Regnormens tro følgesvend

24 Foto: Carsten R. Kjaer Regnormens tro følgesvend Regnorme lever i et intimt samspil med en bestemt type bakterier i deres nyrer. Dette samarbejde udgør i dag et unikt modelsystem for symbiose mellem bakterier og dyr. Det er nemlig muligt at adskille de to parter og undersøge dem hver for sig. Af Marie B. Lund, Kasper U. Kjeldsen, Martin Holmstrup og Andreas Schramm Vi lever konstant i fredelig sameksistens med milliarder af bakterier i vores krop. Når sameksistensen er til gensidig fordel eller i det mindste ikke skadelig for nogen af parterne taler vi om symbiose. Imidlertid er der ikke altid langt fra ven til fjende i dette fællesskab. Vi ved fra sygdomsfremkaldende bakterier, at de pludselig kan skifte fra at være fuldstændig harmløse til at give livstruende infektioner. Det er tankevækkende, at mange af de mekanismer, sygdomsfremkaldende bakterier bruger til at inficere værten med, er de samme som de mekanismer symbiotiske bakterier benytter

25 for at opnå fredelig sameksistens med deres vært. Symbiose mellem dyr og bakterier kan derfor bruges som værdifulde modelsystemer for, hvordan to parter genkender og reagerer på hinanden. Sådanne modelsystemer kan forhåbentlig bidrage til at opklare, hvordan vi bliver inficeret af sygdomsfremkaldende bakterier, og hvordan vi skal bekæmpe dem. Forskere har nu kastet deres interesse på den almindelige regnorm i denne forbindelse. Regnorme bærer nemlig på millionvis af helt bestemte symbiotiske bakterier i deres nyrer. Det unikke ved dette modelsystem er, at de to parter kan adskilles i laboratoriet og dermed studeres hver for sig. Vi ved stadigvæk ikke, hvordan de symbiotiske bakterier gavner deres vært, men forskningsgrupper i både Århus og USA arbejder på højtryk for at opklare, hvad symbiosen går ud på, og hvordan den har udviklet sig. Bakterier går i arv Regnorme tilhører gruppen af ledorme, som kendetegnes ved at være opdelt i en lang række segmenter eller led. Udvendigt kan man se disse segmenter som ormens striber, der indvendigt er afgrænset af skillevægge. I hvert led har ormen et par primitive nyrer (der også kaldes nephridier), og i hver nyre sidder ne (boks 1). En regnorme-nyre består af et langt rør, der snor sig gennem tre slynger, og leder væske med affaldsstoffer fra ormens indre, til ydersiden af ormen. De symbiotiske bakterier findes altid kun i slynge nummer to, hvor de danner en tæt biofilm på rørets inderside. De symbiotiske bakterier nedarves direkte fra forældre til afkom. Dette sker ved at bakterierne overføres til kokonerne (regnormens ægkapsler), hvor de koloniserer nyrerne mens fosteret udvikler sig. Denne form for nedarvning af fra en værtsgeneration til den næste, hvor symbionten leveres direkte fra forældrene til afkommet, kaldes vertikal over- Nyrer og (boks 1) Regnormen har et par nyrer (nephridier) i hvert led. I nyrerne bliver urinen dannet og sidenhen udskilt gennem poren til ormens yderside. Symbionterne danner en tæt biofi lm på indersiden af den 2. løkke kaldet ampullen. Parring og befrugtning (boks 2) Kønsbælte Tarm To regnorme under parring Septum 1 2 3 Pore til yderside Indløb Nephridie Sædgemmer Regnorm er hermafroditter, dvs. de har både hanlige og hunlige kønsorganer. Ved parringen lægger ormene sig med bugen mod hinanden og udveksler sæd. Sæden opbevares i sædgemmerne indtil kokonproduktionen går i gang. Efter parringen bliver kokonerne dannet. Ormen udskiller et slimrør fra kønsbæltet. Mens den kravler baglæns ud af slimrøret afsætter den æg, sæd og i det. Til sidst er ormen kravlet helt ud af slimrøret og dermed er kokonen blevet dannet. Befrugtningen af ægget sker i den færdige kokon. Mens fosteret udvikler sig, koloniserer ne de nydannede nyrer. 1. løkke 2. løkke Ampul 3. løkke (blære) Kokon Symbiose Slimrør Symbionterne (røde) sidder i ampullen. Regnormens væv er farvet grønt. Kønsbælte Symbiose bruges som en bred betegnelse for to arter, der lever tæt sammen. Begrebet dækker derved både over mutualisme, hvor begge parter får gavn af symbiosen, og kommensalisme, hvor kun den ene part får gavn og den anden er uanfægtet. Parasitisme, hvor den ene part lider skade, betegnes normalt ikke som en symbiose. I naturen fi ndes der et utal af eksempler på symbiose mellem bakterier og dyr. Ofte danner symbionten livsnødvendige stoffer, som værten ikke får i sin kost. Dette kendes f.eks. fra bladlus, hvor en symbiotisk bakterie danner livsnødvendige aminosyrer og vitaminer, som ikke fi ndes i den sukkerrige plantesaft, bladlusene lever af. Hos bladskæremyrer spiller symbiotiske bakterier en helt anden rolle: de udskiller et giftstof, som dræber parasitiske svampe, der ellers ville nedbryde myrernes mad. På den måde kan myrerne have deres fødeforråd i fred. Fælles for symbioserne er, at bakterien hjælper værten til at udnytte en ellers utilgængelig ressource og derved skabe sig et livsgrundlag. På denne måde har symbioser spillet en stor rolle i udviklingen af det mangfoldige dyreliv, der fi ndes på jorden i dag.

26 Fotos: Marie Braad Lund De fl este kender regnormen men ikke dens tro følgesvende i form af symbiotiske bakterier. Her ses orme (Aporrectodea tuberculata) med to kokoner til højre. Det indsatte billede viser en kokon (fra ormen Dendrobaena veneta) i nærbillede. Slægtstræ for Vægt (gram) 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 Løvregnorm Mørk regnorm Brandorm Grå orm Figur 1. En vært og en symbiont danner parløb gennem evolutionshistorien. Dette ses ved at deres slægtstræer følger hinanden. Co-artdannelse fi ndes både i gavnlige symbioser, som mellem regnormen og dens symbiotiske bakterier, og mellem parasitter og deres værter. Komøg, med Komøg, uden Halm, med Halm, uden Slægtstræ for regnorme (værten) Kønsmodne uden Kønsmodne med 0,00 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Uger Figur 2. Ormene vokser hurtigere, når de får næringsrig kost. Orme med og uden vokser lige hurtigt, når de får den samme kost. Når ormene vokser på halm, bliver de tidligere kønsmodne, hvis de har symbioter. førsel. Modsætningen til dette er horisontal overførsel, hvor afkommet i hver generation skal rekruttere de symbiotiske bakterier fra det omgivende miljø. Horisontal overførsel kendes bl.a. fra symbiosen mellem ærteplanter og deres kvælstof-fixerende bakterier i rodknolde. Her opsamler alle nye ærteplanter ne fra jorden. En ældgammel symbiose De symbiotiske bakterier er artsspecifikke, dvs. at hver regnormeart har sin egen unikke bakterieart i nyrerne. Indtil videre har vi undersøgt 23 forskellige arter af regnorme, og alle de symbiotiske bakteriearter er tæt beslægtede og danner deres egen særskilte gruppe i bakteriernes stamtræ. Denne gruppe af bakterier har fået det videnskabelige navn Verminephrobacter, som betyder orme-nyre-bakterie. Når bakterierne alle sammen er så tæt beslægtede, og når de udelukkende findes i regnorme, tyder det på, at symbiosen opstod i regnormenes stamfader, der levede blandt dinosaurerne i kridttiden for 62-134 millioner år siden. Lige siden har de symbiotiske bakterier fulgt med regnormene, og når nye arter af regnorme har udviklet sig, har bakteriearterne udviklet sig sideløbende. Når to forskellige grupper af organismer på denne måde danner parløb gennem udviklingshistorien, kaldes det co-artsdannelse (figur 1). I naturen findes der mange eksempler på co-artsdannelse, f.eks. mellem bladlus og deres symbiotiske bakterier og mellem jordegern og deres lus. Co-artsdannelse foregår altså både i gavnlige symbioser og mellem parasitter og deres værter. Specifik genkendelse Vi finder mange forskellige bakteriearter i regnormekokoner, men under fosterudviklingen er det udelukkende de symbiotiske bakterier, der får adgang til at kolonisere

27 nyrerne. Dette, samt co-artsdannelsen, tyder på, at der må være en helt bestemt mekanisme, som de to parter bruger til at genkende hinanden. Bakterier og dyreceller genkender ofte hinanden ved at fastehæfte sig til bestemte sukkermolekyler på overfladen af modpartens celler. Det er f.eks. sådan vores immunsystem genkender sygdomsfremkaldende bakterier. Når vi dyrker regnormens symbiotiske bakterier i laboratoriet, vokser de allerbedst ved at udnytte netop disse bestemte sukkermolekyler som næringskilde. Endnu ved vi dog ikke med sikkerhed, om disse sukkermolekyler spiller en rolle i den specifikke genkendelse mellem regnormene og deres symbiotiske bakterier. Det vil vi undersøge i næste skridt af vore studier. Parterne skilles ad Bakteriernes funktion i symbiosen er stadig en gåde, som vi i lang tid har forsøgt at løse. En metode til at finde ud af, hvad de symbiotiske bakterier laver, er at adskille parterne. Derfor har vi dyrket bakterierne i renkultur på agarplader. Og regnormene har vi gjort symbiontfrie gennem kontrollerede antibiotikabehandlinger. Når først man har adskilt de to parter, kan man bruge en lang række metoder til at undersøge, hvordan de hver især bidrager til symbiosen. Vi har blandt andet undersøgt genomet (den samlede arvemasse) fra den symbiotiske bakterie i brandorm (Eisenia fetida) for at se om den har nogle gener, der gør den specielt egnet til at indgå i symbiosen. Hvad vi kan se i de tusindvis af forskellige gener, genomet indeholder, er, at symbionten har et rekordhøjt antal gener, der koder for proteiner, som er involverede i at optage aminosyrer, som vil være til stede i ormens affaldsprodukter i nyrerne. Ved dyrkningsforsøg har vi også undersøgt, hvad de symbiotiske bakterier lever af, og resultaterne tyder på, at de, ud over at leve af ormens affaldsstoffer, også vil kunne leve af de sukre, der sidder på ormens celleoverflader. Bakteriers arvemasse (boks 3) Lig alt andet liv på jorden er bakteriernes fysiologiske træk dikteret af deres arvemasse. Gener koder for arbejdstegningen til et protein, og det er netop proteinerne, som styrer alle de kemiske omsætninger i levende organismer, og giver celler deres struktur. En bakteries genom består typisk af et cirkulært DNAmolekyle med en længde af 2-5 millioner byggeklodser (nukleotider) indeholdende 2-5.000 forskellige gener. Til sammenligning koder det humane genom for ca. 25.000 gener fordelt over 3,2 milliarder nukleotider. Eftersom længden af vores og bakteriers gener er næsten ens (1.000 3.000 nukleotider), betyder det, at størstedelen af bakteriers arvemasse koder for proteiner, hvorimod dette kun er tilfældet for 5 % af vores egen arvemasse. Bakterier er nemlig effektive til at skille sig af med arvemasse, der ikke tjener dem nogen funktion, mens de samtidigt evner at optage nye gavnlige gener fra andre bakterier. På en evolutionær tidsskala er bakteriers genomer således langt mere dynamiske end planter, dyr og menneskers. Fælles gener Man har anslået, at alle bakterier på jorden kun har ca. 75 gener til fælles. Disse gener koder for proteiner med de allermest basale funktioner i bakteriernes stofskifte og celledeling. Resten af en bakteries gener afspejler dels dens slægtsforhold og dels dens levevis. Nærtbeslægtede bakteriearter vil have fl ere gener til fælles end fjernt beslægtede arter, ligesom arter, der lever i samme miljø, vil have gener til fælles. For at undersøge hvilke gener, der gør regnormenes symbiotiske bakterier i stand til at leve i regnormes nyrer, har vi i samarbejde med Joint Genome Institute i USA og vores amerikanske projektpartnere sammenlignet genomet af symbionten fra brandorm (Eisenia fetida) med to af dens nærmeste fritlevende slægtninge. Ved at kortlægge og sammenligne generne i de tre genomer kan vi identifi cere de bevarede, tabte samt unikke gener i symbiontens genom. Udkommet af dette 8.746 brikker Acidovorax avena 1846 Acidovorax sp. JS42 Ukendt funtion Transkription Energiproduktion 596 Replikation & DNA reparation Produktion af sekundære metabolitter Translation Cellemembran og -væg syntese Membrantransport Signaltransduktion Protein modifikation Cellebevægelse Resistens Celledeling store gen puslespil, er et detaljeret indblik i hvilke karakterer symbiosen har overfl ødiggjort, hvorved generne er forsvundet 268 Symbiont i brandorm 1742 1556 2523 215 Brandorm-symbionten besidder 2523 unikke gener sammenlignet med to af dens nærmeste fritlevende slægtninge. Blandt disse gener fi ndes dem, der muliggør symbiontens vekselvirkning med dens regnormevært. Det viste diagram angiver antallet og fordelingen af fælles og unikke gener i de tre bakteriearters genomer. % af samlet antal gener 0 5 10 15 20 25 Symbiont i brandorm Acidovorax avenae Acidovorax sp. JS42 Gener kodende for proteiner involveret i membrantransport udgør hele 25 % af brandorm-symbiontens gener. Bemærk også den store pulje af gener, hvis funktion vi ikke kan forudsige. fra symbiontens genom, samt hvilke karakterer, der er særlige og derfor af central betydning for symbiosen.

28 Darwins orme Charles Darwin (1809-1882) var dybt optaget af regnorme og han brugte mere end 40 år af sit liv på at studere dem fra sit hjem i Down House 26 km syd for London. Han undersøgte blandt andet systematisk deres sanser. Blæste han på fl øjte eller basun reagerede de overhovedet ikke, hvorfor de måtte være komplet døve. Lyste han derimod på dem fortrak de sig hurtigt ned i deres gange, så de måtte kende forskellen på lys og mørke. Han var en af de første til at erkende den enorme indfl ydelse ormene havde på bearbejdningen af jorden; på en mark nær sit hjem fi k han spredt en mængde kalk og lod marken stå urørt i 29 år (!) før han vendte tilbage for at se hvor dybt ormene havde begravet kalken. 14 cm muld lå nu over kalklaget alt sammen bragt op til overfl aden af ormene. Han afsluttede sit værk om regnorme The Formation of Vegetable Mould Through the Action of Worms (1881) med at fastslå, at længe inden mennesket havde opfundet sit vigtigste værktøj: ploven, havde ormene allerede pløjet jorden gennem millioner af år. Derfor var der næppe noget dyr, der havde spillet en så vigtig rolle i menneskets historie som regnormen. En brandorm (Eisenia fetida) åbnet for nærmere undersøgelse. Kokoner produceret pr. uge 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 84,1 % Med Komøg 78,8 % Uden Producerede kokoner Klækkede kokoner 57,4 % Med Halm 25,0 % Uden Figur 3. Ormene laver fl ere kokoner når de får næringsrig kost. Når ormene får næringsfattig kost er der fl ere kokoner der klækker, hvis de har ne. Tallene over søjlerne viser klækningssucces i procent. Foto: Marie Braad Lund. Betydning for regnormenes reproduktion Sammenligner man naturlige regnorme med de symbiontfrie regnorme, vi har dyrket i laboratoriet, viser det sig, at de vokser lige hurtigt og danner lige mange kokoner (figur 2). Det ser altså ud til, at ne ikke påvirker ormenes vækst og forplantningsevne, men orm med bliver dog tidligere kønsmodne. Kigger man på, hvor mange af kokonerne, der rent faktisk klækker og resulterer i levedygtigt afkom, kan man se, at de symbiontfrie kokoner klarer sig meget dårligere (figur 3). Forskelle i vækst og formering hos dyr, kommer ofte kun til udtryk, når dyrene lever under de forhold, de oftest er udsat for i naturen, hvor næringsstofferne er begrænsende. Derfor havde vi givet regnormene to forskellige diæter; den ene halvdel fik komøg, som indeholder rigelige mængder kvælstof, og den anden halvdel fik halm, som kun indeholder meget lidt kvælstof. Det viste sig, at forskellen i kokonernes klækningssucces kun kunne ses hos de orm, der blev fodret med halm, og som dermed var næringsstofbegrænsede. Der kan være flere grunde til at kokonerne uden ikke klækker, når forældrene er blevet fodret med halm: Voksne orm med har måske mere overskud til at levere rigeligt med næring til kokonerne, og derfor klarer fostrene sig bedre. Symbionterne kan også have en beskyttende effekt overfor regnormefostrene, da kokoner som nævnt ovenfor, indeholder mange forskellige jordbakterier, og ne kan måske bekæmpe skadelige arter blandt disse. Vi kender altså endnu ikke svaret på, præcis hvilken gavnlig effekt, der har fået regnormene til at beholde deres gennem millioner af år. Men med de unikke muligheder for at undersøge dette modelsystem for symbiose mellem bakterier og dyr hver for sig, håber vi at kunne give dette svar. Og lære at forstå, hvad der kræves for at dyr og bakterier kan leve i et intimt samspil. Om forfatterne Marie Braad Lund er phd-studerende ved Mikrobiologi, Biologisk Institut Tlf.: 8942 3318 marie.lund@biology.au.dk Kasper Urup Kjeldsen er Videnskabelig medarbejder Center for Geomikrobiologi. kasper.kjeldsen@biology.au.dk Martin Holmstrup er professor Afd. for Terrestrisk Økologi, Danmarks Miljøundersøgelser mho@dmu.dk Andreas Schramm er lektor Mikrobiologi, Biologisk Institut andreas.schramm@biology.au.dk Alle ved Aarhus Universitet Videre læsning Regnorme, Caspar Andersen, Natur og Museum nr 4 december 1997. Schramm et al. 2003. Acido vorax-like symbionts in the nephridia of earthworms. Environmental microbiology 5 (9): 804-809 Davidson and Stahl. 2008. Selective recruitment of bacteria during embryogenesis of an earthworm. The ISME Journal 2: 510-518 Lund et al. 2009. Diversity and host-specificity of the Verminephrobacter-earthworm symbiosis.e nvironmental microbiology. Accepted