Optimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik

Transkript

1 Afgangsprojekt for Den Sundhedsfaglige Diplomuddannelse Professionspraksis Optimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik Et kvalitetsudviklingsprojekt Udarbejdet af: Bioanalytiker Karen Mette Gram Laursen Vejleder: Daniel Ramskov Jørgensen Afleveringsdato: d. 17. december 2015 Antal anslag:

2 Resumé Real-time baserede behandlingsstrategiske mutationsundersøgelser er i dag en stor del af cancerdiagnostikken, og New Generation Sequencing (NGS) teknologien vinder også stærkt frem. Analyserne kræver en vis koncentration af ren ubrudt DNA template som grundlag for valide analyseresultater. Amplificerbarheden er afhængig af kvaliteten af anvendt DNA template. Udgangspunktet for analyserne er formalinfikseret og paraffinindstøbt væv (FFPE), hvilket kan medføre problemer i forhold til kvaliteten af DNA template. Formalinfikseringen og paraffinindstøbningen skaber varierende skader på DNA strukturen, hvilket påvirker DNA integriteten, mens formalin inducerede krydsbindinger i vævet imellem DNA og proteiner og internt i mellem molekylerne, besværliggør tilgængeligheden og oprensningen af DNA template. Afsnit for molekylærbiologi, Patologisk Institut, Aalborg Universitetshospitals fremtidige ønske om at indføre NGS teknologi og en oplevelse af, at kvaliteten af DNA template for RAS mutationsundersøgelser er svingende, medfører ønske om, at undersøge muligheden for at optimere protokollen for oprensning af DNA. På baggrund af 3 komparative empiriske delundersøgelser undersøges hvilken proteinase K inkubationstid og hvilken målemetode for evaluering af DNA udbyttet, der findes bedst egnet til, at danne grundlag for protokol for oprensning af DNA på FFPE væv. Dette ønskes vurderet ud fra balancen mellem kvalitet, effektivitet og økonomi. Ud fra diskussion af resultaterne fra de tre delundersøgelser findes, at det bedste grundlag for protokol for oprensning af DNA fra FFPE ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH er, at bibeholde den nuværende målemetode for evaluering af DNA udbyttet. NanoDrop ND-1000 spektofotometer muliggør et vejledende kvalitetstjek af renheden af DNA template forud for analyse. Validiteten af koncentrationsbestemmelsen af DNA udbyttet vha. NanoDrop ND-1000 spektofotometer vil, ved at korrigere for en systematiske bias, kunne øges betydeligt, uden brug af yderligere resurser. Desuden anbefales det ikke at ændre proteinase K inkubationstiden, førend effekten af en mere valid koncentrationsbestemmelse er undersøgt. En mindre forlængelse øger udelukkende DNA udbyttet minimalt, og ikke kvaliteten af DNA template. En forlængelse af proteinase K inkubationstiden natten vil øge både kvaliteten og udbyttet, men vil også forlænge svartiden betydeligt og dermed mindske effektiviteten.

3 Indholdsfortegnelse 1 Indledning Problembaggrund Anvendte protokoller og analyseprincipper Protokol for oprensning af DNA til behandlingsstrategiske mutationsanalyser Evaluering af DNA udbytte vha. Qubit 2.0 fluorometer Evaluering af DNA kvalitet vha. kvantitativ Real-time PCR Metode Strukturering af projekt Videnskabsteoretisk perspektiv Litteratursøgning Design Materiale Apparatur, analyse kits, reagenser og utensilier Prøvemateriale Data indsamling Empirisk undersøgelse af proteinase K inkubationstiden Empirisk undersøgelse af målemetode for evaluering af DNA udbytte Undersøgelse af konsekvens af protokolændring Databehandling Proteinase K inkubationstiden Målemetode for evaluering af DNA udbytte Konsekvens af protokol ændringer Etiske overvejelser Resultater Proteinase K inkubationstid Målemetode for evaluering af DNA udbytte Konsekvens af protokol ændringer Diskussion Proteinase K inkubationstid Målemetode for evaluering af DNA udbytte Konsekvens af protokol ændringer... 22

4 4.4 Metode Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilagsliste... 30

5 1 Indledning Denne opgave er skrevet som afslutning på den Sundhedsfaglige diplomuddannelse i professionspraksis. I forbindelse med diplomuddannelsen og i mit virke som bioanalytikerunderviser inden for specialet Patologi, har jeg fået indblik i laboratoriemedicinske områder, herunder molekylærbiologiske metoder. Jeg oplever, at der i sygehusvæsnet i dag til stadighed stilles større krav til effektivitet og kvalitet, hvilket kræver stort fokus på kontinuerlig metodeoptimering og kvalitetsudvikling. Denne opgave vil omhandle metodeoptimering og kvalitetsudvikling inden for molekylærbiologiske metoder. Indledningsvis beskrives centrale fagord og betegnelser (1). Amplifikation: Opformering Deoxyribonucleic acids (DNA): Molekyler der bærer individets genetiske information DNA template: Den DNA struktur der er mål for amplifikation og fungerer som skabelon for PCR-produktet. Elongering: Forlængelse af et molekyle ud fra molekylære byggesten New Generation Sequencing (NGS): Optimeret teknologi til sekventering, hvor mange gener analyseres parallelt med høj sensitivitet. Primer: Syntetisk fremstillet oligonukleotid der ved binding til DNA template virker som en starter for DNA syntese RAS: Betegnelse for en gruppe gener kodende for proteiner, der i aktiveret tilstand stimulerer til celledeling og celledifferentiering Sekventering: Molekylærbiologisk metode til at bestemme baserækkefølgen i DNA sekvenser Polymerase Chain Reaction (PCR): Metode til amplifikation af DNA struktur 1.1 Problembaggrund Cancer er i dag en folkesygdom. Hver tredje dansker får i løbet at deres liv stillet en cancerdiagnose. Takket være stort fokus på hurtig diagnostik, koblet med den rette behandling, overlever flere i dag en sådan diagnose (2,3). Dette fokus fremgår bl.a. af Region Nordjyllands handleplan 2015 for sundhedsområdet (4). Handleplanen præsenterer en strategi, der skal sikre, at patienter og pårørende oplever sikre og effektive patientforløb med mennesket i centrum. Da Sundhedsvæsnet er udfordret af en begrænset økonomi, samt et krav om større effektivitet, vil Region Nordjylland bl.a. fokusere på at undgå resursespild, bedre arbejdstilrettelæggelse, udnyttelse af personaleresurser samt, ud fra den nyeste viden, at tilbyde den rette og bedste behandling til rette tid (4). 1

6 Molekylærbiologiske metoder anvendes i dag i høj grad inden for cancerdiagnostikken. Den stadig stigende udvikling af muligheder for individuel målrettet terapeutisk behandling øger behovet derfor. Analyser vha. molekylærbiologiske metoder på korrekt udvalgt materiale af høj kvalitet kan være med til at sikre den bedst mulige behandling med færrest mulige bivirkninger for det enkelte individ. Derved sikres det endvidere, at sundhedsvæsnets resurser ikke benyttes uhensigtsmæssigt. Molekylærbiologiske analyser, i forbindelse med cancerdiagnostik, udføres oftest i sammenhæng med patoanatomiske analyser af vævet. Patoanatomiske analyser udføres med henblik på at påvise morfologiske forandringer i væv og kræver, at vævet er formalinfikseret og paraffinindstøbt (FFPE, Formalin-Fixed Paraffin Embedded). En stor del af de molekylærbiologiske analyser udføres derfor på FFPE væv (5). Formalinfiksering og paraffinindstøbning af vævet i forbindelse med de patoanatomiske analyser er nødvendig for at bibeholde vævets morfologi, undgå forrådnelse og muliggøre paraffinindstøbning, således vævssnit til mikroskopi kan fremstilles (6). Flere studier viser, at vævets behandling før og under fikseringen påvirker det DNA, der skal danne grundlag for molekylærbiologiske analyser. Tilstedeværelsen af enzymet DNase i vævet er en medvirkende faktor til en begyndende DNA nedbrydning frem til fikseringsprocessen deaktiverer enzymet. Formalinfiksering og paraffinindstøbning er yderligere faktorer der medvirker til nedbrydningen af DNA og dermed påvirker kvaliteten af DNA template. DNA strukturen ødelægges og tilgængeligheden af DNA besværliggøres. Formalin inducerer krydsbindinger i vævet imellem proteiner og imellem DNA og protein. Derudover kan formalin medføre hydrolyse af glycosidbindingerne mellem deoxyribose og baserne i DNA samt phosphordiester bindinger i DNAs rygrad, hvilket bevirker at DNA strukturen opdeles i korte fragmenter og dermed påvirker DNA integriteten. Jo længere tid vævet behandles med formalin, des mere påvirkes DNA (7). En stor del af de PCR-baserede molekylærbiologiske analyser på FFPE væv er rettet mod interessepunkter der kræver DNA template af en størrelse på omkring basepar, og validiteten af analyserne er afhængig af tilgængelighed af tilstrækkelig amplificerbart DNA template. Amplificerbarheden af DNA template er afhængig af renheden og integriteten af oprenset DNA. Er DNA template brudt, eller er der proteinrester eller andre kontaminerende stoffer tilstede, hæmmes amplifikationen (8). Formalinfikseringen og paraffinindstøbningen af væv påvirker DNAet i en sådan grad at kun en brøkdel af DNAet i vævet er amplificerbart og egnet for analyse (9). Koncentrationen af amplificerbar DNA template afhænger derfor af den totale koncentration af oprenset DNA og af oprensningsprocedurens evne til at blotlægge, ekstrahere og isolere DNA. Er ødelæggelsen af DNA integriteten for udtalt, eller er de anvendte procedurer ikke gode nok, er der risiko for, at der ikke oprenses tilstrækkeligt amplificerbart DNA for analyse. Der er stor forskel på de forskellige målemetoder til at bestemme DNA koncentration forud for PCR- baserede mutationsundersøgelser. De nemme, hurtige og billige er mere eller 2

7 mindre specifikke for DNA og skelner ikke mellem amplificerbart DNA og ikke amplificerbart DNA. Mere resursekrævende analyser vurderer koncentrationen af amplificerbare DNA strukturer af en vis længde (10 12). Gennem en årrække har den foretrukne metode for mutationsundersøgelser været mutationsspecifik PCR rettet mod de enkelte gener. Efterhånden som individuel målrettet terapeutisk behandling vinder indpas og geners indvirkning på de forskellige cancertyper afdækkes, øges behovet for at undersøge flere og flere gener pr. patient. New Generation Sequencing (NGS) teknologien, der muliggør undersøgelse af hele genomet eller større dele deraf, på baggrund af amplification af DNA template, kræver i dag ikke så store mængder DNA. Det er derfor blevet en mulighed at udføre disse analyser på FFPE væv og NGS teknologien vinder for øjeblikket større og større indpas i forbindelse med cancerdiagnostikken i Danmark (13). Afsnit for molekylærbiologi, Patologisk Institut (PI) er som en del af Aalborg Universitetshospital (Aalborg UH), underlagt kravene i Den Danske Kvalitetsmodel (DDKM) (14). Dette forpligter, ligesom Regionens Handleplan 2015 for sundhedsområdet, afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH, til kontinuerligt at undersøge og udvikle analyser og procedurer ud fra nyeste viden, således at kvalitet og effektivitet sikres inden for begrænsede økonomiske rammer. Ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH udføres rutinemæssigt PCR-baseret undersøgelser for mutationer i RAS generne i forbindelse med bl.a. diagnosticering af colon cancer. Ras generne koder for proteiner, der i aktiveret form sender aktiverende signaler til en række andre proteiner, hvilket resulterer i aktivering af celledeling og celledifferentiering. Normalt sker aktiveringen af RAS proteinerne ved binding af Epidermal growth factor til cellens Epidermal growth factor receptor (EGFR) (15). Patienter med colon cancer kan have gavn af anti-egfr behandling således, at Epidermal growth factor ikke kan bindes, og celledeling forhindres. Somatiske mutationer kan resultere i, at RAS proteinerne mister evnen til deaktivering af det stimulerende signal, hvilket betyder at celledeling og celledifferentiering foregår ukontrolleret uden vækstfaktor bundet til EGFR. Patienter med disse somatiske mutationer vil derfor ikke have gavn af anti-egfr behandling og forskning har vist at anti-egfr behandling af disse patienter kan øge progressionen af canceren og mindske den gennemsnitlige overlevelse (16). Det er derfor vigtigt at identificere colon cancer patienter med somatiske mutationer i RAS generne. Ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg findes kvaliteten af DNA template for den rutinemæssige RAS mutationsundersøgelse(17) svingende. Dette kommer bl.a. lejlighedsvis til udtryk ved hæmmet PCR reaktion for den interne kontrol for analysen. Den interne kontrol 3

8 kontrollerer, hvorvidt koncentrationen af amplificerbar DNA template er tilstrækkelig til at danne grundlag for analysen. En hæmmet PCR reaktion kan bl.a. skyldes, at template DNA er brudt eller kontamineret, således at primer ikke bindes, eller DNA synteses brydes inden fuld amplifikation af DNA template. En hæmmet PCR reaktion for den interne kontrol medfører usikkerhed om, hvorvidt en mutationsanalyse, vurderet negativ, er sand negativ. Et falskt negativt resultat vil kunne resultere i fejlbehandling, og i værste fald, en forringelse af patientens prognose (16). For at undgå dette kræves nye mutationsanalyser, udført på dobbelt DNA koncentration, i håb om derved at øge koncentrationen af amplificerbart DNA (17). Dette er en resursetung løsning og er kun muligt, hvis der er tilstrækkelig DNA materiale tilgængelig. FFPE væv er den største kilde til prøvemateriale for disse analyser og kvaliteten af DNA template vil være påvirket heraf. Integriteten af oprenset DNA template vil kun være tilstrækkelig for en brøkdel af den totale koncentration af oprenset DNA. Hvor stor en brøkdel der er af tilstrækkelig integritet er individuel for det enkelte materiale (7). Når kvaliteten er svingende kan det enten skyldes, at der ikke er tilstrækkelig DNA af høj integritet tilstede, at den anvendte oprensningsprocedure ikke er god nok til at blotlægge, ekstrahere og isolere en tilstrækkelig koncentration af amplificerbar DNA template eller at vores målemetode til at evaluere DNA udbyttet af oprensningen ikke er tilstrækkelig sensitiv til at bestemme den korrekte koncentration af DNA for vore analyser. Idet det ikke umiddelbart er muligt at påvirke tilstedeværelsen af DNA af tilstrækkelig integritet ønskes protokollen for oprensning og evaluering af DNA udbyttet undersøgt og evt. optimeret. Ønsket om at undersøge og evt. optimere protokollen skyldes deslige, at afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH på sigt forventer at indføre NGS analyser på FFPE væv. De forholdsvis dyre og stadig tidskrævende analyser sætter endnu større krav til DNA template kvaliteten samt til koncentrationsbestemmelse af DNA template, således valide resultater kan danne baggrund for hurtig og korrekt diagnosticering og behandling samt at resursespild undgås. Den nuværende protokol for oprensning af DNA (bilag 1) udføres vha. en kommerciel semiautomatiseret procedure og er udarbejdet ud fra producentens anbefalinger. Producenten anbefaler en proteinase K inkubationstid på mellem 1 time til natten over, afhængigt af hvilken vævstype, DNA ønskes oprenset ud fra (18). I et forsøg på at standardisere proceduren, optimere arbejdsgangen og opfylde kravene for svartiderne udføres oprensningsproceduren med en proteinase K inkubationstid på 2 timer. Protokollen afsluttes med en evaluering af DNA udbyttet. Den anvendte målemetode er ikke specifik for DNA (12). 4

9 Afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH benytter i den nuværende protokol en forholdsvis uspecifik målemetode for bestemmelse af DNA koncentration og har valgt en forholdsvis kort proteinase K inkubationstid, der ligger i den lave ende af producentens anbefaling. Det er derfor relevant at undersøge hvorvidt afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH kan øge kvaliteten af DNA template fra FFPE anvendt for PCR-baserede molekylærbiologiske mutationsanalyser ved at optimere protokollen med udgangspunkt i disse parametre, således at kvaliteten af nuværende analyser og fremtidige NGS baserede analyser sikres, resursespild mindskes og patienten opnår den rette behandling til rette tid. Problemstillingen fører til følgende problemformulering: Hvilken proteinase K inkubationstid og hvilken målemetode for evaluering af DNA udbyttet forud for analyse er bedst egnet til at danne grundlag for protokol for oprensning af DNA på FFPE væv? Dette vurderet ud fra balancen mellem kvalitet, effektivitet og økonomi ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH. Begrebsafklaring Kvalitet: Betegner her amplificerbarhed på baggrund af integritet og renhed. Effektivitet: Effektivitet dækker her over svartiden for efterfølgende analyser og anvendte personaleresurser. 1.2 Anvendte protokoller og analyseprincipper I dette afsnit følger beskrivelse af analyseprincipper for nuværende protokol for oprensning af DNA, princip for den alternative målemetode for koncentrationsbestemmelse samt princip for evalueringsmetode for vurdering af DNA kvalitet Protokol for oprensning af DNA til behandlingsstrategiske mutationsanalyser Først beskrives nuværende protokol (bilag 1) og princip for oprensning af DNA fra FFPE væv på Maxwell 16 Instrument (19) vha. Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit (18) og koncentrationsbestemmelse vha. NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (12). Nuværende protokol består af 3 trin: Afparaffinering og proteinase K behandling på termomixer ved 70 C i 2 timer Oprensning på Maxwell 16 Instrument Koncentrationsbestemmelse af oprenset DNA vha. NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. 5

10 De tre trin vil blive gennemgået i de følgende afsnit. Gennem hele oprensningsproceduren medtages en negativ kontrol bestående af Nucleasefrit vand. Denne kontrol skal belyse hvorvidt de anvendte reagenser er kontamineret med DNA. Afparaffinering og proteinase K behandling på termomixer ved 70 C i 2 timer Afparaffinering, ekstraktion og oprensning af DNA udføres vha. Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit fra Promega. Prøvemateriale bestående af FFPE væv inkuberer på termomixer i 2 timer ved 70 C i en opløsning af inkubationsbuffer og proteinase K. Paraffinen smelter ved opvarmningen og enzymatisk spaltning af vævets proteinstrukturer påbegyndes. Enzymet proteinase K spalter ved hydrolyse peptidbindinger. Enzymaktiviteten er afhængig af forholdet mellem protein og proteinase K (20). Ved enzymatisk spaltning øges tilgængeligheden for DNA og evt. tilstedeværelse af DNaser, DNA nedbrydende enzymer, deaktiveres. Efter 2 timers inkubation tilsættes lysebuffer, hvilket medfører lyse af celle- og kerne membraner (18,21). Oprensning på Maxwell 16 Instrument Den automatiserede del af oprensningsproceduren foregår på Maxwell 16 Instrument. Her blotlægges DNA og isoleres fra cellerester og andre kontaminerende stoffer fra bl.a. oprensningsproceduren. Isolationen foregår vha. af et magnetiserbart stempel samt paramagnetiske silica partikler. Det delvist opløste væv tilsat lyse buffer overføres til brønd 1 i Maxwell oprensningskassette. Maxwell oprensningskassette består af forudfyldte brønde indeholdende paramagnetiske silica partikler samt flere hold vaskebuffer. Oprensningskassetten er illustreret i figur 1. Oprensningskassetten placeres på Maxwell 16 Instrument sammen med et tilhørende elueringsrør indeholdende Nuclease-frit vand. Når processen påbegyndes, knuses vævet vha. stemplet, således tilgængeligheden af DNA øges yderligere og inkubation med lyse buffer medfører lyse af celle- og kerne membraner, således at DNA blotlægges. Efterfølgende overføres de paramagnetiske silica partikler vha. magnetisering af stemplet til vævsopløsningen, hvorefter de frigives ved afmagnetisering af stemplet. De paramagnetiske silica partikler vil, i kraft af lysebufferens høje koncentration af kaotropiske salte, binde DNA. DNA vil efterfølgende, vha. en vekslen mellem magnetisering og afmagnetisering af stemplet, føres gennem en serie afvaskesteps, hvorved DNA skilles fra paraffin og cellerester og endelig overføres til elueringsrør indeholdende Nuclease-frit vand. Grundet den lave koncentration af kaotropiske salte vil DNA frigives fra de paramagnetiske silica partikler. Proceduren på Maxwell 16 Instrument er illustreret i figur 2. 6

11 Figur 1. Oprensningskassette (19) Figur 2. Oprensningsprocedure (19) Efter endt procedure på Maxwell 16 Instrument placeres elueringsrøret i en magnetisk holder, der er i stand til at tilbageholde de paramagnetiske silica partikler, således at det oprensede DNA eluat kan afpipetteres (18,19,22). Afslutningsvis bestemmes DNA koncentrationen og renheden vha. NanoDrop ND-1000 spektrofotometer, for at evaluere udbyttet af oprensningen, således den anbefalede koncentration af DNA for efterfølgende molekylærbiologiske mutationsanalyser kan sikres. Evaluering af DNA udbytte vha. NanoDrop ND-1000spektrofotometer NanoDrop ND-1000 spektrofotometer er en nem, hurtig og billig metode til at bestemme koncentrationen og renheden af oprensede nukleinsyrer. De spektrofotometriske målinger muliggør vurdering af, hvorvidt eluatet er kontamineret med proteinrester eller andre organiske stoffer fra bl.a. oprensningsproceduren (12,23). Metoden har et bredt detektionsinterval fra ng/µl og kræver kun 1 µl oprenset prøvemateriale. Prøvematerialet danner, vha. overfladespænding, en væskesøjle mellem 2 fiberoptiske kabler. Når monokromatisk lys i spekteret 220nm-750nm sendes gennem væskesøjlen vil komponenter i væsken absorbere lys ved forskellige bølgelængder. Intensiteten af passeret lys ved de enkelte bølgelængder registreres af en lysdetektor. Absorbansen, der er proportional med koncentrationen, beregnes vha. det tilhørende computersoftware ud fra Lambert Beers Lov (12). 7

12 Nukleinsyrer dækker over dobbeltstrenget DNA (dsdna) enkeltstrenget DNA (ssdna) og RNA. Alle nukleinsyrer har et absorptionsmaksimum omkring 260 nm. Absorbansen målt ved 260 nm er derfor et udtryk for koncentrationen af alle nukleinsyrer samt eventuelle uønskede komponenter der absorberer lys omkring samme bølgelængde. Uønskede komponenter i det oprensede prøvemateriale, såsom phenol og proteinrester, absorberer lys ved en bølgelængde på 280 nm. Forholdet mellem koncentrationen af nukleinsyrer og koncentrationen af uønskede komponenter i prøvematerialet beskriver renheden af det oprensede prøvemateriale. Oprenset materiale med en 260/280 ratio fra 1,8 betegnes som rent. Renheden kan undersøges yderligere ved at måle absorbansen ved 230 nm. Ved 230 nm absorberer bl.a. flere af de komponenter, der anvendes under oprensningsproceduren. Beregning af 260/230 ratio betegner renheden i forhold til disse komponenter. En ratio fra 1,8 betragtes her ligeledes som rent (23) Evaluering af DNA udbytte vha. Qubit 2.0 fluorometer Qubit 2.0 fluorometer og Qubit dsdna BR Assay Kit er ligeledes en nem og forholdsvis hurtig og billig metode til koncentrationsbestemmelse af oprenset DNA. Metoden kræver 1 µl prøvemateriale og har et detektionsinterval på 100 pg/µl-1µg/µl. Qubit dsdna BR Assay Kit indeholder et fluorochrom, der specifikt interkalerer med dsdna. Når fluorochromet tilsættes DNA eluatet vil det efter en kort inkubationstid interkaleres i dsdna, hvorved fluorochromets struktur ændres, hvilket medfører et stærkt fluorescerende signal. Det fluorescerende signal registreres af en detektor. Intensiteten af det fluorescerende signal er proportionel med koncentrationen af dsdna og beregnes vha. tilhørende software (11,24). Producenten tilbyder desuden tilsvarende analyse kits for koncentrationsbestemmelse af henholdsvis protein og RNA(11) Evaluering af DNA kvalitet vha. kvantitativ Real-time PCR. Som introduktion til Real-time PCR gives først en kort intro til PCR-metoden. PCR er en enzymatisk betinget cyklisk amplifikation af DNA template og bygger på DNAs evne til vha. baseparring at replikere sig selv. PCR er opbygget over tre trin. Første trin er varmeinduceret denaturering af dobbeltstrenget DNA template til enkeltstrenget DNA template. De enkeltstrengede DNA templates fungerer hver især som skabelon for DNA syntese. Når temperaturen sænkes påbegyndes næste trin. Andet trin er annealing af 2 specifikke primere til hver sin enkeltstrengede DNA template. De to primere er designet således, at de tilsammen definerer den dobbeltstrengede DNA template. Annealing af specifikke primere bevirker, at enzymet DNA polymerase i trin 3 er i stand til at forlænge de 2 primere. Ved at hæve temperaturen en smule øges enzymaktiviteten og DNA polymerase vil 8

13 effektivt udføre elongeringen ved at binde frie nukleotider til primerne efter baseparringsprincippet. Ved gentagne cykler af denaturering, annealing og elongering vil nydannede DNA strenge fungere som template for amplifikation og produkt af DNA template vil amplificeres eksponentielt (1,8). Real-time PCR er en metode til visuelt at følge amplifikation af DNA template. Amplifikation kan bl.a. visualiseres vha. fluorochromet SYBR green, der interkalerer specifikt med dsdna. Når SYBR green interkaleres i dsdna produkt, ændres fluorochromets struktur, hvorved det udsender et stærkt fluorescerende lys. For hver PCR cyklus detekteres intensiteten af fluoroscensen, der er proportional med mængden af PCR produkt. Når intensiteten af et specifikt fluorescerende lys overskider et defineret niveauet for baggrundslys (treshhold), afspejler antallet af cykler mængden af amplifcerbart DNA template. Den PCR cyklus, hvor intensiteten af det fluorocerende lys overskrider intensiteten af baggrundslys, betegnes som prøvens Ct-værdi og, er omvendt proportional med mængden af amplificerbar DNA template. Det vil sige at en høj koncentration af DNA template medfører en lav Ct-værdi (25). GeneRead TM DNA QuantiMIZE Assay kit er en Real-time baseret teknik til at bestemme koncentration og kvalitet af amplificerbar DNA på baggrund af 2 tredobbelte real-time PCR analyser over 40 cykler. De to analyser er rettet mod mere 40 loci tilfældig fordelt i genomet og genererer PCR-produkter af en størrelse på henholdsvis 100 bp (analyse 100) og 200 bp (analyse 200). PCR produkterne visualiseres vha. SYBR green, intensiteten af fluorescerende lys detekteres, og Ct-værdier bestemmes vha. Real-time apparaturets software. Koncentrationen af amplificerbart DNA template bestemmes vha. et tilhørende Excel-baseret analyseredskab ud fra en standardkurve lavet på baggrund af kontrol DNA af høj kvalitet. Derudover beregnes en Quality score (QC-score), der beskriver integriteten af DNA template beregnet på baggrund af forskellen mellem Ct-værdierne for analyse 100 og analyse 200. Ligger Ct-værdien for analyse 200 højere end Ct-værdier for analyse 100 indikerer det at større amplificerbare DNA templates er mindre udbredt end mindre amplificerbare DNA templates i denne prøve. Ligger Ct-værdierne for de to analyser helt tæt, indikerer dette at større amplificerbare DNA templates er lige så udbredt i materialet som mindre amplificerbare DNA templates, hvilket indikerer at intergriteten af DNA template er god. Ud fra QC scoren kategoriseres kvaliteten af det oprensede DNA som high eller low (10). 9

14 2 Metode I de følgende afsnit beskrives struktureringen af projektet, det videnskabsteoretiske perspektiv, litteratursøgning, undersøgelses design, materialer og metoder for henholdsvis dataindsamling og databearbejdning samt etiske overvejelser i forbindelse med undersøgelsen. 2.1 Strukturering af projekt I DDKM beskrives kvalitetsudvikling som en kontinuerlig cirkulær proces. Grundlaget for DDKM er PDSA-Cirklen. PDSA står for Plan, Do, Study og Act og beskrives som en 4 trinnet cirkulær proces (14). PDSA-cirklen, der er illustreret i figur 3, vil danne grundlag for dette kvalitetsudviklingsprojekt. Figur 3. PDSA-Cirklen (14) 2.2 Videnskabsteoretisk perspektiv Dette projekt tager udgangspunkt i en laboratoriemedicinsk problemstilling, hvor målbare parametre ønskes som grundlag for sammenligninger. Det laboratoriemedicinske virke hører under naturvidenskaben og det videnskabsteoretiske perspektiv for dette projekt vil derfor være positivistisk. Den positivistiske tilgang kendetegnes ved en systematisk og objektiv tilgang til udelukkende at forholde sig til det, der kan observeres (26). Dette projekt søger, vha. en objektiv systematisk tilgang og objektivisering, via målbare parametre, at beskrive hvilken proteinase K inkubationstid og hvilken målemetode for evaluering af DNA udbytte, der er bedst egnet til at danne grundlag for protokol for, oprensning af DNA på FFPE væv, ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH. Den naturvidenskabelige positivistiske tilgang kendetegnes desuden ved høje idealer om validitet og reliabilitet. Validiteten beskriver hvor velegnet undersøgelsen er til at undersøge dét, der er hensigten at undersøge, mens reliabilitet beskriver i hvilket omfang, undersøgelsen er reproducerbar (27). 10

15 2.3 Litteratursøgning Viden omkring litteratursøgning er opnået ud fra et udvidet kursus i informationssøgning samt beskrivelse af emnet i Bachelorprojekter inden for det sundhedsfaglige område (28). Dette projekt er opstået på baggrund af en tidligere opgave udformet i forbindelse med den sundhedsfaglige diplomuddannelse og litteratursøgningen til dette projekt tager derfor afsæt i litteraturen anvendt deri. Opgaven omhandlede en beskrivelse af en molekylærbiologisk problemstilling ud fra en erhvervet viden om molekylærbiologiske teknikker. Litteratur udvalgt til denne opgave er gennemgået og en del også fundet anvendelig for dette projekt. Denne litteratur har ligeledes dannet grundlag for en indledende søgning blandt diverse retningslinjer, protokoller og procedurebeskrivelser inden for emnet, gældende for afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH, samt en bred bevidst tilfældig søgning indenfor emnet på ucn.bib.dk, bibiolotek.dk og søgemaskinerne Google og PubMed. Gennemgang af udvalgt litteratur har yderligere ført til litteratur udvalgt via kædesøgning. For at sikre at relevant videnskabelig litteratur er identificeret og udvalgt kombineres den tilfældige søgning og kædesøgningen med en afsluttende systematisk søgning. Den systematiske søgning har taget udgangspunkt i den sundhedsfaglige amerikanske database PubMed. PubMed vælges, idet den hovedsageligt indeholder peer-reviewed materiale og dækker relevante emner som biomedicin og bioteknologi. Der er for hvert emne udført bloksøgning. Blokkene er konstrueret ud fra fritekstsøgning på relevante søgeord som DNA, Formalin-Fixed Paraffin Embedded, extraction mm. Der er valgt fritekstsøgning, idet søgning ud fra kontrollerede emneord gav et begrænset søgeresultat. Søgningen er afgrænset til udelukkende at inkludere full text materialer fra de seneste 10 år. Alle blokke, søgeord, og blok kombinationer er illustreret i bilag 2. Resultatet af den systematiske bloksøgning gav 119 hits. Materialets relevans vurderes indledningsvis ud fra titlen. Der udvælges ud fra titlen i alt 12 materialer. Ud fra Abstrakt fravælges yderligere 3 materialer. De resterende 9 materialer skimmes. Ingen af disse materialer vurderes til at kunne bidrage yderligere til dette projekt og inddrages derfor ikke. D Søgehistorik og udvælgelse af materiale er dokumenteret i henholdsvis bilag 3 og 4. Anvendt litteratur er kritisk vurderet og udvalgt efter relevans og validitet. Til udformning af dette projekt er der desuden anvendt faglitteratur benyttet på Patologisk Institut, Aalborg UH samt faglitteratur benyttet i forbindelse med den sundhedsfaglige diplomuddannelse. 11

16 2.4 Design Projektet er et kvalitetsudviklingsprojekt baseret på deskriptive kvantitative analyser på baggrund af komparative empiriske undersøgelser. Projektet er opdelt i 3 delundersøgelser. Første del er en undersøgelse af, hvordan 3 forskellige proteinase K inkubationstider påvirker kvaliteten og koncentrationen af DNA template. Koncentrationen og kvaliteten af DNA template, oprenset ud fra nuværende procedure med proteinase K inkubationstid på 2 timer, vurderes og sammenlignes med koncentrationen og kvaliteten af DNA template oprenset ud fra protokol med 2 alternative proteinase K inkubationstider på henholdsvis 4 timer og inkubation natten over, svarende til ca. 17 timer. De alternative proteinase K inkubationstider er valgt ud fra, hvad der rent praktisk er muligt i forhold til nuværende arbejdstid for PI, Aalborg UH samt med øje for mindst mulig påvirkning af svartiden. Koncentrationen vurderes efter nuværende protokol vha. NanoDrop ND-1000 spektofotometer. Kvaliteten af DNA template bedømmes ud fra 260/280 ratio og 260/230 ratio beregnet på baggrund af NanoDrop målingerne samt Real-time PCR analyse på LightCycler 480 Instrument vha. GeneRead TM DNA QuantiMIZE Assay kit. Anden del er en undersøgelse af, hvordan valg af målemetode påvirker evalueringen af DNA udbyttet af oprensningen. Måleresultater for henholdsvis nuværende metode, udført vha. NanoDrop ND-1000 spektofotometer, og alternativ metode, vha. Qubit 2.0 fluorometer, sammenlignes. Qubit 2.0 fluorometer er valgt som alternativ metode idet den anses for at være en nem, hurtig, forholdsvis billig og mere sensitiv metode til at bestemme DNA udbyttet med. Tredje del er en undersøgelse af, hvilke konsekvenser de forskellige ændringer af protokollen kan forventes at have på det økonomiske aspekt samt på effektiviteten målt på personaleresurse og svartid. Økonomi, personaleresurser og svartid for nuværende protokol sammenlignes med forventede konsekvenser for disse parametre ved de undersøgte protokolændringer. Resultaterne for de 3 delundersøgelser forventes efter diskussion at kunne besvare hvilken proteinase K inkubationstid og hvilken målemetode for evaluering af DNA udbyttet forud for analyse der bedst egnet til at danne grundlag for protokol for oprensning af DNA på FFPE væv ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH. Flow for praktisk udførelse af undersøgelserne er illustreret i figur 4 og vil blive nærmere beskrevet i følgende afsnit. 12

17 Formalinfikseret og paraffinindstøbt tumor væv Proteinase K behandling Angiver standard protokol 2 timer 4 timer Natten over Angiver ændring af protokol Maxwell 16 Automatiseret oprensning af DNA NanoDrop ND 1000 Koncentration Renhed Qubit 2.0 Fluorometer koncentration LightCycler 480 Kvalitets score Figur 4. Flow for praktisk del af undersøgelse Sammenlignes delundersøgelse 1 Sammenlignes delundersøgelse Materiale I de følgende afsnit redegøres for anvendt apparatur, analyse kits, reagenser og øvrige utensilier samt for udvælgelse og håndtering af anvendt prøvemateriale Apparatur, analyse kits, reagenser og utensilier Anvendte apparaturer, analyse kits, reagenser og øvrige utensilier er skematisk fremstillet i tabel 1. Procedure Oprensning af DNA Evaluering af DNA udbytte Koncentration + renhed Evaluering af DNA udbytte Koncentration Kvalitetsvurdering Real-time PCR Apparatur Termomixer Vortex-mixer, Bordcentrifuge NanoDrop ND-1000 spektrofotometer Qubit. 2.0 Fluorometer Vortex-mixer LightCycler 480 Instrument Vortex-mixer, Bordcentrifuge Maxwell 16 Instrument Analyse kits og øvrige reagenser Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit Nuclease-frit vand Nuclease-frit vand Qubit dsdna BR Assay Kit GeneRead TM DNA QuantiMIZE Assay kit Utensilier Pipette Pipettespidser Elueringsrør Pipetter Pipettespidser cellstof Tabel 1. Apparatur og materialer for de anvendte metoder Pipetter Pipettespidser Pipetter Pipettespidser 13

18 2.5.2 Prøvemateriale Prøvematerialet består af FFPE væv fra 9 forskellige materialer. Der anvendes et begrænset antal materialer idet de anvendte analyse kits er omkostningsfulde og projektet er begrænset af en økonomisk ramme. For at sikre sammenlignelighed og reliabilitet anvendes udelukkende adenocarcinom fra colon med højt estimeret tumorprocent. Adenocarcinom fra colon repræsenterer en stor del af det prøvemateriale fra hvilket, afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH rutinemæssigt oprenser DNA template for ud for PCR-baserede behandlingsstrategiske mutationsanalyser. Formalinfiksering og paraffinindstøbning af vævet er udført efter gældende protokoller for PI, Aalborg UH (29 31). Prøvematerialet er formalinfikseret i min 48 timer og maksimum 72 timer svarende til rutinemæssig fiksering af denne prøvetype. De anvendte paraffinindstøbte vævsblokke er anonymiseret og nummereret 1-9. Tumor lokaliseres og tumorprocenten vurderes ud fra Hæmatoxylin- og Eosinfarvede oversigtssnit af vævet. Mikrotomi og farvning er udført efter gældende procedurer (29). Tumorområde udvælges, markeres og tumorprocenten vurderes af erfaren patolog. Tumorprocenten for de udvalgte områder i de 9 materialer er estimeret til minimum 70 procent. Der anvendes materiale med en høj tumorprocent for at sikre tilstrækkelig DNA til begge empiriske undersøgelser. For hver vævsblok mærkes tre eppendorfrør. Eppendorfrørene mærkes alle med materialenummer plus proteinase K inkubationstid på henholdsvis 2 timer, 4 timer og Natten over. (ca. 17 timer). Se figur 5. Figur 5. Udvælgelse og mærkning af prøvemateriale. Der foretages makrodissektion fra de udvalgte og vurderede tumorområder i de enkelte paraffinblokke. For hver blok overføres væv direkte til de tre forskelligt mærkede eppendorfrør. Udvælgelse og makrodissektion direkte fra vævsblok er den rutinemæssige metode for mutationsanalyser ved afsnit for molekylær biologi, PI, Aalborg UH og udføres i henhold til gældende protokol (32). 14

19 2.6 Data indsamling I de følgende afsnit vil metode for dataindsamling for de 3 delundersøgelser beskrives enkeltvis Empirisk undersøgelse af proteinase K inkubationstiden Afparaffinering, ekstraktion og oprensning af DNA fra materialerne mærket proteinase K 2 timer udføres i henhold til protokol gældende for afsnit for molekylærbiologi (Bilag 1). Denne protokol er lavet på baggrund af anbefalinger fra Promega (18,19), producenten af Maxwell 16 Instrument og Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit. Afparaffinering, ekstraktion og oprensning af DNA fra materialerne mærket henholdsvis proteinase K 4 timer og proteinase K natten over udføres efter samme protokol, dog med forlængede proteinase K inkubationstider efter mærkning. Efter oprensning evalueres eluaternes DNA udbytte vha. NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Målingerne udføres i henhold til protokol gældende for afsnit for molekylærbiologi (33) Denne protokol er ligeledes lavet på baggrund af producentens anbefalinger (12). DNA template kvaliteten vurderes endvidere ud fra kvantitativ Real-time PCR udført på LightCycler 480 Instrument vha. GeneRead DNA QuantiMIZE assay fra Qiagen. Real-time PCR udføres i henhold til anbefalede protokoller (10,34). Kvaliteten vurderes ud fra en koncentration på 40 ng/µl svarende til den koncentration der rutinemæssigt anvendes ved afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH, til behandlingsstrategiske mutationsundersøgelser på adenocarcinom fra colon (17). Pladeoversigt over opdrypning af prøvemateriale og negative kontroller for real-time PCR analysen kan ses i bilag Empirisk undersøgelse af målemetode for evaluering af DNA udbytte Efter evaluering af DNA udbyttet ved hjælp af vha. NanoDrop ND-1000 spektrofotometer udføres endvidere DNA koncentrationsbestemmelse af alle eluater vha. Qubit 2.0 Fluorometer og Qubit dsdna BR Assay Kit. Koncentrationsbestemmelsen udføres i henhold til anbefalede protokoller (11,24). Eluatet fortyndes i forbindelse med koncentrationsbestemmelsen 1: Undersøgelse af konsekvens af protokolændring For at undersøge hvilken konsekvens de undersøgte protokol ændringer vil have for analyse pris, personaleresurser og svartid for efterfølgende analyser, indsamles data løbende gennem projektet. Tiden for personaleresurser vurderes ud fra egen erfaring indhentet under den praktiske udførsel af projektet. Betydning for svartid estimeres ud fra den daglige 15

20 arbejdstid på 7,4 timer for afsnit for molekylærbiologi, PI, Aalborg UH og prisen pr. eluat beregnes ud fra en pris for evaluering af 100 euater, indhentet ved forhandler. Priser indhentet ved forhandler kan findes i bilag X. 2.7 Databehandling I de følgende afsnit beskrives først den generelle behandling af data, hvorefter en gennemgang af databehandlingen for de enkelte delundersøgelser følger. Data er indhentet på baggrund af prøvemateriale behæftet med tilfældige variationer af DNA mængden i forhold til biologisk variation og variation i mængden af dissekeret materiale. Koncentrationen og kvaliteten af prøvematerialerne er undersøgt med tiden som en uafhængig variabel, hvorfor disse undersøges enkeltvis. Data fra delundersøgelse 1 og delundersøgelse 2 behandles i henhold til anbefalingerne i de tilhørende protokoller vha. af de anvendte apparaturers tilgængelige software og evt. tilknyttede dataanalyseredskaber. Efterfølgende undersøges, hvorvidt data kan antages at være normalfordelte. Undersøgelse af dette kan ses i bilag 6. Det vurderes, at ikke alle data kan antages som værende normalfordelte, hvorfor den efterfølgende behandling af data fortrinsvis vil bestå af deskriptiv statistik. Den begrænsede mængde data vurderes desuden ikke egnet som grundlag for analytisk statistik (35), hvorfor det udelukkende vil blive anvendt i mindre grad, hvor dette findes relevant Proteinase K inkubationstiden Data indsamlet i forbindelse med undersøgelse af, hvordan proteinase K inkubationstiden påvirker kvaliteten og koncentrationen af DNA template inkluderer data fra evaluering af DNA udbytte samt data fra kvantitativ real-time PCR. Data indsamlet i forbindelse med evaluering af DNA udbyttet på NanoDrop ND-1000 spektrofotometer behandles vha. tilhørende software. Behandlede data, der henholdsvis beskriver udbyttets koncentration og kvalitet i forhold til renhed, sammenlignes ved at indføre disse i histogrammer for at illustrere eventuelle forskelle. Data opsamlet for GeneRead TM DNA QuantiMIZE analyse af prøvematerialet via kvantitativ real-time PCR på LightCycler 480 Instrument behandles efter anbefalingerne (34) vha. tilhørende software. Beregnede Ct-værdier overføres efterfølgende til det anbefalede Excelbaserede dataanalyseredskab, hvor koncentrationen af amplificerbart DNA og QC score beregnes og DNA template kvaliteten kategoriseret som High eller Low. 16

21 2.7.2 Målemetode for evaluering af DNA udbytte Til at beskrive, hvorledes valg af målemetode påvirker evalueringen af DNA udbyttet, sammenlignes resultater for koncentrationsbestemmelse på henholdsvis Qubit 2.0 Fluorometer og NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Data opsamlet vha. Qubit 2.0 Fluorometer behandles indledningsvis efter anbefalinger i protokol vha. apparaturets software. Resultaterne for koncentrationsbestemmelserne sammenlignes vha. et Bland- Altman plot. Et Bland-Altman plot er en grafisk metode til at illustrere og bedømme overensstemmelsen mellem to målemetoder (35). Ses en systematisk forskel på de to målemetoder, indføres den beregnede middelværdi af differenserne for koncentrationsbestemmelsen samt limits of agreement svarende til ± 1,96 SD. Middelværdien af differensen beskriver en eventuel systematisk bias, mens intervallet mellem ± 1,96 SD beskriver i hvor høj grad forskellen mellem de to målemetoder spreder sig omkring middelværdien og udtrykker hvor systematisk forskellen på de to målemetoder er. Ud fra hvor stort et interval der findes acceptabel, kan det vurderes hvorvidt den systematiske bias kan korrigere for forskellen og de 2 metoder og de to metoder kan bruges i flæng (36) Konsekvens af protokol ændringer For at vurdere, hvilke konsekvenser ændringerne af protokol vil forventes at have på det økonomiske aspekt samt på effektiviteten, målt på personaleresurser og svartid, sammenlignes indsamlede data for nuværende protokol og data for protokol ændringer skematisk. 2.8 Etiske overvejelser Prøvematerialet til dette projekt er udelukkende anvendt med henblik på kvalitetssikring og kvalitetsudvikling til internt brug og kræver derfor ingen anmeldelse til myndighederne (28,37,38). Projektet benytter sig af anonymiseret arkivmateriale og beskæftiger sig udelukkende med protokoller for postanalytiske procedurer. Der indsamles ingen patientdata og projektet omhandler ikke diagnosticering og påvirker derfor ikke direkte patientbehandling. Hvis patienter ønsker at sikre at væv afgivet i forbindelse med behandling anvendes til andre formål end dennes behandling eller formål i tilknytning dertil, kræver dette en registrering i Vævsanvendelsesregisteret. Kvalitetssikring og i kvalitetsudvikling kan betragtes som et grundliggende formål for behandling og kræver derfor ikke informeret samtykke (39). 17

22 3 Resultater I de følgende afsnit præsentes resultaterne for de 3 del undersøgelser. Alle måleresultater er indført i et samlet skema i bilag 7. De tre oprensningsprocedurer vurderes, ud fra de medtagne negative kontroller, som værende forløbet tilfredsstillende. Måleresultater for de 3 kontroller kan ses i bilag 8-10, som indeholder diverse rådata. 3.1 Proteinase K inkubationstid I dette afsnit præsenteres resultater for undersøgelse af hvordan proteinase K inkubationstiden påvirker udbyttet og kvaliteten af DNA template. Figur 6 illustrerer at sammenligning af DNA udbyttet, oprenset ud fra nuværende protokol og alternative protokoller med proteinase K inkubationstid på henholdsvis 4 timer og natten over viser, at der er en tendens til, at udbyttet af DNA øges med inkubationstiden. Figur 6. Proteinase K inkubationstidens indvirkning på DNA udbyttet NanoDrop målemetoden muliggør endvidere en vurdering af renheden af det oprensede DNA ud fra beregning af 260/280 ratio og 260/230 ratio. Ud fra resultatskemaet bilag X ses at 260/280 ratioen er tilfredsstillende for 25 af 27 eluater svarende til 92,6 %, mens 260/230 ratioen kun er tilfredsstillende for 6 af 27 eluater svarende til 22,2 %. I figur 7 er illustreret hvordan proteinase K inkubationen påvirker renheden af oprenset DNA. Proteinase K inkubationstiden synes ikke at have den store indvirkning på 260/280 ratioen, der er et udtryk for bl.a. protein kontaminering. Der ses heller ikke en tendens til at en mindre forlængelse af inkubationstiden har nogen indvirkning på 260/230 ratioen. En forlængelse af inkubationstiden natten over ses dog at påvirke 260/230 ratioen hvilket indikerer at andelen af andre kontaminerende stoffer er faldende ved forlænget proteinase K inkubationstid. 18

23 Figur 7. Proteinase K inkubationstidens indvirkning på renheden af oprenset DNA. Angivelse for, hvornår DNA betragtes som rent er markeret med rødt. Proteinase K inkubationstidens indvirkning på kvaliteten af DNA template er desuden vurderet ud fra hvor stor en procentdel af den oprensede DNA template, der kan tilvejebringe PCR produkter af en længde på 100 bp eller 200 bp. Sammenligninger af den procentvise amplificerbarhed er illustreret i figur 8. Her ses en tendens til, at den procentvise amplificerbarhed ikke øges ved en mindre forlængelse af proteinase K inkubationstiden men derimod øges ved proteinase K inkubation natten over. Figur 8. Proteinase K inkubationstidens indvirkning på amplificerbarheden. Figur 9 viser en oversigt over hvordan kvaliteten af oprenset DNA template fra samtlige materialer er kategoriseret ud fra forholdet mellem størrelserne af de amplificerede DNA templates. Kvaliteten af alle materialer er kategoriseret som high. Figur 9. Kategorisering af kvalitet 19

24 3.2 Målemetode for evaluering af DNA udbytte I dette afsnit præsenteres resultater for hvordan valg af målemetode for koncentrationsbestemmelse påvirker evaluering af udbyttet af oprenset DNA forud for analyse. Sammenligningen af de to målemetoder er illustreret i figur 9. De tre Bland-Altman plots viser en tydelig tendens til at NanoDrop ND-1000 spektrofotometer systematisk måler koncentrationen af DNA højere end Qubit 2.0 fluorometer. Den systematiske bias (middelværdien af differencerne) ligger på mellem 76 og 100 ng/µl afhængig af det undersøgte koncentrationsniveau. Desuden ses at differensen mellem de to målemetoder er stigende med koncentrationen. Forskellen på de to målemetoder spreder sig mere omkring middelværdien af differencen, for undersøgelsen, der er lavet på baggrund af 4 timers proteinase K inkubationstid. Figur 10. Bland-Altman plots for de forskellige proteinase K inkubationstider 3.3 Konsekvens af protokol ændringer De undersøgte protokol ændringers konsekvens for pris pr. evaluering af DNA udbytte, brug af personaleresurser og svartid er illustreret i tabel 2. Protokol Proteinase K 2 timer NanoDrop ND-1000 spektofotometer Proteinase K 4 timer NanoDrop ND-1000 spektofotometer Proteinase K natten over NanoDrop ND-1000 spektofotometer Proteinase K 2 timer Qubit 2.0 fluorometer Proteinase K 4 timer Qubit 2.0 fluorometer Proteinase K natten over Qubit 2.0 fluorometer Tabel 2. Konsekvens af protokol ændring Pris for evaluering af DNA udbytte pr. eluat Personale tid pr evaluering af DNA udbytte. Svartid 0,- 1 min ved dobbeltbestemmelse Påvirker ikke svartiden for efterfølgende analyser 0,- 1 min ved dobbeltbestemmelse Påvirker ikke svartiden for efterfølgende analyser 0,- 1 min ved dobbeltbestemmelse Forlænger svartiden 1 dag 6,72,-* 3-4 min. Påvirker ikke svartiden for efterfølgende analyser 6,72,-* 3-4 min. Påvirker ikke svartiden for efterfølgende analyser 6,72,-* 3-4 min. Forlænger svartiden 1 dag Nuværende protokol anses som standard protokol og er markeret med ramme Tiderne er gennemsnitstider og priser er baseret på gennemsnits listepris ved 100 koncentrationsbestemmelser (se bilag 8) *Kræver nyanskaffelse af apparatur (se bilag 8). 20

25 4 Diskussion I følgende afsnit diskuteres resultaterne fra de 3 undersøgelser indledningsvis, dernæst følger diskussion af metode. 4.1 Proteinase K inkubationstid Resultaterne for proteinase K inkubationstidens indvirkning på DNA udbyttet, viser en tendens til, at jo længere tid vævet udsættes for proteinase K, des større bliver DNA udbyttet ved den efterfølgende oprensning. Denne stigning skyldes, at den nuværende proteinase K inkubationstid ikke medfører maksimal spaltning af protein (5) og dermed ikke optimal blotlægning af DNA. Det vil derfor være relevant at forlænge inkubationstiden for et større DNA udbytte. 260/280 ratio er acceptabel for 92,6 % af de oprensede materialer, hvilket indikerer at protein kontaminering ikke er et stort problem (23). 260/280 ratioen synes ikke at påvirkes af en øget proteinase K inkubationstid, hvilket betyder at forholdet mellem mængden af nukleinsyrer og den mængde protein, der er knyttet dertil, er uændret. 260/230 ratioen udtrykker graden af andre kontaminerende komponenter, der bl.a. kan stamme fra oprensningsproceduren (23). 260/230 ratioen er udelukkende tilfredsstillende for 22,2 % af de oprensede materialer, hvilket tyder på, at en betydelig del af den oprensede DNA kan være kontamineret med komponenter, der kan virke hæmmende for de efterfølgende analyser. 260/230 ratioen viser en tendens til, at en forlænget proteinase K inkubationstid på 4 timer ikke vil have nogen betydning for kontaminering med disse komponenter, mens en inkubation med proteinase K natten over vil have nogen betydning for renheden af det oprensede DNA. Det er dog usikkert, om yderligere forlængelse af proteinase K inkubationstiden vil kunne medføre en acceptabel 260/230 ratio. Resultaterne af den kvantitative Real-time analyse vha. GeneRead TM DNA QuantiMIZE Assay kit viser, at den procentvise koncentration af den amplificerbare DNA kun øges ved en forlængelse af inkubationstiden natten over. Da 260/280 ratioen ikke påvirkes af den øgede proteinase K inkubationstid, må den mængde protein, der er knyttet til DNA template og som ses ved evalueringen af dna udbyttet, ikke påvirke amplifikationen af DNA template betydeligt. Dette stemmer overens med, at ratioen for proteinrenheden er vurderet som acceptabel. Da 260/230 ratioen generelt ikke er acceptabel, kan denne formentlig have resulteret i, at den procentvise amplificerbarhed ikke er optimal og kan optimeres. Kvaliteten af amplificerbart DNA fra alle de undersøgte materialer kategoriseres på baggrund af den beregnede QC score som værende high. Dette viser, at integriteten af template fra 21