen excess Diskussion Metodeopsætning og kvalitetssikring Metodesammenligning Linearitet: Intraseriel Præcisions: Antigen excess: Konklusion Perspektivering Referencer Bilag Bilag nr Bilag Nr Bilag Nr Bilag Nr Bilag nr Bilag Nr Bilag Nr

7 Problembaggrund I Danmark er der i år ca danskere, som lever med en kardiovaskulære eller perifere vaskulære sygdomme. Af dem er der ca danskere der har iskæmisk hjertesygdom, som er den hyppigste hjertesygdom i Danmark. Ud af de , er der ca der har haft en akut blodprop i hjertet [1]. Forskning har vist, at infektionsmarkører der afspejler de inflammatoriske processer er forhøjet blandt individer med høj risiko for fremtidig hjertesygdom [2,3]. P- Høj sensitiv C-reaktiv protein; massek er den infektionsmarkør, der har vist sig at være mest stabil som en hjertemarkør, der kan bruges til screening af umiddelbare raske personer i høj risiko gruppe for Cardio vaskulære og perifere vaskulære sygdomme[1]. Men også for patienter ved tidlig indledning af aterosklerotiske trombose i arterierne, samt emboli af trombose, der resulterer i hjerteanfald og alt for ofte, pludselig død [1]. Der er udviklet en mere sensitiv analysemetode, som hedder High Sensitive C- Reaktive Protein, (hscrp), som i forhold til den alm. CRP analysemetode, kan detektere det samme CRP molekyle ved meget lave koncentrationer [5,6]. Der er forskellige målemetoder for analysering af hscrp, da det er muligt at analysere ved tubidimetri eller nephleometrisk måleprincip, som her i opgaven vil blive sammenlignet overfor hinanden parvis ved analysering af P- Høj sensitiv C-reaktiv protein; massek. På Biokemisk afdeling på Herlev Hospital er analysen blevet analyseret på Kone60i, for både rutinen og forskningen, indtil , hvor rutinen valgte at flytte analysering af specifikke proteiner inkl. hscrp hen på BN Prospec fra Siemens. Antistoffet til analysen på Kone60i ikke blev produceret mere. Forskningen havde dermed ikke andre muligheder end at flytte deres hscrp prøver hen på BN Prospec. Men der er blevet produceret et reagenskit til Konelab fra Thermo, som gør det muligt at analysere hscrp på analyseapparatet igen. Forskningen overvejede at benytte reagenset, men fravalgte dette på grund af prisen. En anden udfordring er den alt for lille kapacitet på BN Prospec, 7

8 der gjorde at forskningen anskaffede en Cobas6000 fra Roche, og valgte så at analysere deres hscrp prøver på denne analyse apparat. BN Prospec kunne ikke følge med i forhold til antallet af rutine prøver, derfor flyttede afdelingen også analyseringen af rutinens hscrp over på Cobas6000 den Klinisk biokemisk afdeling på Herlev hospital, har 3 analyseapparater der kan analysere hscrp. For den daglige rutine analysering af hscrp på patienter, og for forskningsafdelingen, har der analyseret hscrp på en Herlev - Østerbro undersøgelsen, været udfordringer om hvilket analyse apparat, der skulle anvendes til analysering af hscrp, målt på serum. For alle tre analyseapparaters vedkomne er selve analyseringen af hscrp målt på serum eller plasma ikke valideret. Da det nye reagenskit til Konelab fra Thermo ikke var anvendt, er det muligt at benytte dette kit til analysering ved projektet, og da der stadig er reagens tilbage til analysering af hscrp på BN Prospec, er det muligt at udføre en delvis metodevalidering af hscrp analysemetode på Cobas6000 fra Roche, Kone30i fra Thermo, og BN Prospec fra Siemens. Metodevalideringen omfatter en metodesammenligning, linearitets forsøg, Intraseriel præcision og antigen excess. Valideringsparametrene bliver udført på alle tre analyse apparater, og vurderet overfor hinanden parvis. CRP analyseres ved to forskellige analysemetoder. Den almindelige CRP i den daglige rutine på Kone60i fra Thermo, der defineres som P- C- Reaktivt protein [CRP], med et reference interval på [< 10 mg/l]. hscrp defineres også P-C- Reaktivt protein [HSCRP], med en beslutningsgrænse, med en øvre grænse på [3 mg/l], og analyseres på forskningsapparatet Cobas6000 fra Roche. Der foretages en rundringning til 4 af de store hospitaler i København, samt RHEL 1 og SSI 2 (se bilag nr.1). Forspørgelsen viser, at analysering af hscrp bliver udført på forskellige apparater alt efter laboratoriets valg af udbyder. Producenterne for de tre apparater har stillet en grænse for antigen excess, da det ikke er ligegyldigt hvor meget antistof der tilsættes som reagens for at detektere CRP i en patient prøve. 1 Regionhovedstadens elektive laboratorium, (før KPLL) 2 Statens serum institut. 8

9 Et resultat, kan detekteres som et falsk for lavt resultat, da der er mulighed for forkert aflæsning af resultat ved en høj CRP prøve. For producenten Thermo, som producerer reagenskittet til Konelab skriver producenten, i metodebladet, at der ikke vil forekomme antigen excess for prøver med en koncentration på op til 300 mg/l [9]. For Roche, der producerer reagenset til Cobas6000 er grænsen for antigen excess grænsen fastsat til 1000 mg/l [8]. Siemens, der producerer reagenset til BN Prospec, har ikke fastsat en grænse i deres metodeblad for antigen excess. Men refererer til et studie, som Siemens selv har udført, hvor de anvender 71 patient prøver på 500 mg/l, uden at der er forekommet antigen excess [13]. En artikel har ved en metodesammenligning også undersøgt fire apparater for antigen excess, ved en høj koncentration af CRP på 480 mg/l, ved analyse apparater der anvender turbidimetri og nephleometri so målemetode ved hscrp analysemetode [22]. Formål Formålet med denne opgave er at udføre en delvis metodevalidering af P- høj Sensitiv C-Reaktive Protein massek; ved at analysere patient prøver på Cobas6000 fra Roche, BN Prospec fra Siemens og Kone30i fra Thermo, og derefter sammenligne resultaterne parvis. Dette vil give et overblik, over om der er en forskel på de tre analyseapparaters måde at analysere hscrp på. Derudover vil projektet undersøge om der kan forekomme antigen excess ved at udsætte hscrp analysen på apparaterne for en prøve med en CRP koncentration > 250 mg/l. 9

10 Problemformulering Kan der ses en forskel på P- Høj sensitiv C-reaktiv protein; massek. analyseret på BN Prospec, Cobas6000 og Kone30i, ved en metodevalidering af udvalgte parametre, som metodesammenligning, linearitet, Intraseriel præcision. Der undersøges også for antigen excess., på alle tre apparater. Hypoteser Metodesammenligning: - Ved analysering af hscrp på de tre apparater, måler BN Prospec detektere en lavere koncentration, da Cobas6000 og Kone30is måleprincip er turbidimetrisk og BN Prospec er Nephleometrisk måleprincip, og er derfor bedre til detektion af specifikke proteiner, som CRP molekyler, analyseret ved en Høj sensitiv analyseprincip. Linearitet: - Der vil være en lineær sammenhængen ved vurdering af de tre analyse apparater linearitet, ved lineær regression. Intraseriel præcision: - Ved det Intraseriel forsøg for alle treanalyse apparater forventes en CV %, tæt på producenterne angivet CV % fra metodebladene for de tre apparater. For BN Prospec forventes en CV % på max 3 % [7]. For Kone30i forventes en CV % på max 2 % [8]. For Cobas forventes en CV % på max 1,6 % [9]. 10

11 Antigen excess: - Der vil ikke forekomme antigen excess på de tre apparater ved analysering af hscrp ved måling af en [CRP] med en koncentration > 250 mg/l. da de alle tre apparater vil fortynde til prøven er i kalibreringsområdet, så det er muligt at afgive et analyse resultat. Begrebsdefinitioner - Konelab; Er der tale om Kone30i og Kone60i. - CRP og hscrp er det samme molekyle i blodet der bliver analyseret, men hscrp er et mere sensitivt assay, og måler CRP i lave koncentrationer, [ 3 mg/l.] - Labka er det system hospitalerne har med alt information vedrørende patienter og svarene på de analyse resultater der ønskes at vide noget om, og som alle afdelinger anvender som kommunikation imellem hinanden, til oplysninger omkring svar på patienters prøver. - [HSCRP] er patientprøver analyseret på Cobas6000 for hscrp defineret i Labka for analysen - [CRP] er patientprøver analyseret på Kone60i for CRP defineret i Labka, for analysen - hscrp er de patientprøver der analyseres i dette projekt, og som analyseres på Cobas6000fra Roche, BN Prospec fra Siemens og Kone30i fra Thermo. Teori C- Reaktivt Protein C- reaktivt protein(crp) er et af de mange akutfase proteiner, der normalt er til stede som protein i blodet. CRP koncentrationen i blodet for raske personer er < 1mg/L. Klinikere anvender CRP til at undersøge om patienter har en infektion eller ej. Niveauer af CRP stiger hurtigt i respons på infektion og inflammation, og falder tilsvarende lige så hurtigt med ændring af tilstanden [5,6]. Således er målingen af CRP almindeligt anvendt til at overvåge forskellige inflammatoriske tilstande, da CRP koncentrationen i blodet kan stige fra 50 til over 500 mg/l. Ved en bakteriel infektion stiger CRP i blodet til mg/L, mens CRP ved en viral infektion vil være under 30 mg/l [5,6]. 11

12 For akutfaseproteinerne er CRP koncentrationen i blodet den hurtigst stigende ved en infektion [5,6]. CRP er første respons i den akutte fase af det cellulære immunrespons og er reguleret af cytokiner, der bliver frigivet af makrofager og neutrofile granulocytter ved fagocytering af en mikroorganisme eller en nekrotiseret celle [5]. Cytokinerne er et signal stof til hepatocytterne i leveren, om at syntisere mere CRP, der derefter frigives ud i blodet, hvor CRP er med til at lave en kompliment - binding til fremmede eller beskadiget celler via Fc receptorerne. Dette fører til generering af cytokiner, der forbedrer den inflammatoriske reaktion [5,6]. CRP måles på forskellige analyse apparater, alt efter klinisk biokemisk afdelings beslutning om apparatur. Ved svarafgivelse lavere end < 3 mg/l, afgives ikke et specifik svar, det kliniske svar vil derfor være < 3 mg/l [5,6]. hscrp bliver også målt på forskellige analyseapparater, men med et måleområdet på 10 mg/l. Hvis hscrp er 1-3 mg/l, er patienten i moderat risiko, og >3 mg/l er høj risiko, for at udvikle cardio vaskulære og perifere vaskulære sygdomme, i en eller anden grad [6]. Det er derfor vigtigt at det valgte analyse apparat, med en analysemetode, der har en validitet i analyseresultaterne 10 mg/l [6]. Analyseprincip For Cobas6000, BN Prospec og Kone30i gælder det analyseprincip for hscrp analysen. En mikropartikel er coatede med antistof rettet mod human CRP. Antistoffet vil danne agglutinationer, hvis der forekommer CRP i patient blodprøven [13], som vist i figur nr. 1. Figur 1. Viser helt til venstre at antistoffet er coatede til en partikel, og i midten illustreres at der tilsættes prøven med CRP molekyler i, som så ved delen helt til højre viser at der dannes antigen- antistof komplekser. 12

13 Måleprincipper BN Prospec anvender nephleometri, som måleprincip. Ved nephleometri måles lyset, som spredes af antigen- antistof komplekser. Lys spredningens intensitet, er proportional med mængden af antigen- antistof komplekser i prøven [13]. Kone30i og Cobas6000 anvender tubidimetri som måleprincip, hvor det er det absorberede lys, der måles. [14]. Nephleometri og Tubidimetri For analysering ved nephleometri og tubidimetri anvendes et spektrofotometer. En lysstråle fra en lampe sendes gennem en kuvetten ved begge måleprincipper, til bestemmelse af en bestemt partikel koncentration i en prøve [14]. Figur nr. 1 viser de to måle-princippers måder at opfange lyset på. Lys spredningen og absorbsionen afhænger af bølgelængde og partikelstørrelse, da nephleometri måler lyset, som spredes af de partikel komplekser, der er aggregeret i prøven. Ved tubidimetri måles mængden af det absorberet lys [14]. Kilde: Michael Bishop Et. Al, Clinical Chemistry, 6 udgave, 2010, side 140. Figur 2. Viser et princip skitse af nephleometri og Tubidimetri. Ved nephleometri måles lyset, som spredes af antigen- antistof komplekser. Lys spredningens intensitet, er proportional med mængden af antigen- antistof komplekser i prøven[13]. Både Kone30i og Cobas6000 anvender tubidimetri som måleprincip. Ved en tubidimetri måles det absorberede lys [14]. 13

14 Testopsætning af BN Prospec Ved hscrp anvendes polystyrenpartikler coatede med monoklonale antistoffer i reagenset, der vil danne antigen-antistof komplekser ved at de aggregere hvis CRP er til stede i patient blodprøven [13]. Først udføres en test fortynding, som er en præreaktion, hvor der mixes lidt af serum med dilluent og antistof med proben. Hvis der kommer en meget hurtigt stigning i lys spredningen, også kaldet antal bits. Næste fortynding fremstilles automatisk, indtil at resultatet af præreaktionen ligger inden for BN Prospekts grænse [13]. For aflæsning af målesignal bruger BN Prospec en matematisk algoritme, som hedder V Line Integral [7,13], hvor det er ændringen i lys spredningens intensitet pr. tidsinterval, der beregnes. På denne måde er reaktionens maksimumhastighed proportional med protein koncentrationen. Derved bruger denne BN Prospec reaktionskinetikken til at fastslå, hvor mange måle punkter, der skal til for beregning af reaktionshastighed ved lineær regression [7,13]. Ved kalibrering af målemetoden for en nephleometrisk måling er det påkrævet med en kvantitativ kalibreringskurve, da forholdet mellem målesignalet og protein koncentration ikke er lineær, skal der en flerpunkts kalibrering til [7]. Dvs. at der skal flere fortyndinger med en kendt koncentration af antigen. Standard fortyndingerne sammenlignes med mål signalerne fra prøven med ukendt antigen koncentration. Dermed omsættes prøvens målesignal til koncentration ved brug af kalibreringskurven [7]. BN Prospec anvender 6 fortyndinger til kalibreringskurven. Ved hjælp af en matematisk log it log funktion beregner BN Prospec kalibreringskurvens forløb og dermed ændres kalibreringskurven til en ret linje [7]. Testopsætning for Kone30i Først tilsættes hscrp buffer i en reaktions kuvetten, derefter tilsættes serum og blandes. Reaktions kuvetten inkuberes i 200 sekunder, ved 340 nm, hvor der aflæses en absorbans ved 1. aflæsning. Derefter tilsættes reagenset med det specifikke antistof rettet mod human CRP og blandes med en lille mikser. Reaktions kuvetten inkuberes igen men ved 300 sekunder, hvorefter aflæsning nr. 2 foretages ved 540 nm [10,11]. - Forskel i absorbans beregnes ved at aflæsning nr. 2 minus aflæsning nr

15 Forskellen i absorbans omsættes via en kalibreringskurve til en koncentration. Ved kalibrering af hscrp analysemetoder på Kone30i anvender analyseapparatet 5 fortyndinger ud fra en kalibrator fra firmaet med en kendt koncentration. Der dannes en krum kurve ved en splein- funktion men her ændres kurvens forløb ikke til en ret linje ved en matematisk funktion, den forbliver krum [9,14]. Testopsætning for Cobas6000 Afpipetering af serum sker hvert 6. sekund. Hvorefter hscrp buffer tilsættes, som er reagens nr. 1. Derefter tilsættes det monoklonale specifikke antistof rette mod human CRP i prøven, som er reagens nr. 2. Der ultralyds- mikses efter hver tilsætning, hvorefter reaktionen forløber [12]. Aflæsning sker i en cyklus med 8 sekunders interval ved en bølgelængde på 540 nm. Se Bilag nr. 2 Absorbansen omsættes til koncentration via en kalibreringskurve [12]. Ved kalibrering af hscrp analysemetoden på Cobas6000, anvender analyse apparatet en kalibrator fra firmaet med en kendt koncentration. Ud fra denne laves 6 fortyndinger, som den danner en krum kalibrerings-kurve, der rettes ud ved en matematisk funktion til en ret linje [12]. Metodevalg Præanalyse: Prøvematerialet, for hele projektet, er patient blodprøver taget ved venepunktur, indsamlet i Rød/gul gel glas med clot aktivator, fra Greiner- bio One med Lot nr. A1306X0, holdbarhed: , og derefter centrifugeret. Da patient blodprøverne er fra den daglige rutine, er prøverne allerede analyseret enten som [CRP] på Kone60i eller [HSCRP] på Cobas6000, og afgivet klinisk resultat her for. [CRP] blev brugt til forsøg hvor koncentrationen af CRP i prøven skulle være 3mg/L. [HSCRP] til forsøg koncentrationen var 3mg/L, da [CRP] på Kone60i kun måles ned til en koncentration på 3 mg/l. Ved selve analyseringen af forsøgene i dette projekt blev Kone60i udskiftet med en Kone30i. Kone60i er en rutine apparat, som er meget belastet i den daglige rutine analysering. Derfor var 15

16 det ikke muligt at anvende apparatet til selve projektet, da det nye reagenskit til Konelab vil kræve tid for opsætning på analyseapparatet. Etiske overvejelser. Patienter der deltager i dette projekt, vil være anonyme, da patient blodprøverne vil blive blændet efter udvælgelsen i Labka. Dermed er det ikke muligt at genfinde patienterne. De patienter der vælges til projektet har allerede fået afgivet som enten [CRP] eller et [HSCRP], og vil derfor ikke give ny viden til patienten. Da der til valideringsforsøgene bruges patientmateriale, der allerede er rekvireret af afdelingen, vil det ikke kræve patient sammentykke. Metodeopsætning Testopsætning for BN Prospec og Cobas6000 var indlagt i apparaterne inden projektets start. På Kone 30i, blev testopsætningen lagt ind i apparatet ved projektets start, ud fra firmaets anbefalinger. Der blev ikke indlagt en kontrol, da reagenskittet er nyt, og derfor ikke indkørt nogen kontrolværdier, for hscrp analysen. Kvalitets kontrol Ved opstart af projektet bliver der udført daglig vedligeholdelse på BN Prospec og Kone30i. for Cobas6000 var er der udført daglig vedligeholdelse af en forsknings bioanalytiker. For vurdering af kvalitetskontrol, vil der blive foretaget kalibrering af analyse apparaterne, som anvendes ved dette projekt, og for godkendelse af hscrp analyse vil der blive analyseret kontroller, for alle tre apparater. Ved kalibrering fastlægges apparatets respons, som funktion af koncentrationen af analysestoffet, ved at anvende en eller flere kalibrator, som er en opløsning med en kendt værdi af analysestoffet. Det er vigtigt at kalibrere inden for hele måleområdet, da det vil sikre at prøvens resultat ligger indenfor det område hvor der er kalibreret, da analysesvaret ikke vil være brugbart som svar på en prøve. Valget af kalibrator er oftest fra producenten af det reagenskit man ønsker at anvende [20]. Valget af kontrol materiale kan være materiale, som laboratoriet selv har fremstillet, som kan anvendes til daglig kontrol. For valg af kontrol materialer skal kontrollens egenskaber ligge nogenlunde op af patientprøver, da kontroller anvendes til daglig kontrol af analysens præcision og korrekthed [20]. 16

17 Kontrol materiale kan også være købt af en producent, der har tillagt kontrolmaterialet en koncentration af det analyse parameter, som man ønsker en kontrol af på et apparat [20] For godkendelse af kontroller på apparaterne, vurderes ud fra et acceptinterval, som er det interval kontrollerne ønskes at ligge indenfor [20]. Kalibrering og kontroller Cobas6000 vil være kalibreret og analyseret den daglige kontrol af en forsknings bioanalytiker, som også vil stå for godkendelse af apparatet til analysering af hscrp. BN Prospec vil blive kalibreret, med N Reumatologisk standard SL kalibrator, fra Siemens, med en Target værdi på 20,3 mg/l, som vist i tabel nr.1 ved opsætning af reagenser. Derefter inden analysering af projektets serum prøver, vil der ved hvert forsøg blive analyseret to kontroller. Cardiac Marker, som har et acceptinterval på [0,191 0,251 mg/l], og er en lav kontrol. Men også Immunology, som har et acceptinterval på [5,019-5,419 mg/l], og er den høje kontrol, se tabel nr. 2, begge kontroller er fra Siemens, se bilag nr. 3. Kone30i bliver der efter testopsætning af det nye reagenskit, og opsætning af reagenser kalibreret, med en CRP HS Kalibrator fra Thermo, med en Target værdi på 10,66 mg/l, som vist i tabel nr.1. Der er for det reagenskit ikke indkørt en kontrol, som det fremgår af tabel nr. 2, er der ikke et acceptinterval til godkendelse af en kontrol for denne hscrp analyse. Der vil blive anvendt den samme kontrol som der anvendes på Cobas6000, da det er laboratoriets fastlagte kontrol, for daglig godkendelse af hscrp prøver. For at kunne acceptere kontrollen på Kone30i, vil acceptintervallet for Cobas6000, blive anvendt for godkendelse af kontrollen på Kone30i ved dette projekt. Kalibrator: 17

18 Apparat. Kalibrator Producent Target værdi BN Prospec Kone30i N- Reumatologisk standard SL CRP HS kalibrator Siemens Thermo 20,3Mg/L 10,66 mg/l Tabel1. Viser de Kalibrator der blev anvendt til BN Prospec og Kone30i, til godkendelse af hscrp analysen. Hvert reagenskit har deres egen kalibrator, og target værdi er fastsat af producenten for reagenskittene. Kontroller: Apparat: Navn: Producent Accept interval: Cobas 6000 Chemistry, Randox nr.1 Randox [ mg/l] BN Prospec Cardiac marker Siemens [0,191-0,251 mg/l] Kone30i Immunology Chemistry, Randox nr.1 Siemens [5,019-5,419 mg/l Randox - Tabel 2. Viser acceptintervallerne for de valgte kontroller til de tre apparater, for Cobas6000 var Randox kontrollen allerede godkendt af en forsknings bioanalytiker, for BN Prospec blev der anvendt en høj og en lav kontrol. For Kone30i blev der anvendt den kontrol, der anvendes på Cobas6000, da reagenskittet til apparatet ikke er indkørt, og har derfor ikke et fastlagt acceptinterval. Metodesammenligning Ved denne metodesammenligning vurderes det om der er en forskel i resultaterne for de tre analyse apparaters måde at analyserer hscrp målt i serum på. For udførelsen af metodesammenligningen, vælges ca. 50 blodprøver, som skal ligge inden for det valgte måleområde, på 10 mg/l. Det er vigtig at kunne vurdere hele måleområdet, men også vigtigt at have en del prøver til metodesammenligningen, for validiteten af resultatet [16]. Patient prøverne udvælges ud fra [HSCRP] analyse resultater fra Cobas6000. Derefter analyseres de samme prøver på Kone30i og BN Prospec. De ca. 50 serumprøver vil give et Måleresultat, der har en stor validitet, i forhold til at bearbejde resultaterne statistisk. Selve databehandlingen vil blive bearbejdet ved lineær regression, ved at benytte X og Y plot, for at få et kvantitativt overblik over data fra analyserne [16]. Derved konstrueres en regressionslinje ud fra punkterne i 18

19 diagrammet. Ud fra korrelations-værdien(r 2 - værdi) 3, kan sammenligningen af de to analyse apparater vurderes, ved at se om R 2 er tæt på 1 [16], ved parvis sammenligning af apparaterne. Derefter udføres et differensplot, for at tjekke overensstemmelsen mellem de to analyse apparater, der parvis sammenlignes. Det vil give et overblik over, om de to metoder, der sammenlignes parvis, giver samme resultat [16], udfra differenceplottet vil der blive valgt tre punkter i det lave måleområde (0-3 mg/l), til udregning af en procentvis afvigelse, da det kan give et billede at hvor stor afvigelse apparaterne har imellem sig ved parvis sammenligning. Til sidst vil der blive udført et konfidenceinterval, for de databeregninger ved lineær regression, som er en anden måde at se om der er sammenhæng, ved at se om hældningen er tæt 1, og skæring er tæt på 0, da dette vil give en sammenhæng ved sammenligning af de tre apparater parvis overfor hinanden. Linearitet Ved linearitetsforsøget undersøges om der er direkte proportionalitet mellem koncentration og mål resultatet på de tre analyseapparater indenfor det ønskede måleområde på [< 10 mg/l.] [16]. Dette vil give en bestemmelse af måleområdet ( 10 mg/l), om der evt. vil være en lineær sammenhæng mellem analysekomponentens respons og koncentrationen [17]. For behandling af resultaterne udføres lineær regression, hvor der vil blive udført et x og y plot, for hvert enkelt apparat, ved at have beregnet koncentration ud af x aksen og målt koncentration ud af y aksen. Udfra dette plot kan der beregnes en R 2 værdi, som skal være tæt på 1[17]. Der vælges 6-10 patient prøver med en [CRP] koncentration målt til ca. 40 mg/l, på Kone60i. Antallet af prøver bliver valg på baggrund af mængden af serum. Det er vigtigt at kunne analysere på alle tre apparater, og dermed have nok serum. Valget af patient blodprøver med en [CRP] Koncentration, er på baggrund af, kalibreringsområdet, da de 40 mg/l ligger inden for dette område, og en CRP koncentration på 40mg/L med en god præcision, [9]. 3 Er den værdi der angiver, om der er sammenhængen mellem de 2 forskellige analysemetoder. R- Værdi, skal ligge tæt på 1 19

20 Intraseriel præcisions Intermediær præcision er en analytisk variation til bestemmelse mellem uafhængige mål resultater, som opnås ved samme analysemetode, på samme prøvemateriale, og i samme laboratorium. Intermediær præcision inddeles i Interseriel og Intraseriel præcision [17,19], - Interseriel præcision er målinger taget over et større tidsrum, dvs. fx flere dage. - Intraseriel præcision, er målinger inden for kort tidsinterval, som fx samme dag og samme serie [17,19]. Ved dette forsøg vil der blive udført en analytisk variation ved Intraseriel præcision, og der vil blive valgt 5-10 patient blodprøver, for hver koncentration i henholdsvis lave, middel og høje område af måleområdet. Det er vigtigt at der er serum nok til at Poole med, da serum poolene skal analyseres på alle tre apparater. De tre ønskede områder er inddelt således: - Lav [0 3 mg/l] - Mellem [3 6 mg/l] - Høj [6 10 mg/l] Det er vigtig at inddele måleområdet i disse tre koncentrations niveauer, så prøverne er fordelt i hele måleområdet. Dette giver et billedet af hvordan de tre apparater måler inden for måleområdet. Analyseringen vil ske samme dag og ved at analysere 6-10 gange ved samme reagens Lot. nummer, kalibrering, kontroller og med samme bioanalytiker, da det ønskes, at der kun er variation i apparat skiftet [16,19]. Bearbejdning af analyse resultaterne beregnes ved en kvantitativ opsummering af data tallene. Først beregnes middelværdi. Middelværdien skal bruges til beregning af SD. SD beskriver hvor langt de enkelte målinger ligger fra middelværdien [17,19]. Derudover beregnes CV %, for at se om spredning er stor eller lille [17,19]. Ved at sammenholde resultaterne med producenternes angivet CV % fra deres metodeblade, overfor dette projekts beregnede CV % er det muligt at vurdere om spredningen skyldes en analytisk variation, apparaterne imellem. 20

21 Antigen excess For bestemmelse af et protein, som CRP ved en antigen/antistof reaktion, er det vigtigt at prøven er fortyndet, sådan at resultatet altid vil befinde sig på venstre side af kurven, se figur 3. Der er ellers mulighed for, at en udfældning/målesignal kan have to aflæsningspunkter på kurven. Dvs. at det første signal for antigen måling ligger i den stigende gren i antistof overskudsområdet, og det andet punkt ligger på den faldende gren i antistof overskudsområdet [18]. Dermed er det muligt at aflæse to punkter på referencekurven, og derved muligt at aflæse et falsk for lavt resultat, ved en høj CRP prøve. Kurven kan inddeles i 3 zoner ved at kigge på figur nr.3 - Antistof excess zone Opløsningen indeholder overskud af Antistof, kompleks dannelse giver Anledning til absorbans stigning, der er proportional med mængden CRP i prøven[18]. - Ækvivalens zone Den maximale kompleksbinding er nået [18]. - Antigen excess zone. Overskud af antigen, vil danne små opløselige komplekser, der vil give en falsk for lav absorbans [18]. Kilde: Figur 3. Grundlæggende princip i immunkemisk proteinbestemmelse, ved brug af kalibreringskurve. Ved en blå del af kurven indeholder opløsningen overskud af Antistof, kompleks dannelse giver Anledning til absorbans stigning, der er proportional med mængden af CRP i prøven, og ved den lilla del af kurve er den maximale kompleksbinding er nået, og til sidst i den røde del af kurven er der overskud af antigen, og dette vil danne små opløselige komplekser, der vil give en falsk for lav absorbans. 21

22 Producenternes grænse for antigen excess: Da producenterne Thermo og Roche har sat nogle grænser op på antigen excess for deres apparater(kone30i og Cobas6000), vil det være muligt ved dette forsøg at afprøve om denne påstand er rigtig [8,9]. For BN Prospec er der ikke opgivet en antigen excess grænse i deres metodeblad, men Siemens har udført et projekt selv. Hvor der er udført en analysering af hscrp, med 71 patientprøver med en CRP koncentration på 500 mg/l [13]. Ved analysering af alle tre apparater med en patient prøve på en høj [CRP] koncentration, vil det kunne give et billedet af om der vil forekomme antigen excess på de tre apparater ved analysering af hscrp. - Kone30i er der en koncentration grænse på 300 mg/l [9]. - Cobas6000 er der en koncentrations grænse på 1000 mg/l [8]. - BN Prospec er der ingen. Ved dette forsøg vælges patient blodprøver ved en koncentration > 250 mg/l, for tjek af antigen excess, ved at teste den øvre grænse, som producenterne har sat for antigen excess, på alle tre apparater [8,9]. Der vil ved dette forsøg blive brugt minimum 1 patient blodprøve, og gerne flere, hvis det er muligt at finde prøver med en [CRP] koncentration > 250 mg/l, ellers accepteres det fra afdelingen at undersøge en prøve ved dette forsøg for antigen excess. Analyse resultaterne for hscrp på Cobas6000, BN Prospec og Kone30i vil blive vurderet og diskuteret ud fra de analyse resultater, der er afgivet for hver af de anvendte [CRP] prøver. Afgrænsning Metode validering - Der er en afgrænsning i valg af valideringsparametre ved metodevalideringen, da der ikke bliver undersøgt for analytisk variation, robusthed, metrologisk sporbarhed, afsmitning, detektionsgrænse, måleusikkerhedsbudget, korrekthed og genfindingsforsøg, valget af de 22

23 parametre er fastsat i samarbejde med Biokemisk afdeling på Herlev, ud fra hvad de ønsker at undersøge, og de parametre vi har fravalgt er ofte muligt at indhente hos producenten. Der vil ikke ved dette projekt blive udført en inter seriel præcision, da dette skal gøres over minimum 20 dage, og det er for lang tid i forhold til udførelsen af projektet i laboratoriet. Præanalytiske forhold Der var ved de præanalytiske forhold, indflydelse på udvalg af patienter, da udvælgelsen sker i Labka, alt efter koncentrationer og apparater. Men selve blodprøven tapning, og centrifugering, er der ingen indflydelse på, da der vælges allerede analyseret patientprøver, som der er afgivet svar for henholdsvis [HSCRP] og [CRP]. Cobas6000 Da analysesvarene for [HSCRP] bliver afgivet for analyseapparatet Cobas6000 fra Roche, er dette apparat medtaget i opgaven. Men der er en begrænsning i selve analyseringen af projektets prøver, da dette er gjort med hjælp fra en forsknings bioanalytiker, og derfor er der ikke nok kendskab til denne analyse apparat, i forhold til BN Prospec og Kone30i, som der blev brugt mere tid på, at lære dem at kende. Der vil ikke blive gennemgået hvordan kalibreringskurven for [HSCRP] analysen, bliver aflæst for Cobas6000, da det ville være for omfattende for dette projekt. Der vil ikke blive gennemgået teoretisk hvordan Cobas6000 fortynder patientprøver ved analysering, og sammenlignet i diskussionen med måden apparatet fortynder kalibratoren ved dannelse af kalibreringskurven. Kone30i Der vil for kone30i ikke blive indkørt en kontrol, til dannelse af et acceptinterval for godkendelse af kontrollen for hscrp analysen på dette apparat, men i stedet blive anvendt laboratoriets egen godkendte kontrol til analysen på Cobas6000, da dette ville kræve tid. 23

24 Metode og materialer materialer Apparatur Cobas 6000 Roche Diagnostics, Apparat nr BN Prospec System Siemens Healthcare Diagnostics, Apparat nr KONE 30i Thermo Scientific, Apparat nr. C Finpipette Digital µl Bio hit Proline. Serie nr Finpipette Digital µl Bio hit Proline. Serie nr Køleskab 2 8 o C. Reagenser Reagenser til BN Prospec System fra Siemens o Cardio Phase hscrp Reagens med antistof. Lot nr o Supplerende reagens (SRP), Lot nr o N- Dilluent Siemens, Lot nr o Kalibrator: N Rheumatology Standard SL, Lot nr A o Kontrol,(high): Immunology 1, Lot nr o Kontrol, (low): Cardiac marker, Lot nr Reagens til Cobas 6000 fra Roche o Cardiac- C-Reactive protein (Latex) High Sensitive, (Reagens med antistof), og Buffer, Lot nr o NaCl 0, 9 % mmol/l, Lot nr (Dilluent på apparat). o Kalibrator: c.f.a.s. proteins, Lot nr o NaCl 0,9 % mmol/l, Lot nr (brugt til manuel sekvens fortynding). o Kontrol: Randox, Lot nr. 662UN. Reagenser til Kone 30i fra Thermo o CRP HS Buffer, Lot nr. J113 o CRP dilluent, Lot nr. J113 24

25 o CRP HS reagens (med det Frysetørrede antistof), Lot nr. J113, o CRP HS CAL: Lot nr. J113 o Kontrol: Randox, Lot nr. 662UN o Sterilt vand, til fortynding af CRP HS reagens. Prøvemateriale Alle blodprøver er taget ved venepunktur, og indsamlet i rød/gul gel glas med clot aktivator, fra Greiner-Bio- One, Lot nr. A1306XO, som rutine blodprøver. Se tabel nr. 3. Alle blodprøver var bestilt af rekvirenten, og allerede analyseret for enten [HSCRP] eller[crp], og klinisk svar var afgivet til rekvirenten. Forsøg Metodesammenligning: Linearitet: Antal, og Indsamling af prøver: 50 blodprøver, der var analyseret for [HSCRP] med en koncentration. CRP 10 mg/l. Blev valgt, via Labka. 6 blodprøver med en [CRP] koncentration på ca. 40 mg/l, blev udvalgt i Labka ud fra frigivet svar. Intermediær præcision: 25 blodprøver med koncentrationer fordelt således: Antigen excess: 5 blodprøver, med en konc. På ca. 0 mg/l, som allerede var analyseret på som [HSCRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 1 mg/l, som allerede var analyseret som [HSCRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 3 mg/l, som allerede var analyseret som [HSCRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 5 mg/l, som allerede var analyseret som [CRP], og valgt ud i Labka 5 blodprøver med en konc. På ca. 10 mg/l, som allerede var analyseret som [CRP], og valgt ud i Labka 1 blodprøve analyseret som [CRP], og med en konc. målt til 270 mg/l, og valgt ud i Labka Tabel 3 Viser hvor mange blodprøver der er blevet brugt til hvert forsøg i projektet, og hvordan de er blevet valgt, og fra hvilket apparat og koncentration af enten [CRP] eller [HSCRP], for hvert af forsøgene ved dette projekt. Blodprøverne afpipiteres, og Serum separeres i nye mærket rør, alt efter hvilken forsøg der ønskes undersøgt, og derefter sat på køl ved 4 C. 25

26 Metode Kvalitetssikring. For BN Prospec og Kone30i blev der først udført daglig vedligeholdelse af apparaterne. Derefter blev der på BN Prospec analyseret to kontroller, fra Siemens. Cardiac Marker (lav), og Immunology (høj), og godkendt ved vurdering af kontrollernes acceptintervaller, (Se tabel nr. 2), for hscrp analysen før alle forsøgene. Der blev for Kone30i også analyseret en kontrol,(se tabel nr. 2), Randox. Da kontrollen ikke var indkørt på apparatet, blev den analyseret min. 2 gange ved hvert forsøg i projektet og godkendt udfra om kontrollen lå niveau med acceptintervallet for Cobas6000. For Cobas6000 blev daglig vedligeholdelse og analysering af kontrollen udført, og godkendt af en forsknings bioanalytiker. Metodesammenligning: Der blev ved metodesammenligning analyseret 50 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Prøverne var allerede blevet analyseret som [HSCRP], af en forsknings bioanalytiker på Cobas6000, og afgivet svar til rekvirenten via Labka, se tabel nr. 3. Prøverne til denne del af projektet blev udvalgt via Labka, og koncentrationen skulle være 10mg/L. De 50 blodprøver, blev serum afpipeteret i nye reagensglas og mærket med et nummer fra 1-50, og derefter sat på køl ved 4 c, med prop på. Ved analyseringen af hscrp blev prøverne først analyseret på Kone30i og derefter på BN Prospec. Hvorefter det var muligt at sammenligne resultaterne med Cobas6000. Linearitet: Der blev anvendt 6 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Prøverne var allerede blevet analyseret som [CRP] på Kone60i, af en bioanalytiker fra rutinen, og afgivet svar til rekvirenten via Labka, Se tabel nr. 3. Prøverne til denne dette forsøg blev udvalgt via Labka, med en koncentration på ca. 40mg/L, se tabel nr. 4. Serum blev afpipiteres over i et reagensglas fra alle 6 prøver og blandet i en pool af serum, svarende til ca. 10 ml i alt. Nr. Målt koncentration: mg/l mg/l mg/l mg/l 26

27 mg/l mg/l Tabel 4. Viser koncentration for hver af de 6 patient blodprøver, som blev valgt ud i Labka, med kriteriet at koncentrationen skulle være ca. 40 mg/l. Derefter blev der udført 3 fortyndingsrækker på 10 forskellige koncentrationer ud fra den poolet serum, i området 0-40mg/L, som man kan se ud fra tabel nr. 5, dvs. en fortyndingsrække til hvert af analyseapparaterne. Fortyndingerne blev dannet ud fra en sekvens fortynding, med apparaternes egen Dilluent, Fortyndingsrækken i et forventet koncentrations område. Måleområdet: [0-40 mg/l]. Fortynding: FF Sekvens fortynding Forventet Konc: Nr. 1. 1: μl serum fra pool. 40 mg/l 2. 1: μl (1) + 600μl Dilluent 20 mg/l 3. 1: μl (2) + 600μl Dilluent 10 mg/l 4. 1: μl (3) + 600μl Dilluent 5 mg/l 5. 1: μl (4) + 600μl Dilluent 2,5 mg/l 6. 1: μl (5) + 600μl Dilluent 1,25mg/L 7. 1: μl (6) + 600μl Dilluent 0,63mg/L 8. 1: μl (7) + 600μl Dilluent 0,31mg/L 9. 1: μl (8) + 600μl Dilluent 0,16mg/L 10. 1: μl (9) + 600μl Dilluent 0,09mg/L Tabel 5. Viser måden de valgte fortyndinger skulle udføres, og hvilken koncentration der blev forventet efter sekvensfortyndingen, serummet blev fortyndet med analyse apparatets egen dilluent. Tabel nr. 5 Viser hvordan sekvensfortyndingerne blev udført: 1. I glas nr. 1, blev der tilsat 1200μl serum fra den poolet serum. 2. I glas nr. 2-10, blev der tilsat 600μl fortyndingsmiddel 3. I glas nr.1, blev der afpipiteres 600μl serum til glas nr.2 og blandet godt med pipetten. Fra glas nr.2, blev der afpipeteret 600μl til glas nr. 3 og blandet med pipetten, denne sekvens fortsatte til og med glas nr.10. For analysering af de tre fortyndingsrækker, blev der først analyseret på Kone30i og derefter på Cobas6000 og til sidst på BN Prospec. 27

28 Intraseriel præcision: Der blev anvendt 25 patient blodprøver, taget ved venepunktur. Prøverne for det lave område fra 0-10 mg/l indsamlet således: - fra 0mg/L til 3mg/L var allerede blevet analyseret som [HSCRP], og afgivet svar til rekvirenten via Labka. - fra 5mg/L - 10 mg/l var også allerede blevet analyseret som [CRP], og afgivet svar til rekvirenten via Labka. Til denne del af projektet skulle koncentrationerne være inden fra hver af de 5 ønskede koncentrationer, som det fremgår af tabel nr. 6 og 7. Nr. 0 mg/l Nr. 5mg/L Nr. 10mg/L mg/l mg/L mg/L mg/l mg/L mg/L mg/l mg/L mg/L mg/l mg/L mg/L mg/l mg/L mg/L Tabel 6 viser de koncentrationer de indsamlede blodprøver havde, ved første del forsøg. Nr. 1 mg/l Nr. 3 mg/l 1. Del mg/l mg/L 2. 0,90 mg/l mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/l Tabel 7. Viser de indsamlede koncentrationer ved andet forsøg Der blev ved første forsøg indsamlet [0 mg/l], [5 mg/l] og [10 mg/l], se tabel 6. Ved denne del af forsøget blev der analyseret et serum pool med 10 analyseringer i træk, da der var nok poolet serum til 10 små analysekopper ved alle tre analyse apparater. 2. Del Ved andet forsøg blev der indsamlet [1 mg/l] og [3 mg/l] se tabel 7. men ved denne del af forsøget blev der analyseret en serum pool, med 6 analyseringer i træk, da der var mindre serum i de indsamlet patientprøver, og derfor kun nok til 6 små analysekopper ved de tre analyse apparater. 28

29 Antigen excess Der blev anvendt 1 blodprøve, med en [CRP] koncentration på 270 mg/l, som allerede var blevet analyseret af en bioanalytiker i rutinen på Kone60i, og afgivet svar til rekvirenten. Prøven til denne del af projektet blev udvalgt via Labka, og ved det kriterium at koncentrationen skulle være > 250 mg/l. prøven blev analyseret i det primære glas, på alle tre apparater, da det blev vurderet at der var prøvemateriale nok. Prøven blev analyseret på Kone30i. derefter Cobas6000 og til sidst analyseret på BN Prospec. 29

30 Resultater Kvalitetssikring [HSCRP] analysen på Cobas6000 var godkendt med kalibrering, og to kontroller af en forsknings bioanalytiker. Der blev for BN Prospec godkendt en kalibrering ved opsætning af reagenser på apparat. Derudover blev de samme to kontroller analyseret på BN Prospec ved hvert forsøg, og godkendt se tabel nr. 8. Det var for Kone30i en ny testopsætning, af hscrp analysemetode, det betød at efter opsætning af hscrp analysen på apparatet blev der kalibreret. Der blev udført en kalibrering mere på Kone30i efter ca. en uges tid, da der ved Intraseriel præcision skulle analyseres med nye koncentrationer, og derfor blev det vurderet at udføre en ny kalibrering på dette apparat. Der blev analyseret den samme Randox kontrol ved alle forsøgene, se tabel nr. 7, på Kone30i. kontrollen blev analyseret mindst to gange ved hvert forsøg, for at danne et billede af hvor kontrollen befandt sig i forhold til at den ikke var indkørt, men også iforhold til acceptintervallet for kontrollen på Cobas6000. Der blev ved Intraseriel præcisions andet forsøg analyseret den samme kontrol to gange mere, se tabel nr. 8 to resultater for kontrollen i kursiv, disse analyseringer blev udført efter anden kalibrering. 30

31 Kalibrering af BN Prospec Figur 5 viser en kalibreringskurve, med en fortyndingsrække på 7 fortyndinger. Analyseapparatet fortynder 1: 2560, 1: 1280, 1:640, 1:320,1: 160, 1: 80 og 1: 40, se figur 5 under kurven, hvor analyse apparatet har udført en krum kurve, der er rettet ud til en næsten ret linje ved matematisk funktion. Ud af x-aksen er koncentrationen i mg/l, og y- aksen viser Bits. Apparatet godkender selv kalibreringskurven for hscrp analysen. Figur 5. Viser her en kalibreringskurve for BN Prospec, som laver 7 fortyndinger, 1: 2560, 1: 1280, 1:640, 1:320,1: 160, 1: 80 og 1: 40. Denne kalibrering blev udført til hscrp analysen. Apparatet har udført en krum kurve, der er rettet ud til en næsten ret linje ved matematisk funktion. ud af x-aksen ses koncentrationen, og y- aksen viser Bits. 31

32 Kalibrering af Kone30i Der blev for Kone30i kalibreret to gange, for den nye testopsætning, da Intraseriel præcision forsøget blev fortaget en gang mere med to nye koncentrationer. Der gik to uger imellem hver kalibrering. Se figur nr. 6 og 7 Ved kalibrering af hscrp analysemetode på Kone30i anvender analyseapparatet 4 fortyndinger ud fra en Kalibrator fra firmaet med en kendt koncentration. Kone30i starter med at måle ufortyndet på kalibratoren, og derefter fortynder den 1+1, 1+2, 1+8 og Ud fra denne måde analyse apparatet fortynder dannes en krum kurve ved en splein- funktion. X- aksen viser koncentrationen og for y-aksen er det absorbans. 32

33 Figur 6. Viser en 5- punkts kalibrering. Kone30i fortynder kun 4 gange, fordi den starter med at analysere på kalibratoren ufortyndet. Ud af x- aksen ses koncentrationer og på y- aksen er det absorbansen. 33

34 Figur nr. 7 viser kalibrering af Kone30i efter ca. 14 dage, ved Intraseriel præcision, da andet forsøg blev udført. Ud af x- aksen ses koncentrationer og på y- aksen er det absorbansen. Figur 7. Viser kalibreringskurven der blev udført ved Intraseriel præcisions andet forsøg. Figuren er en 5- punkts kalibrering. Kone30i fortynder kun 4 gange, fordi den starter med at analysere på kalibratoren ufortyndet. Ud af x- aksen ses koncentrationer og på y- aksen er det absorbansen. 34

35 Godkendelse af Kontroller Tabel nr. 8 viser resultaterne for kontrollerne analyseret på de tre analyse apparater. Kontrollen for Cobas6000 er analyseret og godkendt af en forsknings bioanalytiker. På BN Prospec blev der analyseret to kontroller. Cardiac Marker (High), og Immunology en (Low) kontroller, se tabel nr. 8,disse kontroller blev godkendt ved hvert forsøg for dette projekt. På Kone30i blev anvendt laboratoriets daglige kontrol for [HSCRP] fra Cobas6000. Da det var en ny testopsætning af hscrp analysen, var der ikke en indkørt kontrol til hscrp på Kone30i. Kontrollen blev godkendt ud fra en vurdering ved at sammenligne acceptintervallet for kontrollen på Cobas6000, se tabel nr. 8. Cobas6000 ( mg/l) Kontrol navne Chemestry Randox nr.1 Metodesammenligning 1,17 Linearitet 1,17 Intraseriel impræcision 1,17 Antigen excess 1,17 Acceptinterval for kontrollerne. [1,156-1,396] Bn Prospec ( mg/l) Kone30i ( mg/l) Low: Cardiac Marker High: Immunology nr. 1 Chemestry Randox nr.1 Low: 0,236 1,27, 0,85, 1,20, High: 5,43 1,27 Low: 0,247 1,17, 1,20 High: 5,48 Low: 0,236 0,89, 1,27, High: 5,43 1,46, 1,38 Low: 0,236 High: 5,43 1,46, 1,20 Low: [0,191-0,251] - High: [5,019-5,419] Tabel 8. Viser Resultaterne for kontrollerne, der blev analyseret på de tre apparater, ved hvert forsøg i projektet. Kontrollen er den samme for alle forsøgene på Cobas6000, og godkendt af en forsknings bioanalytiker. For BN Prospec blev de samme to kontroller analyseret ved alle forsøgene, og godkendt. Kone30i anvender den samme kontrol som Cobas6000, der er laboratoriets indkørte og anvendte kontrol for [HSCRP], Da det er en ny analyseopsætning for hscrp på apparatet, er der ikke et acceptinterval for kontrollen på Kone30i. Der er ved Intraseriel impræcision blevet udført en ekstra kalibrering, og derfor blev det valgt at analysere den samme Randox kontrol to gange efter kalibreringen(kontroller skrevet i kursiv.) 35

36 Metodesammenligning Ved metodesammenligning blev der analyseret serum af 50 patient blodprøver. Resultaterne er vist i Bilag nr. 5, som Rådata. Da 5 af resultaterne var negative, resultat nr. 15, 26, 31, 48 og 50, blev de fravalgt til lineær regression. Derudover var der også et resultat for BN Prospec, der lå langt fra de 2 andre apparater, resultat nr. 21, der også blev valgt fra, ved udførelsen af lineær regression. Lineær regression er beregnet i et Excel regneark, hvor der er blevet udført et x og y plot. Tabel nr. 9 viser de 44 patient prøver, der blev brugt til udregning af lineær regression, ved sammenligning parvis af de tre apparater, se figur nr. 8, 10 og 12. Resultaterne er sammenlignet således at Cobas6000 sammenlignes med BN Prospec, og derefter sammenlignes BN Prospec med Kone30i og til sidst sammenlignes Cobas6000 med Kone30i. 36

37 Målte koncentrationer i (mg/l), ved analysering af hscrp på alle tre apparater: Nr. Cobas6000 (mg/l) BN Prospec (mg/l) Kone30i (mg/l) 1 0,45 0,44 0,03 2 0,62 0,63 0,27 3 0,64 0,63 0,33 4 0,72 0,77 0,29 5 0,75 0,69 0,06 6 0,79 0,88 0,20 7 0,92 0,97 0,22 8 1,10 1,20 0,36 9 1,11 1,17 0, ,17 1,20 0, ,40 1,15 0, ,49 1,61 0, ,58 1,57 1, ,64 1,57 1, ,84 1,92 1, ,05 2,20 1, ,26 2,58 2, ,45 2,45 2, ,58 2,65 1, ,65 2,77 2, ,81 3,13 2, ,96 3,30 2, ,03 3,20 2, ,06 3,18 2, ,07 3,50 2, ,08 3,24 2, ,22 3,68 3, ,44 3,72 3, ,50 3,89 3, ,63 4,43 3, ,90 4,30 4, ,19 5,04 4, ,26 4,75 4, ,42 6,31 6, ,76 6,81 6, ,27 7,57 7, ,81 8,01 8, ,03 8,43 8, ,22 8,34 7, ,21 11,40 11, ,38 10,30 10, ,79 11,50 10, ,82 12,10 11, ,88 10,40 10,87 Tabel 9. Viser resultaterne for de 44 prøver, der blev anvendt til statistisk beregning af metodesammenligning for de tre apparater parvis overfor hinanden, ved at udregne resultaterne i et Excel regneark og udføre et X og Y plot for lineær regression og et differensplot. 37

38 Differenceplot ved metodesammenligning For udregning af differenceplot, er anvendt de samme 44 patient blodprøver, se tabel nr. 10, som analyse resultater. For udregning af differenceplot er anvendt et Excel regneark for de tre analyse apparater, sammenlignet parvis overfor hinanden, se figur nr. 9, 11 og 13. Der er først udregnet en middelværdi for de to apparater der sammenlignes parvis i hvert differenceplot i et Excel regneark. Middelværdien er ud af X- aksen for de to apparater der sammenlignes og differencen mellem de to apparater er op af Y- aksen. Tabel 10 Viser de beregnede koncentrationer(mg/l) til differenceplot, der er udregnet i et Excel regneark, og derefter blevet udført difference plot for hver af de tre sammenligninger for apparaterne parvis overfor hinanden. 38

39 Nr. middel: (cobas BN Prospec)/2 Difference: (BN Prospec Cobas6000)/2 middelværdi: (BN Prospec + Kone30i)/2 Difference: (Kone30i BN Prospec) Middelværdi (Cobas6000+Kone30i)/ 2 Difference: (Kone30i - Cobas6000) Mg/L Mg/L Mg/L Mg/L Mg/L Mg/L 1 0,45-0,01 0,24-0,41 0,24-0,42 2 0,63 0,01 0,45-0,36 0,45-0,35 3 0,63-0,01 0,48-0,30 0,49-0,31 4 0,75 0,05 0,53-0,48 0,51-0,43 5 0,72-0,06 0,37-0,63 0,41-0,69 6 0,84 0,09 0,54-0,68 0,50-0,59 7 0,94 0,04 0,59-0,75 0,57-0,70 8 1,15 0,10 0,78-0,84 0,73-0,74 9 1,14 0,06 0,82-0,71 0,79-0, ,19 0,03 0,86-0,68 0,85-0, ,28-0,25 0,99-0,33 1,11-0, ,55 0,12 1,25-0,72 1,19-0, ,58-0,01 1,31-0,53 1,31-0, ,61-0,07 1,36-0,42 1,40-0, ,88 0,08 1,69-0,46 1,65-0, ,13 0,15 1,92-0,57 1,84-0, ,42 0,32 2,35-0,46 2,19-0, ,45 0,00 2,25-0,40 2,25-0, ,62 0,07 2,28-0,74 2,25-0, ,71 0,12 2,51-0,53 2,45-0, ,97 0,32 2,86-0,55 2,70-0, ,13 0,34 2,99-0,63 2,82-0, ,12 0,17 2,88-0,65 2,79-0, ,12 0,12 2,94-0,49 2,88-0, ,29 0,43 3,22-0,56 3,01-0, ,16 0,16 2,95-0,58 2,87-0, ,45 0,46 3,47-0,42 3,24 0, ,58 0,28 3,49-0,47 3,35-0, ,70 0,39 3,68-0,43 3,48-0, ,03 0,80 4,20-0,46 3,80 0, ,10 0,40 4,18-0,24 3,98 0, ,62 0,85 4,57-0,94 4,15-0, ,51 0,49 4,48-0,55 4,23-0, ,87 0,89 6,44 0,25 5,99 1, ,29 1,05 6,63-0,37 6,10 0, ,92 1,30 7,33-0,49 6,68 0, ,41 1,20 8,04 0,06 7,44 1, ,73 1,40 8,54 0,22 7,84 1, ,78 1,12 8,15-0,38 7,59 0, ,31 2,19 11,65 0,49 10,55 2, ,84 0,92 10,64 0,67 10,18 1, ,65 1,71 11,12-0,77 10,26 0, ,96 2,28 11,87-0,47 10,73 1, ,14 0,52 10,64 0,47 10,38 0,99 Tabel 10. Viser de beregnede data udfra de 44 udvalgte patient blodprøver, ud af de 50 til at udregne et differenceplot, hvor de tre apparater er sat to overfor hinanden i en difference plot. 39

40 BN ProSpec [mg/l] Sammenligning af BN Prospec overfor Cobas6000 Figur nr. 9 Viser en lineær regression for metodesammenligning mellem Cobas6000 overfor BN Prospec. Ved at se på figuren er der beregnet en skæring på -0,2098, og en hældning på 1,1879. R 2 Værdien er beregnet til 0,9927. ved at sætte en regressionslinje(sorte linje) ind er det muligt at se om punkterne ligger på en ret linje, og ved at sætte en identitetslinje ind er det muligt at vurdere en skæring i 0,0, da(røde linje), har en funktion på y = x, og ved at sammenligne disse to linjer, er det muligt at se om forskellen kan skylden en systematisk fejl. Cobas 6000 Vs. BN ProSpec y = 1,1879x - 0,2098 R² = 0, y = x 6 4 Serie1 2 Serie2 Regressionslinje Cobas 6000 [mg/l] Identitetslinje Figur 9. Viser en lineær regression ved sammenligning af Cobas6000 ud af X- aksen og BN Prospec ud af y- aksen overfor, figuren viser en skæring på -0,2098 og en hældning på 1,1879. R 2 Værdien er beregnet til 0,

41 Diff. (BN ProSpec - Cobas 6000) Differenceplot ved metodesammenligning af BN Prospec overfor Cobas6000 2,5 Differenceplot for hscrp Cobas6000 vs BN Prospec 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2, Middel: (BN ProSpec + Cobas 6000)/2 [mg/l] Serie1 Figur 10. Ved at have middelværdien ud af X- aksen for de to apparater, og difference mellem de to apparater er op af Y- aksen. Den røde linje, viser hvor 0 er, for at danne et bedre overblik over værdierne i difference plottet. Ved beregning af en procentvis afvigelse for Differenceplot for Cobas6000 overfor BN Prospec, er det muligt at vurdere hvor langt de to apparater ligger fra hinanden ved den givne måling, se tabel nr. 11 Beregningen vil blive foretaget som en stikprøve i det lave område af måleområdet. - Udregning: Differencen/ Middelværdien 100 % Fra 0-3 mg/l er der en % afvigelse på: [mg/l] Beregning: Procent afvigelse 1 mg/l 0,04/0, ,26 % 2 mg/l 0,15/2, ,04 % 3 mg/l 0,34/3, ,86 % Tabel 11. Viser udregningerne for den procent vis afvigelse, beregnet for 3 punkter, i det lave måleområde. 41

42 Konfidenceinterval for beregnet data ved lineær regression for sammenligning af BN Prospec overfor Cobas6000. der er i Excel regneark blevet beregnet et konfidenceinterval, for at vurdere om middelværdien, med en 95 % tilfældighed, se tabel nr. 12. Beregning: middelværdi + t 0,05(f) Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95 % Upper 95 % Intercept -0, , , , , , Hældning 1, , , ,8094E-46 1, , Tabel 12. Viser konfidensintervallet, der er beregnet for sammenligningen af BN Prospec overfor Cobas6000, med en 95 % tilfældighed for om der ses en sammenligning. 42

43 Kone 30i []mg/l Metodesammenligning Metodesammenligning af BN Prospec overfor Kone30i. Figur nr.10 viser en sammenligning af BN Prospec overfor Kone30i, udført ved en lineær regression, Hvor der er beregnet en skæring på -0,6621, og en hældning på 1,0604. R 2 Værdien er beregnet til 0,9935. Regressionslinje(sorte linje)bruges til at se om punkterne ligger på en ret linje, og ved at sætte en identitetslinje ind er det muligt at vurdere en skæring i 0,0, da(røde linje), har en funktion på y = x. Ved at sammenligne disse to linjer, er det muligt at se om forskellen kan skylden en systematisk fejl. BN ProSpec Vs. Kone 30i y = 1,0604x - 0,6621 R² = 0,9935 y = x Serie1 Serie2 Regressionslinje Identitetslinje BN ProSpec [mg/l] Figur 10 Viser en lineær regression ved sammenligning af BN Prospec ud af x- aksen overfor Kone30i som er ud af y- aksen. figuren viser en -0,6621, og en hældning på 1,0604. R 2 Værdien er beregnet til 0,

44 Diff. (Kone 30i - BN ProSpec) Difference plot for metodesammenligning af BN Prospec overfor Kone30i Difference plot udført for metodesammenligning af BN Prospec overfor Kone30i. Ud af x- aksen middelværdien mellem BN Prospec og Kone30i, og på y-aksen er sat differencen mellem de to apparater. Den røde streg indikerer 0, for et bedre overblik over differenceplottet: 1,0 0,8 0,6 0,4 Differenceplot for hscrp BN Prospec vs Kone30i 0,2 0,0-0,2-0,4-0,6-0,8-1, Middel: (BN ProSpec + Kone 30i)/2 [mg/l] Serie1 Figur 11. Ved at have middelværdien for de to apparater er ud af X- aksen og op af Y- aksen er det difference mellem de to apparater. Den røde linje, viser hvor 0 er, for at danne et bedre overblik over værdierne i difference plottet. Ved beregning af en procentvis afvigelse for Differenceplot for BN Prospec overfor Kone30i, er det muligt at vurdere hvor langt de to apparater ligger fra hinanden ved den givne måling. Beregningen vil blive foretaget som en stikprøve i det lave område af måleområdet. - Udregning: Differencen/ Middelværdien 100 % 44

45 Fra 0-3 mg/l er der en % afvigelse på: [mg/l] Beregning: Procent afvigelse 1 mg/l 0,33/0,99 100) 33,33 % 2 mg/l 0,40/2, ,78 % 3 mg/l 0,56/3, ,39 % Tabel 13. Viser udregningerne for den procent vis afvigelse, beregnet for 3 punkter, i det lave måleområde Konfidenceinterval for beregnet data ved lineær regression for sammenligning af BN Prospec overfor Kone30i. der er i Excel regneark blevet beregnet et konfidenceinterval, for at vurdere om middelværdien, med en 95 % tilfældighed, se tabel nr. 12. Beregning: Middelværdi + t 0,05(f) Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95 % Upper 95 % Intercept -0, , , ,2114E-12-0, , Hældning 1, , , ,60536E-47 1, , Tabel 14. Viser konfidensintervallet, der er beregnet for sammenligningen af BN Prospec overfor Kone30i, med en 95 % tilfældighed for om der ses en sammenligning. 45

46 Kone 30i []mg/l Metodesammenligning af Cobas6000 overfor Kone30i. Figur nr. 12 viser en sammenligning af Cobas6000 overfor kone30i. Der er beregnet en skæring på -0,8954, og en hældning på 1,2626. R 2 Værdien er beregnet til 0,9909. ved at sætte en regressionslinje(sorte linje) ind er det muligt at se om punkterne ligger på en ret linje, og ved at sætte en identitetslinje ind er det muligt at vurdere en skæring i 0,0, da(røde linje), har en funktion på y = x, og ved at sammenligne disse to linjer, er det muligt at se om forskellen kan skylden en systematisk fejl. 12 Cobas 6000 Vs.Kone 30i y = 1,2626x - 0,8954 R² = 0, y = x Serie1 Serie2 Regressionslinje Identitetslinje Cobas 6000 [mg/l] Figur 12 Viser en sammenligning af Cobas6000 overfor Kone30i, hvor Cobas6000 er ud af x- aksen og Kone30i er ud af y- aksen. Ud fra figuren er det muligt at aflæse en skæring på -0,8954, og en hældning på 1,2626. R 2 Værdien er beregnet til 0,

47 Diff. (Kone 30i - Cobas 6000) Difference plot for metodesammenligning af Cobas6000 overfor Kone30i Difference plot udført for metodesammenligning af Cobas6000 overfor Kone30i. er der ud af x- aksen middelværdien mellem Cobas6000 og Kone30i, og på y-aksen er sat differencen mellem de to apparater. Den røde streg indikerer 0, for et bedre overblik over differenceplottet: 3,0 Differenceplot for hscrp Cobas6000 vs Kone30i 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2,5-3, Middel: (Cobas Kone 30i)/2 [mg/l] Serie1 Figur 13 Ved at have middelværdien er ud af X- aksen for de to apparater, og difference mellem de to apparater er op af Y- aksen. Den røde linje, viser hvor 0 er, for at danne et bedre overblik over værdierne i difference plottet. Ved beregning af en procentvis afvigelse for Differenceplot for Cobas6000 overfor Kone30i, er det muligt at vurdere hvor langt de to apparater ligger fra hinanden ved den givne måling. Beregningen vil blive foretaget som en stikprøve i det lave område af måleområdet. - Udregning: Differencen/ Middelværdien 100 % 47

48 Fra 0-3 mg/l er der en % afvigelse på: [mg/l] Beregning: Procent afvigelse 1 mg/l 0,58/1, ,25 % 2 mg/l 0,14/2, ,39 % 3 mg/l 0,42/2, ,63 % Tabel 15. Viser udregningerne for den procent vis afvigelse, beregnet for 3 punkter, i det lave måleområde Konfidenceinterval for beregnet data ved lineær regression for sammenligning af Cobas6000 overfor Kone30i. der er i Excel regneark blevet beregnet et konfidenceinterval, for at vurdere om middelværdien, med en 95 % tilfældighed, se tabel nr. 12. Beregning: middelværdi + t 0,05(f) Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95 % Upper 95 % Intercept 0, , , ,40434E-13-1, , Hældning 1, , , ,69491E-44 1, , Tabel 16 Viser konfidensintervallet, der er beregnet for sammenligningen af Cobas6000 overfor Kone30i, med en 95 % tilfældighed for om der ses en sammenligning. 48

49 Linearitet: Tabel nr. 17 viser Resultaterne til beregning for linearitetsforsøget, der er blevet anvendt, til beregning af lineær regression. De beregnede data koncentration for hvert apparat er beregnet ud fra den første målte koncentration, som i tabel 17 hvor det er nr. 1 ved hvert apparat, og er derefter divideres resultatet med 2. For udregning af linearitet blev dette udført i et Excel regneark, hvor der blev lavet en sammenligning ved hver analyse apparat. Den beregnede værdi, som var sat ud af x- aksen ved, Den målte værdi, som blev anvendt ud af y- aksen, ved lineær regression, se tabel 17. Der er også blev udregnet en R 2 -værdi, for hver analyse apparat. Cobas 6000 BN Prospec Kone 30i Nr. Forventet Konc. Beregn Konc. (mg/l) Målt Konc. (mg/l) Beregn Konc. (mg/l) Målt Konc. (mg/l) Beregn Konc. (mg/l) Målt Konc. (mg/l) 1 40mg/L 43,91 43,91 35,70 35,70 43,96 43, mg/L 21,96 18,94 17,85 18,60 21,98 24, mg/L 10,98 10,52 8,93 9,84 10,99 12,21 4 5mg/L 5,49 5,67 4,46 5,39 5,50 6,77 5 2,5mg/L 2,74 3,03 2,23 2,75 2,75 3,38 6 1,25mg/L 1,37 1,54 1,12 1,48 1,37 1,63 7 0,63mg/L 0,69 0,78 0,56 0,80 0,69 0,74 8 0,31mg/L 0,34 0,31 0,28 0,46 0,34 0,29 9 0,16mg/L 0,17 0,23 0,14 0,24 0,17 0, ,09mg/L 0,09 0,07 0,07 0,16 0,09-0,11 Tabel 17 Viser både de målte og beregnet resultater ved linearitets forsøget. For udregning af linearitet blev dette udført i et Excel regneark, hvor der blev lavet en sammenligning ved hver analyse apparat. Den beregnede værdi der blev anvendt er ud af x- aksen og den målte værdi er ud af ud af y- aksen ved lineær regression. 49

50 Målt Konc. [mg/l] Linearitets for Cobas6000 Linearitets forsøg for Cobas6000 er udført med lineær regression. Ved figur 14 er der beregnet en skæring på -0,0535, og en hældning på 0,9749. R 2 Værdien er beregnet til 0,9956. Ved at sætte en regressionslinje(sorte linje) ind er det muligt at se om punkterne ligger på en ret linje, og ved at sætte en identitetslinje ind er det muligt at vurdere en skæring i 0,0, da(røde linje), har en funktion på y = x, og ved at sammenligne disse to linjer, er det muligt at se om forskellen kan skylden en systematisk fejl. Linearitet på Cobas y = 0,9749x - 0,0535 R² = 0, y = x Serie1 Serie2 Regressionslinje Identitetslinje Beregnet konc. [mg/l] Figur 14 Viser en lineær regression udført for Cobas6000, hvor beregnet konc.[mg/l] er ud af x- aksen og målte konc. på apparatet er ud af y- aksen. 50

51 Målt konc. [mg/l] Linearitets for BN Prospec Linearitets forsøg for BN Prospec blev udført ved lineær regression. Ved figur nr. 15 er der beregnet en skæring på 0,4184, og en hældning på 0,9986. R 2 Værdien er beregnet til 0,9991. Ved at sætte en regressionslinje(sorte linje) ind er det muligt at se om punkterne ligger på en ret linje, og ved at sætte en identitetslinje ind er det muligt at vurdere en skæring i 0,0, da(røde linje), har en funktion på y = x, og ved at sammenligne disse to linjer, er det muligt at se om forskellen kan skylden en systematisk fejl. Linearitet på BN ProSpec y = 0,9986x + 0,4184 R² = 0,9991 y = x Serie1 Serie2 Regressionslinje Identitetslinje Beregnet konc. [mg/l] Figur 15 Viser en lineær regression udført for BN Prospec, hvor beregnet værdi er ud af x- aksen og målt værdi er ud af y- aksen. 51

52 Målt konc. [mg/l] Linearitets for Kone30i. Linearitets forsøg for Kone30i blev udført ved lineær regression. Ved figur 16 er der beregnet en skæring på 0,504, og en hældning på 1,0091. R 2 Værdien er beregnet til 0,9974. Ved at sætte en regressionslinje(sorte linje) ind er det muligt at se om punkterne ligger på en ret linje, og ved at sætte en identitetslinje ind er det muligt at vurdere en skæring i 0,0, da(røde linje), har en funktion på y = x, og ved at sammenligne disse to linjer, er det muligt at se om forskellen kan skylden en systematisk fejl. Linearitet på Kone 30i y = 1,0091x + 0,504 R² = 0, y = x Serie1 Serie2 Regressionslinje Identitetslinje Beregnet konc. [mg/l] Figur 16 Viser en lineær regression for Kone30i, hvor beregnet værdi er ud af x- aksen og målte værdi er ud af y- aksen. 52

53 Intraseriel Præcisions: Da dette forsøg blev udført to gange er resultaterne delt op i 1. del og 2. del. Der er for hvert apparat beregnet en middelværdi, SD og en CV %, for alle målingerne for hvert enkelt apparat ved hver koncentration. Udregningerne er udført i et Excel regneark. Del 1. Der blev ved denne del analyseret ved tre forskellige koncentrationer, [0 mg/l], [5 mg/l] og [10 mg/l]. Serum poolen for hver af de tre koncentrationer blev analyseret 10 gange i træk, se tabel 18. Nr. hscrpkonc. Ca. [0 mg/l] hscrp konc. Ca. [5 mg/l] hscrp konc. Ca. [10mg/L] Cobas6000 BN Prospec Kone 30i Cobas6000 BN Prospec Kone 30i Cobas6000 BN Prospec 1 0,32 0,31-0,05 7,83 9,36 9,54 10,55 11,08 13,60 2 0,31 0,30-0,02 7,89 9,59 9,71 10,38 11,50 12,92 3 0,32 0,30-0,06 7,86 9,24 9,61 10,50 11,80 13,23 4 0,31 0,38 0,00 7,93 9,46 9,57 10,53 11,90 13,23 5 0,31 0,30-0,01 7,90 9,47 9,50 10,47 11,90 13,30 6 0,32 0,30-0,55 7,93 9,64 9,42 10,52 11,80 13,35 7 0,31 0,31 1,87 7,79 9,51 9,45 10,57 12,00 13,14 8 0,31 0,32-0,05 7,91 9,53 9,79 10,56 11,90 13,19 9 0,31 0,32 0,01 7,87 9,66 9,77 10,60 11,90 13, ,30 0,32 0,00 7,88 9,56 9,75 10,49 11,80 12,98 Kone 30i n Middel 0,312 0,316 0,114 7,879 9,502 9,611 10,517 11,758 13,195 SD 0,01 0,02 0,64 0,04 0,13 0,14 0,06 0,27 0,20 CV % 1,92 7,57 559,04 0,56 1,35 1,42 0,59 2,32 1,52 Tabel 18. Viser målingerne for de Cobas6000, BN Prospec og Kone30i ved Intraseriel præcision, hvor der blev analyseret 10 gange i træk på samme serum pool ved hvert apparat. Figuren viser også beregnet middelværdi, SD og CV %, for alle tre apparater. 53

54 Del 2. Der blev ved denne del analyseret ved tre forskellige koncentrationer, [1 mg/l] og [3 mg/l]. Serum poolen for hver af de tre koncentrationer blev analyseret 6 gange i træk, se tabel 19. Nr. hscrp konc. Ca. [1 mg/l] hscrp konc. Ca. [3 mg/l] Cobas6000 BN Prospec Kone 30i Cobas6000 BN Prospec Kone 30i 1 0,99 1,02 0,87 3,58 3,95 3,90 2 1,01 0,98 0,95 3,62 3,97 3,89 3 1,00 1,01 0,89 3,56 3,88 3,89 4 1,01 1,03 0,87 3,52 3,91 3,85 5 1,00 1,02 0,88 3,56 3,93 3,81 6 0,99 1,00 0,87 3,58 3,88 3,78 n Middel: 1,000 1,010 0,888 3,570 3,920 3,853 SD 0,01 0,02 0,03 0,03 0,04 0,05 CV 0,89 1,87 3,52 0,92 0,94 1,28 Tabel 19. Viser målingerne for de Cobas6000, BN Prospec og Kone30i ved Intraseriel præcision, hvor der blev analyseret 6 gange i træk på samme serum pool ved hvert apparat. Figuren viser også beregnet middelværdi, SD og CV %, for alle tre apparater. Antigen excess Der blev ved antigen exces forsøget målt en koncentration på CRP, på alle tre analyse apparater, som vist i tabel 20. Cobas 6000 Kone30i BN Prospec Resultat: 355 mg/l 421 mg/l 276 mg/l Tabel 20 Viser resultatet, som de tre analyse apparater hver især målte på den kendte CRP] prøve. Resultatet for CRP prøven, blev målt på Kone60i til 270 mg/l. se Bilag nr

55 Diskussion I diskussionen vil der først blive udført en vurdering af hvordan BN Prospec og Kone30i udføre deres kalibrering, ved at sammenligne de to apparaters måde at behandle prøverne på i forhold til hvordan de kalibrerer. Der vil ikke blive diskuteret hvordan Cobas udføre og aflæser sin kalibrering og fortynding prøverne, da afdelingen ikke har materiale nok omkring apparatet fra Roche. Der vil for dette projekt blive diskuteret en metodesammenligning, med Cobas6000, BN Prospec og Kone30i parvis overfor hinanden, ved sammenligning i lineær regression og differenceplot. Derudover diskuteres linearitetsforsøgets sekvensfortynding for alle tre apparater enkelt vis, men resultater vurderes også overfor hinanden. Ved Intraseriel præcision, vil der blive vurderet for hvordan Cobas6000, BN Prospec og Kone30i analyserer serum poolens koncentration. Resultaterne vil blive diskuteret ud fra producenternes CV % i deres metodeblade for apparaterne. Det sidste forsøg, der vil blive diskuteret er antigen excess, hvor apparaternes evne til at analysere en høj CRP koncentration, vil blive vurderet, om der er antigen excess. Producenterne for Cobas6000 og Kone30i har fastsat en grænse for hvor høj koncentration apparaterne vil kunne analysere hscrp. For BN Prospec har producenten ingen grænse i metodebladet, men producenten har udført et tilsvarende forsøg, som der medtages i denne opgave til at diskutere apparaternes analyse resultat med ved dette forsøg. Metodeopsætning og kvalitetssikring Kalibrering: Kalibreringen af Kone30i og BN Prospec er forskellig fra hinanden. Kone30i anvender en fem punkts kalibrering, se figur 6, hvor den først fortynder ved punkt nr. 4. punkt 5 er ufortyndet kalibrator. Patient prøver analyseres ufortyndet op til 10 mg/l. herefter fortyndes 1+3. hvis prøven skal fortyndes yderligere, fortyndes ved manuel indtastning på apparatet. For godkendelse af Kone30i kalibrering, bliver kalibreringskurven visuelt vurderet, og godkendt på apparatet af en bioanalytiker, om de kalkuleret koncentrationer for kalibratoren stemmer overens med de målte koncentrationer for kalibratoren. se figur 6. 55

56 Ved dette forsøg blev kalibreringskurven for den nye testopsætning også godkendt, ud fra visuel vurdering af kalibreringskurven, og ved at se på de kalkuleret koncentrationer for kalibratoren i forhold til de målte koncentrationer, som Kone30i har angivet som kalibrator koncentrationer, se figur 6, under kalibreringskurven. BN Prospec udføre en syv punkts kalibrering, og fortynder ved punkt nr. 7. BN Prospec analysere patient prøver hvis prøven skal fortyndes yderligere, sker dette automatisk, således at omsætning af bits til koncentration foretages i kalibreringsområdet. se figur 5. Godkendelse af kalibrering på BN Prospec er en fuldautomatisk proces, som sker uden manuel godkendelse. for Cobas6000 var både kalibrering og kontroller for [HSCRP] analysen godkendt af en forsknings bioanalytiker, der vil ikke blive diskuteret selve testopsætningen og kvalitet sikringen af dette apparat. Kontroller. For BN Prospec kontroller ligger Cardiac marker (Low) i den høje ende af acceptintervallet, med værdier på 0,236 mg/l og 0,247 mg/l, se tabel 7, men er indenfor acceptintervallet, som er [0,191-0,251 mg/l]. For Immunology 1 (High) befinder kontrollerne udenfor acceptintervallet, som var [5,019-5,419 mg/l.], med 5,43 mg/l og 5,48 mg/l se tabel nr. 7. Afdelingen anvendte BN Prospec til hscrp analysen og godkendte Immunology 1 kontrollen i det niveau, da hscrp analysen var på BN Prospec. Ud fra Bilag nr.3, er det muligt at se hvilket niveau kontrollen har været i, da dette er rettet med kuglepen, til 5,47 mg/l, som acceptgrænse af en afdelings bioanalytiker. Der blev ved dette projekt vurderet at godkende kontrollen, selvom den var uden for acceptintervallet, da der er afgivet analysesvar for hscrp for rutine og forskningsprøver, og da analysen blev flyttet til Cobas6000 havde afdelingen ikke haft mulighed for at udregne et nyt acceptinterval for kontrollerne, så derfor besluttes det for kontrollerne på BN Prospec at disse godkendes til dette projekt. For analyse apparatet Kone30i, var der ikke indkørt en kontrol for hscrp analysen så da det var et nyt reagenskit, blev valget at bruge en kontrol, som laboratoriet bruger til frigivelse af resultater for [HSCRP] på Cobas6000, se tabel 7, der har en validitet i forhold til selve analyseresultaterne for dette projekt. Randox kontrollen blev analyseret flere gange ved hvert forsøg, for at kunne 56

57 vurdere hvordan niveauet var for kontrollen på Kone30i. Resultaterne svingede fra 0,85 mg/l til 1,46 mg/l, se tabel nr. 7. For Randox kontrollen når den anvendes til [HSCRP] analysen på Cobas6000 har den et acceptinterval på [1,156-1,396 mg/l], så hvis kontrollen skulle godkendes ud fra dette interval, ville der være nogle der ikke kunne godkendes, så det kan ikke lade sig gøre, da der er en variation i analyse apparaterne, så kontrollerne blev godkendt for testopsætningen af Kone30i, da der ikke var en indkørt kontrol til hscrp analysen for projektet. Metodesammenligning Prøvemateriale For Indsamlingen at prøvematerialet, til metodesammenligningen var det muligt at finde 50 patient blodprøver analyseret for [HSCRP] på Cobas6000, som repræsenteret hele det ønskede måleområde, som var < 10 mg/l. prøve materialet var analyseret på det samme apparat, dog analyseret over flere dage. Men alle prøverne var analyseret ved samme kalibrering, og ved analysering af samme Randox kontrol, som var blevet godkendt af forsknings bioanalytikeren. Se tabel 7. Vurdering af resultater Ud af de 50 patient blodprøver, blev kun anvendt 44 af dem, ved beregnede data for lineær regression og difference plot. Kone30i havde analyseret hscrp og målt resultater der var negative, resultat nr. 15, 26, 31, 48 og 50 se Bilag nr. 5 (Rådata), resultaterne var; - 0,19, - 0,41, - 0,21, - 0,12 og 0,06 mg/l. Dvs. at Kone30i havde problemer med at analysere hscrp i det lave område, for nogle af patient prøverne, og kunne ikke afgive disse svar. For BN Prospec var det ikke muligt at afgive svar for prøve nr. 26, da resultatet bliver afgivet som < 0,159 mg/l, se bilag nr. 2 hvilket stemmer overens med metodebladet for apparatet, hvor BN Prospec acceptgrænse er 0,16 mg/l, og derfor skriver apparatet < 0,159 mg/l, da analysesvaret ikke har en validitet, i forhold til det kalibreret måleområde, og derfor er resultat nr. 26 udeladt ved beregning af lineær regression. Der var også resultater, som blev valgt at tage med i beregningerne, men som lå under Kone30i måleområde, der har en nedre grænse på 0,25 mg/l, resultat nr. 9, 16, 30 og 34, med koncentrationer på 0,06, 0,03, 0,20 og 0,22 mg/l, Se Bilag nr.2. Men resultaterne lå stadig 57

58 indenfor det ønskede måleområde for projektet (0-10 mg/l), derfor blev disse resultater medregnet for Kone30i ved lineær regression. Derudover var der et resultat for BN Prospec, der lå langt fra de 2 andre apparaters analyse resultater, resultat nr. 21 se Bilag nr. 5 (Rådata). Cobas6000s analysesvar er 6,85 mg/l, og Kone30i måler 8,27 mg/l men BN Prospec måler 1,96 mg/l, for samme prøve, hvilket gør analyseresultatet for BN Prospec til en outlair, og valgt fra, til videre beregning af lineær regression og difference plot. Det ville have været hensigtsmæssigt at analysere prøven igen, men dette blev ikke gjort, resultatet på denne prøve kan skyldes en fejlkilde, som fx clot i form af koagel eller fibrintråde. Men kan også i en langt værre grad skyldes at BN Prospec ikke har fanget ved mærkning med flag, at der er noget galt med prøven. Dette er problematisk i forhold til at analyseresultatet befinder sig i det lave område 0-3 mg/l, hvor en patient ville kunne få en besked om en risiko for udvikling af cardio vaskulære sygdomme. Derved risikerer patienten at få en forkert besked, fordi BN Prospec ikke har analyseret prøven rigtigt. Cobas6000 overfor BN Prospec. Ved at se på Figur nr. 8, er der opsat en lineær regression for metodesammenligning af Cobas6000 overfor BN Prospec. Hældningen for regressionslinjen er 1,1879. hældningen afviger fra 1. Skæringen for regressionslinjen er 0,2098, og afviger fra 0. Korrelationsværdien (R 2 ) beregnet til 0,9927, ligger tæt på 1, og bekræfter at der er en sammenhæng mellem de to apparaters måde at analysere hscrp på. Figur nr.9 viser et differenceplot, hvor punkterne har en tendens til at ligge på den ene side af 0, stigende for x, som er middelværdien mellem de to apparater. Ved 0 3 mg/l ses en tendens til at apparaterne analysere hscrp med en lille forskel, og fra 3 10 mg/l. Ses en systematisk stigning for analyseresultaterne. Ved vurdering af procentvis afvigelse, for tre punkter i det lave koncentrations område, som en stikprøve for henholdsvis [1 mg/],[2 mg/l] og [3 mg/l], var der afvigelser på 4,26 %, 7,04 % og 10,86 %, hvor der ud fra regressionslinjen ses en tendens til at de to apparater måler med en lille forskel i analyse resultaterne. Ved at vurdering af konfidenceinterval for de analyseresultater der er beregnet for sammenligning af Cobas6000 overfor BN Prospec, er det ved at se på tabel nr. 12,et konfidensintervallet, der er udregnet med 95 % sandsynlighed, for at interceptet er indenfor intervallet,[ -0,3547-(-0,0649)] 58

59 hvis det var 0, men da 0 ikke kan være indenfor interceptet konfidenceinterval, er det muligt at sige at der er en forskel i de apparaters måde at analysere hscrp på. Det samme kan formuleres for om X er variabel fra 1, ved at se om 1 kan være i konfidensintervallet [1, ,2197], her er der heller ikke mulighed for at 1 kan være inden for intervallet af 95 % sandsynlighed, og derfor er der en forskel i de to metoders måde at analysere på. BN Prospec overfor Kone30i. Ved metodesammenligning af BN Prospec og Kone30i ved lineær regression, se figur 10, hvor der kan aflæses en Hældningen på 1,0604, for regressionslinjen, der afviger fra 1. Skæringen er beregnet til 0,664 og afviger fra 0. R 2 - værdien er beregnet til 0,9935, og er tæt på 1. hvis, så der er en sammenhæng mellem de to apparater. Figur nr. 11 viser et differenceplot, for sammenligning af BN Prospec overfor Kone30i, hvor der ser ud til at være en overvægt af negative differencer, dvs. en tendens til at y- værdierne, som er differencen mellem de to apparater. For at se hvor langt de to apparater ligger fra hinanden i det lave måleområde (0 3 mg/l), er der udregnet en procentvis afvigelse, som en stikprøve, for koncentrationerne [1 mg/],[2 mg/l] og [3 mg/l], der var afvigelser på 33,33 %, -17,78 % og - 17,39 %, se tabel nr. 13. Hvilket viser at der er en tendens til at BN Prospec og Kone30i måler med stor variation i det lave måleområde. Konfidensintervallet for to apparaters analyseresultater er beregnede, Ved at se på tabel nr. 14, er det muligt at aflæse konfidensintervallet, der er udregnet med 95 % sandsynlighed. Interceptet er indenfor intervallet,[ -0, (-0,52138)], hvis interceptet var 0. Men da 0 ikke kan være indenfor interceptet konfidenceinterval, er det muligt at sige at der er en forskel i de apparaternes måde at analysere hscrp på. Det samme kan formuleres for om hældningen, ved at se om 1 kan være i konfidenceintervallet [1,0336-1,0872]. Her er der heller ikke mulighed for at 1 kan være inden for intervallet af 95 % sandsynlighed, og derfor er der en forskel i BN Prospec metode at analysere hscrp på i forhold til Kone30i. Cobas6000 overfor Kone30i. Ved figur nr. 12 er der ved lineær regression for sammenligning af Cobas6000 overfor Kone30i. Hældningen for regressionslinjen er 1,2626, og afviger fra 1, og skæringen er beregnet til 0,8954, og afviger fra 0. Korrelationsværdien (R 2 ) er beregnet til 0,9909, og er tæt på 1. Figur nr.13 er et differenceplot, til at vurdere om der er en difference i forhold sammenligning af 59

60 Cobas6000 overfor kone30i. der er i det lave område (0 3 mg/l), en overvægt af negative differencer, og fra ca. (4 11 mg/l), ses en tendens til større spredning i differencen mellem de to apparater. For at se hvor langt de to apparater ligger fra hinanden i det lave måleområde (0 3 mg/l), er der udregnet en procentvis afvigelse, som en stikprøve, for koncentrationerne [1 mg/],[2 mg/l] og [3 mg/l]. Afvigelserne var på 52,25 %, -6,39 % og -14,63 %, se tabel 15. Hvilket viser at der er en tendens til at Cobas6000 og Kone30i måler med en tendens til variation i det lave måleområde. Konfidenceintervallet for de to apparaters analyseresultater er beregnede. I tabel nr. 16, kan der aflæses et konfidenceintervallet, der er udregnet med 95 % sandsynlighed, for at interceptet er indenfor intervallet,[ - 1, (-0,7237)] hvis det var 0. Men da 0 ikke kan være indenfor interceptet konfidenceinterval, er det muligt at sige at der er en forskel i de apparaters måde at analysere hscrp på. Det samme kan formuleres for om hældningen, ved at se om 1 kan være i konfidenceintervallet [1,2249-1,3003], her er der heller ikke mulighed for at 1 kan være inden for intervallet af 95 % sandsynlighed, og derfor er der en forskel i Cobas6000 metode at analysere hscrp på i forhold til Kone30i. Opsamling af metodesammenligning Der kan ved metodesammenligning af Cobas6000, BN Prospec og kone30i vurderes at der er en forskel i de tre apparaters måde at analysere hscrp på, men der ses en tendens til lineær sammenhæng ved sammenligning parvis af alle tre apparater i det lave område, da R 2 - værdierne ligger tæt på 1, for alle apparaterne når de sammenlignes parvis. for BN Prospec og Cobas6000, ses en større tendens i sammenligning af analysemetode, hvilket kan skyldes, at begge apparater retter deres kalibreringskurve ud, ved matematisk funktion. Der kan ikke ses en tendens i forskellen på måleprincippet for BN Prospec i forhold til Cobas6000, Der er ikke bevis for at BN Prospec har en bedre detektion af CRP i måleområdet < 10 mg/l, ved et højt sensitivt analyseprincip. Der er i en artikel blevet sammenlignet henholdsvis 9 apparatet, I artiklen William L. Roberts et a. l, [22], hvor der sammenlignes med bl.a. Dade Behrings BN II 4 og Roche, ved anvendelse af 388 serum prøver, hvor der også ses en lineær sammenhæng i måleområdet 0-3 mg/l, og ved statistisk 4 BN II er forgænger til BN Prospec, og måler nephleometrisk 60

61 beregning er korrelations værdien alle tæt på 1 (0,991-0,997). Så i forhold R 2 ved dette projekt er, har artiklen eller ikke fundet den store forskel på apparaterne. Artiklen konkluderer at der er en forskel i, men der er også lineærsammenhæng ved de ni apparater for analysering af hscrp. Men de konkludere at det er vigtigste data i forhold til at medvirke i assay til at forudsige hjerte-kar sygdomme. En anden artikel af Snježana Rothkrantz-Kos et Al. [23], bliver BN Prospec, der sammenlignes med Synchron LX 20 PRO, og Immage som er apparater der anvender tubidimetri ved analysering af hscrp. Ved denne sammenligning, blev der anvendt 521 blodprøver, deres resultater viser en lineær sammenhængen ved 0 2 mg/l. R 2 for BN Prospec overfor er 0,990, og Synchron LX 20 PRO overfor Immage var R 2 0,994. for artiklens konklusion, bliver der bekræftet at de ved metodesammenligningen er lineærsammenhæng, men der analyseres med en lille forskel i resultaterne. Artiklen mener at det er vigtigt at finde et apparat der kan have en valide resultater i hele måleområdet. Ved dette projekt overfor artiklen er der sammen tendens, da der er stor lineærsammenhæng i det lave måleområde. I en tredje artikel, William L Roberts et. al.[24] Bliver der sammenlignet fire apparater, som var Dade Berings BN II, og tre turbidimetrisk analyse apparater som var Immulite, Immage, Abbott IMX. Resultatet i artiklen viser at der er lineær sammenhæng i det lave område, 0-2 mg/l, ved anvendelse af 50 serum prøver, og en R 2 - værdi på 0,98, for alle tre apparater sammenlignet med BN II. I artiklen konkludere at det er en vigtig analyse, og at den kan være med til at gøre en forskel ved forudsigelse af hjertekarsygdomme ved at deltage i assay, og ikke stå alene som biomarkør, men mener også at der bør laves en standardisering af hscrp analysen. En fjerde artikel af Ahmed Hamwi, et.al.[21] er der udført en metodesammenligning forsøg med 4 apparater overfor BN II fra Dade Bering, de andre tre er fra Roche, Technoclone, Orion og Biokit, ved denne metode sammenligning, er der en tendens til at Dade Berings BN II detektere hscrp, ved lavere værdier end Orion, Biokit og Technoclone, men for Roche er der en tæt lineær sammenhæng ved deres sammenligning, med en korrelationsværdi på 0,9920, r 2 værdi ved de tre andre var; 0,9801, 0,978 og 0,9643. artiklen konkludere at der er stor sammenhæng ved en turbidimetrisk måling ved analysering af hscrp. 61

62 Linearitet: Ved linearitetsforsøget blev de udførte fortyndingsrækker dannet ved en sekvens fortynding, og hvor de beregnede koncentrationer, blev beregnet, som forventet resultat, da de blev beregnet ud fra den første målte koncentration på hver af apparaterne se tabel nr.11. Og med apparatets egen dilluent, hvilket kan betyde at der er en variation i resultatet for apparaterne ved sammenligning. Sekvensfortyndingen blev valgt på baggrund af at minimere fejlkilder ved en fortynding, da der ikke bliver overført fortyndingsfejl til næsteglas, da der fortyndes med en finpipette, der fra hver prøve overføre, så hvert glas er en ny fortynding. Ved dette forsøg blev det valgt at udføre en fortyndingsrække der dækkede hele måleområdet [0 10 mg/l], så det derved også er et forsøg der tjekker kalibreringsområdet for hscrp analysen. Cobas6000 For vurdering af Cobas6000 ved linearitets forsøget, se figur nr. 14 er der en linearitet ved koncentrationerne fra 0 mg/l og til ca. 10 mg/l, dvs. at der for projektets måleområde < 10 mg/l, udført en sekvens fortynding, hvor apparatet rammer den beregnede koncentration med lille variation i det lave område, og med lidt større varians ved koncentrationerne over 10 mg/l Hældningen er 0,9749, hvilket er tæt på 1, og skæring er 0,0535, som tæt på 0, det kan også vurderes ved at se på identitetslinjen, som skærer i 0, Der ligger regression linjen lidt over 0. R 2 - værdien er beregnet til 0,9956, som også ligger tæt på 1, og udfra disse resultater kan det vurderes en næsten ret linje med en skæring tæt på 0. dvs. at der er linearitet mellem den beregnet koncentration og målte koncentration for Cobas6000. BN Prospec. BN Prospec målte den første pool af serum lavere end de andre to apparater. For Cobas6000 var første koncentration målt til 43,91 mg/l, og for Kone30i blev første koncentration målt til 43,96 mg/l. men BN Prospec målte den første koncentration til 35,7 mg/l se tabel 17. Men for resten af fortyndingsrækken måler apparatet koncentrationerne tæt på de beregnede koncentrationer. Den sidste fortynding afgiver BN Prospec et resultat på < 0,159. det gør apparatet, da den ikke kan afgive svar under måleområdet for den nedre acceptgrænse på 0,16 mg/l. For lineær regression se figur 15, som viser at hældningen er beregnet til 0,9986 hvilket er tæt på 1, og ved at se på identitetslinjen er det svært at bedømme afstanden til regressionslinjen. Skæringen for 62

63 regressionslinjen er beregnet til 0,4184, som er tæt på 0 og dermed også tæt på at være en ret linje. Dette kan også bekræftes ved R 2 - værdien, som er 0,9991, og det er tæt på 1. Det er for BN Prospec et resultat, der er tæt på en fuldstændig linearitet, for hele måleområdet, og området op til de 35,7 mg/l, og derved konstaterer, at der er en lineær sammenhæng mellem målte og beregnet koncentrationer på BN Prospec. Kone30i. En vurdering af de beregnede koncentrationer for Kone30i se tabel 17, ses en tendens ved de lave koncentrationer at apparatet måler lavere en de beregnede koncentrationer omkring 0. Ved den sidste målte koncentration er resultatet negativt, og Kone30i kan ikke måle koncentrationen. For de målte koncentrationer omkring 1 mg/l og højere ses en tendens til at apparatet måler højere end de beregnede koncentrationer. For en bedre vurdering beregnes en lineær regression, se figur 16, hvor den samme tendens for koncentrationerne ses, ved at hældningen for regressionslinjen er 1,009, hvilket er højere end 1, men tæt på 1, og ved at forholde resultaterne til tendenslinjen ligger de over tendenslinjen, hvilket hældningen bekræfter ved at være større end 1. skæringen er beregnet til 0,504, som er tæt på 0, men den ligger over 0. R 2 - værdien, som var beregnet til 0,9974 kan fortælle om der er en linearitet, og om regressions linjen er ret, ved at vurdere resultatet er tæt på 1. så der er en lineær sammenhæng mellem den målte og beregnede koncentration på Kone30i. Opsamling af linearitetsforsøget For Cobas6000, BN Prospec og Kone30i, er der lineær sammenhæng for alle tre apparater ved analysering af hscrp, men for BN Prospec var der størst linearitet, da korrelationsværdien var tættest på 1. Der bliver i en artikel af William L. Roberts, et. al [24], hvor der bliver sammenlignet fire metoder(dade Behring, Immage, Immulite og IMx). Der bliver anvendt 2 serum pools med en konc på 14 mg/l, der fortyndes ned til linearitetsforsøget, der er linearitet ved alle 4 apparater, for BN II, IMx og Immage var R 2 på 0,994, og for Immulite var R 2 på 1. for de fire apparater er der beregnet en hældning og en skæring på BN II; 9,87 og 0,42. IMx; 13,33 og 0,48. Immulite; 8,86 og 0,84. Immage; 8,56 og 1,75. for BN II og IMX er der en skæring tæt på 0, men hældningen ligger langt fra 1, for Immulite er skæringen lidt længere fra 0 end de to første, men også med en 63

64 hældning langt fra 1, og for det sidste apparat er skæringen meget langt fra 0, og hældningen er langt fra 1, og derfor ses der systematisk fejl. Intraseriel Præcisions: Ved dette forsøg var det vigtigt at undersøge de tre apparaters præcision. Der blev ved dette forsøg udført 2 delforsøg, så resultaterne vil blive diskuteret ud fra del 1 og 2. Del 1. Resultaterne ses i tabel nr. 18, hvor måleområdet (< 10 mg/l), blev vurderet udfra tre koncentrationer; [0 mg/l], [5 mg/l] og [10 mg/l]. Koncentrationen af det poolet serum der blev analyseret, ses i tabel nr. 21. Koncentrationen fremgår som et interval, da det poolet serum ikke blev analyseret, som en prøve før selve forsøget. Det poolet serum blev analyseret 10 gange i træk på hvert apparat. Del 1. Resultater [0 mg/l] [5 mg/l] [10 mg/l] Koncentration af serum pool; 0,19-0,45 mg/l Koncentration af serum pool; 4,6-5,8 mg/l Koncentration af serum pool; 8,9 12,1 mg/l Cobas BN Prospec Kone3 Cobas6 BN Kone30 Cobas60 BN Kone30i i 000 Prospec i 00 Prospec N Middel 0,312 0,316-7,879 9,502 9,611 10,517 11,758 13,195 CV % 1,92 7,57-0,56 1,35 1,42 0,59 2,32 1,52 Tabel 21. Viser de beregnet resultater i form af middelværdien, og CV %, for alle tre apparater ved henholdsvis analysering af poolet serum ved [0 mg/l], [5 mg/l] og [10 mg/l]. [0 mg/l]. Ved at se på middelværdien tabel nr. 21, er det muligt at vurdere hvordan Cobas6000 måler i forhold til BN Prospec og Kone30i. Cobas6000 og BN Prospec analyserer med en forskel på 0,004mg/L. CV % for Cobas6000er 1,92 %, det vil sige at der er en god impræcision, da der er en lille spredning. BN Prospec har en CV % på 7,57 % den er højere end Cobas6000, men dette skyldes at der er et resultat, resultat nr. 4, i tabel nr. 18, der er lidt højere ned de andre resultater. Men apparatet har en god impræcision. For analyse apparatet Kone30i, var det ikke muligt at beregne resultaterne, da apparatet havde fået negative resultater, og havde derfor ikke mulighed for at afgive et analysesvar på dette serum pool. 64

65 [5 mg/l] Der var en udfordring ved analyseresultaterne for resultaterne ved [5 mg/l] se tabel18, da intervallerne for den poolet serum var lavere end det de tre apparater analyseret poolen til, se tabel nr.21. For Cobas6000, BN Prospec og Kone30i måler alle tre apparater de samme 10 pools med en god præcision, da analyseresultaterne ligger tæt for hvert enkelt apparat se tabel nr.18. Men langt fra hvad der var forventet i forhold til intervallet for det poolet serums koncentration, se tabel nr. 21. Ved at se på tabel nr. 21, kan der ved middelværdien vurderes at BN Prospec og Kone30i måler ens ved denne koncentration. Cobas6000 måler ved en lidt lavere koncentration, med en forskel på ca. 1,623 mg/l, i forhold til BN Prospec og Kone30i. For BN Prospec er CV 1,35 % og Kone30i er CV 1,42 %. Cobas6000 har den laveste CV % på 0,56 %. Alle tre apparater har en god præcision [10 mg/l] Cobas6000, BN Prospec og Kone30i analyserer alle poolet serum 10 gange i træk. Cobas6000 og BN Prospec har begge en middelværdi, der ligger inden for det poolet serums interval, se tabel nr. 21, men deres analyse resultater har en større varians fra hinanden, da Cobas har en middelværdi på 10,517, og BN Prospec er på 11,758. Kone30i er den der analysere serum poolen højest, og er også udenfor intervallet for poolen, med 13,195, se tabel nr. 21. Ved at se på CV % er det muligt via tabel nr. 21. Cobas har en CV på0,59 %, BN Prospec har en CV på 2,32 % og Kone30i har en CV på 1,52 %. Alle tre apparater har en god impræcision, da der er en lille spredning, i forhold til hvert apparats analysering af serum poolen for [10 mg/l]. Del 2. Der blev valgt at udføre to forsøg mere med Intraseriel impræcision, i den lave ende af måleområdet.(0 3 mg/l), da det er det område de tilsyneladende raske personer ligger i høj risiko for hjertekarsygdomme. Koncentrationerne blev;[1 mg/l] og [3 mg/l], se i tabel 19. der analyseres ved 6 målinger i træk, af samme pool ved alle tre apparater, ved hver koncentration. Koncentrationen for [1 mg/l] og [3 mg/l] ses i tabel nr

66 [1 mg/l] [3 mg/l] Del 2. Koncentration af serum pool; Koncentration af serum pool; Resultater 0,90 1,15 mg/l 2,97 3,97 mg/l Cobas 6000 BN Prospec Kone3 0i Cobas6 000 BN Prospec Kone30 i n 6 6 middel 1,000 1,010 0,888 3,570 3,920 3,853 CV % 1,89 1,87 3,52 0,92 0,94 1,28 Tabel 22 Viser de beregnet resultater i form af middelværdien og CV %, for alle tre apparater ved henholdsvis analysering af poolet serum ved [1 mg/l] og [3 mg/l]. [1 mg/l] Ved denne koncentration, måler Cobas6000 og BN Prospec serum poolen ens, se tabel 22. Kone30i måler poolen lidt lavere, med 0,112 mg/l forskel i middelværdien fra de to andre apparater. Ved at se på CV %, har Cobas6000 og BN Prospec målt med en lille spredning, og der er en god impræcision. Kone30i har også en god impræcision, men der er en lidt højere CV % på 3,52 %. [3 mg/l] Ved at se på middelværdien tabel nr. 21, er det muligt at vurdere hvordan Cobas6000 måler i forhold til BN Prospec og Kone30i. der er for alle tre apparaters vedkommende en forskel på 1,35 mg/l i variation for apparaternes middelværdi, de måler serum poolen med koncentrationer tæt på hinanden, se tabel nr. 22, hvor det ses at Cobas6000 er den der har den laveste middelværdi og BN Prospec og Kone30i måler tættest med en forskel på 0,067 mg/l. Cobas6000 og BN Prospec har begge en CV % på under 1 og Kone30i er lige over 1, se tabel nr. 22, der med kan det vurderes at der er en god impræcision for alle tre apparater, da der næsten er ingen spredning på analyseresultaterne. Producenternes Intraseriel præcision Producenterne for alle tre apparater har udført præcisions forsøg, som udfra metodebladene for hvert apparat kan aflæses[7,8,9]. Cobas6000 Cobas har udført et Intraseriel præcisions forsøg, se tabel nr. 23 ved en koncentration beregnet som middelværdi for 21 humane serum prøver, på [0,54 mg/l] og [15,9 mg/l], for humanserum. 66

67 Middelværdi: n CV % 0,54 mg/l 21 1,6 % 15,9 mg/l 0,4 % Tabel 23. viser en Intraseriel præcision udført den samme dag af producenten Roche, med 21 prøver, og ved 2 koncentrationer For sammenligning ved dette forsøg er det kun interessant at se på middelværdien ved 0,54 mg/l, da den anden middelværdi på 15,9 mg/l er udenfor projektets måleområde. Det ville have været spændende at diskutere resultaterne for Cobas ved flere repeterbarheds forsøg fra producenten ved 1-3 mg/l, da det er her at patienterne ligger i størst risiko for Cardiovaskulære og perifærevaskulære sygdomme. Cobas6000måler ved [0 mg/l], med en middelværdi på 0,312 mg/l, og er det forsøg der kommer tættest på producentens forsøg. For producentens CV % ved 21 patientprøver, er der en sammenlignelig for dette forsøgs CV %, da både producenten og projektet opnår en god præcision. BN Prospec Producenten Siemens, har vurderet BN Prospec måleområde med et præcisions forsøg. Ved dette forsøg hvor de anvender 40 humanserum prøver, og analysere dem 10 gange. De vælger at udføre deres intraserielle forsøg der har en beregnet middelværdi på [0,69 mg/l], [5, 95 mg/l] og [9,23/L], se tabel nr. 24. BN Prospec Middelværdi: n CV % 0,69 mg/l 2,3 % 5,95 mg/l 40 4,0 % 9,23 mg/l 1,3 % Tabel 24. Viser en Intraseriel præcision udført den samme dag af producenten Siemens, med 40 serumprøver, og ved 3 koncentrationer. Ved de første koncentration på 0,69 mg/l er der en CV % på 2,3 %. Ved 5,95 mg/l er der beregnet en CV % på 4,0, og ved sidste koncentration på 9,23 mg/l er der en CV % 1,3.ved sammenligning at projektet med Siemens forsøg, er der en fin sammenligning i måleområdet for BN Prospec. Der er en god validitet i at de anvender 40 prøver til deres forsøg, hvor dette projekt anvender mellem 6 67

68 og 10 prøver ved forsøgene. Det ville være interessant at diskutere det lave område ved flere forsøg Hvis Siemens havde udført flere præcisions forsøg ved 0-3 mg/l, da det er vigtigt at validiteten er høj ved afgivelse af svar til rekvirenten Kone30i producenten Thermo har valgt at udføre to intraserielle præcisions forsøg i det lave måleområde (0 3 mg/l), og et forsøg ved 7 mg/l, så de dækker hele det lave måleområde for hscrp,(< 10 mg/l). Thermo resultater for hele måleområdet er lavet med en god impræcision, Dvs. alle målinger er målt med en lille spredning. Ved dette forsøg kan der ikke sammenlignes med [0 mg/l], men kan sammenlignes ved [1 mg/l], da der blev målt en middelværdi på 0,888 mg/l. der er ved Thermo en CV % på 3,2 % hvilket ikke er nogen dårlig præcision, da der er 80 serum prøver, og ved dette forsøg er der 6. ved producentens to andre forsøg, se tabel 25, er der en god præcision, med næsten ingen spredning, hvilket apparatet også har vist i dette projekt, at have en god impræcision med en mindre spredning, se tabel 21 og 22.. Kone30i Middelværdi: n SD CV % 0,80 mg/l 0,002 3,2 % 2,41 mg/l 80 0,02 0,8 % 7,02 mg/l 0,04 0,6 % Tabel 25 Viser en Intraseriel præcision udført den samme dag af producenten Thermo, med 80 serumprøver, og ved 3 koncentrationer. Opsamling af Intraseriel præcision Cobas6000 Ved alle 5 koncentrationer havde Cobas6000 en CV % under 1 %, se tabel nr. 21 og 22. Cobas6000 er det apparat der på nuværende tidspunkt afgiver svar for hscrp analysen til rekvirenten, og det har ikke været muligt at finde nogle analytiske fejl, i forhold til at an analysere på samme serie af samme poolet prøve, ved gentagne målinger, lige efter hinanden. BN Prospec Ved næsten alle forsøg havde BN Prospec en CV % på omkring 1 %, men en enkel CV % var på 7,57 %, se tabel nr. 21 og 22.. For BN Prospec var der stillet en hypotese for at dette projekt ville opnå 68

69 en CV % på max 3 %. Der er ved [0 mg/l] observeret en CV % på 7,57 %, men ved at vurdere resultaterne, er der en enkelt prøve der måler CRP koncentrationen højere end de andre 9, hvilket gør udslaget. Ved de andre koncentrationer er der lave CV % med en max på 2,3 %. Kone30i Kone30i har en nedre grænse på 0,25 mg/l, men producenten har ikke udført et præcisions forsøg, selvom de vælger at apparatet kan afgive svar ved denne koncentration, hvilket ville have været spændende at diskutere. For [1 mg/l] var den beregnet CV % på 3,52 %, hvilket overstiger de max 2 % fra Producenten. Det er ikke en dårlig præcision for projektet, men de overstiger producentens CV %. Dette kan skyldes at dette forsøg er udført med færre målinger end producentens præcisions forsøg, hvor n = 80, dette projekt havde en n = 6 eller 10, som er væsentlig mindre. En artikel Roberto Dominici, Paula Lurachi og Carlo Frazini et. al [25]. Der er lavet en sammenligning mellem nephleometri(modular, Roche) og turbidimetrisk (Immage, Roche) måling af impræcision forsøg, som er udført ved to serum pool en høj og e lav hscrp på 2,12 og 8,21 mg/l. Poolen var mikset i 7 portioner, og hver blev analyseret 20 gange. Resultatet blev et interval på 2,12-8,21 mg/l ved nephleometri, med CV % på 1,78-2,29 % og ved tubidimetri blev intervallet 2,52-10,54 mg/l, og CV % på 2,96-5,75. de konkludere i artiklen at der bør laves flere præcisions forsøg i hele kalibreringsområdet, for at arbejde med forskelle i de to måleprincipper, og mener også at der skal en standardisering af hscrp analysemetoden, og mener at der er en sammenhæng, for de to måleprincipper. Antigen excess: Der blev ved dette forsøg anvendt en alm. CRP prøve med en koncentration på 270 mg/l, som var analyseret på Kone60i se bilag 6. Producenterne for de tre apparater har en grænseværdi for antigen excess på apparatet, altså om det er muligt at kunne aflæse et falsk for lavt resultat, ved at have overskud af antigen i kuvetten. For Cobas6000 er der i metodebladet fastsat en acceptgrænse på 1000 mg/l, og for Kone30i var grænsen 300 mg/l. BN Prospec har udført et forsøg, hvor de anslår en grænse på 500 mg/l, ved at der er blevet udført et forsøg med 71 serum prøver med en CRP koncentration på 500 mg/l, og der blev ikke opfanget noget antigen excess. 69

70 Cobas6000 Der vil ikke blive diskuteret hvordan den fortynder den høje prøve ned, med andet end at den gør dette automatisk, til den har mulighed for at afgive et resultat, i dette forsøg målte apparatet en koncentration på 355 mg/l, se tabel nr. 20, var der er der ikke tegn på antigen excess. BN Prospec BN Prospec fortynder prøven ned automatisk, men vælger at gå tilbage til prøven og fortynder forfra med en ny fortynding, dette tager i sin fulde længde 8 min pr. analysering, så for BN Prospec er det en lang analysering, og en prøve kan tage lang tid med en høj koncentration af CRP i prøven. Dette apparat aflæste en koncentration på 276 mg/l, se tabel 14, hvilket er et resultat der ligger op af det resultat på Kone60i, som var 270 mg/l. Der var heller ikke her tegn på antigen excess. Kone30i Kone30i fortynder ikke automatisk, men kommer med et forslag, som så skal godkendes manuelt af en bioanalytiker, hvis den ved standard fortyndingen ikke kan afgive et svar, så for en høj CRP prøve, som den der blev analyseret ved dette forsøg kan det tage lang tid for at komme med et resultat på prøven. Dette kan give en vigtig fejlkilde. En bioanalytiker skal vurdere mange fejlkoder, og mål resultater for at vælge en fortynding. Kone30i målte en koncentration på 421 mg/l, se tabel 20, hvilket er et højt resultat i forhold til referencemetoden, som i dette tilfælde er kone60i, der har afgivet et resultat til rekvirenten langt lavere end Kone30is resultat, se Bilag nr. 6. Men der er ikke tegn på antigen excess ved denne metode for analysering af antigen excess. Klinikerne ved at metoden ikke kan anvendes til måling af høje CRP prøver, idet de i de tilfælde skal bestille CRP på Kone60i. Afdelingen har analyseret 2 høje prøver, på henholdsvis 245 mg/l og 312 mg/l, som der var analyseret alm. CRP på kone60i og afgivet klinisk svar herfor, se bilag nr.7 på BN Prospec, den resultatet for BN Prospec, se Bilag nr. 7, Viser at apparatet har en tendens til at måle en høj CRP prøve højere end Kone60i, men viser ingen tegn på antigen excess. Der bliver i en artikel, William L. Roberts, et. al hvor der sammenlignes ni analyseapparater, der er bl.a. Dade Behrings BN II, som er forgænger for BN Prospec, og Roche, der producere Cobas6000. Her anvender de en prøve med en koncentration på 480 mg/l, på alle ni apparater, og finder ingen bevis for antigen excess. 70

71 Opsamling af Antigen excess Det har ved dette forsøg ikke været muligt at detektere antigen excess for Cobas6000, BN Prospec eller Kone30i, ved måling af en høj hscrp koncentration( > 250 mg/l). Konklusion Metodesammenligning Der kan ved metodesammenligning af Cobas6000, BN Prospec og kone30i vurderes at der er en forskel i de tre apparaters måde at analysere hscrp på, men der ses en tendens til lineær sammenhæng ved sammenligning parvis af alle tre apparater i det lave område (0 3 mg/l), da R 2 - værdierne ligger tæt på 1, for alle apparaterne når de sammenlignes parvis. for BN Prospec og Cobas6000, ses en større tendens i sammenligning af analysemetode, hvilket kan skyldes, at begge apparater retter deres kalibreringskurve ud, ved matematisk funktion. Der kan ikke vurderes en tendens i forskellen på måleprincippet for BN Prospec i forhold til Cobas6000. Der er ikke bevis for at BN Prospec har en bedre detektion af CRP i måleområdet < 10 mg/l, ved et højt sensitivt analyseprincip. Det har ikke været muligt at kunne detektere at nephleometri skulle måle CRP mere sensitivt end turbidimetrisk måleprincip, ved metodesammenligningen. 71

72 Linearitet For Cobas6000, BN Prospec og Kone30i, er der lineær sammenhæng for alle tre apparater ved analysering af hscrp, da korrelationsværdien var tættest på 1 ved analysering af hscrp på alle tre analyse apparater. Det er derfor ikke muligt at konkludere hvilket apparat der har den bedste linearitet. Intraseriel præcision Der ses en tendens til at Cobas6000 og BN Prospec måler med en lille forskel, men for alle tre apparater ligger de tæt, i forhold til apparaternes måde at analysere hscrp ved Intraseriel præcision. Det er derfor ikke muligt at vurdere hvilket analyseapparat der analyserer hscrp med den bedste præcision. Antigen exces Det har ved dette forsøg ikke været muligt at detektere antigen excess for Cobas6000, BN Prospec eller Kone30i, ved måling af en høj hscrp koncentration( > 250 mg/l), og det er derfor muligt at vurdere at producenternes påstande om at der ikke vil forekomme antigen excess ved analysering af en høj koncentration af CRP i en prøve, ved en høj sensitiv analyse metode ved Cobas6000, BN Prospec eller Kone30i analyse apparater. Opsamling af konklusion Cobas6000 afgiver allerede svar hscrp, hvilket der i opgaven, også vises evidens for at analyseapparatet er god til. BN Prospec har afgivet svar for hscrp analysen, tidligere på året, hvilket, der her i opgaven har fundet ud af at den kan, der er ikke evidens for at ikke kan anvendes, til hscrp analysen, men dette ville kræve en ny validering af Immunology 1. kontrollen, da prøver ellers ikke kan godkendes i kalibreringsområdet. Dette ville kræve at der blev udarbejdet et nyt acceptinterval for kontrollen på apparatet. Kone30i er det et helt nyt reagenskit, og der er ikke resultater til sammenligning, som fx videnskabelige artikler. For at kunne anvende hscrp analyse resultat som svar, skal der laves en ny metodesammenligning, hvor alle parametre bliver gennemgået for en metodevalidering. Derudover vil det være nødvendigt at finde en kontrol, som kan bruges til godkendelse af kalibrerings kurve, og udarbejde et acceptinterval for kontrollen på apparatet. 72

73 CRP som markør for Cardiovaskulære og perifere sygdomme Da hscrp analysen er stadig en forsknings analyse, men vil kunne anvendes, som biomarkør for Cardiovaskulære og perifere sygdomme i fremtiden, ved at indgå som en markør i en helhed af et sygdomsbillede, sammen med andre faktorer ved forudsigelse af disse sygdomme. Det kræver en standardisering af hscrp analysen, da de artikler som er brugt i diskussionen[21,22,23,24,25] alle konkludere at det kræver en struktureret bearbejdning af analysemetoden for hscrp, ved at lave en standardisering for analysen, da der er variationer for hvornår hvilkeapparat måler bedst som helhed, er det svært at konkludere hvilke apparat der måler hscrp bedst ud fra dette projekt. Perspektivering Der er i dette projekt lavet en delvis metodevalidering, det kunne være spændende at udføre en metodevalidering for Konelab, hvor alle valideringsparametrene vil blive gennem arbejdet for hscrp analysen, da det er et nyt reagenskit, og dermed få mulighed for at sammenligne analysemetoden for Konelab, da viden omkring dette kit ikke er stor. 73

74 Referencer [1 ] Hjerteforeningen, opdateret [2] [Paul M. Ridker and Nader Rifai]. High-sensitivity C-reactive protein: A novel and promising marker of coronary heart disease. Udgivet AF Clinical Chemistry, [3] [Paul M. Ridker and Josh D. silver town] Inflammation, C - reactive protein and Atherothrombosis. Udgivet af Periodontol, August [4] metodeblad for BN Prospec SIEMENS, CardioPhase, hscrp Revideret Juli.2012, [5] [Kenneth D. McClatchy]. Clinical laboratory medicine. 2. Udgave, 2002, udgivet af Lippincott Williams and Wilkins. ISBN Nr. 10: [6] [Jørgen lyngbye, Et. al]. Lyngbye`s laboratoriummedicin. Udgivet af nyt nordisk forlag. 2. udgave, ISBN Nr [7] Betjeningsvejledning, Kap. nr. 14. version 1.4- BN Prospec. Bilag, Udgivet af Siemens,

75 [8] metodeblad for Cobas6000 til hscrp analysen. Udgivet af Roche Diagnostic, [9] metodeblad forkone30i, til hscrp analysen. Udgivet af Thermo Scientific, 2011 [10] Funktionsprincip kone apparatur, udleveret modul 4, udarbejdet af Klinisk Biokemisk afdeling, Herlev hospital, 2003 [11] Analyseforskrift på Kone60i. Udgivet af Klinisk Biokemisk afdeling, Herlev Hospital, [12] instruktions vejledning. udgivet af Roche Diagnostic, oktober, 2013 [13], Analyseprotokol for BN Prospec. System Manual. Version; 5.1. Dec/ [14] [Michael Bishop Et Al] Clinical Chemistry, techniques, Principles, Correlations. 6 udgave, 2010 Udgivet Af Lippincott Williams & Wlikins, ISBN Nr [15] [Flemming Simonsen Merete Norsker Bergsøe Helle Jeppesen]. Analyseteknik, Instrumentering og metoder. Hæftet, Kapitel 3 og 4. Udgivet af Erhvervsskolernes Forlag, ISBN [16] DSKB anbefaling til metodevalidering, for klinisk biokemisk laboratorier Revideret 1. Okt.,

76 [17] [Ove S Lauritsen]. Statistik for bioanalytikere, udgivet 17. Udgave. Udgivet af bioanalytikeruddannelsen, Aug [18] [Hans Andersen Et Al.] Immunkemiske Metoder, teori og praksis 1. udgave, 6. opslag, Udgivet af Nucleus [19] Statistik noter for Bioanalytikere Udgivet af bioanalytiker uddannelsen ved Metropol skolen I København. udgivet [20] (Mette La Cour) Kompendium i generelle analyseprincipper. Udgivet af Bioanalytiker uddannelsen, Metropol KBH, Revideret 5 juli, [21] [Ahmed Hamwi et. al]. Evaluation of Turbidimetric High- Sensitivity C-Reactive Protein Assays for Cardiovaskulære Risk Estimation. Udgivet af Clinical chemistry, 2001 [22] [William L. Roberts] Evaluation of Nine Automated High- Sensitivity C-Reaktive Protein Methods: Implications for Clinical and Epidemiological Applications, Part. Udgivet af, Clinical chemistry, 2001 [23] [Snjezana Rothkrantz-Kos et. Al] Evaluation of two new High- Sensitivity Methods for C-Reaktive Protein. Udgivet af Annals of Clinical Biochemestry,

77 [24] [William L. Roberts] Evaluation of Four Automated High- Sensitivity C-Reaktive Protein Methods: Implications for Clinical and Epidemiological Applications. Udgivet af Clinical chemistry, [25][Roberto Dominici, Paula uraschi og Carlo Franzini]. Measurement of Creaktive Protein: Two High Sensitivity Methods Compared. Udgivet af Journal of Clinical Laboratory Analysis,

78 Bilag Bilag nr.1 Rundringning til hovedstadens hospitaler, hvor vi spurgte om hvilket analyseapparat klinisk biokemisk afdeling anvender til Høj sensitiv C- Reaktiv Protein. Hospital: RHEL(det gamle KPLL) Bispebjerg Rigshospitalet Hvidovre Glostrup Statens serum institut Analyse apparat: ADVIA KRYPTOR VITROS Alm. CRP på Cobas, måler ikke hscrp Alm. CRP på Vitros, måler ikke hscrp KRYPTOR 78

79 Bilag Nr. 2 Viser hvordan Cobas6000 detektere hele forløbet ved analysering af en prøve. Apparatet måler hvert 8. sekund. 79

80 Bilag Nr. 3 Viser acceptintervallet for Cardiac Marker(high) og Immunology (low) kontroller på BN Prospec. 80

81 Bilag Nr.4 Viser t- tabel til udregning af konfidenceinterval: 81

82 Bilag nr.5 Dette bilag viser rådata fra metodesammenligningen, da der blev analyseret 50 patient blodprøver, men det var ikke alle data det var muligt at beregne på. Nr. Cobas6000 (mg/l) BN Prospec (mg/l) Kone60i (mg/l) Nr. Cobas60000 (mg/l) BN Prospec (mg/l) Kone60i (mg/l) 1. 3, , < , ,

83 Bilag Nr. 6 Viser CRP resultatet for den valgte prøve for antigen excess, der er analyseret på Kone60i 83

84 Bilag Nr. 7 Viser to høje CRP prøver, som afdelingen har sammenlignet resultat fra Kone60i overfor BN Prospec. 84