Den elektroniske næse: en hurtig objektiv måling af frø-kvalitet? Per V. Nielsen BioCentrum-DTU
genda Baggrund ekspertiser på DTU Hurtigmetoder til mykologisk kvalitets måling Hvad er en elektronisk næse? Eksempler på anvendelser Korn Ost Mykotoxiner Konklusion / diskussions punkter
Food Ecology: ll food products have their own specific group of microorganisms associate to them The Microbiota Spoilage Fermentation
Ecophysiology of Food-borne Fungi environmental conditions and stress The Food ecosystem Natural preservation systems Storage Spices and herbs Microbial interaction Water relations Extreme atmospheric conditions Processing Eco-physiology of food-borne fungi Germination Growth Reproduction Spoilage Fermentation Metabolites Chemometrics
The Food ecosystem Natural preservation systems Storage Spices and herbs Microbial interaction Water relations Extreme atmospheric conditions Processing Characterisation of moulds 75 Eco-physiology of food-borne fungi Chemometrics Simulation (C-incubators, M-Pack equipment, respirometer) Microscopy Bactometer Germination Growth Reproduction Spoilage Fermentation Metabolites Design and nalysis (Exp. design and Chemometrics) Impedance units 8 7 65 6 55 1^2 1^3 1^4 1^5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time (h) Morphology (Visual, Colour, NIR, Video meter) Visual, NIR, E-nose Metabolism: E-nose, flavour/ off-flavour flavour, (TLC, HPLC, GC-MS, respiration)
Konventionelle- / Hurtigmetoder Nogle overvejelser Hvad ønsker vi at opnå ved brug af vores metoder? Kvantitative metoder detekterer kontaminationsniveauet (CFU) eller biomasse Kvalitative metoder detekterer specifikke arter eller grupper af arter.
ccelererede konventionelle metoder Mykotoksin dannende cerialie associerede svampe DRYES/DG18 Xerophilie svampe DG18/MY5G Fusarium CZID spergillus flavus og. parasiticus FP Syre tolerante svampe (P. roqueforti) DYS DYRES FP CZID
Direkte udlæg eller suspension
Byg i lufttæt silo I 18 måneder % Pen. roqueforti Paecilomyces sp. Eurotium sp. Candida sp. DRBC Direkte 1 Fort. 17 68 FP Direkte 1 Fort. 21 62 DRYES Direkte 1 Fort. 11 64 DG18 Direkte 99 83 Fort. 22 57
Mykologiske hurtigmetoder Direct methods Howard mould count DEFT (direct epifluorescens filter technique) Turbidimetrc measurement combined with 2 phase separation Chemical and Biochemical methods Bioluminescens - TP Chitin Ergosterol Enzymes Secondary metabolites Volatile organic compounds (VOC) Immunological methods Molecular biological methods Impedimetri
What are the characteristics of an fungal isolate? Morphology Microscopic structures Macroscopic structures Color Growth characteristics Growth rate on specific substrates / growth conditions Resistance / tolerance Secondary metabolites Mycotoxins Volatiles Molecular characters
De vigtigste svampe metabolitter
Lugte sansen - det olfaktoriske system Mønstergenkender (rigtig neural netværk) Sensor array: 1 7 celler med ~1 forskellige receptor typer Limbiske system Olfaktoriske epithel Prøveudtagning og prøveforberedelse (filtrering, justering af temperatur, fugtighed, tryk og flow hastighed)
Den elektronisk næse Opbygning Gas opsamling og transportsystem (flow injection) Uspecifikke kemiske sensorer (8 48 stk.) Multivariat-kalibrering og -dataanalyse (neurale netværk / PC, cluster analyse) Bloodhound bygger på conducting polymer sensor teknologi dsorbtionen i toplaget svarer til interaktionen mellem componenter i en gasstrøm og den stationære fase i en GC-kollonne
Essentielle fysiske og kemiske egenskaber ved lugtstoffer Tilstrækkelig høj damp tryk Lav polaritet Overflade aktiv Delvis opløselige i vand og i fedt Molekylevægt under 3 (der er ikke nogen kendt lugt stof der har en molekylevægt på over 294) E-næse sensors Mennesket kan skelne ca. 9 lugte Metal oxide sensors (MOS) Surface acoustic wave sensors Quartz crystal microbalance Conducting polymer sensor
Ergosterol Hvede korn: w =,94 ~26-3% vand Ergosterol CFU 5 Time, days Sporulation Schnürer, Olsson, Börjesson, 1999 Fungal Genetics and Biology
pplying Electronic Nose (e-nose) technology for the Prediction of Danish Blue Cheese Quality 4.8 4.6 4.4 Predicted Y Elements: 22 Slope:.44967 Offset: 1.97574 Correlation:.77448 RMSEP: SEP: Bias:.291625.26774 -.128986 4.2 Me 4. 3.8 43 43 43 43 Me 43 Me 43 43 43 43 43 43 3.6 3.4 Me 43 43 43 43 43 43 43 3.2 Y Reference 3.2 3.4 3.6 3.8 4. 4.2 4.4 4.6 4.8 prediction of w, (Y-var, PC): (C 12: Lauric,1)
Opbygning af karakter,4,35,3,25,2,15 Total area % 2-Butanone 1-PropanOH 2-meth 2-Pentanone 2-Pentanol Disulfide dimeth 1-Butanol 3meth 1-Butanol 2meth 2-Hexanone Butanoic acid 2-Heptanone 2-Heptanol 2-Octanone 3methbutButanoate 8-Nonen-2-one 2-Undecanone GC-MS,1,5 roma compound changes with time 5 weeks Sensorik 8 weeks 12 weeks Lugt Smag Teksture River i næsen Sødme Modstand Valle Svampeagtig Flager Syrlig Salt Cremet Skimmel Frugtagtig Smeltet Smørsyre Fløde Smuldre Frugtagtig Syrlig Skimmel Bitter Ef tersmag roma compounds?? real bsorbsion Desorption Respons Max respons E-næse
Opbygning af karakter: Kombination af metoder GC-MS Sensorik 4 3 2 1-1 -2-3 -4-5 PC2 c b c b c a c a a a b b bc b c a b a b b b 12 Weeks 5 Weeks b a b a bc -8-6 -4-2 2 4 6 8 GC-MS 5-12, X-expl: 54%,16% PC results fra GC-MS data. 7% variation af dataene forklaret Scores a c a b a c c b c ab c 8 Weeks a a 5 4 3 2 1-1 -2-3 -4 PC2 C C a a a a 5 Weeks B PC1 C C 8 Weeks 4 3 2 1-1 -2-3 PC2 B 5 Weeks -1-8 -6-4 -2 2 4 6 8 E-nose 5-12, X-expl: 82%,11% Scores B B B C C B B BC C B C B B Scores 8 Weeks -5-4 -3-2 -1 1 2 3 4 Sensory 5-12, X-expl: 27%,16%?? C C C 12 Weeks B C B B B PC1 C C B B 12 Weeks PC results fra BH 114 data. 93% variation af dataene forklaret B C C PC1 PC results fra sensoriske data. 43% variation af dataene forklaret E-næse
Sammenhæng mellem e-næse data og GC-MS Kombination af data fra E-næse og GC-MS fra de samme oste gjorde det muligt at optimere brugen af den elektroniske næses sensorer til blåskimmelos te prøver..4.3.2.1 -.1 -.2 -.3 -.4 PC2 2-octanol 1-pentanol 2-Undecanon 1/Des. 13/Des. Disulfide d 1Butanol 2m 2-Nonanone 5/Des. 1Butanol 8/Des. 11/Des. 3m 2/Des. 14/Des. 9/Des. 3/Des. 13/bs. 8-Nonen-2-o 1/bs. 2-Octanone 11/bs. 7/bs. 1/Div. 3/bs. 2-Heptanone 7/Div. 6/Des. 2-Heptanol X- and Y-loadings 14/bs. 8/bs. 2/bs. 1/bs. Isopentyl h 2methylbuty 13/Div. 2-Hexanone 5/bs. 9/bs. 6/Div. 1methylprop 3methylbuty ethylbutano octan 6/rea Methyl deca ethyl hexan 1/Des. Butanoic methyl ac 1/rea hexa 2methylprop 9/Div. 5/Div. 5/rea 9/rea 1PropOH 2me 3methylbuty 2-Butanone 2/Div. 2/rea 2-Pentanol 8/Div. 14/Div. 14/rea 8/rea 1/rea 2methylprop 11/rea isoproh 1/Div. Propan 3/rea Butan acid acid 13/rea 1-Pentene 2-Nonanol 1-Heptene 3/Div. methyl buta 2-Pentanone 7/rea 11/Div. -.2 -.15 -.1 -.5.5.1.15.2 GCMS V e-nose,x-expl: 64%,17% Y-expl: 56%,14% 7/Des. 6/bs. PC1 Loadings plot fra PLS analyse. GC-MS data (X variabler) med E-næse data (Y variabler).
Quality control in the food industry PC2 Scores 2. E-nose readings of a good and a not so good batch of Black Castello cheese on day 6 to day 25 after production. 1.5 1. 1 1 6 6 1 1.5 6 6 16 16 -.5 21 21 16 16-1. -1.5-2. 13-good -8-6 -4-2 2 4 two batches,x-expl: 82%,13% 25 25 21 25 25 21 9-flowery taste PC1
Måle på lager, prediktere senere kvalitet.9.8.7.6.5 Batch Modning Sensorer.8.6.4.2 6 dage 1 dage 16 dage 21 dage 24-27 dage 6 dage 1 dage 16 dage 21 dage 24-27 dage Ingen information Kvalitet 6 uger efter pakning 5214 1 SY/Gh 1 SY/Gh 2 SY/Gh 3 SY/Gh 4 SY/Gh 5 SY/LG 1 P4/1 1 T3/1 2 SY/Gh 3 SY/LG 4 P4/1 4 T3/1 5 5172 15179 15185 1527 15214 15228 25233 17524 175247 175254 13B5261 175268 215275 19
Brugen af kvalitetskort model C2 : 26.29% 4. 3. Gråvhid grhv_5312 grhv_5312 1B 1 1B 1B 11B grhv_5312 1 1 5165 2B Lys 2. 5165 1B 1.. -1. 5165 2 brun_5261 brun_5268 brun_5261 21 17B brun_5268 17B brun_5261 17 21 17B brun_5268 17B 21 21B 17 17 21B 21 21B 17 21B Brun 5179 1 5221 2 Meget grøn 5228 1 5221 1 5165 1 mggr_5247 mggr_5247 mggr_5247 17 17 17B 17B 17B 17B okay_5228 2 52 5179 1 2 okay_527 okay_524 okay_5233 okay_5228 1B okay_527 1 17 17 1B 17 2B1 5172 1 5179 1B 1 mggr_5247 17 okay_5185 1B 1B 5179 17 1B okay_5185 okay_527 1B 1 okay_524 17B 1 17B 1B 1B 1B praf_5214 1 1 okay_527 1 1 OK 524 16B 5228 52541B14B praf_5214 praf_5214 1 1B 1B 1 1B 1B 524 16 5172 1B 5198 2 5172 1 5254 5198 13B 5221 2B 2B 5155 4 5198 3B Prik affald Ikke til bedømmelse -2. 5275 19 Bare pletter 5172 1B baple_5275 baple_5275 19 19 baple_5275 19B 19B 19B 19B Væsker 5198 3 Ikke til bedømmelse -3. -4. -39.92-35. -3. -25. -2. -15. -1. -5.. 5. 1. 15. 2. 25. C1 : 65.23% 3. 3.6 Graf taget fra α M.O.S. software. DF model over kvalitet ydre uanset alderen.
Contaminants can be detected already after 3 days, which is before growth is visible Differentiation between contaminants and mixtures is possible after 7 days (just before visible growth). Differentiation between contaminants is more clear when samples with mixtures are taken out. (day 7) Growth conditions 11% O 2 25% CO 2,965 a w 5.25 ph 1 conidia per sample (5 ml cheese substrate).5.4.3 Center points 3, X-expl: 96%,3%,%.5 Control PRD PRD PRD PRG PRD PRG PRG PRG PRD PRG DH PRG PRP PRP PRP DH PRP PRP DH DH DH PRP GCDH PRO Contaminants GC GC GC PRO GC PRO GC PRO -.5 PVE 6 PVE -2. 4 PVE -1.5 PVE 2-1. PRO PRO -.5 Scores -2-4.5-6 1. -Y -8 X 1.5 Center points 7, X-expl: 88%,11%,1% 2..2 1.5.1 -.1 -.2 -.3 -.4 1.5 1..5 -.5-1. -1.5-4 1. GC DH DH -2.5 DH DH DH Control GC DH -.5 PVE PVE PVE GC GC GC 2-1. Y PVE -X PRD PRG PRP PRP PRD PRD PRP PRP PRG PRP PRD PRD PRG PRD -8 PRO 4 Mix Mix -6 PRO PRO PRP PRG 6-4 -X Control -Y -2 GC Pure cultures PVE PVE DH PVE GC GC DH PVE PRO PROGC PVE DH PVE PRO PRO PRO GC DH PRO PRO PRO 2 4 Cheese starter P. roqueforti Cheese starter P. roqueforti PRO 1.5 2.2.5 1..5 -.5-1. 8-1.5 6
2 dys on PD an,x-expl: 79%,11%,4% Scores P. verrucosum (4 isolates) on cheese and PD measured by e- nose 2 days after inoculation. Citrinin production is measured 11 days after inoculation. X -Y 22123 22123 2252 1..5 2252 1377 1377 139 +++ 139 ++ - 2252 139 22123 139 22123 1377 -.5-1. -1.5-6 -4-2 2 4 6 1.5 1..5 -.5-1. 1377-1.5-2.
6 4 2 Predicted Y Elements: 16 Slope:.64458 Offset:.63761 Correlation:.78575 RMSEP:.94861 SEP:.835123 Bias: -.495987 1.398 2.26 3.14 3.823 4.631 5.439 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 7 dage 14 dage 14 dage 14 dage 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 maxvmikrlog ude, (Y-var, PC): (G.candidum,5) Measured Y 9 6 3 Predicted Y Elements: Slope: Offset: Correlation: RMSEP: SEP: Bias: 1.398 2.734 4.7 5.47 6.743 8.79 46.89539.7159.921374.94616.92699.233421 1 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 dage1 dage1 1 dage dage 7 dage 1 1 dage dage 1 1 dage dage 1 dage7 dage 1 dage 1 dage 14 dage 14 dage 14 dage 1 dage 1 1 dage dage 1 dage 1 dage 1 dage 1 1 dage dage 14 dage 14 dage 28 dage 28 28 28 dage 14 dage dage 28 28 dage dage 28 dage 14 dage 28 dage 28 dage 28 dage 1 2 3 4 5 6 7 8 maxvmikrlog ude, (Y-var, PC): (P.roqueforti,5) Measured Y
Diskussions punkter Hvad ønsker vi Kvalitativ eller kvantitativ Pris Tilgængelighed Hastighed Total cfu giver sjælden det svar vi søger Identifikation på artsniveau er oftest vigtig for at vurdere sikkerhed måske ikke mulig med E-næse? ndre kvalitets parametre, oxidation, spiring Hvad kendes om produktet: lagring og behandling
Hvis du ikke kan finde den rigtige vej..brug næsen! Gandalf fra Ringenes Herre