Cystisk fibrose. Bioteknologi A og matematik A. Klemens Besser Gyldendorf 3.w. Næstved Gymnasium og HF

Cystisk fibrose Bioteknologi A og matematik A Klemens Besser Gyldendorf 3.w Næstved Gymnasium og HF 19/12 2012

Indholdsfortegnelse Indledning side 1 Arvelighed og symptomer side 2 Diffusion, migration og flux side 4 Separation af de variable side 4 Separation af de variable Ficks lov side 5 Udledning af Goldman-ligningen side 6 Følgesygdomme bugspytkirtlen side 9 Følgesygdomme luftvejene side 11 Kliniske undersøgelser side 12 Fremtidige behandlingsformer ivacaftor side 13 Genterapi side 13 Lipider som vektor side 14 Ivacaftor vs. lipidvektorer side 15 Hardey-Weinberg side 15 Konklusion side 17 Litteraturliste side 19 Bilag side 21

Indledning Cystisk fibrose er en sygdom, man har kendt lige siden middelalderen, og allerede dengang vidste man, at hvis børns sved smagte meget af salt, ville de snart dø. Der skulle dog gå rundt regnet 500 år, før man i 1938 beskrev fænomenet som en selvstændig sygdom og i 1989 fandt CFTR- genet, der er årsagen til sygdommen, hvis det vel at mærke er muteret. Emnet er valgt på baggrund af aktualiteten, men også fordi det kan anskues fra flere faglige vinkler, hvor jeg kan fordybe mig i informerende baggrundsstof og foretage en fagligt begrundet vurdering. At én mutation i ét enkelt gen, ud af de 25.000 gener vores genom består af, kan have døden som følge, synes meget skræmmende for mig og i den grad aktuelt at undersøge. Hvorfor er mutationen så farlig? Hvad er det egentlig, der sker? Og vigtigst af alt hvordan, om muligt, kan man blive behandlet for sygdommen? Det er mit formål i denne opgave, ved sammenspillet mellem matematik og bioteknologi, at undersøge netop dét. Opgaven præsenterer emnet cystisk fibrose, idet der ses nærmere på CFTR-genet, arveligheden og symptomer for sygdommen. For at give opgaven en matematisk drejning benyttes en matematisk metode kaldet separation af de variable og Ficks lov til at få et udtryk for nettofluxen over en membran. Desuden udledes Goldman-ligningen, hvor der gives et eksempel på anvendelsen af denne. Da jeg har dannet et overblik over, hvad cystisk fibrose er, ses sygdommen i forbindelse med andre sygdomme som følge af cystisk fibrose. Her forklarer jeg sammenhængen mellem sygdommene. Til sidst ses der på fremtidige behandlingsformer, hvor jeg diskuterer fordele og ulemper og vurderer potentiale. For en af behandlingsformerne giver jeg min egen vurdering af, hvordan den kan virke. Til slut gives der et matematisk bud på, om det er muligt at udrydde sygdommen ved at abortere syge fostre.

Arvelighed og symptomer Cystisk fibrose (også kendt som mucoviscidosis) er en autosomal recessiv sygdom. Autosomal betyder, at sygdommen ikke er bundet til et bestemt køn. Recessiv betyder, at genet er vigende - hvis et kromosonpar består af et raskt gen og et sygt gen, vil det raske gen dominere. Man skal altså arve to kopier af en genforandring (homozygot), en fra hver af forældrene, for at få sygdommen. Derudover kan recessive sygdomme springe generationer over. Hvis begge forældre er heterozygote bærere af arvematerialet for cystisk fibrose, og altså dermed ikke udtrykker sygdommen, er der 25 % risiko for, at deres barn vil have sygdommen, 25 % chance for, at barnet er rask uden at arve sygdommen og 50 % risiko for, at barnet er rask, men har genet for cystisk fibrose. Den recessive nedarving kan ses af bilag 1. Ca. 1 ud af 34 danskere har arvemateriale for cystisk fibrose, hvilket er omkring 150.000 danskere. 1. Man er ikke selv skyld i sygdommen, og den smitter heller ikke, da den skyldes mutationer i et bestemt gen nemlig CFTR-genet (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), som er et stort gen på kromosompar nr. 7. Genets egenskab er at give instruktioner til at lave CFTRproteinet. Proteinet er opbygget, som ovenstående figur viser. TMD1 og TMD2 udgør et transmembrant domæne, som består af 12 udspændende dele samt NBD1 og NBD2, som er nukleotid-regulerende domæner og et regulerende R-domæne. De to nukleotidregulerende domæner og R-domænet er hovedaktører i reguleringen af aktiviteten af kanalen. R-domænet skal phosphoryleres ved det camp afhængige enzym proteinkinase A for at lede Cl - -ionerne. Phosphoryleringen er reguleret af 1 http://www.cystiskfibrose.dk/infomateriale/infopjecerogfaktaark/informationomcfannelisehansen.pdf s. 5-7

NBD erne. Disse binder og hydrolyserer ATP, således at der er energi til en nettotransport. 2 Proteinet er medlem af den såkaldte ABC-familie. Medlemmer af denne familie har til opgave at udføre energiafhængige transporter af store molekyler over cellemembranen, regulere andre kanaler og transportere ioner over membraner. 3 Proteinet har i hvert fald to af egenskaberne. Det transporterer Cl - -ioner over cellemembranen hos de celler, som producerer sekreter som slim, sved, spyt, tårer og fordøjelsesenzymer altså de exokrine kirtler, som fx er i lungerne, tarmen, huden eller bugspytkirtlen. Dette er med til at kontrollere transporten af vand i væv, som er nødvendig for at fremstille slim, som beskytter bl.a. fordøjelsessystemet, organer og væv. CFTR-proteinet regulerer også en Na + -kanal, kaldet den epiteliale natriumkanal (ENaC). Der ses nu på betydningen af CFTRproteinet i svedkirtlerne, luftvejene og bugspytkirtlen, når proteinet er funktionelt og dysfunktionelt. Ved svedkirtlerne absorberes Cl - -ionerne for at opretholde svedens elektrolytniveauer. I et raskt menneske er chloridkoncentrationen i svedet normalt under 40 mm. Når CFTR-proteinet er dysfunktionelt, sker der et markant tab i absorptionen af Cl - -ionerne. Dette medfører, at chloridkoncentrationen i svedet kan opnå en koncentration over 60 mm. I luftvejene bliver der udskilt Cl - - ionerne således, at der er en normal mængde af væske på overfladen af luftvejene, så fimrehårene (forklares og behandles senere) kan arbejde frit. Når proteinet er dysfunktionelt, bliver der ikke udskilt Cl - -ioner. Dette medfører, at ENaC absorberer Na + -ioner. Der opstår en større saltkoncentration inde i cellerne, hvilket dehydrerer væsken på overfladen af luftvejene, så fimrehårene ikke virker, samt at der i stedet for normale sekreter udskilles et tykt, sejt slim. Dette fører til hyppige luftvejsinfektioner. I bugspytkirtlens kirtelrør tillader CFTR-proteinet transporten af chlorid- og bicarbonatoiner. Den regulerede strøm af de førnævnte ioner sikrer den rette mængde og ph af de sekreter bugspytkirtlen udskiller med andre ord, at bugspytkirtlen fungerer normalt. Når CFTR er dysfunktionelt, svækkes reguleringen af bicarbonat og Cl - -ionerne, så volumen samt ph for sekreterne sænkes. Dette medfører, at kirtelrørene tilstoppes og dermed kan der ikke udskilles vigtige fordøjelsesenzymer. Udover de nævnte symptomer er der også infertili tet hos mænd, fordi der bliver blokeret for sædcellerne 4 5. 2 http://www.umd.be/cftr/w_cftr/protein.html 3 http://www.stanford.edu/class/psych121/humangenome-cf.htm 4 https://www.cftrscience.com/cftr_dysfunction.php 5 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/cftr

Diffusion, migration og flux Da cystisk fibrose er en membransygdom, hvor transporten af et stof over en membran er defekt, er det relevant at se på, hvad der gør sig gældende for transport over semipermeable membraner. En massetransport kan ske grundet termiske bevægelser, som de opløste partikler og opløsningsmidlets molekyler udfører på en helt tilfældig måde. Hvis koncentrationen af et stof er ens overalt i et system, vil der ikke ske nogen nettotransport, men hvis der er en koncentrationsforskel, vil de termiske bevægelser medføre, at der sker en transport i koncentrationsfaldets retning. En sådan transport fra en høj koncentration til en lavere koncentration kaldes diffusion. Diffusion går under kategorien passiv transport - det er kun uladede små molekyler, der på denne måde kan diffundere gennem den semipermeable membran uden brug af energi i form af ATP eller andet. Hvis alle opløste partikler påvirkes af en ydre kraft, betegnet med X, vil partiklerne bevæge sig med en given hastighed i kraftens retning, og derfor vil der ske en nettotransport, selvom koncentrationen er ens overalt i systemet. En sådan transporttype kaldes migration. 6 Til at karakterisere intensiteten af nettotransporten af opløste stoffer i et system har vi transportstrømtætheden eller fluxen, betegnet med J, af det transporterende stof. Fluxen er defineret som mængden af stof, som pr. sekund passerer en arealenhed, der er anbragt vinkelret på transportstrømmens retning. Fluxen er givet ved J=BNX, hvor B er mobiliteten, N er antallet af transporterende enheder, og X er den drivende kraft 7. Fluxen er beskrevet anderledes ved Ficks lov: J = D m dc dc, hvor Dm er diffusionskoefficienten og er koncentrationsændringen pr. dx dx længdeenhed Separation af de variable I forbindelse med Fick s lov bevises, at differentialligningen af formen dy = g(y) h(x) kan løses ved separation af de variable. Metoden har fået sit navn, fordi man separerer de variable, altså x og y, således, at leddene med x og leddene med y samles på hver sin side af lighedstegnet. Før noget kan bevises, skal det forudsættes, at funktionen h er kontinuert i intervallet I, og funktionen g skal dx 6 Knudsen - 1995 Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner kapitel2.1 og 2.3 7 Knudsen - 1995 Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner kapitel 2.2 og 2.42

være kontinuert i intervallet J 0. Med det kan differentialligningen løses for x ϵ I og y ϵ J, hvor y=f(x) er løsning til dy 1 = g(y) h(x) y=f(x) er løsning til dy = h(x)dx. dx g(y) I princippet kan løsningen fås ved en simpel omskrivning, hvori der multipliceres med dx og divideres med dy på begge sider af lighedstegnet, så vi får: dy dx 1 = g(y) h(x) dy = h(x)dx. g(y) Dette giver dog rent matematisk ikke mening, idet dy er et samlet symbol. Derfor behøves beviset for, at omskrivning passer. Da g er kontinuert i J og forskellig fra 0, er 1/g kontinuert i J. 1/g har en stamfunktion, som vi kalder G. Med den grundlæggende viden om stamfunktioner må det gælde, at G(y)= 1 dy. h er kontinuert i I og har stamfunktionen H, altså H(x)= h(x)dx. Nu kan der g(y) foretages en række omskrivninger: dy = g(y) h(x) 1 dy = h(x) 1 dx g(y) dx g(f(x)) f (x) = h(x) Nu udnyttes definitionerne af H og G samt reglen for differentiation af en sammensat funktion, så følgende udtryk fås: dx G(f(x)) -H (x)=0 Reglen om differentiation af en differens bruges: (G(f(x))-H(x)) =0 Udtrykket på venstre side må være en stamfunktion til 0, hvilket må medføre: G(f(x))-H(x)=k G(y)=H(x)+k Igen ses der på definitionen af G og H, og følgende resultat opnås: 1 dy = h(x)dx. g(y) Det er hermed bevist, at løsningerne til de to ligninger er lig hinanden 8. Separation af de variable Ficks lov dc Udtrykket J = D m er en differentialligning, der kan omskrives til nettofluxen J=-P* C, hvor P dx er permeabilitetskoefficienten, ved brug af separation af de variable, så vi har dx på venstre side af lighedstegnet og dc på højre side. Dog er der 4 forudsætninger: Stationær tilstand, altså koncen- 8 Carstensen, Matematik 3, 1990 s. 70-72

trationsforskellen, der er i rummene adskilt af membranen, er konstant og tidsuafhængig, diffusion i x-aksens retning, koncentrationsprofilen gennem membranen er lineær, og koncentrationen af stoffet i membranen kan beskrives som koncentrationen i mediet multipliceret med fordelingskonstanten β, altså C 1= βc1 og C 2= βc2. Dette forstås bedre ved at se på bilag 2. Ved antagelse af disse forudsætninger bruges separation af de variable på Ficks lov. Der multipliceres med dx på begge sider af lighedstegnet og integreres: x c 2 Jdx = 2 D m dc c J[x] x 2 x 1 1 x = D m [C] c 2 => J = (x 1 c 2 x 1 ) = D m (C 2 C 1 ) 1 Det udnyttes, at (x2-x1)=δ, C 1= βc1 og C 2= βc2: J δ = D m (βc 2 βc 1 ) J = D m β (C 2 C 1 ) Permeabilitetskoefficienten P = D m β indføres, og følgende fås: δ δ J=-P* C hvor C=(C2-C1) 9 Hermed er nettofluxen, altså størrelsen af fluxen i den stationære tilstand, fundet ved brug af separation af de variable for Fick s lov. Udledning af Goldman-ligningen Da der er set på transport ved diffusion af uladede stoffer, er det relevant at se på transport af elektrolyter, altså transport med positivt og negativt ladede ioner (kat- og anioner), hvis ladning skyldes, at der kan være en spændingsforskel over membranen et såkaldt membranpotentiale. Transporten af ioner går under aktiv transport altså transport, der kræver energi i form af ATP. Der vil blive lagt fokus på Nernst-Planck diffusionligningen, hvor der ses på én iontype. En ydre kraft påvirker transporten og er givet ved X = ƶ e dψ. Her er z ladningstallet på en given ion, e dx dx er elementarpartiklens ladning og dψ er et elektrisk felt. Dette udtryk indsættes i Smoluchowskiligningen, som beskriver et totalflux: J = J diff + J mig = D dc + BC :10 J = D dc dψ B C z e J = dc + B dψ C z e dx dx D dx D dx dx 9 Cornelius 1997 Medicinsk Biofysik 1 Grundbog s. 116-117 10 Knudsen 1995 - Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner kapitel 2.61

J = dc + 1 dψ C z e D dx kt dx J = dc dψ + z C D dx dx Konstanten D=kTB B=D/kT indføres Det indføres, at Ψ= eψ dψ, altså kt = e dx dψ 11 kt dx Det kan udregnes, at hvis man anvender Kramers s transformation på ovenstående udtryk, da får man følgende resultat: J e z Ψ(x) = D d dx (C e z Ψ(x) ) 12 Fra ovenstående udtryk ønskes det at udlede Goldman-ligningen. For at komme frem til Goldmanligningen, må en række antagelser foretages se bilag 3: a) Membranen har tykkelsen h b) Alle betragtede ioner er monovalente, altså stoffer, der kan danne én binding c) Hvis vi ser på koncentrationen af én iontype i membranen ved x=0, har vi C(0), og ved x=h har vi C(h). Disse er knyttet til koncentrationerne udenfor membranen således: C(0)=α*C (i) og C(h)=α*C (o) α er fordelingskoefficient for iontypen. d) Vi ikke kender dψ, så for denne må følgende antages, idet det forudsættes, at det elektriske felt i dx membranen er konstant: dψ = ψ(h) ψ(0) = ψ(0) ψ(h) = ψi ψ o = V, hvor dx h h h h ψi ψ o = V e) Stationær tilstand intet ændrer sig med tiden. Med dette kan J e z Ψ(x) = D d dx (C e z Ψ(x) ) integreres: h J e z Ψ(x) dx = D [C e zψ(x) ] h 0 0 h J e z Ψ(x) dx = D C(h) e zψ(h) C(0) e z Ψ(0) 0 J = D Ci e zψi C o e z Ψo h e z Ψ(x) dx 0 Integralet i nævneren bestemmes ved brug af integration ved substitution: 11 Knudsen 1995 - Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner kapitel 3.321 12 Knudsen 1995 - Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner kapitel 2.63

h e z Ψ(x) dx 0 t= Ψ(x) substitutionen ligger i at substituere Ψ(x) med t dt= Ψ (x)dx dx= 1 Ψ (x) dt dx defineres Ψ(h)=0 e z t Ψ(0)=V 0 = e z t V 1 dt dx= 1 dt og t= Ψ(x) udnyttes Ψ (x) Ψ (x) ( h V )dt det udnyttes, at 1 Ψ (x) er den reciprokke til Ψ (x)= V h = h V [1 z e z t ] 0 V e zt dt = 1 z e z t, altså 1 z e z t er en stamfunktion til e zt = h V (1 e zv ) Det ses altså, at J = D Ci e zψi C o e z Ψo J = D Ci e zψi C o e z Ψo = z V αd C0 C i e zv h J = z V P C0 C i e zv h e z Ψ(x) dx 0 h V (1 ezv ) 1 e zv Konstanten P= αd h indføres 1 e zv Nu antages det, at membranen kun er gennemtrængelig for 3 typer af ioner, nemlig Na +, K + og Cl -. Fluxen for disse ved membranpotentialet V m = RT kelvin og F er Faradays konstant, opskrives: F V, R er gaskonstanten, T er temperaturen i J K = P K V C0 K C i K e V, J 1 e V Na = P Na V C0 i Na C Na e V, J 1 e V Cl = P Cl V Ci Cl C Cl 1 e V For én iontype er der en ionstrøm givet ved I=F*J. Ionstrømmen opskrives for de tre ioner: I K = F J K = F P K V C0 K C K i e V 1 e V I Cl = F J Cl = P Cl V Ci o Cl C Cl e V. 1 e V, I Na = F J Na = F P Na V C0 i Na C Na e V, 1 e V o e V Den samlede ionstrøm er I = I K + I Na + I Cl I = F V P (o) (o) (i) (i) (i) (o) K C K +PNa C Na +PCl C Cl [PK C K +PNa C Na+PCl C Cl ] e V 1 e V Ionstrømmen sættes lig 0, og det kan kun opfyldes ved, at tælleren er lig 0.

(o) (o) (i) (i) (i) (o) P K C K + PNa C Na + PCl C Cl [PK C K + PNa C Na + PCl C Cl ] e V = 0 e V = P (o) (o) (i) K C K +PNa C Na +PCl C Cl (i) (i) P K C K +PNa C Na+PCl C Cl (o) V = ln ( P K C K (o) (o) (i) +PNa C Na +PCl C Cl (i) (i) P K C K +PNa C Na+PCl (o)) C Cl Det udnyttes, at V m = RT F V m = RT (o) (o) (i) ln F (P K C K +PNa C Na +PCl C Cl V hvormed Goldman-ligningen fås: (i) (i) P K C K +PNa C Na+PCl (o)) 13 C Cl Der gives et kort eksempel på brugen af Goldman-ligningen. I en frøs muskelcellemembran har man fundet følgende koncentrationer af Na +, K + og Cl - : [Na + ] [K + ] [Cl - ] intracellulært 13 mm 130 mm 3 mm ekstracellulært 110 mm 2,5 mm 114 mm Derudover er følgende permeabiliteter for Na +, K + og Cl - fundet: PNa=1*10-10 m*s -1, PK=1,2*10-8 m*s -1 og PCl=4*10-8 m*s -1. Temperaturen er 27 o C. Med disse oplysninger kan membranpotentialet i en frøs muskelcellemembran bestemmes ved brug af Goldman-ligningen: V m = RT (o) (o) (i) ln F (P K C K +PNa C Na +PCl C Cl (i) (i) P K C K +PNa C Na+PCl (o)) C Cl = 8,31 J 300,15 K mol K 9,65 C mol ln ( 1,2 10 8 m s 1 2,5 mm+1 10 10 m s 1 110 mm+4 10 8 m s 1 3,0 mm ) = 0,0941 V 1,2 10 8 m s 1 13 mm+1 10 10 m s 1 130 mm+4 10 8 m s 1 114 mm = 94,1 mv 14 Hermed er membranpotentialet over en muskelcellemembran for en frø fundet. Følgesygdomme - bugspytkirtlen Cystisk fibrose er skyld i en række følgesygdomme i både lungerne og fordøjelsessystemet. I fordøjelsessystemet er det oplagt at se på cystisk fibrose relateret diabetes. For at forstå, hvordan 13 Knudsen 1995 - Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner kapitel 3.73 14 Cornelius 1997 Medicinsk Biofysik 1 Grundbog tabel fra 10.4 og eksempel 10.1

cystisk fibrose kan føre til diabetes, er det relevant at se på fordøjelsessystemet, og hvordan vores mad nedbrydes gennem dette. For overblik se bilag 4. I vores mund tykkes maden for at findele og øge overfladen. Spytkirtler i munden udskiller enzymet spytamylase, som spalter polysaccharider til mindre stivelseskæder. Maden føres gennem spiserøret til mavesækken, hvor der er meget surt ph1-2. Her udskilles pepsin, som spalter proteiner til kortere aminosyrekæder. Maden føres videre til tarmsystemet, tolvfingertarmen, tyndtarmen og tyktarmen. I tolvfingertarmen og tyndtarmen er ph neutral, og her sker størstedelen af fødeoptagelsen. Bugspytkirtlen er i tæt kontakt med tolvfingertarmen, og denne har stor indflydelse. Den udskiller hydrogencarbonat for at neutralisere den syre masse fra maven. Derudover udskilles en række enzymer., nemlig amylase, som spalter stivelseskæderne til dissacharidet maltose, lipase til at spalte triglycerider, peptidase til at spalte proteiner og peptider og til sidst maltase, som spalter maltose til monosaccharidet glukose bedre kendt som druesukker. Samtidig tilsættes galde fra galdeblæren til at dele lipider op i mindre dråber. I tyndtarmen sker optagelsen af alle næringsstofferne. Tyndtarmens overfladeareal er ca. 250 m 2,hvilket betyder, at optagelsen sker hurtigt. Optagelsen sker ved faciliteret diffusion. 15 Optagelsen af glukose er brændstof for alle cellerne i kroppen, og især hjernen har brug for konstant energi. Bugspytkirtlen producerer ikke kun enzymer til nedbrydning, når maden når maven. Den voksne bugspytkirtel består af 98 % spytkirtel og 2 % hormonproducerende celler, også kaldet β-celler, som udskiller hormonet insulin, som er meget vigtigt i forhold til blodsukkerreguleringen. Efter optagelse af mad i tyndtarmen dannes også et hormon kaldet GLP1. Hormonet flyder ind i bugspytkirtlen og binder sig til β-cellerne. En lang kæde af biokemiske reaktioner startes, som resulterer i dannelse af korn med grupper af insulinhormon, der flyder ud til β-cellemembranen. Her frigøres insulinen og kommer ud i blodårerne. Insulinen vil sætte sig på receptorer, der bl.a. sidder på muskel- og fedtceller. Herved aktiveres cellerne således, at de kan optage glukosen. Ved type 2 diabetes er problemet enten, at man ikke producerer nok insulin, eller at man er insulinresistent typisk som følge af overvægt, hvor følsomheden for insulin nedsættes, hvilket ender i en utilstrækkelig insulinproduktion. I tilfælde af dette aktiveres cellerne ikke, så de optager ikke glukosen. Glukosen bliver i stedet i blodårerne og reagerer med proteiner i vores væv, og det skader en lang række af kroppens indre fx blodårerne, hjertet, nyrerne, nervebanerne, øjnene og huden. 16 Grunden til, at cystisk fibrose kan resultere i diabetes, er at sygdommene har et fælles punkt, nemlig bugspytkirtlen. Når man har CF, vil man udskille utilstrækkelige mængder af vigtige fordøjelses- 15 Bruun, 2010, Grundbog i Bioteknologi 1 s.155-156 16 http://www.dr.dk/tv/se/danskernes-akademi-tv/viden-om-diabetes-fremtidens-stoerste-draeber

enzymer og insulin, fordi udskillelsesgangene er blokeret af den seje slim, der bliver produceret i stedet for de normale sekreter. Når det sker, gentager scenariet kendt fra diabetes sig er der utilstrækkelig insulin kan glukose ikke optages i fedt- og muskelceller, glukosen ophober sig i blodårerne, hvilket er skadeligt for kroppen. Diabetes er ikke den eneste følgesygdom, som følge af mave-/tarmproblemer. Der vil være en dårlig nedbrydning og optagelse af føde. Her stammer problemet igen fra bugspytkirtlen. Hvis enzymerne lipase, amylase, maltase og peptidase ikke bliver udskilt fra bugspytkirtlen, bliver maden ikke nedbrudt, og dermed kan størstedelen af maden ikke optages i blodårerne. Det er en ulempe, idet man får et kalorieunderskud, går ned i vægt, mister muskelmasse og kan opleve træthed, hvilket fører til en mindre modstandsdygtighed overfor andre sygdomme 17. Når maden ikke optages i blodårerne, må den nødvendigvis stå i tarmsystemet. Dette resulterer i, at vand bliver trukket ud i tarmene, og det kan forklares ved osmose. Koncentrationen af vandopløste stoffer i tarmen er meget større end udenfor tarmen. Vi ved, at stofferne ikke kan passere membranen, så der sker en transport over membranen af vand. Tarmsystemet er i et hypotonisk miljø sammenlignet med miljøet udenfor tarmene, og i et sådant tilfælde vil vand diffundere ind i tarmene i bestræbelsen på at udligne koncentrationsforskellen. Da lipider ikke nedbrydes kombineret med den mere vandholdige tarm, vil ens afføring være mere fedtet, abnorm, og man kan være i en tilstand af kronisk diaré. Følgesygdomme - luftvejene Der er taget hånd om fordøjelsessystemet, og der tages nu hånd om følgesygdomme i lungerne. I den anledning er det relevant at se på lungernes opbygning og funktion. Se bilag 5. Når vi indånder luft, kommer luften ned i luftrøret, som deler sig i to veje. Ud af de to veje får vi hoved-bronkierne. Bronkierne deler sig flere gange i mindre rør og bliver til sidst til alveoler. Når vi trækker vejret, trækkes O2 helt ud i alveolerne, hvor væggene er så tynde, at O2 trænger igennem og ud i blodårerne, hvor O2 bindes til blodet og transporteres ud til kroppens celler, så de kan respirere. Når cellerne har respireret, er det også lungerne, der skifter CO2 ud med ny O2. Det er ikke kun luft, der kommer ned i lungerne også støv og bakterier eksempelvis. Da der altså er fri adgang for fremmede mikroorganismer, har lungerne et system, der holder lungerne rene. Celler i lungerne udskiller en vand- og saltholdig væske samt et slimet, klæbrigt sekret kaldet mucus. Mucus flyder ovenpå væsken og fanger bakterierne. Når bakterierne er indfanget, fejes de ud ved hjælp af nogle fimrehår. Når man har cystisk fibrose, er det før forklaret, at væsken på celleoverfladen i lungerne bliver 17 http://sult.msf.dk/projektet/historien-underernaering/faq-om-underernaering.html

dehydreret i en sådan grad, at fimrehårene ikke fungerer, samt at de exokrine kirtler ikke udskiller almindelige tyndtflydende sekreter, men i stedet en sej slim, som ikke kan transporteres ud af lungerne igen. Denne seje mucus bruger bakterier som vækstmedie, før de angriber omkringliggende celler. Bakterierne skal altså ikke blot fejes væk, men bekæmpes. Ved cystisk fibrose er man altså hyppigt udsat for lungeinfektioner. Et eksempel på en meget problematisk lungeinfektion er bakterien pseudomonas aeruginosa. Bakterien har gennem evolution udviklet sig således, at den kan overleve i flere forskellige miljøer. Det største problem med bakterien er dog dens særprægede beskyttelsesmekanisme. Den danner et lag af biofilm, et slags skjold udenom sig. Denne biofilm gør at antibiotika ikke kan komme i kontakt med selve bakterien. Dermed kan bakterien undgå at blive udryddet og er derfor ekstra farlig. 18 Kliniske undersøgelser I dag er man nået langt med den medicinske behandling af cystisk fibrose, men kravene for markedsføring af farmaceutiske midler er markante. For at kunne udgive et lægemiddel, skal lægemidlet gennem flere faser af kliniske undersøgelser. Kliniske undersøgelser er den dyreste del af lægemiddelsudviklingen. Det er lovpligtige undersøgelser på dyr og senere mennesker, der omhyggeligt er designet til at evaluere effekten, sikkerheden og mulige bivirkninger af et farmaceutisk produkt. Undersøgelser kan være placebokontrollerede patienter modtager enten placebo, en uvirksom medicinsk behandling 19, eller det nye produkt for at vurdere en effekt af produktet. Patienten ved ikke, om der behandles med det ene eller det andet. Der foretages mange kliniske undersøgelser, som resulterer i flere tusinde forsøgsresultater. Disse resultater er meget vigtige for udviklingen af det farmaceutiske produkt. De kliniske undersøgelser sker i fire forskellige faser. I Novo Nordisk gør man således: Efter forsøg på dyr har vi fase 1, hvor undersøgelser omfatter 100-200 frivillige og/eller patienter. Man tester, hvordan produktet tolereres i enkelt- og flergangsdoseringer. Her kan der bruges placebokontrol. I fase 2 bruges mere end 200 patienter, der har været syge i måneder. Der testes for virkning og forholdet mellem dosis og respons. I fase 3 undersøges mere end 2.000 patienter, der har været kronisk syge i mere end et år. Effektiviteten og sikkerheden over en længere periode påvises samt eventuelle bivirkninger. Efter tredje fase kan produktet markedsføres. Fase 4 foregår efter frigivelsen af produktet på markedet. Effektiviteten og sikkerheden bevises endnu en gang, men i et større omfang end ved fase 3. 20 18 http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/jagten/cystisk%20fibrose.aspx 19 http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/placebo 20 http://www.novonordisk.com/images/science/bioethics/downloads/bioethics_clinical%20trials%20uk_27-10.pdf

Fremtidige behandlingsformer - ivacaftor Et lægemiddel, der er kommet på markedet er ivacaftor (Kalydeco), udviklet af Vertex, som har fået godkendelse i Europa og USA. Stoffet er det første til ikke at behandle de svækkende symptomer, men derimod den underliggende årsag altså det misdannede CFTR-protein. Fase 3 resultater viste, at der to uger skete forbedringer i lungefunktionen på, som varede ved i 48 uger. Der blev også observeret forbedringer i forhold til vægt og koncentration af chlorid i sveden. Lægemidlet virker dog kun på patienter med mutationen G551D, hvilket er 4 %. 21 Genterapi Genterapi til behandling kan være vejen frem. Behandlingsformen kræver en forklaring. Genterapien handler om at danne nye, manglende gener eller at udkonkurrere det/de syge gen(er). Man kan tage udgangspunkt i en retrovirus, hvis genom består af en enstrenget RNA-sekvens. Sygdomme som følge af inficering af retrovira er meget farlige, fordi de muterer hurtigt og er ustabile. Derudover kender man ikke til vacciner og behandlingsformer mod et sådant angreb. Af den grund skal virussens genom modificeres. Den del af virussens genom, som koder for sygdom, skiftes ud med det manglende gen, vi skal have ført ind i en menneskelig værtscelle. Der er interesse for at inficere værtscellen med retrovirussen, men først skal dens modificerede genom laves om til en DNA-sekvens ved revers transkription. Til det har vi enzymet revers transkriptase. Ved DNAreplikation skabes et DNA-dobbelthelix molekyle. Man lader retrovirussen inficere værtscellen, og DNA-stykket indsættes i cellens genom med enzymet integrase for den proces. Bilag 6 viser processen i billeder. Brugen af retrovira er den mest anvendt i forskning, fordi virussen kun inficerer delende celler. På den måde kan det nye gen sprede sig og i højere grad blive udtrykt end det defekte gen. Den store fordel ved brugen af retrovira som vektor er, at man kurerer cystisk fibrose en gang for alle. Dermed vil det utvivlsomt være et glimrende økonomisk alternativ til de kendte behandlingsformer, hvor behandlingen er livslang, og genterapi er også mere målrettet. Potentialet i genterapi er så stort, at man i fremtiden regner med at kunne helbrede sygdomme, som man i dag anser som værende uhelbredelige. Dog ligger genterapi med retrovira nogle år ude i fremtiden, bl.a. fordi man på nuværende tidspunkt ikke kan styre, hvilke celler retrovirussen inficerer. Det er meget alvorligt, hvis retrovira inficerer tilfældige celler, der styrer, hvornår kroppens celler deler sig, da dette kan føre til cancer grundet uhæmmet formering. 22 Der er heller ikke en garanti for, at 21 http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/piis0140-6736(12)60617-5/fulltext 22 http://www.biotechacademy.dk/bioindex/biolex/genterapi.aspx

behandlingen af kropsceller ikke har indflydelse på kønscel-lerne. Risikoen er dog meget lille. Man kender ikke så meget til bivirkninger, da man kun har eksperimenteret med behandlingsformen på dyr og et begrænset antal af mennesker. Selvom ulem-perne er alvorlige, er de alligevel bagateller, hvis man sammenligner med kræftbehandlingen. 23 Hvis man kan styre, hvilke celler retrovira inficerer, garantere, at behandlingsformen ikke har indflydelse på kønsceller og holde eventuelle bivirkninger til et minimum, er behandlingsformen noget nær optimal. Lipider som vektor Man arbejder også med lipider, som alternativ til vira som vektor. Patienter skal inhalere raske DNA-molekyler, som er pakket ind i fedtperler, gennem en forstøver. Fedtperlerne fører de raske gener ind i cellerne i lungerne. Da jeg ikke har kunnet finde kilder, der uddyber, hvorfor metoden virker, vil jeg selv vurdere det. Ved at inhalere DNA-molekylerne, som er pakket ind i fedtperlerne, kommer de ned i luftrøret og ud i bronkierne. I bronkierne bliver DNA-molekylet optaget. Fedtperlerne virker som vektor, fordi cellemembranen selv er opbygget af lipider. Ved overførslen vil fedtperlerne blive integreret i cellemembranen, og DNA-molekylet optages i cellen. Inde i cellen formoder jeg, at vi har nogle restriktionslignende enzymer. Restriktionsenzymer spalter dobbeltstrenget DNA ved at spalte en esterbinding mellem to nabonucleotider ved enzymets genkendelsessekvens. 24 Der må være et specifikt sted i cellernes DNA, hvor DNA et kan spaltes, således at det raske DNA-molekyle passer ind. Her kan DNA-molekylet blive integreret i cellens DNA ved enzymet DNA-ligase. Mit grundlag for, at det raske DNA-molekyle skal integreres i cellernes kromosomer, er celledelingen. Hvis ikke det raske gen sidder på cellernes kromosomer, kan det raske DNA-molekyle ikke blive udbredt, men i modsatte tilfælde vil det raske DNA sprede sig i takt med celledelingen ved mitose. Denne behandlingsform giver man 130 patienter månedligt i et år. Her er der ingen garanti for at få den ønskede virkning, men inden marts 2014 har man svaret. Muligheden ved denne behandlingsform er dog fristende, idet den potentielt vil kunne virke mod alle former for mutationer. 25 23 http://www.tekno.dk/pdf/projekter/956.pdf 24 Bruun,2011, Grundbog i bioteknologi 2 s. 24-25 25 http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/piis0140-6736(12)60617-5/fulltext

Ivacaftor vs. lipidvektorer Hvis man sammenligner metoden med lipider som vektor og ivacaftor, kan det ses, at de hver har deres fordele og ulemper. Ivacaftor er kommet på markedet, hvor man stadig er i gang med kliniske undersøgelser for lipidvektorer. Dermed ved man altså meget mere om ivacaftor og har påvist en forbedret lungefuntion, hvor der er større usikkerhed ved lipidvektorer, og om virkningen overhovedet bliver stor nok. Fordelen ved lipidvektorer er utvivlsomt, at den behandler for alle mutationer, hvor ivacaftor kun behandler for 4 % af alle cystisk fibrose ramte. Jeg vil vurdere, at der kan være mest potentiale i lipidvektorer, fordi den rammer så bredt, som den gør. Der vil altid opstå nye mutationer, og da der allerede er over 1500 forskellige mutationer, bliver det meget svært at fremstille farmaceutiske produkter til hver og en. Hardey-Weinberg Der er en matematisk mulighed for at se på, om det kan lade sig gøre at udrydde sygdommen og simpelthen abortere syge børn, nemlig ved Hardey-Weinberg ligevægten. For recessive alleller kan følgende opskrives: q = q 1+n q Her er q frekvensen ved n - antallet af generationer og q er den aktuelle frekvens. Dog må det antages, at der er tilfældig parringsvalg, populationen er konstant, der opstår ikke flere mutationer, og overlevelsesevne til formeringsdygtig alder samt tilpasningsværdi er ens for alle former for eksisterende mutationer 26 Vi ved, at 1 ud af 34 danskere bærer arvemateriale for cystisk fibrose, altså q = 1 = 0,0294. Hvis vi nu ønsker at nedbringe frekvensen til 0,01, kan man ved brug af TI- 34 Nspire CAS lommeregner bestemme, hvor mange generationer, der vil gå: solve ( 0,0294 = 0,01, n) n=65,9864 ~ n=66 1+n 0,0294 For at komme ned på, at kun 1 % af befolkningen har cystisk fibrose, skal der gå 66 generationer, så alene af den grund kan man ikke udrydde sygdommen. Noget andet er, at ingen af forudsætningerne for Hardey-Weinberg ligevægten holder i virkeligheden. Vi kan ikke undgå, at der sker indvandringer i landet, der vil altid kunne opstå nye mutationer, og de forskellige mutationer har sandsynligvis forskellige tilpasningsværdier og overlevelsesevner. 26 Bremer, 1997, Levende organismer s. 142-145

Alle de førnævnte behandlingsformer har en fælles ulempe, nemlig at metoderne også er anvendelig i forbindelse med andet, fx må der blive mulighed for at ændre på sit udseende og egenskaber. Her er det et rent etisk spørgsmål, hvorvidt det er i orden eller ej. Her mener jeg, at individet er selvstændigt og ansvarligt nok til at stå til ansvar for sine egne valg, så hvis muligheden er der, skal folk være velkomne til at benytte den, men når det er sagt, er jeg stor modstander af indgreb, hvis eneste formål er selvtilfredsstillelse.

Konklusion Cystisk fibrose er en autosomal recessiv sygdom, som ca. 1 ud af 34 danskere har arvemateriale for. Sygdommen skyldes mutationer i CFTR-genet (cystic fibroses transmembrane conductance regulator). Genet bærer informationer for at lave CFTR-proteinet. Proteinet transporterer normalt Cl - -ioner over cellemembranen, men grundet det muterede gen er proteinet dysfunktionelt. Dette viser sig specielt ved alvorlige symptomer i lungerne, bugspytkirtlen og sveden. For at beskrive intensiteten af en transport har vi fluxen, som er beskrevet ved Ficks lov: J = D m dc. For denne kan separation af de variable, hvor y=f(x) er løsning til dy = g(y) h(x) y=f(x) er løsning til 1 dy = h(x)dx, bruges til at nå frem til nettofluxen: J=-P* C. Under visse antagelser er det g(y) bevist, at man ved Nernst-Planck diffusionsligningen kan komme frem til Goldman-ligningen givet ved V m = RT (o) (o) (i) ln F (P K C K +PNa C Na +PCl C Cl (o)). Cystisk fibrose leder til flere følgesygdomme som følge (i) (i) P K C K +PNa C Na+PCl C Cl af symptomer fra bugspytkirtlen og lungerne. På grund af en manglende udskillelse af hormonet insulin fra bugspytkirtlen forårsaget af det dysfunktionelle CFTR-protein kan cystisk fibrose patienter udvikle diabetes. Insulin er et vigtigt blodsukkerregulerende hormon, som sørger for, at glukose kan optages i cellerne. Hvis det ikke udskilles, vil glukosen blive i blodårerne, hvilket er skadeligt. Grundet det dysfunktionelle CFTR-protein udskilles ej heller vigtige fordøjelsesenzymer. Dette medfører nedsat fordøjelse, hvilket kan føre til vægttab og en tilstand af kronisk diaré. I lungerne skyldes det dysfunktionelle CFTR-protein, at væsken på overfladen af luftvejene dehydreres, således af fimrehårene ikke kan arbejde, samt at der udskilles en sej, tyk slim, bakterier kan bruge som vækstplade. En særlig slem bakterieinfektion er ved bakterien pseudomonas aeruginosa. Denne danner biofilm, hvilket gør, at antibiotika ikke kan nå ind til selve bakterien. Til behandling af cystisk fibrose er stoffet ivacaftor for nyligt kommet på markedet. Det specielle ved lægemidlet er, at det behandler den underliggende årsag for cystisk fibrose altså CFTR genet. Det behandler dog kun for patienter med mutationen G551D, hvilket er 4 %. Man ser også på genterapi, hvor man danner nye gener eller udkonkurrerer syge gener, som en fremtidig mulighed. Man kan bruge en retrovirus som vektor. Fordelen er, at man teoretisk kan behandle for cystisk fibrose en gang for alle, men der er flere ulemper ved brugen af retrovira, der gør at metoden ligger nogle år ude i fremtiden. Fx at man ikke kan styre, hvilke celler retrovira inficerer. Man arbejder også med at bruge lipider som vektor. Virkningen er indtil videre uvis, men man har resultater inden marts 2014. Det fristende ved denne behandlingsform er, at den vil behandle for alle CFTR-mutationer. Hvis dx dx

man sammen-ligner ivacaftor og lipidvektorer har begge behandlingsformer fordele og ulemper, men jeg vurderer, at lipidvektorer har mest potentiale, såfremt den ønskede virkning opnås. Endelig kan man rent matematisk med en række antagelser ved Hardey-Weinberg ligevægten q = q 1+n q se på, om det kan lade sig gøre at udrydde sygdommen. Det viser sig, at der skal gå 66 generationer for at mindske antallet af cystisk fibrose ramte i Danmark til 1 %. Derfor synes udryddelse ikke at være en mulighed. Gensplejsning har den ulempe, at det kan bruges til andet end medicinsk behandling, fx at ændre på sit udseende. Dette ser jeg negativt på, men min etiske vurdering er, at mennesket ved, hvad der er bedst for det selv. Underskrift:

Litteraturliste Bøger: Bremer Jens: Levende organismer Evolution, genetik og diversitet, Nucleus, 1. udgave, 1. oplag 1997. Bruun Kim m.f: Grundbog i Bioteknologi 1, Gyldendal, 1. udgave, 1. oplag, 2010 Bruun Kim m.f: Grundbog i Bioteknologi 2, Gyldendal, 1. udgave, 1. oplag, 2011 Carstensen Jens m.f: Matematik 3, systime, 1990 Cornelius Flemming m.f: Medicinsk Biofysik 1 Grundbog, Aarhus Universitstsforlag, 3. udgave, 2. oplag, 1997 Knudsen Ove Steen: Stoftransport, Membranpotentialer og elektriske impulser over biologiske membraner, Akademisk Forlag, 1. udgave, 1995. Internetsider: http://www.cystiskfibrose.dk/infomateriale/infopjecerogfaktaark/informationomcfannelisehansen.p df Hansen Annelise m.f: Information om Cystisk Fibrose, Olesen Offset, 1. udgave, 1. oplag, 1998 set d. 5. december 2012. http://www.umd.be/cftr/w_cftr/protein.html The CFTR Muation database the CFTR protein - set d. 15. december 2012. http://www.stanford.edu/class/psych121/humangenome-cf.htm Wine Jeffrey, Human Genome Cystic Fibrosis, 2003 set d. 15. december 2012 https://www.cftrscience.com/cftr_dysfunction.php, CFTR Dysfunction in CF Disease set d. 15. december 2012. http://ghr.nlm.nih.gov/gene/cftr National Institute of Health, CFTR set d. 5. december 2012 http://sult.msf.dk/projektet/historien-underernaering/faq-om-underernaering.html Læger uden grænser, set d.. 18. december 2012. http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/jagten/cystisk%20fibrose.aspx Biotech Academy, cystisk fibrose set d. 9. december 2012 http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/placebo Medicinal Dictionary - set d. 12 december 2012.

http://www.novonordisk.com/images/science/bioethics/downloads/bioethics_clinical%20trials%2 0UK_27-10.pdf Novo Nordisk, an introduction to clinical trial set d. 13. december 2012 http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/piis0140-6736(12)60617-5/fulltext Corbyn Zöe, The Lancent, Promising new era dawns for cystic fibrosis treatment set d. 13. december 2012. http://www.biotechacademy.dk/bioindex/biolex/genterapi.aspx Biotech Academy, genterapi - set d. 11. december 2012 http://www.tekno.dk/pdf/projekter/956.pdf Teknologirådet, genterapi - set d. 11 december 2012. Videoer: http://www.dr.dk/tv/se/danskernes-akademi-tv/viden-om-diabetes-fremtidens-stoerste-draeber Viden Om: Diabetes Fremtidens største dræber, set d. 8. december 2012.

Bilag 1 27 Bilag 2 27 http://www.eurogentest.org/blocks/leaflets/pdf/danish/recessive_inheritance.pdf

Bilag 3 Bilag 4

Bilag 5 28 28 http://www.google.dk/imgres?q=lunge+bronkie+alveoler&um=1&hl=da&sa=x&tbo=d&biw=930&bih=453&tbm=isch &tbnid=speufxtkqiiw4m:&imgrefurl=http://ibog.idraetc.systime.dk/index.php%3fid%3d91&docid=njeohvychtrj7m &imgurl=http://ibog.idraetc.systime.dk/typo3temp/pics/3cd06d7d34.png&w=900&h=500&ei=i7peuogmjcyp4gs91y GYDg&zoom=1&iact=hc&vpx=591&vpy=161&dur=763&hovh=168&hovw=301&tx=154&ty=133&sig=11194848909545 9370331&page=1&tbnh=138&tbnw=247&start=0&ndsp=10&ved=1t:429,r:9,s:0,i:106

Bilag 6 29 29 http://www.biotechacademy.dk/bioindex/biolex/genterapi.aspx