(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT (il) 169749 B1 Patentdi rektoratet TAASTRUP (21) Patentansøgning nr.: 2308/90 (22) Indleveringsdag: 24 sep 1990 (24) Løbedag: 11 apr 1989 (41) Alm. tilgængelig: 24 sep 1990 (51) Int.Cl.6 C 12 N 15/31 C 07 K 15/04 C 12 N 15/62 C 12 N 15/70 (45) Patentets meddelelse bkg. den: 13 feb 1995 (86) International ansøgning nr.: PCT/DK89/00084 (86) International indleveringsdag: 11 apr 1989 (85) Videreførelsesdag: 24 sep 1990 (30) Prioritet: 12 apr 1988 DK 1995/88 (73) Patenthaver: *lntervet International B.V.; Wim de Koerverstraat 35; P.O. Box 31; NL-5830 AA Boxmeer, NL, *Statens Veterinære Serumlaboratorium; Buelowsvej 27; DK-1503 København V, DK (72) Opfinder: Niels Tækker *Foged; DK, Svend *Petersen; DK (83) Deponering af mikroorganismer (74) Fuldmægtig: Plougmann & Vingtoft A/S (54) DNA-fragment, der koder for et Pasteurella multocida-toxin eller for en immunogen subsekvens eller analog deraf, ekspressionsvektor, der omfatter DNA-fragmentet, fremgangsmåde til fremstilling af et Pasteurella multocida-toxin og anvendelse af Pasteurella multocida-toxinsekvens eller -analog til fremstilling af en vaccine (56) Fremdragne publikationer (57) Sammendrag: 2308-90 DK 169749 B1 Vaccine til immunisering af et dyr mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin, idet vaccinen omfatter en immunologisk effektiv mængde af et rekombinant, immunogent, detoxificeret Pasteurella multocida-toxin eller en rekombinant, immunogen, detoxificeret Pasteurella multocida-toxinanalog, hvilken vaccine er ejendommelig ved at den kodes for af en nukleotidsekvens, der koder for et Pasteurella multocida-toxin eller en Pasteurella multocida-toxinanalog indsat i en ekspressionsvektor, der er i stand til at replikere i en egnet værtsmikroorganisme, hvori sekvensen kan udtrykkes. Det producerede toxin eller den producerede toxinanalog underkastes eventuelt posttransskriptionelle modifikationer til opnåelse af det detoxificerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog. Alternativt modificeres nukleotidsekvensen forud for insertion i ekspressionsvektoren for at opnå toxinet eller toxinanalogen i en detoxificeret form. Der beskrives yderligere anvendelse af et monoklonalt antistof mod Pasteurella multocida-toxin eller -toxinanalog, en mærket DNA-sekvens, der er homolog med en DNA-sekvens, der koder for et toxin eller en toxinanalog, samt toxinet eller toxinanalogen som sådan som diagnostiske midler.
Den foreliggende opfindelse angår et DNA-fragment, der omfatter en nukleotidsekvens, der koder for et Pasteurella multocida-toxin, der er nyttigt til fremstilling af toxinet, fremgangsmåder til fremstilling og isolering af et P. 5 multocida-toxin og anvendelse af et P. multocida-toxin til fremstilling af en vaccine til immunisering af dyr mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin. 1 Atrofisk rhinitis er en sygdom, som i høj grad indvirker på 10 grisetrynens knoglestruktur. Det ætiologiske agens, som for nuværende anses for at være årsagen til væksthæmmende progressiv atrofisk rhinitis, er toxinogene (toxin-producerende) stammer af P. multocida, som koloniserer svins næsehule (Pedersen og Barfod, 1981, (ref. 1), Rutter og Rojas, 1982, 15 (ref. 2), Elling og Pedersen, 1985, (ref. 3), Pedersen et al., 1988 (ref. 4). Det er blevet vist, at næseslimhinden lettere koloniseres af P. multocida, når modstandskraften over for infektion er nedsat, som det fx er tilfældet, når grisene samtidig er inficeret med Bordetella bronchisepti- 20 ca, eller når næseslimhinden eksponeres for et mildt kemisk irriterende stof (jf. Pedersen og Elling, 1984, (ref. 5)). De patologiske manifestationer af P. multocida-infektioner kan tilskrives et toxin, der produceres af denne bakterie. Toxinet, som har en tilsyneladende molekylvægt på 143 kd og 25 en aktuel molekylvægt på 146,5 kd inducerer knogleresorption (osteolyse) af næsemuslingebenene og andre knoglestrukturer i næsehulen ved stimulering af osteoklast aktivitet i svinemuslingeben og forårsager nedsat osteoblasisk knogledannelse. 30 Sygdommen er af afgørende økonomisk betydning for svineproducenter over hele verden, da den ud over de ovennævnte p -atologiske virkninger på næseknogler (og undertiden ansigtsknogler) forårsager en langsommere væksthastighed hos inficerede grise og som følge deraf højere produktionsomkost- 35 vinger. Der har derfor været gjort forsøg på at reducere
udbredelsen og betydningen af P. multocida-infektionen, fx ved produktion af SPF (specifik patogenfrie) svin via kejsersnit eller ved antibiotisk behandling af inficerede dyr eller profylaktisk vaccination. 2 5 Kendte vacciner til immunisering af dyr, først og fremmest svin, mod sygdomme, der tilskrives P. multocida-infektion, især atrofisk rhinitis, omfatter dræbte P. multocida-celler eventuelt kombineret med dræbte Bordetella bronchisepticaceller (jf. EP 85 469) og/eller en inaktiveret (sædvanlig- 10 vis ved varmebehandling eller tilsætning af formaldehyd) toxinholdig ekstrakt af toxinogene P. multocida. Vacciner af den sidstnævnte type er kommercielt tilgængelige fra Nordisk Droge & Kemikalie A/S, København, Danmark, under varemærket Atrinord, såvel som fra Intervet International 15 BV, Boxmeer, Holland, under varemærket Nobi-vacART. Nærværende opfindere antager, at en forbedret immunogen effekt i forhold til de kendte vaccinepræparater kan opnås ved anvendelse af et oprenset og passende modificeret toxinpræparation til vaccinationsformål enten med henblik på 20 at erstatte de konventionelle vacciner eller som en bestanddel heraf. Oprensningen af P. multocida-toxin er tidligere blevet beskrevet. Således beskriver Foged et al., 1987, (ref. 6) oprensningen af toxinet ved hjælp af kromatografi og polya- 25 crylamidgelelektroforese. Det oprensede toxin anvendes alene til undersøgelse af dets toxiske og patologiske virkninger. Kamp et al., 1987, (ref. 7) beskriver ligeledes oprensning af P. multocida-toxinet med henblik på kliniske undersøgelser. De foreslår, at det oprensede toxin kan an- 30 vendes som et antigen til fremstilling af specifikke antistoffer, der er nyttige til serologiske undersøgelser. Nakai et al., 1984, (ref. 8) beskriver en metode til oprensning af P. multocida-toxinet ved hjælp af kromatografi og polyacrylamidgelelektroforese. De beskriver endvidere frem- 35 stilling af polyklonale antistoffer rettet mod det oprense-
de toxin, som de anvender til bestemmelse af det oprensede toxins renhed. Det foreslås, at antistofferne ydermere kan anvendes til undersøgelse af toxinets rolle i atrofisk rhinitis. 3 5 Ingen af disse publikationer foreslår anvendelsen af et oprenset toxin som en komponent i en vaccine til immunisering af dyr mod Pasteurella-infektion, og dette anses for at udgøre et nyt koncept. I overensstemmelse hermed angår den foreliggende opfindelse 10 i ét aspekt et DNA-fragment, som koder for et Pasteurella multocida-toxin, eller en subsekvens eller analog deraf, som koder for en immunogen subsekvens eller analog af toxinet, hvilket toxin, subsekvens eller analog deraf er nyttig til fremstilling af en vaccine til immunisering af 15 et dyr, herunder et menneske, mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin, idet vaccinen omfatter en immunogent effektiv mængde af et rekombinant, immunogent, detoxificeret P.multocida-toxin P.multocida- eller en rekombinant, immunogen, detoxificeret 20 toxinanalog sammen med en immunologisk acceptabel bærer eller et immunologisk acceptabelt vehikel. Til fremstilling af de kendte vacciner dyrkes en toxinogen Pasteurella-stamme, og toxinet isoleres fra dyrkningsmediet eller fra en bakterieekstrakt efterfulgt af detoxifikation 25 ved fx termisk eller kemisk behandling. I sammenligning med denne fremgangsmåde har fremstilling af toxinet eller toxinanalogen ved rekombinant-dna-metoder en række fordele: det er muligt at fremstille toxinet eller toxinanalogen ved dyrkning af en non-patogen organisme, toxinet eller toxin- 30 analogen kan produceres i højere mængder end de, der produceres af vildtype P. multocida-stammer, fx under anvendelse af en stærk promotor med henblik på at inducere et højt ekspressionsniveau af toxingenet eller under anvendelse af en højkopitalsvektor til kloning af toxingenet, og det er 35 muligt at producere toxinet eller toxinanalogen i en deto-
xificeret form, fx ved at underkaste det gen, der koder for toxinet, behandling med et mutagen eller ved at deletere en del af nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen, substituere én eller flere nukleotider i se- 5 kvensen, etc. Det rekombinante toxin eller den rekombinante toxinanalog kan anvendes i en i det væsentlige ren form i vaccinen ifølge opfindelsen, men kan tillige anvendes som en rå eller delvis oprenset præparation. 4 I nærværende sammenhæng angiver udtrykket "i det væsentlige 10 ren", at vaccinen er i det væsentlige fri for andre immunogent aktive komponenter, hvis tilstedeværelse kunne give anledning til uønskede immunreaktioner i de dyr, der immuniseres med vaccinen, og, hvad der er det væsentligste, at ingen andre komponenter af de mikroorganismer, der produce- 15 rer toxinet eller toxinanalogen såsom cellerester eller cellulære proteiner bortset fra toxinet eller toxinanalogen selv eller et protein eller polypeptid, hvortil toxinet eller toxinanalogen er fusioneret (vide nedenfor), er til stede i vaccinepræparationen. En høj renhed af det detoxi- 20 ficerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog anses for at resultere i en høj antitoxinrespons i forbindelse med immunisering med vaccinen ifølge opfindelsen, hvorfor en lavere dosis af toxinet eller toxinanalogen kan være påkrævet til immuniseringsformål i forhold til den dosis, der 25 anvendes i rå eller delvis oprensede vaccinepræparationer. Et i det væsentlige rent toxin eller en i det væsentlige ren toxinanalog har den yderligere fordel, at den nøjagtige koncentration deraf i en given vaccinepræparation er kendt, således at en eksakt dosis kan administreres til det pågæl- 30 dende dyr. Mikroorganismen, der producerer et osteolytisk toxin (dvs. et toxin, som er direkte eller indirekte involveret i knogleresorption), hvorimod vaccinen giver immunitet, er fortrinsvis P. multocida. Andre mikroorganismer, som har vist 35 osteolytiske virkninger eller regulering af specifikke markører for knoglemetabolisme, er fx Actinomyces viscosus og
5 Bordetella pertussis (Trummel et al., - 1979, (ref. 9) og Price (ref. 10)). Som følge af P. multocida-toxinets toxiske aktivitet er det ikke muligt at anvende det native toxin som en vaccine 5 ifølge opfindelsen. Det skal tværtimod være til stede i en detoxificeret form. Udtrykket "detoxificeret" betyder i denne sammenhæng, at den toxiske aktivitet er blevet fjernet fra i det mindste et tilstrækkeligt antal, men ikke nødvendigvis alle, toxinmolekyler, der findes i vaccinepræ- 10 parationen, således at vaccinen, når den administreres til et dyr, der skal immuniseres, ikke vil give anledning til nogen uønskede virkninger i de pågældende dyr, idet den stadig fremkalder en tilfredsstillende immunrespons. Detoxifikationen af P. multocida-toxinet eller -toxinanalo- 15 gen kan udføres på en række forskellige måder. Det er således muligt at underkaste toxinet eller toxinanalogen en termisk behandling, idet toxinet vides at være varmelabilt og at blive inaktiveret (dvs. detoxificeret) ved 70 C. Endvidere kan toxinet eller toxinanalogen underkastes behand- 20 ling med et kemikalie såsom formaldehyd, glutaraldehyd eller et egnet proteolytisk enzym, fx trypsin. Detoxifikation kan ligeledes tilvejebringes ved mutagenisering af det gen, der koder for P. multocida-toxinet eller -toxinanalogen, fx ved hjælp af ultraviolet bestråling, ionise- 25 rende bestråling eller et kemisk mutagen såsom mitomycin C, 5-bromuracil, methylmethansulfonat, nitrogensennep eller en nitrofuran. Endvidere kan toxinet detoxificeres ved substituering, deletion, addition eller insertion af én eller flere aminosyrer i toxinet eller toxinanalogen eller ved 30 substituering, addition, deletion eller insertion af et eller flere basepar i nukleotidsekvenser, der koder for toxinet eller toxinanalogen, eller ved en kombination af disse metoder. I modsætning til detoxifikation ved termisk eller kemisk 35 behandling frembyder den genetiske fremgangsmåde den åben-
lyse fordel, at den resulterer i en ensartet population af ligeligt detoxificerede molekyler. 6 Det skal bemærkes, at udtrykkene "substituering, deletion, addition eller insertion" skal defineres i forhold til to- 5 xinproteinet i sin fulde længde. "Substituering" skal således opfattes som udskiftning af &I eller flere aminosyrer eller nukleotider i den totale aminosyre- eller nukleotidsekvens med en eller flere andre, "addition" skal opfattes som addition af én eller flere aminosyrer eller nukleotider 10 i den ene eller den anden ende af den totale aminosyreeller nukleotidsekvens, "insertion" skal opfattes som introduktion af én eller flere aminosyrer eller nukleotider i den totale aminosyre- eller nukleotidsekvens, og "deletion" angiver, at én eller flere aminosyrer eller nukleoti- 15 der er blevet deleteret fra den totale aminosyre- eller nukleotidsekvens enten i den ene eller den anden ende af sekvensen eller på et hvilket som helst egnet punkt inden for denne. Det er klart, at detoxifikation af toxinet eller toxinanalogen også kan fremkaldes ved en kombination af to 20 eller flere af disse fremgangsmåder. Udtrykket "toxinanalog" betegner i nærværende sammenhæng et protein eller polypeptid af en lignende aminosyresammensætning eller -sekvens som P. multocida-toxinet, idet variationer, som ikke har en negativ virkning på analogens immuno- 25 genicitet, er indbefattet. Det analoge polypeptid eller protein kan stamme fra en mikroorganisme tilhørende en anden art end P. multocida eller kan delvis eller fuldstændig være af syntetisk oprindelse. Det analoge polypeptid eller protein kan ligeledes være ét, 30 som omfatter i det mindste én epitop, der er reaktiv med anti-p. multocida-toxinantistoffer påvist i prøver fra individer med atrofisk rhinitis, og/eller som giver anledning til dannelse af antistoffer, der er reaktive med det native P. multocida-toxin. Udtrykket dækker endvidere over en
hvilken som helst immunogen subsekvens, funktionel ækvivalent eller derivat af toxinet. 7 Udtrykket "immunogen subsekvens" angiver en sekvens af toxinet i sin fulde længde, som oprindeligt er produceret i 5 en trunkeret form i forhold til toxinproteinet af fuld længde, eller som efter produktion af proteinet i fuld længde dannes fx ved proteolytisk spaltning deraf eller ved ekspression af en nukleotidsekvens, der er kortere end den totale nukleotidsekvens, der koder for P. multocida-toxin. 10 Den mindste subsekvens er en sådan, som i det mindste omfatter &I relevant epitop af toxinet, dvs. en epitop, som giver anledning til en relevant immunrespons i et dyr, der er immuniseret med vaccinen ifølge opfindelsen. Udtrykket "funktionel ækvivalent" dækker over alle immuno- 15 gent aktive substanser, som er i stand til at fremkalde en immunrespons i dyr, hvortil en vaccine indeholdende ækvivalenten er blevet administreret, som svarer til den immunrespons, der fremkaldes af det detoxificerede P. multocidatoxin, idet den er i stand til at fremkalde immunitet mod 20 sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin. Den funktionelle ækvivalent kan være afledt af en mikroorganisme hørende til en anden art end P. multocida eller kan delvis eller fuldstændig være af syntetisk oprindelse. Det er klart, at lighederne mellem P. mul- 25 tocida-toxinet og den funktionelle ækvivalent snarere er kvalitative end kvantitative, idet de snarere angår den funktionelle ækvivalents natur end dens aktivitetsniveau. Udtrykket "derivat" betegner i denne sammenhæng en modifikation af toxinet såsom en modifikation frembragt ved sub- 30 stituering, insertion, addition eller deletion af &I eller flere aminosyrer eller nukleotider eller en kombination af disser metoder som defineret ovenfor eller ved fusion med et andet polypeptid.
I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse et DNA-fragment, der omfatter en nukleotidsekvens, der koder for et P. multocida-toxin eller en P. multocida-toxinanalog som defineret ovenfor. DNA-fragmentet kan fx anvendes i en 5 fremgangsmåde til fremstilling af toxinet eller toxinanalogen ved hjælp af rekombinant-dna-metoder eller som et diagnostisk middel (dvs. en DNA-probe). 8 Det toxin, der produceres af P. multocida (i det følgende lejlighedsvis forkortet til PMT), som, hvad der er bemærket 10 ovenfor, i almindelighed anses for at være den agens, der fremkalder porcin atrofisk rhinitis, er i den foreliggende litteratur angivet med forskellige betegnelser: "dermonekrotisk toxin", "osteolytisk toxin", "muslingebenatrofitoxin" og "varmelabilt exotoxin", men det fremgår, at disse 15 betegnelser dækker over det samme toxin, da aminosyresam- mensætningen, det isoelektriske punkt og de biologiske aktiviteter for de forskelligt betegnede toxiner udviser basale lighedspunkter, selv om mindre variationer i egenskaber for toxiner isoleret fra forskellige stammer af P. 20 multocida synes at eksistere. Den estimerede aminosyresammensætning for PMT (som deduceret fra DNA-sekvensen) er som vist i det følgende: Ala påvises 76 gange = Cys påvises 8 gange = 5,91% 0,62% 25 Asp påvises 71 gange = 5,53% Glu påvises 100 gange = 7,78% Phe påvises 69 gange = 5,37% Gly påvises 71 gange = 5,53% His påvises 19 gange = 1,48% 30 Ile påvises 92 gange = 7,16% Lys påvises 70 gange = 5,45% Leu påvises 127 gange = 9,88% Met påvises 36 gange = 2,80% Asn påvises 73 gange = 5,68% 35 Pro påvises 62 gange = 4,82% Gin påvises 56 gange = 4,36%
Arg påvises Ser påvises Thr påvises Val påvises 5 Trp påvises Tyr påvises 58 gange = 97 gange = 66 gange = 63 gange = 18 gange = 53 gange = 9 4,51% 7,55% 5,14% 4,90% 1,40% 4,12% Det totale antal aminosyreenheder er 1285, og det totale toxin har en molekylvægt på 146,5 kd. Det rekombinante toxin eller den rekombinante toxinanalog 10 ifølge opfindelsen, der kan anvendes i en vaccine, kan mere specifikt være et toxin eller en toxinanalog, der kodes af en DNA-sekvens i det væsentlige som vist i figur 10 (a)-(j) eller en subsekvens deraf, der koder for en immunogen subsekvens af toxinet eller toxinanalogen. Det skal bemærkes, 15 at aminosyresekvensen, der er afledt fra DNA-sekvensen, ligeledes er vist i figur 10 (a)-(j) over DNA-sekvensen. En egnet analog kan være en, der har en DNA-sekvens, som afviger fra det native toxins DNA-sekvens i ft eller flere basepar, og som kan være afledt ved substituering af ft 20 eller flere nukleotider i toxin-dna-sekvensen, hvilket enten giver anledning til dannelse af den samme aminosyresekvens, men hvor nukleotidsubstitutionerne gør sekvensen konform med kodonanvendelsen i den mikroorganisme, hvori sekvensen er indsat, eller som resulterer i en noget afvi- 25 Bende aminosyresekvens, som imidlertid funktionelt er lig med det native toxins aminosyresekvens. Ud over toxinet eller toxinanalogen som defineret ovenfor omfatter en vaccine fremstillet ifølge opfindelsen ligeledes en immunologisk acceptabel bærer eller et immunolo- 30 gisk acceptabelt vehikel. Dette vehikel kan være et hvilken som helst vehikel, der sædvanligvis anvendes i fremstillingen af vacciner, fx et fortyndingsmiddel såsom isotonisk saltvand, suspensionsmidler, etc. Vaccinen kan fremstilles ved blanding af en immunogent effektiv mængde af toxinet 35 eller toxinanalogen med vehiklet i en mængde, der resul-
terer i den ønskede koncentration af toxinet eller toxinanalogen i vaccinepræparationen. Uanset at mængden af toxin eller toxinanalog pr. enhedsdosis af vaccinen vil være forskellig afhængig af alderen af de dyr, der skal immuni- 5 seres, (fx afhængig af hvorvidt søer eller smågrise skal immuniseres mod P. multocida) administrationsvejen og -måden, og immunogeniciteten af det pågældende toxin, der findes i vaccinen, anses en egnet mængde af toxin eller toxinanalog at ligge inden for området 0,1-500 gg pr. dosis 10 af vaccinen. 10 Vaccinen kan endvidere omfatte en adjuvans med henblik på at forøge vaccinepræparationens immunogenicitet. Adjuvansen kan udvælges blandt Freund's komplette eller inkomplette adjuvans, aluminiumhydroxid, Bordetella pertussis, et sa- 15 ponin, et muramyldipeptid, et iscom (immunstimulerende komplex; jf. fx EP 109 942) og en olie såsom en vegetabilsk olie, fx jordnøddeolie, eller en mineralsk olie, fx siliconeolie. Det kan i nogle tilfælde være fordelagtigt at koble toxinet 20 eller toxinanalogen til en bærer, især en makromolekylær bærer. Bæreren er sædvanligvis en polymer, hvortil toxinet bindes ved hydrofob non-kovalent interaktion såsom en plastic, fx polystyren, eller en polymer, hvortil toxinet bindes kovalent såsom et polysaccharid, eller et polypeptid, 25 fx bovint serumalbumin, ægalbumin eller keyhole-limpet-hæmocyanin. Bæreren er fortrinsvis non-toxisk eller non-allergen. Toxinet eller toxinanalogen kan kobles multivalent til den makromolekylære bærer, da dette resulterer i en forøget immunogenicitet af vaccinepræparationen. Det anta- 30 ges ligeledes, at toxinet eller toxinanalogen kan præsenteres i multivalent form ved polymerisering af toxinet eller af toxinanalogen med sig selv. I en særlig udførelsesform af vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse fusioneres toxinet eller toxinanalogen 35 som defineret ovenfor til et andet polypeptid. Metoder til
fremstilling af fusionerede polypeptider er kendte fra fx Casadaban og Cohen, 1980, (ref. 30). Alternativt kan fusionen tilvejebringes ved fusion af den nukleotidsekvens, der koder for toxinet, til en nukleotidsekvens, der koder for 5 et andet polypeptid, således at den fusionerede nukleotidsekvens, når den indsættes i en hensigtsmæssig vektor, udtrykkes som et fusionspolypeptid ved transformation af vektoren til en egnet mikroorganisme og dyrkning af mikroorganismen under betingelser, der er gunstige for ekspression 10 af den fusionerede sekvens. Polypeptidet, hvortil toxinet er fusioneret, kan fx være et bærerpolypeptid som angivet ovenfor, lysozym eller et andet immunogent peptid såsom et Ty-protein fra Saccharomyces cerevisiae, protein A fra Staphylococcus aureus, Hepatitis B-core-antigen, etc. 11 15 Det antages ligeledes, at vaccinen kan være i form at en tablet, pille eller kapsel egnet til oral administration, da der foreligger tegn på, at immunogener kan absorberes gennem tarmvæggen og stimulere B-lymfocytter, som derefter migrerer til lokale epithelregioner, hvor de transformeres 20 til immunglobulin-producerende plasmaceller. En oral vacci- ne skal være forsynet med en enterisk coating med henblik på at beskytte toxinet eller toxinanalogen mod substanser i mavesaften, som kunne være ødelæggende for toxinet eller toxinanalogen, såsom pepsin. Den enteriske coating kan ud- 25 vælges blandt shellak, celluloseacetatestere såsom cellu- loseacetatphthalat, hydroxypropylmethylcelluloseestere såsom hydroxypropylmethylcellulosephthalat, polyvinylacetatestere såsom polyvinylacetatphthalat og polymerer af methacrylsyre og (meth)acrylsyreestere. Nyligt udviklede 30 fremgangsmåder til indkapslinger baseret på mikrokugler med en diameter på ca. 5-15 pm er af særlig interesse, da sådanne partikler indeholdende en immunogen substans efter administration selektivt vil blive ført til Peyers's pletter og dermed fremkalde immunitet på slimhindeoverflader. 35 Stimulering af en immunrespons på luftvejsslimhindeoverflader kan ligeledes fremkaldes ved intranasale immuniseringer. (Mestecky, 1987, (ref. 12)).
12 DNA-fragmentet ifølge opfindelsen, der omfatter den nukleotidsekvens, der koder for toxinet eller toxinanalogen, kan afledes fra komplementært cdna vundet ved fremstilling af et cdna-bibliotek på grundlag af mrna fra en toxinproduce- 5 rende P. multocida-stamme ved hjælp af standardfremgangsmåder. Nukleotidsekvensen kan alternativt og fortrinsvis hidrøre fra et P. multocida-genom ved screening for genomsekvenser, der hybridiserer til en DNA-probe fremstillet på grundlag af den hele eller delvise aminosyresekvens for 10 toxinet i overensstemmelse med anerkendte fremgangsmåder eller ved etablering af et toxingenbibliotek og screening for toxinproducerende kloner ved hjælp af et toxinspecifikt antistof (vedrørende en mere detaljeret beskrivelse af denne fremgangsmåde se eksempel 4). For så vidt angår PMT er 15 det ikke muligt at fremstille en DNA-probe på grundlag af dets N-terminale aminosyresekvens, da PMT er blokeret i den N-terminale ende og derfor ikke nedbrydes ved fremgangsmåder til sekventering af aminosyrer. En anden rutine-screeningsmetode, som har vist sig vanske- 20 ligt anvendelig i tilfælde af PMT, er screening for toxinproducerende kloner ved hjælp af et anti-pmt-serum. Ved anvendelse af serum fra en kanin, der gentagne gange var immuniseret med PMT, fandt nærværende opfindere ved hjælp af colony blot-metoden 5 E. coli-kloner i det genbibliotek, 25 der er beskrevet i eksempel 5. Yderligere undersøgelser af de nævnte 5 kloner viste imidlertid, at ingen af disse producerede PMT. Disse resultater viser vigtigheden af at udføre screeningen med anti-pmt-monoklonale antistoffer som beskrevet i eksempel 5. 30 Nukleotidsekvensen kan ligeledes hidrøre fra en bakteriofag, der er infektiøs for P. multocida, dvs. en fag, som er blevet overført fra en bakteriestamme, der oprindeligt indeholdt sekvensen, til en anden stamme, som oprindeligt ikke indeholdt sekvensen, ved hjælp af bakteriofagtransfek- 35 tion. Tilsvarende kan nukleotidsekvensen hidrøre fra et
plasmid eller et andet genetisk element overført fra en stamme til en anden ved hjælp af konjugation, transformation eller lignende. 13 Nukleotidsekvensen, der koder for toxinet, kan endvidere 5 være en syntetisk sekvens, dvs. en sekvens fremstillet i overensstemmelse med standardfremgangsmåder, fx som beskrevet i Matthes et al., 1984, (ref. 13). Endelig kan nukleotidsekvensen være en sammensat genom- og syntetisk sekvens eller en sammensat cdna- og syntetisk sekvens frem- 10 stillet ved ligering af DNA-fragmenter af genom-, cdnaeller syntetisk oprindelse (afhængig af hvad der er hensigtsmæssigt), hvilke DNA-fragmenter hver indeholder en del af den nukleotidsekvens, der koder for toxinet, i overensstemmelse med anerkendte fremgangsmåder. 15 Ifølge den i det foranstående givne forklaring kan DNAfragmentet være et fragment, som er modificeret ved substituering, addition, insertion eller deletion af en eller flere nukleotider i sekvensen med det formål at tilvejebringe en sekvens, som, når den udtrykkes, resulterer i 20 produktionen af et detoxificeret toxin eller en detoxificeret toxinanalog. Den foreliggende opfindelse angår især et DNA-fragment, som omfatter en nukleotidsekvens i det væsentlige som vist i figur 10 (a)-(j) eller en modifikation deraf som angivet 25 ovenfor. Sekvensen, der koder for toxinet i sin fulde længde, starter i den i figuren viste sekvens' position 219 (eller 213), medens sekvensens ende er ved position 4073. Den i figur 10 (a)-(j) viste DNA-sekvens er blevet fastslået ved hjælp af velkendte metoder som beskrevet i ek- 30 sempel 7 nedenfor. DNA-fragmentet ifølge opfindelsen kan yderligere omfatte en nukleotidsekvens, der koder for et andet polypeptid, fusioneret med nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen, med det formål at producere et fusioneret
polypeptid som forklaret i det ovenstående. Et yderligere formål med fremstilling af et fusioneret polypeptid kan være at gøre oprensningen af toxinet lettere. I dette tilfælde kan den fusionerede sekvens indsættes i en hensigts- 5 mæssig vektor, som transformeres til en egnet værtsmikroorganisme, som dyrkes under betingelser, der sikrer ekspression af den fusionerede sekvens, hvorefter det fusionerede polypeptid udvindes fra kulturen ved at underkaste det fusionerede polypeptid affinitetskromatografi, der involverer 10 et antistof eller en hvilken som helst anden ligand, der reagerer med det andet polypeptid. Efter oprensning kan det andet polypeptid derefter fjernes, fx ved en egnet proteolytisk spaltning efterfulgt af adskillelse af de to polypeptider. 14 15 I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en ekspressionsvektor, som er i stand til at replicere i en værtsmikroorganisme, og som indeholder et DNA-fragment som beskrevet i det ovenstående. Vektoren kan enten være en vektor, som er i stand til autonom replikation såsom et 20 plasmid, eller en vektor, som repliceres sammen med værtskromosomet såsom en bakteriofag. Specifikke eksempler på ekspressionsvektorer ifølge opfindelsen er plasmiderne pspe A-R, som er beskrevet i eksempel 9 nedenfor og vist i figur 13. 25 I endnu et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en mikroorganisme, som er i stand til at udtrykke et DNA-fragment som defineret ovenfor, og som indeholder en vektor som beskrevet ovenfor. Mikroorganismen er fortrinsvis en bakterie, især en gram-negativ bakterie såsom E. 30 coli. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent detoxificeret P. multocida-toxin eller en immunogen detoxificeret P. multocida-toxinanalog, idet fremgangsmåden omfatter
a) isolering af en nukleotidsekvens, der koder for P. multocida-toxinet eller -toxinanalogen, 15 b) indsættelse af denne sekvens, eventuelt i en passende modificeret form, der resulterer i ekspression af det 5 detoxificerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog eller en subsekvens, der koder for en immunogen subsekvens af toxinet eller toxinanalogen, i en ekspressionsvektor, c) transformation af en egnet værtsmikroorganisme med den i trin b) fremstillede vektor, 10 d) dyrkning af mikroorganismen fremstillet i trin c) under betingelser, der er egnede til ekspression af toxinet eller toxinanalogen, e) høstning af toxinet eller toxinanalogen fra kulturen, og f) eventuelt udsættelse af toxinet for post-translationelle 15 modifikationer for at frembringe det detoxificerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog. I trin a) ifølge metoden kan nukleotidsekvensen fx isoleres ved etablering af et P. multocida-genbibliotek og scree- ning for toxinpositive kloner i overensstemmelse med aner- 20 kendte fremgangsmåder som angivet i det ovenstående og som beskrevet i detaljer i nedenstående eksempel 4. I trin b) ifølge metoden kan de eventuelt udførte modifikationer af sekvensen udføres før eller efter, at sekvensen er blevet indsat i vektoren. Modifikationen kan omfatte 25 substituering, addition, insertion eller deletion af én eller flere nukleotider i sekvensen eller en kombination deraf som forklaret ovenfor. Transformationen i trin c) ifølge metoden kan udføres ved hjælp af standardfremgangsmåder såsom fremgangsmåder be-, 30 skrevet i Maniatis et al., (ref. 14).
Dyrkningen af værtsmikroorganismen i trin d) ifølge metoden kan udføres i et dyrkningsmedium, der anvendes konventionelt til fermenteringsformål, fx Luria Broth-medium, og under ph-, temperatur- og beluftningsbetingelser, etc, der 5 er egnede til den pågældende type af mikroorganismer fx som beskrevet i Maniatis et al., (ref. 14). 16 I trin d) ifølge metoden kan høstning af toxinet eller toxinanalogen udføres ved hjælp af velkendte fremgangsmåder såsom ved præcipitation, gelfiltrering, ionbytning eller 10 HPLC-omvendt fasekromatografi eller immunoaffinitetskromatografi. Såfremt nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen, ikke er modificeret i trin b) ifølge metoden for at opnå ekspression af det detoxificerede toxin eller 15 den detoxificerede toxinanalog, underkastes toxinet eller toxinanalogen post-translationelle modifikationer i trin f) ifølge metoden, fx termisk behandling, behandling med et kemikalie såsom formaldehyd, glutaraldehyd eller et egnet proteolytisk enzym, fx trypsin, eller substituering, addi- 20 tion, insertion eller deletion af én eller flere aminosyrer i toxinet eller toxinanalogen. Den foreliggende opfindelse angår også anvendelse af et rekombinant detoxificeret immunogent P. multocida-toxin eller en rekombinant detoxificeret immunogen P. multocida- 25 toxinanalog til fremstilling af en vaccine til immunisering af et dyr, herunder et menneske, mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin. Toxinet eller toxinanalogen, der anvendes til immunisering, kan være et toxin eller en toxinanalog, der kodes for af DNA- 30 sekvensen vist i figur 10 (a)-(j), eller en modifikation deraf som forklaret i det ovenstående. Den foreliggende opfindelse beskrives yderligere i det følgende idet der henvises til figurerne, hvor
figur 1 er en graf, der viser titrering af PMT i en kvantitativ sandwich-elisa. Absorbansen ved 492 nm målt i denne ELISA er afsat mod PMT-koncentrationen. Den mindste detekterbare koncentration af PMT er ca. i ng/ml svarende til 5 ca. 50 pg eller 0,35 fmol. 17 Figur 2 viser en SDS-PAGE af fraktioner fra den i eksempel 3 beskrevne affinitetskromatografi. Bane A: kultursupernatanten påsat søjlen, bane 0: effluenten fra søjlen, bane E. det eluerede oprensede PMT og bane M: molekylvægtmarkørpro- 10 teiver. Figur 3 er en Western blot, der viser de i screeningsproceduren påviste 5 positive rekombinante E. coli-kloners PMT-produktion. Bane 1: SPE 301; banerne 2 og 3: SPE 308; bane 4: SPE 315; banerne 5 og 6: SPE 312; bane 7: SPE 311; 15 bane 8: oprenset PMT. Figur 4 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plasmidet pspe 308 med en længde på 21,5 kb (kilobasepar). Det skraverede felt angiver P. multocida-dna, det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, og det lodret skraverede felt 20 betegner plasmidet pun121-dna. Figur 5 er et restiktionsenzymsspaltningskort for plasmidet pspe 312 med en længde på 13,8 kb. Det skraverede felt betegner P. multocida-dna, det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, og det lodret skraverede felt angiver plasmidet 25 pun121-dna. Figur 6 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plasmider konstrueret ved enzymatisk spaltning af plasmidet pspe 308. Det skraverede felt angiver P. multocida-dna, det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, og det lodret skraverede 30 felt angiver plasmidet pun121-dna. Figur 7 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plasmi- der konstrueret ved enzymatisk spaltning af plasmidet pspe
312. Det skraverede felt angiver P. multocida-dna, det lodret skraverede felt angiver plasmidet pun121-dna, og det tæt skraverede felt angiver pmt-genet. 18 Figur 8 er et Western blot, der viser PMT-produktion af 5 derivater af plasmiderne pspe 308 og pspe 312. Bane 1: oprenset PMT; bane 2: pspe 350; bane 3: pspe 349; bane 4: pspe 341; bane 5: pspe 345; bane 6: pspe 312; banerne 7 og 8: oprenset PMT. Plasmid pspe 349 er identisk med plasmid pspe 347 vist i figur 7. 10 Figur 9 er et restriktionsenzymsspaltningskort for pmt- genet. Det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, det lodret skraverede felt angiver en sandsynlig promotor, og det skraverede felt angiver en sandsynlig terminator. Figur 10 (a)-(j) viser DNA-sekvensen for pmt-genregionen og 15 aminosyresekvensen udledt fra DNA-sekvensen. Aminosyrerne er identificeret med enkeltbogstavskoder i overensstemmelse med konventionelle regler. Det har vist sig, at aminosyresekvensen starter ved position 213 eller 219. Figur 11 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plas- 20 midet pspe 525 med en længde på 7,7 kb. Det skraverede felt angiver P. multocida-dna, det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, og det lodret skraverede felt angiver pun121- DNA. Figur 12 er et restriktionsenzymsspaltningskort for eks- 25 pressionsvektoren pspe 481 med en længde på 8,25 kb. Det skraverede felt (til højre) angiver P. multocida-dna, det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, det skraverede felt (til venstre) angiver ÅPL-DNA, det krydsskraverede felt angiver amp-genet, og det lodret skraverede felt angiver 30 replikationsorigin. Figur 13 er et restriktionsenzymsspaltningskort for den toxa-kodende region. Udstrækningen af den kodende region på
hvert plasmidderivat (pspe A-R) er angivet (A-R) med bjælker. Skraverede bjælker: kodende region i korrekt læseramme; åbne bjælker: kodende region, som ikke er i ramme med 5'-delen af den kodende region. 19 5 Figur 14 er en Western blot, der viser genkendelse med et muse-anti-pmt-antiserum af PMT-derivater produceret af plasmiderne pspe A-L. Banerne 7, 13, 14 og 15: forskellige stammer indeholdende hele mit-genet; bane 1: derivat A; bane 2: derivat I; bane 3: derivat B; bane 4: derivat J; 10 bane 5: derivat L; banerne 6 og 9: derivat E; bane 8: derivat C; bane 10: derivat G; bane 11: derivat H; bane 12: derivat D. Den omtrentligt størrelse (i kilodalton) af fremtrædende fuld-længde-derivater og nedbrydningsprodukter er angivet. 15 Figur 15 er en graf, der viser fordelingen af relative absorbanser (A/A0 ) ved PMT-ELISA af ekstrakter af non-cytopatiske (skraverede bjælker) og cytopatiske (udfyldte bjælker) kliniske isolater af P. multocida fortyndet 1:1 i PBS-T-BSA. 20 Figur 16 er en graf, der viser middeltal ± SD for relative absorbanser (A/A0 ) for fortyndinger af ekstrakter af cytopatiske (udfyldte firkanter) og non-cytopatiske (åbne firkanter) kliniske isolater af P. multocida. Figur 17 er en graf, der viser forekomsten af anti-pmt-an- 25 tistoffer i serumprøver fra anti-pmt-antistofnegative, inficerede og vaccinerede grise påvist ved kompetitiv ELISA. Grafen viser 50% blokerende titerværdier ved -en absorbans på 492 nm. 30 - negativ inficeret vaccineret
Figur 18 viser kolonihybridisering af - P. multocida-isolater, idet der er testet 17 toxinpositive og 18 toxinnegative stammer bestemt ved ELISA og EBL-celleundersøgelser for tilstedeværelsen af pmt-genet. 20 5 Figur 19 viser måling af toxiske aktiviteter i cellefrie sonikater af rekombinante E. coli-kloner. E.coli-stamme MT102 med pun121 viste ingen cytopatisk effekt på EBL-celler i fortyndingen 1:25 i PBS (a). Sonikater af E. coli SPE 312 (b) og toxinogenet P. multocida (NCTC 12178) (c) 10 fortyndet 1:3125 viste signifikante og identiske virkninger (80 X forstørrelse). Figur 20 viser P. multocida-dna'et, der flankerer imt-genet (sort felt). Udstrækningen af insertionerne af plasmiderne pspe 308, pspe 312, pspe 344, ploa03 og plob03 er angivet. 15 Der er vist DNA indeholdt i de til blotting anvendte prober (skråtskraveret felt) og de fragmenter, der indeholder de to homologe sekvenser (lodret skraveret felt). Figur 21 viser et Southern blot af restriktionsenzymfordøjet P. multocida-dna. Probe: 2,4 kb BcflII-EcoRI-fragment 20 af plob03. Banerne 10*-14* er en korttidseksponering af banerne 10-14. Banerne 1-4: toxinogene P. multocida 45/87. Banerne 5-9: non-toxinogene P. multocida MH81P8. Bane 10: pspe 308. Bane 11: ploa03. Bane 12: ploa02. Bane 13: pspe 312. bane 25 14: plob03. Anvendte restriktionsenzymer: HindIII: banerne 1, 5, 10, 11, 12 og 13. EcoRI: banerne 2, 6 og 14. BcrlII: banerne 3 og 7. PvuII: banerne 4 og 8. 30 PstI: bane 9.
Figur 22 viser et dot blot af 24 forskellige P. multocidabakteriofag-genomer. Probe: ploa03. Proben hybridiserer ikke med B2 og C5. A7: pspe 308; B7: pspe 312, C7: ploa03 og D7: plob03 er positive kontroller. 21 5 EKSEMPEL 1 Fremstilling af monoklonale antistoffer mod P. multocidatoxin Immunisering P. multocida-toxin (PMT) blev oprenset som beskrevet af 10 Foged et al. (ref. 6), dvs. ved 50% (NH4)2SO4-præcipitering af en cellefri ekstrakt af den toxinogene type D-stamme af P. multocida ssp. multocida 45/78 (referencerne 3 og 22) efterfulgt af DEAD-Sephacel@-kromatografi og præparativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) på en måde, der er 15 kendt per se. En suspension af (NH4)2SO4-præcipitatet fremstillet som beskrevet ovenfor og indeholdende ca. 25 pg/ml PMT blev detoxificeret ved inkubering med 0,37% formaldehyd ved 37 C i 1 time. Balb/c-hunmus (8-12 uger gamle) blev immuniseret 20 subkutant på dag 0 og dag 14 med 300 pl af en 1:1-fortyn- ding af den rå præparation af detoxificeret P. multocidatoxin og Freund's inkomplette adjuvans (dag 0) eller PBS (dag 14). På dag 30 og 45 blev 1 gg nativt PMT i 200 pl PBS injiceret subkutant, og på dag 60 blev musene "boostet" in- 25 travenøst med 0,5 pg PMT i 100 pl PBS. 3 dage efter booster-injektionen blev musene aflivet og deres milte fjernet med henblik på fusion.
Fremstilling af hybridomcellelinier og monoklonale antistoffer 22 I overensstemmelse med fremgangsmåder beskrevet af Fazetas et al. (ref. 23) og Gebeyechu et al. (ref. 20) blev milt- 5 cellerne og P3-X63-Ag8.653 myelomceller fusioneret under anvendelse af 50% PEG 4000 GK (Merck), og de resulterende hybridomceller blev dyrket selektivt i hypoxanthin/aminopterin/thymin (HAT) -tilsat RPMI 1640-medium indeholdende 15% føtalt kalveserum (FCS) og 4% human endothelial celle- 10 supernatant (Costar, Holland). Hybridomcellelinier blev selekteret ved analyse af deres respektive monoklonale antistoffer ved ELISA og immunblotting. ELISA til påvisning og titrering af monoklonale antistoffer 15 Mikrotiterplader (96-brønde Immuno Plate II, Nunc, Danmark) blev coatet med 50 pl/brønd af en 0,75 µg/ml opløsning af oprenset PMT i PBS ved 4 C i 16 timer og ved 20 C i 1 time. Brøndene blev tømt og blokeret med 200 pl PBS-T-BSA (PBS indeholdende 0,05% (volumen/volumen) Tween 20 og 1% (vægt/- 20 volumen) bovint serumalbumin) pr. brønd ved 20 C i 1 time, derefter vasket 3 gange med PBS-T. 50 pl/brønd hybridomkultursupernatant lodes reagere ved 20 C i 1 time, og pladerne blev vasket som beskrevet ovenfor. Anti-PMT-antistofaktiviteten blev målt kolorimetrisk efter inkubering ved 20 C i 1 25 time med 50 pl/brønd fåre-anti-muse-immunglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase (Amersham International, GB) fortyndet 1:1500 i PBS-T-BSA og (efter 3 yderligere PBS-Tvaskninger som ovenfor) med 50 pl af en o-phenylendiamin (OPD)-H202-substratopløsning. Reaktionen blev standset med 30 150 pl 2M H2SO4 efter 5 minutter, og absorbansen blev bestemt i et Kontron SLT-210-fotometer (SLT Lab-instr., Zfirich, Schweiz) ved 492 nm (ref. 620 nm).
Middelabsorbansen ved titreringskurvens mætningsniveau (Asat) og middelkoncentrationen af de monoklonale antistoffer, der resulterede i 50% af A sat (C50%) blev bestemt ved hjælp af ELISA som beskrevet ovenfor med den undtagel- 5 se, at der blev anvendt fortyndingsrækker af protein A- oprenset monoklonalt antistof (MAb) i PBS-T-BSA. Samtlige resultater er baseret på i det mindste dobbeltbestemmelser. 23 Immun-blotting Med henblik på at bestemme specificiteten af de monoklonale 10 antistoffer blev proteinerne i en rå cellefri ekstrakt af P. multocida 45/78 adskilt ved hjælp af SDS-PAGE forud for overføring til en nitrocellulosemembran og immunologisk påvisning. Polyacrylamidgeler (total acrylamid: 10%, relativ bis-acrylamid: 3%) og en elektroforesebuffer blev frem- 15 stillet i henhold til Laemmli (ref. 24). Elektroforese blev udført vertikalt ved 10 C ved en konstant spænding på 60 V i 16 timer eller 250 V i 4 timer. Proteinbånd på gelerne blev enten visualiseret ved sølvfarvning med en detektionsgrænse på mindre end i ng protein pr. bånd (8) 20 eller overført til en nitrocellulosemembran (0,45 gm) under anvendelse af en halvtør elektroblotter (Ancos, Ølstykke, Danmark (9)). Proteinerne på nitrocellulosemembranen blev enten påvist ved hjælp af en kolloid guld/sølvforstærkningsfarvemetode (detektionsgrænse: ca. 0,5 ng protein pr. 25 bånd) (ref. 25) eller immunologisk ved hjælp af en modifikation af den metode, der tidligere er beskrevet af Bjerrum et al. (ref. 26). En positiv reaktion i immun-blotting blev registreret som + eller (+), når der blev observeret en intens (eller svag) farvning af PMT-båndet, men ikke af noget 30 andet proteinbånd. Farvning af andre bånd eller ingen reaktion blev registreret som -. PMT's molekylvægt blev bestemt ved sammenligning med kendte markører: ægalbumin (43,0 kd), BSA (66,3 kd), phosphorylase B (97,4 kd), /3-galactosidase (116,2 kd), RNA-polymerase fl 35 (150,6 kd) og /3' (155,2 kd) og myosin (ca. 200 kd).
ELISA til påvisning af epitopspecificitet 24 Bestemmelse af tilsyneladende epitopspecificitet for anti- PMT-monoklonale antistoffer blev udført ved en kompetitiv ELISA svarende til en fremgangsmåde beskrevet af Anderson 5 et al. (ref. 27). Mikrotiterplader blev coatet med PMT og blokeret som beskrevet ovenfor. 50 /cl af det konkurrerende MAb fortyndet til 10 pg/ml i PBS-T-BSA blev tilsat og inkuberet i 1 time ved 20 C. Der blev tilsat 25 gl biotinyleret monoklonalt antistof uden aspiration af brøndene, og 10 blandingen blev inkuberet i 20 minutter ved 20 C. Efter vaskninger tilsattes 50 ul af en 1:2500-fortynding af peberrodsperoxidase-konjugeret avidin (Kem-En-Tec, Danmark), og pladerne blev inkuberet i 45 minutter ved 20 C. Substratet, reaktionstiden og bestemmelse af absorbans var 15 som beskrevet ovenfor. Det biotinylerede MAb blev anvendt ved en brugsfortynding, der resulterede i ca. 75% af absorbansen ved titreringskurvens mætningsniveau. Kurven blev opnået under anvendelse af et fortyndingsmiddel i stedet for det konkurrerende MAb 20 og fortyndingsrækker af det biotinylerede MAb. Graden af et kompetitivt MAb's blokering blev beregnet ud fra formlen (1-A/A0 ) x 100%, hvor A er middelabsorbansen for 3 brønde med det konkurrerende MAb, og A o er middelabsorbansen for 8 brønde indeholdende fortyndingsmiddel i stedet for det kon- 25 kurrerende MAb. Data for 10 repræsentative monoklonale antistoffer, alle tilhørende IgGi-underklassen, ud af 92 ELISA-positive supernatanter er vist i tabellerne 1 og 2.
25 TABEL 1 Karakterisering af 10 repræsentative MAb'er 5 Hybridcm- gruppe nr. Repræsentativt MAb -sat C50%. Immun-blotting 1 P3F51 1,2 110 + 2 P3F64 0,4 250 + 3 P3F37 0,7 30 (+) 4 P4F58 0,7 110 + 10 5 P3F22 0,6 35 + 6 P4F46 1,3 55 + 7 P4F38 1,9 40 + 8 P4f55 1,3 33 + 9 P3F50 1,8 315 + 15 10 P3F53 0,9 300 (+) a) Asat angiver middelabsorbansen ved 492 nm ved mætningsniveau i ELISA-titreringen.
26 TABEL 2 Graden af 10 repræsentative MAb'ers blokering i den kompetitive ELISA. 5 Konkurrerende MAb (hybridamgruppe nr. Biotinyleret detektor-mab (% reduktion af.a 0a) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P3F51 (1) 92 b P3F64 (2) 95 44 P3F37 (3) 63 95 78 10 P4F58 (4) 91 96 73 P3F22 (5) 71 88 P4F46c (6) 92 90 93 16 P4F38c (7) 93 92 95 27 P4F55 (8) 92 92 95 15 15 P3F50 (9) 16 24 13 84 91 P3F53 (10) 56 83 2No 1,43 0,19 0,53 0,80 0,64 0,64 0,85 1,01 0,26 0,52 a) Ao angiver middel absorbansen med fortyndingsmiddel i stedet for 20 konkurrerende MAb. b) Ingen blokering (mellem 12% forøgelse og 9% reduktion af A o) c) De nært beslægtede hybridcmgrupper 6, 7 og 8 blev differentieret ved hjælp af en to-sidet kcmpetitiv RLTSA under anvendelse af et "catching" MAb (metoden er ikke beskrevet). Resultaterne viste, 25 at gruppen 6 var beslægtet ned grupperne 3 og 4, gruppe 7 var ikke beslægtet ned nogen anden gruppe, og gruppe - 8 var beslægtet ned gruppe 1. De selekterede hybridomcellelinier blev derefter klonet, indtil de var stabile. De resulterende kloner blev derefter 30 dyrket i "cell factories" (Nupc, Danmark) ved 37 C i RPMI 1640-medium suppleret med 10% FCS og injiceret i en mængde på ca. 5 x 10 6 celler/mus i Balb/c-mus, hvilket efter en
vis inkuberingstid fører til dannelse - af en tumor i peritoneum i musen, der frigiver store mængder antistof i sin bughulevæske (ca. 5-10 ml indeholdende 5-25 mg/ml). 27 Hybridomcellekultursupernatanterne blev passeret gennem en 5 protein A-agarosesøjle (Kem-En-Tec, Danmark). Bundne anti- stoffer blev elueret med 0,05M eddikesyre, ph 4,0, eller 0,03M citronsyre, ph 3,0, og straks neutraliseret med en egnet buffer. Oprensede antistoffer blev biotinyleret som beskrevet af Guesdon et al., 1979, (ref. 28). 10 To hybridomcellelinier, P3F37 og P3F51, der som vist i tabel 1 producerer MAb, blev deponeret den 3. december 1987 i the European Collection of Animal Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, GB, under deponeringsnumrene ECACC 15 87120301 og ECACC 87120302. EKSEMPEL 2 Kvantificering af PMT Kvantificering af PMT blev udført ved hjælp af en sandwich- ELISA-fremgangsmåde. Sandwich-ELISA'en blev indledt ved en 20 coatning af alle brønde i en mikrotiterplade (96 brønde Immuno Plate II, Nunc, Danmark) med 50 pl indeholdende 2 pg/ml af det monoklonale anti-pmt-antistof, P3F51 (fremstillet i eksempel 1) i 0,05M carbonatbuffer, ph 9,6, i 16 timer ved 4 C og 1 time ved 20 C. Hver brønd blev inkuberet 25 i 1 time med 200 pl phosphat-bufret saltvand indeholdende 0,05 Tween 20 og 1% bovint serumalbumin (PBS-T-BSA). Pladerne kunne opbevares i mindst 6 måneder før tilførsel af 20 pl/brønd PBS-sorbitol og forsegling med klæbende tape. Analysen blev indledt med to PBS-T-vaskninger efterfulgt af 30 inkubering af 50 pl/brønd opløsninger med formodet indhold af PMT. Opløsningerne blev fortyndet på en hensigtsmæssig måde i PBS-T-BSA og inkuberet i 1 time ved 20 C. Efter 3
PBS-T-vaskninger blev hver brønd inkifteret med 50 gl af 0,5 pg/ml af det biotinkonjugerede monoklonale antistof, P3F37, i 1 time ved 20 C efterfulgt af yderligere 3 PBS-Tvaskninger og inkubering med 50 pl/brønd af en 1:2500 for- 5 tynding af peberrodsperoxidase-konjugeret avidin (Kem-En- Tec, Danmark) i 45 minutter ved 20 C. Sluttelig blev der tilsat 50 pl/brønd af en o-phenylendiamin/h202-opløsning. Reaktionen blev standset med 2M H2SO4 efter 5 minutter, og absorbansen blev bestemt i et Kontron SLT-210-fotometer 10 (SLT Lab-instr., Zfirich, Schweiz) ved 492 nm (ref. 620 nm). 28 Kalibrering blev udført med en PMT-præparation kvantificeret ved hjælp af aminosyreanalyse (ref. 6), og samtlige kvantitative data er gennemsnit af i det mindste dobbeltbestemmelser. 15 Under anvendelse. af en sandwich-elisa med MAb P3F51 som "catching" antistof og biotinyleret MAb P3F37 som detektionsantistof var det muligt at detektere mindre end 50 pg PMT i en 50 gl prøve. PMT ved en koncentration på 1 ng/ml resulterede i en A492 på ca. 0,1 svarende til mere end 8 20 gange baggrundsabsorbansen (jf. figur 1). EKSEMPEL 3 Affinitetsoprensning af PMT Ca. 100 mg protein A-oprenset MAb P3F51 fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev koblet til 40 ml divinylsulfon- 25 agarose (Mini-Leak, Kem-En-Tec, Danmark) som -beskrevet af producenten og påsat en søjle (2,5 x 10 cm). Supernatanten vundet ved dyrkning af den toxinogene type D-stamme P. multocida 45/78 blev centrifugeret (12000 x g i 30 minutter ved 4 C), filtreret (Gelman, 0,45 pm), blandet med 1/10 vo- 30 lumen af 1M Tris-HC1, ph 7,7, og NaCl blev tilsat til 0,5M, før den blev påsat affinitetssøjlen. Gentagne vaskninger. før eluering af søjlen blev udført med en 0,1M Tris-HC1-