2013 Evaluering af metoderne MALDI-TOF MS, ChromID CARBA, KPC+MBL comfirm ID og Modificeret Hodge Test til påvisning af Carbapenemase aktivitet i gramnegative stave Modul 14 Bachelorprojekt University College Sjaelland Udarbejdet af: Afdeling: Vejledere: Mikkel B Nielsen. Klinisk mikrobiologisk afdeling, Slagelse Sygehus. Charlotte Birk Olsen, University college Lillebaelt. Janne Fønns Møller Klinisk mikrobiologisk afdeling Slagelse sygehus. Projektperiode: 8okt.2012 3jan. 2013 Projektsamarbejde: Sussie Rasmussen og Rung Arun Pedersen MALDI-TOF MS, Bruker Daltonics ChromID CARBA MHT 1/3/2013
Resumé Introduktion. Carbapenemase producerende- Enterobateriacae (CPE) og -Pseudomonas aeruginosa er et stigende problem for folkesundheden verden over. I danmark har der siden 2008 været 15 tilfælde af CPE hvoraf størstedelen af disse har været Klebsiella pneumoniae. Alle 15 er fundet i forbindelse med screeningsundersøgelser og ingen af patienterne havde symptomatiske infektioner. Klinisk mikrobiologiske laboratorier har ikke en standariseret metode til påvisning af CPE. Man kan benytte molekylærbiologiske metoder, dog har disse metoder den begrænsning at det kun er kendte enzymer de kan fange. I dette projekt vil der blive afprøvet følgende metoder: Detektion af carbapenemase aktivitet på MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics), KPC+MBL comfirm ID(Rosco Diagnostics), Modificeret Hodge Test(MHT) og chromid CARBA(BioMerieux) Metoder. Til forsøget blev 52 stammer benyttet, 45 Enterobacteriacae og 7 Pseudomonas sp. Af de 52 var 15 carbapenemase producerende, 27 var ESBL eller AmpC og 10 stammer var uden betydelig resistens. Til forsøget på MALDI-TOF blev ertapenem brugt. Til metoderne KPC+MBL comfirmid og Modificeret Hodge Test blev BD iso-res agar(becton Dickinson) benyttet for at fremme detektionen af Metallo-β-laktamaser. Til Modificeret Hodge Test blev Escherichia coli ATCC 25922(Microbiologics, Inc., USA) benyttet som indikatorstamme, til positiv og negativ kontrol blev Klebsiella pneumoniae ATCC stamme 1705 og Klebsiella pneumoniae ATCC stamme 1706(Microbiologics, Inc., USA) benyttet. KMA EUCAST model blev brugt til MHT og KPC+MBL. ChromID CARBA blev udført efter medfølgende protokol. Resultater/konklusion. Der blev med metoden MALDI-TOF-MS opnået en sensitivitet og specifitet på 53,3% og 100%, KPC+MBL confirmid opnåede en sensitivitet og specifitet på 80% og 100%, Modificeret Hodge Test opnåede henholdsvis 83,3 % og 69,4% og chromid CARBA opnåede 100 % og 94,3 %. ChromID CARBA opnåede den højeste specifitet og er velegnet til sceening og detektion af carbapenemase producernde klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, E. coli og Serratia. I tilfælde af eksempelvis carbapenemresistente Pseudomonas og Acinotobacter skal andre metoder benyttes. En optimeret Modificeret Hodge Test med Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 som indikatorstamme vil her kunne benyttes. MALDI-TOF MS er en spændene analyse og har potentiale til udvikling og hvis mikrobiologiske afdelinger har MALDI-TOF til identifikation af bakterier vil det være en fordel at udnytte denne fuldt ud. 2
INHOLDSFORTEGENELSE 1. INDLEDNING 4 1.1. Problembaggrund 4 1.2. Problemformulering 5 1.3. Carbapenemer 6 1.4. Carbapenemaser 6 1.5. Metoder til påvisning af carbapenemase aktivitet 7 1.5.1 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight (MALDI-TOF) 7 1.5.2 ChromID CARBA 8 1.5.3 KPC+MBL confirm ID 8 1.5.4 Modificeret Hodge Test 9 1.6. Metodiske overvejelser 9 2. METODE OG MATERIALER 11 2.1. Prøvematerialer 11 2.2. Forberedelse og fremstilling af bakteriemateriale 12 2.3. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry 12 2.3.1 Fremstilling af matrix til MALDI-TOF MS 12 2.3.2 Forberedelse af antibiotika 12 2.3.3 Fremgangsmåde 12 2.3.4 Aflæsning og fortolkning af resultater 12 2.4. CHROMagar (Biomerieux) 14 2.4.1 Fremgangsmåde 14 2.4.2 Aflæsning og fortolkning af resultater 14 2.5. KPC+MBL CONFIRM ID KIT (ROSCO) 15 2.5.1 Fremgangsmåde 15 2.5.2 Aflæsning og fortolkning af resultater 15 2.6. Modificeret Hodge Test 16 2.6.1 Fremgangsmåde 16 2.6.2 Aflæsning og fortolkning af resultater 16 3. RESULTATER 17 3.1. MALDI-TOF MS 17 3.2. ChromID CARBA 20 3.3. KPC+MBL confirm ID 20 3.4. Modificeret Hodge TesT 20 4. DISKUSSION 21 4.1. MALDI-TOF MS 21 4.2. ChromID CARBA 24 4.3. KPC+MBL confirm ID 25 4.4. Modificeret Hodge Test 26 5. KONKLUSION 28 6. PERSPEKTIVERING 28 7. REFFERENCER 29 8. BILAG Bilag 1 Resultater ubehandlet, MALDI-TOF Bilag 2 Resultatskema/liste over bakterier og gener Bilag 3 EUCAST KMA Slagelse Sygehus Bilag 4 Beregning af sensitivitet og specifitet Bilag 5 Stammernes oprindelse 3
1. INDLEDNING. 1.1 Problembaggrund Antibiotikaresistens hos gram negative stave anses for at være en af de største udfordringerer inde for behandling af infektioner verden over. Infektioner med multiresistente Gram negative stave behandles som regel med carbapenemer. Resistensen over for denne type antibiotika er gennem de seneste år steget, og skyldes ændringer i den ydre membran af cellevæggen samt produktion af carbapenem-hydrolyserende-enzymer(carbapenemaser) (Hraba k J 2011). I danmark har der siden 2008 været 15 tilfælde af carbapenemase producerende enterobakterier (CPE) hvoraf størstedelen af disse har været Klebsiella pneumoniae. Alle 15 er fundet i forbindelse med screeningsundersøgelser og ingen af patienterne havde symptomatiske infektioner(ssi, EPINYT 2012). Fra 2007 til starten af 2008 blev to patienter, den ene i Sverige og den anden i Frankrig, identificeret med infektion forårsaget af carbapenemase producerende Klebsiella pneumoniae. Fælles for disse to patienter var, at de havde været indlagt på et sygehus i Grækenland. (Giakkoupi P 2009), Der er for nylig rapporteret flere store udbrud af CPE i Holland, Italien og Polen af typen Klebsiella pneumoniae carbapenemase(kpc) samt Oxacillinase(OXA) producerende Klebsiella pnemoniae. I Grækenland er Carbapenemase producerende bakterier endemisk forekommende. I Pakistan og Indien ses en høj forekomst af New Delhi metallo-β-lactamase (NDM), men der rapporteres om tilfælde fra stort set alle dele af verden. Ud over at infektionerne er særdeles vanskelige at behandle med antibiotika, har bakterierne potentiale til at etablere sig og spredes både på fx sygehuse, plejehjem og herfra til samfundet idet antibiotikabehandling kan medvirke til at fastholde bærertilstanden og medføre opformering og større udskillelse.(ssi epi nyt 2012) I kontrast til de kromosomale metallo-β-lactamaser, ses der en øget spredning af overførbare varianter af carbapenemaser, specielt hos KPC og OXA-producerende Klebsiella pneumoniae(k. pneumoniae). Selvom KPC enzymer hovedsageligt ses i forbindelse med K. pneumoniae, er de også set i Enterobacter spp. og i Salmonella spp.(queenan A, Bush K 2007) European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) og Centers for Disease Control (CDC) i USA, anbefaler screening for CPE hos patienter overflyttet fra sygehus i udlandet, samt patienter som mistænkes at være del af et udbrud. Carbapenem-resistens kan påvises fænotypisk. Dog kræves en molekylærbiologisk undersøgelse for at bekræfte dette, dette muliggør samtidig karakterisering af enzym-typen.(ssi EPI-NYT 2012, 10) 4
De første beskrevne carbapenemaser var fra gram- positive Bacillus sp. Man fandt ud af at de var af typen metallo-β-lactamase(mbl) idet de blev inhiberet af EDTA, man har senere fundet ud af at alle MBL har mindst et zink-atom i det aktive site. I midten af 80érne fandt man endnu et carbapenem hydrolyserende enzym denne gang i familien Enterobacteriacae. Disse β-lactamaser har man fundet ud af har serine i det aktive site og at de bliver inhiberet af clavulansyre og tazobactam. Indtil starten af 90érne var carbapenemaser beskrevet som kromosomale β- lactamaser og derfor arts-specifik. Men med opdagelsen af plasmid-encoded IMP-1 hos Pseudomonas aeruginosa og ARI-1 (OXA23) hos Acinetobacter baumannii samt KPC-1 hos Klebsiella pneumoniae, blev man opmærksom på at det ikke kun var spredning af specifikke stammer der også kunne være et problem. Mange af disse enzymer genkender næsten alle former for hydolyser-bare β-lactamer og næsten alle af dem er modstandsdygtige over β-lactamase hæmmere. (Queenan A, Bush K 2007) De hyppigst forekommende carbapenemaser er Klebsiella pneumoniae carbapenemase(kpc) Oxacillinase β-lactamase (OXA) Verona integron-kodet metalo-β-lactamase (VIM) og New Delhi metallo-β-lactamase (NDM). Klebsiella pneumonieae carbapenemaser(kpc) giver anledning til bekymring, idet arten er kendt for at overføre resistensmekanismer til andre arter.(ssi EPI-NYT 2012, 10) På nuværende tidspunkt er der ikke en pålidelig og standardiseret metode til påvisning af carbapenemase aktivitet på klinisk mikrobiologiske afdeling Slagelse sygehus. Ved infektion med gram negative stave bliver der lavet resistensbestemmelse, hvori meropenem indgår som indikator for carbapenemresistens. Der findes forskellige metoder til påvisning af carbapenemase aktivitet, bla. MIC bestemmelse, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS), Modificeret Hodge Test, KPC+MBL disk diffusion og chromagar samt DNA baseret-metoder såsom PCR. Ved følsomhedstest baseret på antibiotikadiffusion, går der mindst 18 timer inden der forekommer et resultat, og visse enzymer viser ikke resistens in vitro. Resultater fra PCR kan haves inden for samme dag, dog har analysen højere omkostninger pr. reaktion og er mere arbejdskrævende. PCR kan desuden kun detektere kendte enzymer. (Irene Burckhardt, Stefan Zimmermann). 1.2 Problemformulering Hvilken metode til påvisning af carbapenemase aktivitet, har den højeste diagnostiske sensitivitet og specifitet af henholdsvis MALDI-TOF, KPC+MBL confirm ID kit, Modificeret Hodge Test eller chromid 5
CARBA, til påvisning af carbapenemresistente bakterier, som på baggrund af dette kan anvendes på Klinisk Mikrobiologisk afdeling 1.3 Carbapenemer Carbapenemer er β-lactam antibiotika der har et carbon atom i stedet for sulfon i β-lactam-ringen. Carbapenemer virker ved at inhibere cellevæg-syntesen når det binder sig til inaktiverende penicillin-bindende-protein (PBP). Carbapenemer modstår de fleste β-laktamer inklusiv ESBL β- laktamaser. Resistens imod carbapenemer opstår ved ændringer i bakteriernes PBP og ved erhvervelse af carbapenemaser eller ved ændringer i membran-permabiliteten på grund af tab af specifikke poriner i den ydre membran.(wexler H, 2004) Meropenem er et bredspektret β-laktam-antibiotika der virker på de fleste grampositive og gramnegative bakterier, aerobe og anaerobe, dog ikke på Stenotrophomonas maltophilia. Meropenem er mindre aktivt imod stafylokokker og Clostridium sp end imipenem. Meropenem har en højere affinitet til PBP, end øvrige β-laktam antibiotika. Det virker bakteriecidt i logfasen idet den høje affinitet forårsager sfæriske protoplaster(sfæroplaster) der er meget labile og let lyserer.(promedicin.dk) Ertapenem er et langtids virkende carbapenem, som har bred antibakteriel spektrum. Det gives en gang i døgnet pga. en høj bindingsprocent til plasma proteiner. På grund af tilstedeværelsen af 1 β -methyl substituent er hydrolysen af ertapenem i kroppen ca. en fjerdel i forhold til imipenem. Ertapenem virker både på grampositive og gramnegative bakterier inkl. de fleste anaerobe arter. Ertapenem har begrænset virkning på Pseudomonas aeruginosa, Acinotobacter sp, Methicillin resistente staphylococcus sp og enterokokker. (Zhanel GG, et al 2007),(Wexler H, 2004) 1.4 Carbapenemaser Carbapenemaser er β-lakamaser der hurtigt kan hydrolysere carbapenemer. β-lakamaser kan inddeles efter funktion eller efter molekylær klassificering baseret på nukleotid og aminosyresekvenser. Den molekylære inddelling kaldes Ambler klassifikation og består af grupperne A, B, C og D hvor A,C og D har serine i deres aktive site og klasse B har Zink i det aktive site. Carbapenemaser fra klasse A kan deles op i 6 grupper hvoraf KPC, SME, IMI/NMC-A og GES udgør 4 af grupperne. SHV-38 og SFC-1 er hver især en gruppe i sig selv. Disse gener er enten indkodet i plasmider eller kromosomet. De kan hydrolysere penicilliner, cefalosoriner, monobactam og carbapenemer. Denne klasse bliver inhiberet af clavulansyre og tazobactam. 6
Klasse B carbapenemaser dækker metallo-β-laktamaser(mbl). De mest almindelige MBL er VIM, IMP, GIM, NDM og SIM. Disse hydrolyserer carbapenemer, penicilliner, cefalosporiner men ikke aztreonam. MBL er modstandsdygtig over for β-laktamase hæmmere, men inhiberes af EDTA og dipicolinsyre. I modsætning til de kromosomale MBL, ses en stigning af overførbare varianter af MBL. Disse gener er lokaliseret I integron strukturer, hvor de er blevet inkorporeret i genkassetter, når disse integroner bliver forbundet med plasmider eller transposoner er overførelse af generne en mulighed. AmpC enzymer tilhører Ambler Klasse C. Generne involveret i AmpC betalactamaser kan være i bakteriernes kromosomer eller i plasmider. Kromosomale AmpC-betalaktamaser bliver produceret i mindre grad, men ved inducering hyper-produceres AmpC β- laktamaser, der i forbindelse med porin og efflux mekanismer udviser klinisk resistens. AmpC β-laktamaser hydrolyserer bland andet penicilliner, cefalosporiner og cefoxitin og i ringe grad carbapenemer. OXA-β-laktamaser tilhører klasse D β-laktamaser, hvoraf nogle er ESBL og carbapenemaser. Det er den type af β-laktamaser der er hyppigts forekommende i plasmider. Indtil videre er der fundet 102 oxacillinaser(oxa) heraf er 37 identificeret som carbapenemaser. De inhiberes kun svagt af clavulansyre. (Queenan A, Bush K 2007) 1.5 Metoder til påvisning af carbapenemase aktivitet Carbapenem-resistens kan påvises fænotypisk, men kræver en molekylærbiologisk undersøgelse for at dette bekræftes der samtidig muliggør karakterisering af enzym-typen.(ssi EPI-NYT 2012, 10) I denne opgave afprøves metoder til påvisning af carbapenemase aktivitet på MALDI-TOF og carbapenemresistens på modificeret Hodgetest, KPC+MBL Confirm ID kit(rosco Diagnostica) og chromagar(biomerieux). 1.5.1 MALDI-TOF Mass Spectrometry MALDI-TOF kan deles op i to principper. Hvor første del er MALDI og den anden TOF. Ved MALDI delen bliver prøven samt den påførte matrix belyst af en nitrogen laser. Matrix absorberer det ultraviolette lys og omdanner det til termisk energi En lille del af matrix samt prøvemateriale opvarmes på få nano sekunder og fordamper. På grund af fordampningen dannes der ioner af forskellige størrelser se figur 1. 7
Ved Time Of Flight (TOF) delen er det spændingspotentialet mellem ionerne og bunden der tiltrækker ionerne i den retning som vist i figur 2. Hastigheden af ionerne bestemmes med loven om bevarelse af energi der defineres således, den totale energi i et lukket system forbliver den samme uanset ændringer Fig 1. illustrerer ionisering af prøven. Kilde: Shimadzu Coorp inde i systemet. De lette ioner og ioner med høj ladning bevæger sig hurtigere igennen drift space indtil de når detektoren. Dvs at ionernes tid gennem drift space afhænger af m/z (mass over charge) værdien af ionen.(shimadzu coorp, 2012),(Bruker Daltonics) Bestemmelse af carbapenemase/β-laktamase aktivitet på MALDI-TOF er en spektrometrisk analyse af degrationen af antibiotika. Når ertapenem fremstilles vil der opstå flere varianter af ertapenem i Fig 2 viser ionernes vej gennem drift space kilde: Shimadzu Coorp form af ertapenemsalte. 4 af disse varianter bliver brugt til vurdering af resultatet. Noget af ertapenemen er i forvejen hydrolyseret og decarboxyleret og har en molekylevægt på 450 Dalton(DA). Denne top vil altid kunne ses i spektrummet fra MALDI-TOF idet den ikke kan nedbrydes yderligere. 476 toppen er en ren form for ertapenem, 498 toppen er ertapenem med et natrium molekyle, 520 toppen er ertapenem med 2 natriummolekyler. Toppen på 450Da bliver brugt som en form for refferencetop, idet man ved bedømmelse af andre toppe ser på hvor meget disse er blevet mindre i forhold til 450 toppen. Hvis test bakterierne producere β-laktamaser der kan nedbryde ertapenem, vil man på kromatogrammet kunne se at toppene er blevet mindre i forhold til toppen på 450Da. I henhold til forsøget på KMA Slagelse sygehus, har bedømmelseskriterierne for positiv for carbapenemase, været at toppene på 476Da, 498Da og 520Da skal være forsvundet fuldstændigt altså total nedbrydning.(bruker Daltonics), (Kempf M et al) 1.5.2 ChromID CARBA ChromID CARBA-agar er et selektiv kromogent medium til screening af carbapenemaseproducerende-enterobacteriacea(cpe). Der er tilsat forskellige typer af antibiotika som muliggør selektiv vækst af CPE. E. coli der producerer β-glucoronidase og/eller β-galactosidase vokser med 8
et farve spectrum fra lyserød til bourgogne farvet. Klebsiella, Enterobacter,Serratia, Citrobacter der producerer β-glucosidase vokser med blålig-grøn til blå-grå farve.(biomerieux) 1.5.3 KPC+MBL confirm ID kit som måles efter EUCAST modellen Følsomhedsomhedstesten KPC+MBL kan bruges til at detektere og skelne mellem de forskellige klasser af carbapenemaser og er baseret på zonestørrelser i forhold til meropenem og meropenem kombineret cloxacillin eller disse forskellige β-laktamase hæmmere, borsyre og dipicolinsyre. Zonestørrelserne måles efter EUCAST forskrift. AmpC enzymerne bliver inhiberet af Cloxacillin. Dette bliver brugt til at skelne imellem AmpC og KPC, da begge bliver inhiberet af Borsyre. En forskel på mere eller lig med 5mm zone mellem meropenem og meropenem + Cloxacillin indikere AmpC aktivitet. MBL bliver inhiberet af Dipicolinsyre og en forskel i zone størrelse på 5mm eller mere mellem meropenem og meropenem+dipicolinsyre indikerer tilstedeværelsen af et Metallo β-laktam. KPC enzymer bliver inhiberet af Bor syre, men idet Borsyre også inhiberer AmpC, kigger man ligeledes på Cloxacillin kombinationen. Så en zone forskel på mere eller lig med 4mm med meropenem + borsyre men ingen forskel (mindre end 4mm) med meropenem +Cloxacillin indikerer KPC enzym.(rosco Diagnostica) 1.5.4 Modificeret Hodge Test Modificeret Hodge Test bruges til detektion af carbapenemaser. Der benyttes en 10 ug meropenem tablet, 3 American Type Culture Collection (ATCC) stammer, en carbapenemase positiv og negativ Klebsiella pneumoniae som positiv og negativ kontrol og en følsom Escherichia coli som indikatorstamme, der sås ud med total spredning med en mcfarland på 0.5. Oven på e. coli bliver der fra kanten af agarpladen og ind til meropenem tabletten påført de to kontrolstammer samt test bakterien. Når en test bakterie producere carbapenemaser er den i stand til at nedbryde carbapenem. Det gør at den følsomme E. coli vil vokse langs stregen inde i hæmningszonen, fordi carbepenemaserne nedbryder carbapenem omkring stregen. (BioNovus 2008) 1.6 Metodiske overvejelser Valg af bakteriestammer til projektet blev foretaget ud fra slægt og resistens-mekanisme(se bilag 2, for oprindelse se bilag 5). Bakterier fra Enterobacteriaceae, og Pseudomonas sp blev udvalgt ud fra resistens mekanismerne ESBL, AmpC og carbapenem-resistens, samt kendte carbapenemfølsomme kvalitets kontrol(qc) og ATCC stammer. ESBL og AmpC blev medtaget for at efterligne 9
et potentielt fremtidig klinisk scenarie med højere forekomst af forskellige resistensmekanismer. Disse resistens-mekanismer blev desuden valgt for at undersøge metodernes styrke til at påvise carbapenemase og undgå falsk positive resultater fra ESBL og AmpC idet overekspression af f.eks. AmpC kan give resistens overfor carbapenemer.(leavitt. A et al 2009) Stamme nr 30 blev i denne rapport anset som ESBL og ikke som carbapenemase, Idet carbapenemase aktiviteten af GES-1 enzymer er så lav at den bør betragtes som ESBL.(Rasmussen, J.W og Høiby, N. 2007) Idet stammesamlingen kun har en OXA-48 carbapenemase producerende bakterie (nr. 43 E. coli) blev denne udeladt fra forsøget med KPC+MBL confirm ID. Der blev vurderet at der ikke kunne konkluderes noget på en stamme, derfor blev resultater for Temocillin ikke medtaget i denne rapport. Postiv(Klebsiella pneumoniae ATCC 1705 ) og negativ(klebsiella pneumoniae ATCC 1706) kontrol blev taget med i udregning af sensitivitet og specifitet for KPC+MBL confirm ID. Ved valg af metoder til projektet, var MALDI-TOF i første omgang blevet prioriteret. Klinisk mikrobiologisk afd Slagelse sygehus så også gerne CHROMagar afprøvet. Derudover blev der valgt at afprøve KPC+MBL confirm ID kit, dette er tidligere blevet afprøvet på afdelingen unden stor succes. Til sidst blev Modificeret Hodge Test afprøvet. I artiklerne af Hrabák J et al. samt artiklen af Kempf M et al. blev der brugt NaCl til carbapenemopløsningen. På anbefaling fra Bruker blev der benytter HPLC-vand i stedet for en NaCl-opløsning til forsøget på MALDI-TOF. Brugen af HPLC-vand ville ifølge Bruker fjerne forstyrrende ioner. Metoderne for MHT og KPC+MBl blev udført i henhold til laboratorieinstruks for EUCAST s diskdiffusions metode. På baggrund af artiklen af Amjad A 2011 et al samt information givet af medarbejder fra biomerieux blev der i stedet for Mueller Hinton agar, brugt Becton Dickinson isores, idet pladen indeholdt zink. Der blev beregnet sensitivitet og specificitet på MHT, ChromID og KPC+MBL samt for MALDI-TOF MS og resultaterne blev sammenlignet for at bedømme metoderne. Sensitivitet og specifitet er blevet anvendt til at vurdere metodernes evne til at foretage en korrekt diagnose.(statnoter biolyt.dk) Opbygningen og udførelse af protokolen var afgørende for metodernes evne til at påvise et pålideligt resultat. Ifølge Jørgensen T. et al. kan dette ske ved, at kvalitet inddrages i hele forskningsprocessen. Dvs at valg af litteraturer, der anvendes, skal leve op til krav om validitet.(jørgensen, T. Christensen, E. og Kampmann, J.2011) 10
Sensitivitet % = x 100 Specificitet % = x 100 For at sikre pålideligheden af resultaterne fra MALDI-TOF, blev der udført dobbeltbestemmelse. Der blev kørt en nul prøve der kun indeholdt ertapenem, en postiv(klebsiella pneumoniae ATCC 1705 ) og negativ(klebsiella pneumoniae ATCC 1706) kontrol. Nulprøven og kontrollerne inkuberes og behandles ligesom test bakterierne. (Amjad, A et al 2011) Vurdering af resultaterne fra MALDI-TOF MS skete i samarbejde med medarbeder fra bruker samt forskningsbioanalytiker og underviser fra KMA slagese. Pladerne fra MHT, chrom-agar og KPC+MBL kit blev aflæst af 4 personer, 3 som udgjorde bachelorgruppen og k-vejleder. Efter aflæsning blev resultaterne sammenholdt. Ved uens resultater blev der vurderet yderligere, med vægt på erfaring. 2 Materialer og metode 2.1 Prøvematerialer Til forsøgene blev der anvendt i alt 52 isolater (bilag 2), der blev opbevaret i minus 80 C fryser på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Slagelse sygehus. 45 (85%) af stammerne tilhørte Enterobacteriaceae familien. Der blev udvalgt henholdsvis 21 Klebsiella pneumoniae, 1 Klebsiella oxytoca, 16 Escherichia coli, 3 Enterobacter species, 2 Citrobacter freundii, 1 Proteus mirabilis og 1 Morganella morganii. Resten af isolaterne omfatter 7 Pseudomonas species. Som kontrolstammer blev Klebsiella pneumoniae ATCC stamme 1705 (Microbiologics, Inc., USA) anvendt som positiv kontrol, og Klebsiella pneumoniae ATCC stamme 1706 (Microbiologics, Inc., USA) blev anvendt som negativ kontrol. Escherichia coli ATCC stamme 25922 (Microbiologics, Inc., USA) blev anvendt som Indikatorstamme til MHT. 11
2.2 Forberedelse og fremstilling af bakteriemateriale Bakteriemateriale blev taget fra frysebouillon og blev udsået med tretrinsspredning på 5 % blodagar (SSI, København). Pladerne blev inkuberet i varmeskab (Struers, Rødovre) ved 35 C i ca. 18-24 timer. For at opnå renkultur blev stammerne omsået fra en enkeltliggende koloni. Renkulturerne blev anvendt inden for 6 timer efter inkubation.(burckhardt 2011) 2.3 MALDI-TOF MS 2.3.1 Fremstilling af matrix til MALDI-TOF MS: Basalt organisk opløsningsmiddel (OS) blev blandet af 560 µl 50 % acetonitril (Sigma-aldrich, Germany) 35 µl 2,5 % tri-flour-eddike-syre (TFA) (Merck KGaA, Germany) og 525 µl HPLC-vand (Merck KGaA, Germany). Matrix blev fremstillet af udportioneret HCCA([α-cyano-4- hydroxycinnamic acid])-krystaller (Bruker Daltonik GmbH, Germany) og 250 µl OS (KMA, 2012) 2.3.2 Forberedelse af antibiotika opløsning: Til 5 ug ertapenem (MSD, Frankrig) i fast form blev 500 µl HPLC-vand (Merck KGaA, Germany) tilsat. Herefter blev opløsningen fortyndet med HPLC-vand 1:10 svarende til en antibiotisk koncentration på 1 ug/ml. 2.3.3 Fremgangsmåde: 30 µl ertapenem-opløsning blev overført til 1,5 ml effendorp-rør (SARSTEDT, Germany). Til hvert rør blev der tilsat ca. 1 µl teststamme fra koloni ved hjælp af øjepodenål. Prøverne blev inkuberet ved 36 C i 1 time og mixet samtidig ved 700 rpm. Efter inkubation blev prøverne centrifugeret i 90 sek. ved 12.000 x g. 1 µl af supernatanten blev afsat på targetpladen (Bruker Daltonik GmbH, Germany). Det afsatte prøvemateriale blev tørret ved stuetemperatur. På hvert spot blev tilsat 1 µl matrix på targetpladen der igen skulle tørre. Herefter blev targetpladen loaded på MALDI-TOF. (Burckhardt & Zimmermann 2011, Sparbier 2012,Bruker Daltonics) 2.3.4 Aflæsning og fortolkning af resultater: Et resultat blev fortolket positivt for carbapenemase-aktivitet, hvis toppene for ertapenem på 476, 498 og 520 Dalton (Da) forsvandt fuldstændig efter inkubation (figur 3). Der skulle samtidig observeres for forekomsten af andre toppe, der indikerede et resistensmønster i prøven (se tabel 1). Dette blev medtaget i tolkning og vurdering af positive resultater. Ved negativt resultat, forekom toppene på 476, 498 og 520 Da nogenlunde samme højde som toppen på 450 Da eller 12
højere (figur 4). Disse toppe blev aflæst og tolket ved hjælp af tabel 1. (Burckhardt & Zimmermann 2011, Sparbier 2012) På figur 3 er et eksempel på et positivt resultat fra MALDI-TOF MS, toppene for ertapenem på 476, 498 og 521 Dalton (Da) forsvandt fuldstændigt efter inkubation. Massespektrum i figuren afspejler et resistent mønster på grund af toppene på 471 og 488, som fremgår i tabel 1. Figur 1: Viser spektrum for et positivt resultat af stamme nr. 46 indeholdende ESBL+CARBA. Figur 4 viser eksempel for et negativt resultat fra MALDI-TOF MS, hvor der ikke observeres nedbrydning af ertapenem, da toppe på 476, 498, 514 er synlige og lige høje med toppen på 450 Massespektre i figuren afspejler et sensitivt mønster, som fremgår i tabel 1. Figur 2: Viser spektrum for et negativt resultat af stamme nr. 2. Tabel 1 illustrerer opdeling af et sensitivt og resistent mønster for ertapenem på baggrund af varierende massespektre. Forekomsten af det pågældende mønster er baseret på stammer, der enten er carbapenem-sensitive eller -resistente. Tallene i nedenstående tabellen afspejler de massespektre, der typiske forekommer for det pågældende mønster. Tabel 1: Masse (Da) og molekyleformer, der definerer et sensitivt mønster og et resistent mønster for ertapenem (Burckhardt & Zimmermann 2011, Sparbier et al. 2012).. 13
MW Sensitivt mønster [g/mol] [M+H] + [M+Na] + [M+K] + [M+2 Na] + [M+Na+K] + [M+3Na] + Ertapenem 475,5 476,5 498,5 514,5 520,5 536,5 542,5 Resistent mønster [M hydr.+h] + [M hydr.+na] + [M hydr.+2na] + [M hydr.+na+k] + [M hydr/decarb..+h] + [M hydr/decarb..+na] + [M hydr./decarb.+k] 497,5 516,5 538,5 554,5 450,5 472,5 488,5 + 2.4 CHROM ID Carba 2.4.1Fremgangsmåde: Der blev efter EUCAST-forskrift fremstillet en baktieriesuspension svarende til 0,5 McFarland(KMA EUCAST 2012). Denne opløsning fortyndes 1:10 med 0,9% NaCl-opløsning. 10 µl af fortyndingen blev afsat på en ChromID TM CARBA-plade.(BioMerieux,Frankrig) Bakteriesuspensionen blev strøget ud med tretrinsspredning. Pladerne blev inkuberet i varmeskab ved 35 C i 18-24 timer. (KMA: EUCAST, 2012) 2.4.2 Aflæsning og fortolkning af resultater: For et positivt resultat skelnedes der mellem E. coli og en gruppe af Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp. og Citrobacter sp. (KESC-gruppen), som var baseret på en farveindikation. Kun carbapenemase resistente bakterier kunne fremvokse på ChromID CARBA. Et resultat blev tolket positivt, når der på ChromID CARBA fremkom kolonierne i farverne blå-grøn til blå-grå hos KESCgruppen (figur 5-1). Ligeledes blev et positivt resultat for E. coli tolket ved, at der fremkom lyserøde til bourgognefarvede kolonier eller transparente kolonier med et lyserødt til bourgognefarvet centrum (figur 5-2). Ved negative resultater observeredes der ingen bakterievækst (figur 5-3). (BioMéreux: Indlægsseddel, 2012) 14
1.) Positiv for CPE af KESC-gruppen. 2.) Positiv for CPE af E. coli arter. 3.) Ses ingen vækst derfor negativ for CPE. Figur 5 viser ChromID CARBA agarplader fra eget forsøg. Billede 1 illustrerer et positivt resultat for carbapenemaseaktivitet af KESC-gruppen, hvor kolonierne i blå-grøn til blå-grå farver blev udtrykt på pladen. Billede 2 viser ligeledes et positivt resultat med carbapenemase-aktivitet af E. coli, hvor kolonier med lyserøde til bourgognefarvede eller transparente med et lyserødt til bourgognefarvet centrum blev udtrykt på pladen. Billede 3 observeres der ingen bakterievækst, som derved blev tolket for et negativt resultat. Kilde Egne fotos. 2.5 KPC-MBL confirm ID pack 2.5.1 Fremgangsmåde: På BD iso-resistensplade blev stammerne udsået efter EUCAST-metoden. Meropenem 10ug, meropenem 10ug+dipicolinsyre, meropenem 10ug+borsyre og meropenem 10ug+cloxacillin blev lagt i hvert hjørne af en firkant mindst 15 mm fra kanten (se figur 6). Pladerne blev inkuberet i varmeskab ved 35 C i 18-24 timer.(rosco Diagnostica: Indlægsseddel, 2012) Efter inkubation blev hæmningszonerne aflæst og målt ifølge EUCAST forskrift. Figur 6 illustrerer, hvorledes tabletterne bliver afsat på BD-iso-res ved KPC MBL metode. 2.5.2 Aflæsning og fortolkning af resultater: Et positivt resultat blev tolket på følgende måde. Ved tilstedeværelse af AmpC+ porin-tab skulle hæmningszonen for MRPBO være 4 mm og MRPCX være 5 mm i forhold til hæmningszonen for MRP10 (se tabel 2). Et positivt resultat for KPC skulle hæmningszonen for MRPBO være 4 mm og MRPCX være < 4 mm i forhold til hæmningszonen for MRP10. For MBL skulle hæmningszonen for MRPDP være 5 mm i forhold til hæmningszonen for MRP10 (se tabel 2). Et negativt resultat for KPC og MBL, hvor carbapenemase-aktivitet ikke blev udtrykt, skulle forskel af hæmningszonerne være indenfor 3 mm for hvert antibiotika og hæmmere (se tabel 2). (Rosco Diagnostica: Indlægsseddel, 2012) Figur 6: KPC+MBL confirm ID kit afprøvet på Klebsiella pneumoniae på BD iso-res. Kilde: Eget foto 15
Tabel 2 illustrerer, hvorledes hæmningszonen for det pågældende antibiotikum skal tolkes. MRPBO med en hæmningszonen 4 mm og MRPCX med en hæmningszonen 5 mm i forhold til hæmningszonen for MRP10 indikerer AmpC+porin-tab. KPC positiv, hvis hæmningszonen for MRPBO er 4 mm og MRPCX er < 4 mm i forhold til hæmningszonen for MRP10. MBL positiv, hvis hæmningszonen for MRPDP er 5 mm i forhold til hæmningszonen for MRP10. Tabel 2: illustrerer fortolkning af zonestørrelse for antibiotika, der er gældende for den enkelte resistensmekanisme. Resistensmekanisme MRPBO MRPDP MRPCX AmpC + porin-tab MRP10 4 mm <= 3 mm 5 mm KPC MRP10 4 mm <= 3 mm < 4 mm MBL MRP10 < 4 mm 5 mm <= 3 mm 2.6 Modificeret Hodge Test 2.6.1Fremgangsmåde: Der blev efter EUCAST-forskrift fremstillet en baktieriesuspension af Escherichia coli ATCC 25922 svarende til 0,5 McFarland. Opløsningen blev fortyndet 1:10 med 0.9% NaCl-opløsning og blev udsået på BD iso-res efter EUCAST. På pladerne blev der med nummer 1, 2 og 3 angivet hvor de respektive bakterier skulle afsættes for at skelne mellem negativ kontrol, positiv kontrol og teststreg. En 10 ug meropenemtablet blev placeret i midten af pladen. Teststamme, positive og negative kontroller blev opsamlet fra kolonier og påført fra kanten af pladen og ind til meropenmtabletten. Pladerne blev inkuberet ved 35 C i 18-24 timer. (Amjad 2011) 2.6.2 Aflæsning og fortolkning af resultater: Ved positiv MHT voksede indikatorstammen (E. coli) under inkubation, ind mod stregen af testbakterien med retning mod meropenemtabletten og dannede et karakteristisk kløverblad, som illustreret på billede 1 ved pilen (se figur 7). Ved et negativt resultat, ville indikatorstammen derimod ikke vokse ind mod stregen af testbakterien og danne kløverbladsvækst, som vist på billede 2 ved pilen (se figur 7). (Amjad et al. 2011) Figur 7 viser to BD-iso-res plader fra eget forsøg med MHT. Hver streg er nummeret 1, 2 og 3, som illustrerer henholdsvis positiv kontrol, negativ kontrol og teststamme. Billede 1 viser et positivt 16
resultat, hvor der observeres en karakteristisk kløverbladsvækst af standardstammen (E. coli) omkring teststregen, som vises med pilen. Billede 2 viser et negativt resultat, hvor der omkring teststregen ikke ses en karakteristisk kløverbladsvækst af standardstammen (E. coli), som vises med pilen. 3 1 2 3 1 2 1.) Carbapenemase positiv 2.) Carbapenemase negativ Figur 3: Illustrerer positive og negative resultater ved MHT. Nr. 1 og 2 indikerer henholdsvis positiv og negativ kontrol, mens nr. 3 indikerer testbakterie. Kilde: Egne fotos 3 Resultater MALDI-TOF MS Af de 15 carbapenemase-producerende stammer, blev 8 påvist sandt positive (bilag 2). Ud af 37 carbapenem-følsomme stammer blev alle påvist sandt negative. MALDI-TOF MS opnåede en sensitivitet på 53,3 % og en specificitet på 100 % (se tabel 3). For alle resultater se (bilag 1). Nedenstående viser eksempler af MALDI-TOF resultater. Figur 8 viser falsk negative resultater. Figurer 9 illustrerer falsk negative resultater, hvor der ses en svag nedbrydning af carbapenem. Ligeledes viser figurer 10 og 11 sandt negative resultater med en svag nedbrydning af ertapenem. Figur 8 viser resultater for bakteriestammerne nr. 31, 36 og 38. På figuren ses der toppene 476, 498 og 514, da disse toppe er mindre end toppene fra spektrumet af ren ertapenem indikerer dette delvis nedbrydning af ertapenem. 17
Figur 8: Viser et falsk negativt resultat for stammerne nr. 31, 36 og 38 indeholdende CARBA og ESBL+CARBA. Figur 9 viser resultater for bakteriestammerne nr. 33, 35 og 53 der alle er Pseudomonas sp. På figuren ses der toppe på 476, 498 og 514, der indikerer svag nedbrydning af ertapenem, da disse er lavere end toppene for ren ertapenem Figur 9: Viser et falsk negativt resultat for stamme nr. 33, 35 og 53 indeholdende CARBA gen. 18
Figur 10 viser resultater for bakteriestammerne nr. 22-29(ESBL). På figuren ses delvis nedbrydning af ertapenem på toppene 476, 498 og 514 sammenlignet med ren ertapenem. Figur 10: Viser massespektrum for stamme nr. 22-29 indeholdende ESBL, hvor der ses delvis nedbrydning af ertapenem. 19
Figur 11 viser resultat for bakteriestamme nr. 45 (ampc). På figuren ses der delvis nedbrydning af toppene på 476, 498 og 514 sammenlignet med spektrum for ren ertapenem. Figur 11: Viser stamme nr. 45 indeholdende AmpC, her ses delvis nedbrydning af ertapenem. ChromID CARBA Testen kunne påvise 13 sandt positive ud af 13 stammer indeholdende carbapenemaseproducerende (inkl. pos. Kontrol), mens 32 stammer blev påvist sandt negative ud af i alt 34 negative stammer (inkl. negativ kontrol) (se bilag 2). På baggrund af udregninger for sensitivitet og specificitet opnåede testen en sensitivitet og specificitet på henholdsvis 100 % og 94,1 % (se tabel 3). KPC-MBL confirm kit Ud af i alt 16 carbapenemase-producerende stammer (inkl. positiv kontrol), blev 12 stammer detekteret sandt positive. Af i alt 37 stammer, der ikke indeholdt carbapenemaser, blev alle identificeret sandt negative. Testen opnåede en sensitivitet og specificitet på henholdsvis 80% og 100 % (se tabel 3). Sensitiviteten for KPC alene var på 100% og for MBL var den på 71.4% Modificeret Hodge Test Ud af 15 carbapenemase-producerende stammer, blev 10 stammer påvist sandt positive, 4 stammer var uaflæselige og 2 stammer blev påvist falsk negative. Af de 37 carbapenem-sensitive stammer blev 25 stammer identificeret sandt negative. Sensitivitet og specificitet på testen blev beregnet til henholdsvis 83,3 % og 69,4% (se tabel 3). Tabel 3: viser beregning af sensitivitet og specificitet for KPC-MBL, MHT og ChromID CARBA (se bilag 4). KPC-MBL MHT ChromID CARBA MALDI-TOF Sensitivitet % 80 % 83,3 % 100% 53,3 % Specificitet % 100 % 69,4 % 94,1 % 100 % 20
Tabel 4 viser isolater, der gav falske resultater, som enten er falsk negativ eller positiv. Stammerne er inddelt efter resistensgen, hvor CARBA er placeret øverst, ESBL i midten og AmpC til sidst. For hver metode, afsættes der et kryds, der indikerer enten falsk negativ eller positiv. For MHT fremkom der i alt 11 falsk positive og 2 falsk negative resultater, mens for KPC+MBL fremkom der i alt 4 falsk negative resultater. Ved MALDI-TOF fremkom der i alt 7 falsk negative resultater og ingen falsk negativt resultat for ChromID (tabel 4). Tabel 4: viser falsk positive og negative resultater i forhold til KPC+MBL, ChromID CARBA og MHT samt resistens-mekanisme. Bakterienr. Art Resistensgen MALDI KPC-kit MHT ChromID FP FN 31 K. pneumoniae KPC-2 CARBA X + 32 E.coli VIM-1 CARBA X + 33 Pseudomonas sp. VIM-2 CARBA X + 35 P. aeruginosa IMP-1 CARBA X X X + 36 K. pneumoniae KPC-2 CARBA X + 38 K. pneumoniae VIM CARBA X + 43 E. coli OXA-48, TEM CARBA X X + 53 P. aeruginosa CARBA X X X + 11 E.coli CTX-M ESBL X + 27 P. mirabilis ESBL X + 28 K. pneumonia CTX-M15, ESBL X + SHV28-TEM 50 E.coli CTX-M gr1, imp ESBL X + 51 E.coli ESBL X + 16 C. freundii AmpC X + 17 E. cloaceae AmpC X + 18 K. oxytoca AmpC X + 19 M. morgana AmpC X + 20 E. coli AmpC X + 45 K. pneumoniae AmpC X + 4. DISKUSSION MALDI-TOF MS Der er ved analyse af CPB på MALDI-TOF, opnået en sensitivitet på 53,3% og specifitet på 100% se tabel 3. Sensitiviteten og specifiteten af vores forsøg er ikke repræsentativ for analysen, kun for forsøget på KMA slagelse, idet anlysen ikke er standardiseret og en del optimering af assay med 21
hensyn til indstilling af MALDI-TOF, forberedelse af bakterie-materiale samt opløsningen af antibiotika, er påkrævet. Hraba k, J. et al fandt i valideringen af deres forsøg på 124 stammer af Enterobacteriacae sp. og Pseudomonas aeruginosa en sensitivitet på 96,7% og en specifitet på 97,9%. I dette forsøg blev der brug meropenem og ikke ertapenem som i nærværende forsøg. Der var ingen falsk positive eller falsk negative resultater ved analyse af Enterobacteriacea. Ud af 25 non-carbapenemase producerende P. aeruginosa var der to falsk positive. Ved en metallo- β-laktamase producerende P. aeruginosa var alle toppe stadig tilstede så den blev bestemt som non-carbapenemase producernde stamme. I henhold til forsøget på KMA slagelse har Hraba k, J. et al opnået en langt bedre sensitivitet, dette kan skyldes at op- sætningen af MALDI-TOF MS i deres forsøg var tilpasset denne degrations-analyse, hvor der på KMA slagelse blev kørt med opsætning beregnet til identifikation af bakterier. Hraba k, J. et al benyttede blandt andet Tris-HCL buffer (ph 6,8) for at stabilisere ph, forklaringen kan være at carbapenemaser virker bedst ved ph 6,8 idet højere eller lavere ph værdi resulterer i ændringer af enzymets struktur derved virkning.(livermore D et al.) I forsøget på KMA slagelse er der ikke brugt buffer til at justere ph på ertapenem opløsningen. Det vil kunne give problemer i forhold til degrationen af ertapenem. I samtlige anvendte artikler benyttes der NaCl i opløsningen til inkubation. Vi har i stedet valgt at bruge HPLC-vand på anbefaling af Bruker, idet dette mindsker antallet af ioner der muligvis kan virke forstyrrende på tolkningen af resultatet. Dette kan give flere forskellige toppe der repræsenterer nedbrydningsprodukter, og herved vanskeliggøre aflæsningen af toppene set i forhold til resistens -mønster og sensitivt mønster. Hraba k J et al beskriver at disse nedbrydningsprodukter i næsten alle reaktioner med tilsat bakterie-materiale, ikke kunne ses i sprektrumet. Dette kan skyldes yderligere nedbrydning som ikke kan detekteres på grund af for lav molekylevægt, eller de er blevet uspecifikt bundet til proteiner tilstede i reaktionen. Dette ses også i nærværende forsøg. Det må overvejes om brugen af HPLC-vand er ideelt, idet bakterierne vil have bedre betingelser for at overleve i en NaCL opløsning. Omvendt behøver bakteriene måske ikke at have optimale betingelser, da det kan tænkes at bakterien vil lyserer på grund af osmotisk tryk og herved eksponerer enzymerne. I forsøget af Zimmermann, S og Burckhardt I, 2011, hvis formål var at udarbejde en protokol til detektion af carbapenemase aktivitet, blev der ikke beregnet sensitivetet og specifitet. Der er 22
afprøvet forskellige inkubationstider med det formål at få samtlige CPB til at nedbryde ertapenem, uden at opnå falsk positive resultater fra ESBL og AmpC gruppene. Dette kan tyde på at nogle af bakterierne producerer carbapenemaser langsommere end andre og at raten af hydrolyse er langsommere for nogle typer enzymer. Analysen af bakterie nr. 31, 36 og 38 der alle er K. pneumoniae viste falsk negative resultater se figur 8. Årsagen hertil kan være at de carbapenem-hydrolyserende enzymer i næsten alle gramnegative stave, er bundet til den periplasmiske membran i bakterien(livermore, D), dette samt ændringer eller mangel på generne omkp35 og 36 vil ændre permabiliteten af ertapenem og herved forhindre at antibiotika kommer i kontakt med carbapenemaserne.(jacoby G A, Mills D M, Chow N 2004) Pseudomonas sp. nr 33, 35 viste ingen nedbrydning af ertapenem og 53 viste delvis nedbrydning se figur 9. Årsagen hertil kan være efflux-pumper og porin-tab der muligvis hindrer enzymernes virkning. Det kan også skyldes langsom eller ringe syntese af enzymet.(livermore D) I forsøget af Quale J et al. Blev der udført qrt-pcr for at undersøge ekspressionen af gener involveret i effluxsystemet, ampc regulering og det kromosomale porin oprd gen. Resultaterne fra qrt-pcr blev sammenholdt med bakteriernes MIC af forskellige typer antibiotika, heriblandt carbapenemer. Resultaterne viste at ud af 25 isolater med resistens mod ertapenem havde 19 reduceret oprd ekspression (p = 0,003) og af de 19 havde 13 isolater øget ampc ekspression. Det viser at pseudomonas mange resistens-mekanismer kan give falsk negative resultater for detektion af carbapenemase aktivitet i forhold til undersøgelserne på KMA slagelse, idet antibiotika ikke kan komme ind i cellen på grund af efflux og reduceret oprd ekspression. Bakterierne 22-29 er ESBL positive og resultaterne fra forsøget viste delvis degration af ertapenem se fig 10. Ud af disse 8 ESBL producernde stammer er 6 bestemt med et eller flere af CTX-M, SHV og TEM gener se bilag2. Denne degration var ikke forventet så der blev lavet yderlige et forsøg med forlænget inkubations-tid på ialt 3 timer, hvor der blev analyseret på de ESBL bærende bakterier der viste degration samt dem der viste falsk negative resultater i forhold til carbapenemase. Resultaterne ved inkubationstid på 3 timer viste at ESBL enzymerne i forhold til forsøg med 1 times inkubation, ikke var i stand til yderligere at nedbryde ertapenem. Der blev heller ikke observeret så stor hydrolyse som i første kørsel. Dette kan skyldes at optimering er påkrævet. ESBL og ampc nedbrydning af ertapenem se figur 10 og 11, er mulig ifølge Jacoby G A, 23
Mills D M, Chow N, som har påvist en forhøjet MIC af ertapenem med en standardiseret E. coli uden ændringer i cellemembran. Med hensyn til de falsk negative der blev analyseret igen blev der observeret nedbrydning af ertapenem som i første kørsel. Følsomme analyser kan detektere en hvis β-laktam hydrolyse hos stort set alle bakterier, dette må formodes at være en side reaktion fra de penicillin bindene proteiner og må ikke forveksles med hydrolyse fra β-laktamaser. (Livermore D. 1995) Detektion af β-laktamase aktivitet på MALDI-TOF giver et billede af hvilken type resistens en bakterie besidder. Et eksempel er, hvis en bakterie udviser resistens ved diskdiffusion kan man ikke vide om denne er forårsaget af enzymer eller ændringer i PBP, efflux pumper. Her vil man kunne konstatere eller udelukke enzymaktivitet. Fordelen ved denne analyse er at den kan bruges alle bakterier der producerer β-laktamaser. Den egner sig bedst som konfirmatorisk test til carbapenemase aktivitet, idet den kun giver et direkte billede af enzym aktiviteten. Den vil ikke kunne detektere resistens som følge af efflux pumper og/eller ændringer i porinmekanismen. ChromID CARBA-agar I henhold til forsøget på KMA slagelse sygehus blev der ud af 47 undersøgte stammer påvist 44 med carbapenemase produktion. Det gav en sensitivitet på 100% og en specifitet på 94,1% se tabel 3. Dette er lavere end i forsøget af Perry, J D. et al, hvor der ud af 64 blev påvist 56 positive isolater for carbapenemase. Dette gav en sensitivitet på 93 % og en specifitet på 100 %. Sensitiviteten og specifiteten af forsøget er beregnet ud fra Enterobacteriacea sp. dog uden resultaterne fra arten Provedencia rettgeri. Denne artikel må siges at have en hvis bias idet arbejdet er blevet bestilt af BioMerieux, dette er noteret bagerst. Der er fra producentens side blevet specificeret at chromid CARBA kun er egnet til KESC gruppen fra Enterobacteriacae sp. Tabel 1 i artiklen viser at chromid CARBA påviste 17 ud af 21 Enterobacter cloacae og 0 af 2 Providencia rettgeri. Pseudomonas sp. Acinotobacter baumanii og Aeromonas caviae kunne heller ikke påvises korrekt. Dette kan indikere at chromid CARBA ikke bør benyttes til disse arter. Denne begrænsning af arter i henhold til metoden, bør ses som en svaghed idet den eksempelvis ikke kan påvise carbapenemase produktion hos Pseudomonas sp. og Acinotobacter baumanii som er kendt for at være resistente over carbapenemer. I henhold til forsøget på KMA slagelse sygehus blev der observeret at alle Pseudomonas sp resistente eller ej, voksede på chromid CARBA uden farvning af 24
kolonier. Det er usikkert hvad grunden kan være til vækst af Pseudomonas sp, idet der er meget begrænset oplysninger angående indhold af antibiotika i chromid CARBA. Det er muligvis Pseudomonas forskellige resistensmekanismer som ampc, effluxpumper og impermabillitet der tillader vækst. I undersøgelsen af Vrioni, G. et al blev der sammenlignet 3 chromogene medier, chromid ESBL, ESBL-BH og chromid CARBA, samt CDC-TS (tryptisk soy) og MCM(MacConkey-meropenem). Her opnåede de en sensitivitet på 92,4% og en specifitet på 96,9% på chromid CARBA som lå over de andre afprøvet tests. Deres resultater bekræfter resultaterne opnået på KMA Slagelse sygehus. Vrioni et al, nævner at Proteeae vokser med mørk til lysebrune kolonier. Det blev bemærket at Pseudomonas voksede med grøn til brunlige kolonier i nærværende forsøg. Dette kan give mulighed for fejl i fortolkning af resultater. ChromID CARBA egner sig til screening af carbapenemase producerende Enterobacteriacea idet der blev opnået høj sensitivitet og specifitet. ulempen ved denne metode er at den ikke kan påvise nonfermantative gram negative stave. Resultaterne fra Perry, et al. Viser at man skal være forsigtig ved tolkning af resultater fra Provedencia rettgeri og Enterobacter cloacae, da disse kan vise falsk negative i testen. Dette kan have alvorlige konsekvenser for patienten i form af forkert behandling. KPC+MBL confirm ID Ved afprøvning af KPC+MBL confirm ID kit blev der ud af 16 carbapenemase positive og 37 carbapenemase negative, samlet set opnået en sensitivitet på 80% og en specifitet på 100% se tabel. For detektion af KPC blev der opnået en sensitivitet på 100%. For detektion af MBL blev der opnået en sensitivitet på 71,4%. I undersøgelsen af Tsakris, A. et al 2010 blev der afprøvet en ligende metode på 141 carbapenemase producerende stammer hvoraf 63 producerede KPC og 47 producerede MBL samt 31 med KPC og MBL emzymer. Udover de 141 carbapenemase positive stammer blev der i forsøget medtaget 84 carbapenemase negative stammer med resistensmekanismerne ampc, ESBL samt ampc og ESBL. Tsakris, A. et al opnåede en sensitivitet 100% og en specifitet på 98,8% i forhold til bestemmelse af KPC. Ved Bestemmelse af MBL blev der opnået en sensitivitet og specifitet på 100%. Ved bestemmelse af KPC og MBL opnåede metoden en sensitivitet på 96,8% og en specifitet på 100%. Metoden adskiller fra forsøget på 25
KMA Slagelse sygehus ved at der benyttes EDTA i stedet for dipicolinsyre til inhibering af MBL. Derudover benyttes der ikke nogen kombination af antibiotika og hæmmere der kan detektere ampc. I en undersøgelse af Giske, CG. et al 2011. blev der undersøgt om kombineret disk diffusions test kan bruges til at detektere og skelne imellem KPC, MBL og AmpC. Et kit magen til forsøget udført på KMA slagelse, blev afprøvet i forsøget af Giske, C.G. et al. Her opnåede de en sensitivitet og en specifitet for detektion af KPC på 100% og 98%. Det samme opnåede de ved detektion af MBL. Ved detektion af AmpC+porintab opnåede de en sensitivitet og specifitet på 40% og 100%. I henhold til forsøget på KMA Slagelse sygehus fremgik det af resultaterne, at ved dette forsøg er det lykkedes at skelne imellem KPC, MBL og ampc. Ud af 7 stammer med kendt KPC blev 7 påvist korrekt. Nr 37 en Klebsiella pneumoniea blev udover KPC, påvist med MBL. Dette kan være fordi stammen har begge gener. Ud af 7 stammer kendt med MBL blev 5 påvist korrekt de sidste 2 blev registreret som falsk negativ. Af de 5 korrekt påvist MBL, blev bakterie nummer 33 Pseudomonas sp. og nummer 38 Klebsiella pneumoniea også påvist med KPC. Dette kan skyldes at bakterierne besidder begge typer af gener. Ved brug af testen fra forsøget af Tsakris, A. et al på klinisk mikrobiologiske laboratorier kan der være mulighed for falsk positive resultater idet hyperproduktion af AmpC kan vise resistens og på grund af manglende stof til at skille AmpC fra KPC er der mulighed for fejldiagnostisering. I nærværnde forsøg ville et større antal positive stammer have givet et bedre billede af metodens evne til at skelne korrekt imellem KPC, MBL og ampc. Modificeret Hodge Test Der er med Modificeret Hodge Test opnået en sensitivitet på 83,3% og en specifitet på 69,4%. Se tabel 3. Ud af 53 test bakterier sås 10 falsk positive samt 4 uaflæselige. De 4 uaflæselige blev afprøvet en gang til, med samme resultat. Ved forsøget af Pasteran F et al. er der opnået en sensivitet på 78% og en specifitet på 57% på 64 afprøvet stammer, hvilket ligger under vores resultater. Dette kan skyldes at vi benyttede Becton Dickinson iso-res agar, hvor der er tilsat ekstra zink. Ifølge Amjad A et al. Opnåede de i deres forsøg en forbedret specifitet og sensivitet når der blev tilsat zinksulfat. 26
I artiklen af Pasteran F. et al optimerede de MHT ved at afprøve forskellige indikatorstammer. Med Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 som indikator stamme, opnåede de en sensitivitet på 100% og en specifitet på 98%. I artiklen beskives der at reproducerbarheden med E. coli ATCC 25922 var på 40%, hvorimod der blev opnået en reproducerbarhed på 100% med Klebsiella pneumoniae ATCC 700603. I en undersøgelse af Lee. K et al 2003 blev MHT afprøvet på 440 isolater af P. aeruginosa og Acinotobacter sp. hvor af 49 var positive og 391 var negative. Ved dette forsøg blev imipenem benyttet, også ved dette forsøg blev der tilsat zink for at fremme detektionen af MBL. Resultaterne viste at ved tilsat zink blev falsk negative resultater til sand positiv. Undersøgelsen kom frem til en sensitivitet og specifitet på 83,7% og 97,4%. I forsøget afprøvede man udover MHT, en diskdiffusion metode med samme princip som ovenstående KPC og MBL kit, dog med imipenem og EDTA. Lee. K et al konkluderede at MHT var pålidelig når denne blev kombineret med diskdiffusion test. I fremgangsmåden ved dette forsøg, ventede man ca 15 min efter test- og kontrol- stregerne var påført med at placere disken. Denne fremgangsmåde blev ikke brugt i nærværende forsøg. Ifølge artiklen af Carvalhaes, C, G. et al kan der ved for høj inoculum forekomme falsk positive resultater især ved isolater med CTX-M gener. Dette kan være tilfældet for bakterier nummer 11, 28 og 50 idet disse isolater påvist med CTX-M varianter. Nummer 16 til og med 20 samt 45 og 51 viste falsk positiv. Dette kan ifølge Carvalhaes,C,G. et al tilskrives at de alle er kendt med ampc, der med en kombination af ændret porinmekanismer og ESBL viser sig som resistene i MHT. Ved bakterie 17 ses også falsk positiv og den eneste oplysning angående resistenmekanismer i dette isolat, er at den er carbapenem følsom. Her kan årsag til falsk postiv MHT være nogle af de førnævnte resitensmekanismer. Resultaterne opnået på KMA Slagelse sygehus skal tages med et hvis forebehold idet metoden er beregnet til erfarne bioanalytikere og mikrobiologer idet aflæsning af denne test kan være svær hvis ikke man har erfaring at holde det op i mod. Modificeret Hodge Test udført som forsøget på KMA Slagelse sygehus, er ikke pålidelig idet der er for mange falsk posiive resultater, dette kan betyde uhensigtmæssig behandling i form af colistin af patienter der har en livstruende infektion med ESBL producerende bakterier som ville kunne behandles med carbapenemer. Med en modificeret udgave af MHT som i forsøget af Pasteran, F. 27
et al med en sensitivitet på 100% og en specifitet på 98% vil denne kunne benyttes i et klinisk mikrobiologisk laboratorie til screening af carbapenemase producerende bakterier 5. Konklusion MALDI-TOF MS er en spændene analyse og har potentiale til udvikling og hvis mikrobiologiske afdelinger i forvejen har denne til identifikation af bakterier, vil det være en fordel at udnytte MALDI-TOF-MS fuldt ud. MALDI-TOF MS opnåede i nærværende forsøg en sensitivitet og specifitet på 53,3% og 100%. Med en optimeret protokol kan der ifølge Hrabák. et al opnås en sensitivitet på 96,7% og en specifitet på 97,9% der gør det til en stærk og pålidelig analyse til konfirmatoriske undersøgelser. Modificeret Hodge Test udført som i forsøget på KMA Slagelse sygehus, opnåede en sensitivitet og en specifitet på 83,3 % og 69,4%. Med en modificeret udgave af MHT som i forsøget af Pasteran, F. et al hvor en sensitivitet på 100% og en specifitet på 98% blev opnået, vil denne kunne benyttes i klinisk mikrobiologiske laboratorier til screening af carbapenemase producerende bakterier. ChromID CARBA har med en specifitet og sensitivitet på 100% og 94,3% vist sig at være et pålideligt screeningsmedie til påvisning af carbapenemresistens hos Klebsiella, Enterobacter, citrobacter, serratia og E.coli. Mediet har den svaghed at den ikke kan detektere resistens hos andre bakterier end før nævnte, og idet der ses spredning af gener for carbapenemase på tværs af arter må dette ses som en svaghed. ChromID CARBA kombineret med en optimeret MHT eller MALDI-TOF MS vil på klinisk mikrobiologiske laboratorier være tilstrækkelig til at detektere carbapenemase i gram negative stave. 6. Perspektivering Afprøvningen af metoderne til påvisning af carbapenemresistens, har vist hvor svært det kan være ikke at opnå falsk positive resultater. Ligesom det kan være en udfordring at finde ud af hvilken resistensmekanisme der forårsager resistens. Undersøgelsen af metoderne, foruden chromid CARBA, viste at det er nødvendigt med optimering. Det kunne være interessant at afprøve MTH med Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 som indikator stamme og se om samme høje sensitivitet og specifitet kunne opnås. Bestemmelse af carbapenemase aktivitet på MALDI-TOF MS kan benyttes til alle former for β-laktamase, her vil det også være nærliggende at afprøve metoden på vancomycinresistente Enterokokker. Princippet på MALDI-TOF vil måske kunne benyttes til at 28
sammensætte en behandling til patienter med multiresistene bakterier, hvor der afprøves diverse typer af antibiotika og β-laktamasehæmmere for at give en optimal behandling og muligvis undgå at behandle med typer af antibiotika som ikke er ønskværdige. 7. Refferencer Amjad A, et al. 2011. Modified Hodge test: A simple and effective test for detection of carbapenemase production, Iranian Journal of Microbiology. 3: 189-193. BioMéreux 2012. Indlægsseddel: ChromID TM CARBA-agar. BioNovus, 2008. A Guide to performing to the Modified Hodge Test using Microbiologics, BioNovus, Cherrybrook. Lokaliseret 22.11.2012 på http://www.bionovuslifesciences.com.au/products-and-applications/mbl-products-andapplications/feature. Bruker Daltonics 2004. MALDI-TOF MS: brugermanual. Germany: Bruker Daltonics. Burckhardt I. Zimmermann S. Using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry To Detect Carbapenem Resistance within 1 to 2.5 Hours. Journal of clinical microbiology. 49: 3321-3324. Carvalhaes C G, et al. 2010. Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results. Journal of Antimicrob Chemotherapy. 65: 249 251. Den nationale videnskabsetiske kometé. Forskere. København: Den nationale videnskabsetiske kometé; 2012. 10.10.12 Lokaliseret på: http://www.dnvk.dk/forskere.aspx. Giakoupi P et al. 2009, KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae infections in Greek hospitals are mainly due to a hyperepidemic clone, Lokaliseret 28.11.12 på http://www.eurosurveillance.org/viewarticle.aspx?articleid=19218 Giske CG. et al. 2011, A sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-βlactamases and KPC in Klebsiella pneumonia with the use of meropenem disks supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin, Clinical Microbiology and Infection, 17: 552-556. 29
Hraba k J, et al. 2011. Carbapenemase Activity Detection by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of clinical microbiology. 49: 3222-3227. Jacoby, G. Mills, D. Chow, W. 2004. Role of β-lactamases and Porins in Resistance to Ertapenem and other β-lactams in Klebsiella pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48.8.3203-3206 Jørgensen, T. Christensen, E. Kampmann, J. 2011. Klinisk forskningsmetode, en grundbog. Munksgaard, København, s 83 Kempf M. 2012 et al. Rapid Detection of Carbapenem Resistance in Acinetobacter baumannii Using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, PLoS ONE. 7: e31676. Klinisk Mikrobiologisk afd. Slagelse 2012. D4-infonet, Sygehus Syd: Instruks for MALDI-TOF MS. Region Sjælland. Dokumentnummer 306052, version 4. Leavitt, A. et al. 2009. Ertapenem resistance among Extended-Spectrum-β-Lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolates. Journal of Clinical Microbiology: 47:969 Lee. K et al. 2003, Evaluation of the Hodge Test and the Imipenem-EDTA Double-Disk Synergy Test for Differentiating Metallo-β-lactamase-Producing Isolates of Pseudomonas ssp. and Acinotobacter ssp. Journal of Clinical Microbiology. 41.10 4623-4629 Livermore, D. 1995, β-lactamases in Laboratory and Clinical Resistance, Clinical Microbiology Reviews 8. 557-584 Noter i statistik, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen. Link: http://statnoter.biolyt.dk/. kap. 9.1-9.7 Panagea T, 2010, Evaluation of CHROMagar KPC for Rapid Detection of Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae in Surveillance Rectal Swabs, ELSEVIER International Journal of Microbiology, 10. Pasteran F. et al 2011, Sensitive and Specific Modified Hodge Test for KPC and Metallo-Beta- Lactamase Detection in Pseudomonas aeruginosa by Use of a Novel Indicator Strain, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Journal of Clinical Microbiology, 49: 4301-4303. Perry J. D. et al 2011, Prevalence of faecal carriage of Enterobacteriaceae with NDM-1 carbapenemase at military hospitals in Pakistan, and evaluation of two chromogenic media, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 10.1093 Quale, J. et al 2006. Interplay of Efflux system, ampc and oprd Expression in Carbapenem resistance of Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50.5.1633-1641 30
Queenan A. M., Bush K 2007, Carbapenemases: the Versatile β-lactamases, Clinical Microbiology Reviews. 20: 440-458. Rasmussen, JW. Høiby. N 2011, Class A carbapenemases, Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60, 470-482 Rosco Diagnostica 2012, Indlægsseddel: KPC-MBL confirmation kit. Taastrup: Sparbier, K, et al. 2012, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry-Based Functional Assay for Rapid Detection of Resistance against β-lactam Antibiotics, Journal of clinical microbiology. 50: 927-937. Statens Serum Institut 2012, EPI-NYT: CARBAPENEM-RESISTENTE ENTEROBAKTERIER, Statens Serum Institut, København. Uge 10, 2012. Lokaliseret den 22. november 2012 på http://www.ssi.dk/~/media/indhold/dk%20-%20dansk/aktuelt/nyhedsbreve/epi- NYT/2012/PDF/EPI-NYT%20-%202012%20-%20Uge%2010.ashx Tsakris A. et al 2010, A simple phenotypic method for the differentiation of metallo-β- lactamases and class A KPC carbapenemases in Enterobacteriaceae clinical isolates, Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65: 1664-1671. Vrioni G, 2012, Comparative Evaluation of a Prototype Chromogenic Medium (ChromID CARBA) for Detecting Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae in Surveillance Rectal Swabs, Journal of Clinical Microbiology. 50: 1841. Zhanel, GG. Et al. 2007. Comparative review of the carbapenems, Drugs. 67.71027-52 31