8 Billeder af cellens molekylære univers Hver enkelt levende celle består af tusindvis af biologiske makromolekyler. Om du er menneske, mus, svamp eller bakterie, så er mange af de biologiske molekyler fælles og afgørende, for liv. Tredimensionale molekylære strukturmodeller viser vejen til en bedre forståelse af cellens molekyler og deres mange funktioner i cellen. Af Thomas Boesen og Rikke Schmidt Kjærgaard Da banden i The Italian Job skal have guldet tilbage fra deres tidligere, men forræderiske makker, er et centralt led i planen at hacke sig ind på systemet, der styrer al trafikregulering i Los Angeles. For overhovedet at kunne bruge det til noget, må de først kende systemets struktur. Dernæst må de finde ud af, hvordan de enkelte elementer virker. Det gør de ved at tænde og slukke for forskellige stærkt befærdede lyskryds ikke altid lige heldigt for trafikanterne. Da de endelig har et overblik over systemet og kender funktionerne af enkeltdelene, er de klar til at omsætte det i praksis. Du må se filmen for at se om planen virker. Det er lidt det samme, når vi forsøger at forstå cellen og dens tusindvis af biologiske molekyler. Her er vi også nødt til først at kende den overordnede og de enkelte elementers struktur. Herigennem kan vi komme til en forståelse af deres funktion og hvis planen holder, kan vi omsætte det i praksis og forsøge at påvirke cellen i eksempelvis medicinsk øjemed dog uden garanti for en lastbil fuld af guld. Ved hjælp af en metode kaldet makromolekylær krystallografi kan vi lave tredimensionale modeller af disse strukturer på atomart niveau. Afbildning af disse modeller er afgørende for vores forståelse for og kommunikation af, hvad vi ved om sammenhængen mellem struktur og funktion i cellen. Når vi bevæger os på et molekylært og atomart niveau er visualisering derfor mere end blot et spørgsmål om at kommunikere videnskabelig indsigt. Den er en integreret del af selve forskningsprocessen og produktionen af naturvidenskabelig viden. Strukturel biologi hvad er det? Cellen er tæt pakket med makromolekyler som DNA, RNA, protein, kulhydrat og lipid. Lipiderne er primært byggesten i de membraner, der omgiver cellen og dannner forskellige rum inden i cellen. De resterende makromolekyler udøver deres funktion inden i eller mellem disse intracellulære rum, på overfladen af cellen eller direkte i lipidmembranerne. Det er vekselvirkningen mellem makromolekylerne i samspil med mindre molekyler og ioner, som får cellen til at leve. Denne vekselvirkning er afhængig af strukturen af makromolekylerne. Da James Watson og Francis Crick i 1953 publicerede den tredimensionale model af DNAs struktur baseret på Rosalind Franklins data, kunne DNAmolekylets egenskaber forklares ud fra dets antiparallelle dobbeltspiralstruktur og hydrogenbindingerne mellem de fire baser i DNAets byggesten. Strukturen viste også, hvorfor dette molekyle var det genetiske materiale. Det var stabilt, nemt at kopiere og aflæse, og den specifikke rækkefølge (sekvens) af baserne i form af gener i DNAet kunne kode for eksempelvis proteiner. I 1950 erne førte en række gennembrud inden for makromolekylær krystallografi, til den første strukturbestemmelse af et protein, Myoglobin, et arbejde der blev ledet af John C. Kendrew. Disse resultater var startsskuddet til den strukturelle biologi, som de senere år har udviklet sig eksplosivt. Hvert år publiceres tusindvis af nye eksperimentielt baserede strukturmodeller af biologiske makromolekyler.
9 A B C D Den atomare struktur af Sortilin. Sortilin består af ca. 5200 atomer (hydrogen ikke medregnet) og et billede af strukturen hvor alle atomer vises er derfor uoverskuelig (A) selvom man farver atomerne efter type ( Carbon gul, Nitrogen blå og Oxygen rød). For at få et overskueligt billede vælger man derfor ofte kun at vise alle atomer for et lille rumligt udsnit (B) eller forenkler strukturen ved kun at vise peptidkædens forløb (C) og for at forøge overskueligheden, er polymeren vist i et regnbuefarvet spektrum fra den ene ende til den anden. Man kan også vælge at vise overfl aden af proteinet (D) og evt. farve den efter fordelingen af ladninger på overfl aden (negativ ladning rød, positiv blå). Orienteringen af sortilin i A, C og D er den samme. Den danske forskning inden for strukturel biologi har i de senere år i stigende grad fokuseret på de menneskelige proteiner, der findes i cellemembraner og udenfor cellerne. Det har betydet forøget anvendelsesmæssige aspekter og en mere medicinsk orienteret forskning. Makromolekyler i bevægelse Der findes mange forskellige typer af de enkelte makromolekyler. For eksempel er et protein ikke bare et protein. Der er tusindvis af forskellige proteiner i cellen, som har hver sin unikke struktur og funktion. Strukturbestemmelse og karakterisering af simple proteiner kan gøres på blot få uger, men for komplicerede makromolekyler tager det mange år før strukturel og funktionel karakterisering kommer på plads. Selvom tusindvis af strukturer allerede er kendt, ligger der stadig en stor opgave for forskerne forude, før vi kan forstå cellen helt ned i de mindste atomare detaljer. En enkelt struktur giver et statisk billede af makromole- Krystaller af Sortilin set under mikroskop. Protein krystaller er i de fl este tilfælde farveløse. Farverne her skyldes, at der er anvendt polariseret lys.
10 Makromolekylær krystallografi Vi kender i dag den tredimensionale molekylære struktur af tusindvis af makromolekyler, særligt af proteiner og såkaldte Trinnene i strukturbestemmelsen Billede a: Protein oprenses fra en proteinblanding som ses i søjle 1 (hver blå, vandret streg indikerer et protein). Proteinet oprenses via en række metoder (søjle 2-5), hvorefter det er meget rent og fri for forurenende proteiner (kan ses ved at en af proteinstregerne bliver tykkere (mere koncentreret) og de andre proteinstreger forsvinder. Når proteinet er oprenset, krystalliseres det (billede b). Datasættet analyseres og ved hjælp af en metode kaldet fourieranalyse beregnes et tredimensionalt elektrontæthedskort (vist med blåt hønsenet i billede d), der afspejler atomernes position i proteinet. Det er elektronerne omkring atomerne, der spreder den indkommende røntgenstråling (jo fl ere elektroner og dermed højere elektrontæthed, jo mere spredning), og derfor er der en kylet, men i den levende celle er det en dynamisk størrelse. For at få den optimale forståelse af et makromolekyles funktion er det derfor bedst at bestemme flere strukturer. Det gør man ved at fange makromolekylet i forskellige tilstande, eller konformationer. Det kan for eksempel være makromolekylet alene, makromolekylet med bundne ioner og småmolekyler, og makromolekylet bundet til andre makromolekyler. Det er primært strukturer af makromolekylet i vekselvirkning med andre molekyler, der giver indsigt i funktionen af makromolekylet. Med strukturer af tilstrækkeligt mange tilstande nukleinsyrer (RNA og DNA). Billederne forsyner os med detaljeret information om makromolekylernes overfl ade og struktur, direkte sammenhæng mellem diffraktionsmønstret og elektrontætheden i krystallen. Elektrontæthedskortet er det eksperimentelle resultat af røntgendiffraktions-eksperimentet, og nu begynder krystallografen at fortolke elektrontætheden ved at bygge en atomar model, der passer med elektrontæthedskortet (vist med røde streger i billede e). Når man har en atomar model kan man sætte dem sammen til en film, der afspejler makromolekylets dynamik. Langt de fleste makromolekyler i cellen binder til eller vekselvirker med andre og flere makromolekyler i cellen. Binding mellem to eller flere molekyler kaldes kompleksdannelse. Makromolekylerne kan ofte aktivitet, hvordan de genkender og binder molekyler, samt hvordan de forandres under en given proces i eller udenfor cellen. Krystallisationen kan anses som en kontrolleret udfældning, hvor eksempelvis ændring af temperatur, ph, saltkoncentration og tilsætning af kemikalier bruges til at styre processen. I krystallerne binder proteinerne til hinanden og danner et meget velordnet tredimensionalt gitter. De dannede krystaller i størrelsesordenen 50 mikrometer til 1 mm beskydes med røntgen stråling og i krystallen bliver røntgenstrålingen spredt (diffraktion). Den spredte stråling danner et diffraktionsmønster (billede c, hver plet svarer til spredte røntgenstråler). Hvert diffraktionsbillede svarer eksempelvis til spredningen opnået ved beskydning med røntgenstråling under en halv grads rotation af krystallen. Et datasæt kan bestå af 200 diffraktionsbilleder svarende til rotation af krystallen over en vinkel på 100 grader i dette eksempel. kan man beregne et teoretisk elektrontæthedskort og den tilsvarende diffraktion. Ved at sammenligne den beregnede elektrontæthed eller diffraktionsmønster med de eksperimentelt opnåede kan man forbedre modellen indtil den passer bedst muligt med det eksperimentelt observerede, og dermed er den endelige model af proteinstrukturen bestemt (billede f). danne forskellige komplekser. Kompleksdannelsen er således en dynamisk proces, hvor komplekser dannes og opløses. Denne dynamik er meget vigtig for cellens mange funktioner. Proteinernes struktur Hvor hurtigt vi kan bestemme en struktur afhænger for eksempel af, hvor tilgængelig det specifikke makromolekyle er. De lettest tilgængelige blev naturligt nok først bestemt. Det drejer sig blandt andet om de ganske få proteiner, der findes i store mængder i cellen. Et eksempel er hæmoglobin, et protein, der transporterer iltmolekyler fra lungerne ud til vævene og samtidig er det protein, der gennem binding af jern gør, at vores blod er rødt. Den molekylære struktur af hæmoglobin blev allerede bestemt af Max Perutz i 1959. Det gav ham Nobelprisen i kemi tre år senere. Lysozym er et andet populært eksempel på et protein, der findes i rigelig mængder i for eksempel æggehvide. Som mange andre proteiner, katalyserer lysozym en kemisk reaktion, de fungerer som enzymer. Dets funktion er at hæmme og dræbe bakterier ved at nedbryde kulhydrater i deres cellevægge. Hos mennesket findes lysozym i de hvide blodlegemer, milten, lungerne, nyrerne, plasma, spyt, modermælk, og tårevæsken. Strukturen af Lysozym blev beskrevet i 1965 og er ofte lærebogseksemplet, når man underviser i sammenhængen mellem proteiners struktur og deres evne til at katalysere kemiske reaktioner. For at gennemføre systematiske eksperimenter skal der store mængder protein til. I praksis lader det sig oftest kun gøre, når forskere arbejder sammen på tværs af forskningsområder. Det er også oftest igennem interdisciplinær forskning og samarbejde, at nye og spændende resultater opstår. I strukturbestemmelsen af proteinet sortilin, der findes i centralnervesystemet hos pattedyr, og som blandt andet er i stand til at programmere drab af nerveceller, var samarbejde mellem to grupper
11 af forskere i Århus helt afgørende. Den ene gruppe havde brugt 3-4 år på at fremstille sortilin fra celler dyrket i reagensglas, hvilket havde resulteret i ca. 8 milligram protein. Hermed var der nok materiale til, at den anden gruppe kunne prøve at krystallisere proteinet. Udover sortilin s struktur blev det også kortlagt, hvordan sortilin binder signalstoffer kemiske stoffer, der frigøres og overfører et signal fra én celle til en anden via såkaldte receptorer (som for eksempel sortilin). Viden om sortilins struktur kan blandt andet udnyttes i udviklingen af medicin, der kan begrænse tabet af nerveceller efter traumer. Resultatet fører også til mulighed for bedre undersøgelser af, hvordan sortilin binder til andre komponenter, der er med til at signalere celledød. Derved kan forskerne få en bedre ide om, hvordan sådanne komplekser kan hæmmes og nervedød forhindres. Haleløse pumper Receptor-området er relativt nyt inden for strukturel biologi. Receptorerne sidder på overfladen af cellen og er dermed den første kontakt og samtidig en vej ind i cellen. Forskning inden for receptorområdet producerer mange samarbejdsrelationer og er samtidig mål for den farmaceutiske industri. Forskere arbejder i øjeblikket på at opnå mere viden om den molekylære struktur af SorLA en sortilin-relateret receptor, der blandt andet er involveret i Alzheimers. Mængden af SorLA i hjernen hos folk med Alzheimers er væsentlig mindre end ved raske personer, derfor mener man, at der er en sammenhæng, og strukturen af SorLA måske kan hjælpe til udvikling af nye lægemidler. Her kan strukturen af sortilin hjælpe os, fordi de to strukturer antages at være meget ens. I cellemembranen sidder en anden type protein: natriumkalium-pumpen. En såkaldt ionpumpe, som pumper natrium- og kaliumioner henholdsvis ud af og ind i cellen. Natrium-kalium-pumpen blev opdaget i 1957 af Jens Christian Skou, som 40 år senere fik Nobel prisen for opdagelsen. Men selve den molekylære struktur er først for nyligt blevet bestemt af en gruppe forskere fra Århus. Natrium-kaliumpumpen er afgørende for funktionen og overlevelsen af alle vores celler og bruger cirka en fjerdedel af al den energi, vi bruger i hvile. Ingen celler fungerer uden natrium-kalium-pumpen. Hjernen bruger for eksempel pumpen rigtig meget, hvilket er en af de vigtigste grunde til, at hjernen er meget følsom overfor iltmangel. Det skyldes, at den aktive transport af ioner over cellemembranen kræver energi i form af såkaldt ATP (adenosin triphosfat), der er alle cellers vigtigste energikilde. Produktionen af ATP kræver ilt og i hjernen bruges det meste ATP til natrium-kalium-pumpen, så uden ilt, ingen ATP og så fungerer pumpen ikke og hjerneskader opstår. Fordi funktionen af natriumkalium-pumpen er så afgørende for alle celler, har det været højt på forskeres ønskeliste at udvikle medicin rettet mod netop den ionpumpe. Men uden at kende strukturen er det næsten umuligt. Bestemmelsen af den tredimensionale molekylære struktur har blandt andet betydet, at man i Århus har opdaget, at natrium-kalium-pumpen har en lille hale, der er med til at regulere ionpumpens funktion. Ved at klippe halen af har man fundet ud af, at pumpen uden hale har en nedsat evne til at binde natriumioner. Ved at lave molekyler, der efterligner eller hæmmer halens binding er der således opstået en mulighed for at udvikle medicin, der enten skruer op eller ned for ionpumpen. Strukturen af natrium-kalium pumpen vist med atomer som kugler (bortset fra brint ikke vist). Alfa-kæden, som har pumpefunktionen, er vist med blåt. Alfakæden danner et kompleks med en betakæde (orange) og gamma-kæde (rød). Et nyopdaget regulatorisk motiv er vist med grønt. Hele proteinet (inklusive brint) består af ca. 20.000 atomer. Cellemembranen, som pumpen er indlejret i, er vist som en gennemsigtig firkant. Ofte samles de krystallografiske data på internationale partikelaccelereringsanlæg (synkrotroner) som her på Swiss Light Source tæt ved Zürich.
12 Den rummelige struktur af komplement proteinet C5. Når immunsystemet genkender sygdomsfremkaldende bakterier, spaltes den røde C5a del fra den langt større C5b del (farvet blå), som derefter sammen med andre proteiner danner et hul i bakterierne og derved dræber disse. C5a delen binder til receptor proteiner på vores egne celler og forstærker herved immunforsvarets angreb på bakterierne. C5 proteinet måler ca. 14 nm på den lodrette led. Center for Strukturel Biologi Center for Strukturel Biologi (CSB) blev grundlagt af lektor Jens Nyborg i 2003 som et forskningscenter fi nancieret af Forskningsrådet for Natur og Univers (se også www.bioxray.au.dk). CSB repræsenterer mere end 30 års erfaring med strukturbestemmelse af makromolekyler og består af 8 uafhængige, men tæt samarbejdende forskergrupper ved Molekylærbiologisk Institut, Aarhus Universitet. Forskergrupperne bruger makromolekylær krystallografi som den primære metode i strukturbestemmelsen af proteiner og RNA. Udover krystallografi anvendes en lang række biofysiske, molekylærbiologiske, biokemiske og genetiske metoder til analyse af de mange forskellige biologiske områder, der forskes i. Til forsvar for cellen En atomar struktur giver en meget detaljeret viden om den molekylære overflade og dens egenskaber. Først og fremmest øger den vores forståelse af makromolekyler, deres funktion og indflydelse i celler. Hermed får vi også en øget forståelse af livet i hvert enkelt celle. Forståelsen af raske celler giver også en bedre forståelse af syge celler og skaber derfor et bedre grundlag for udvikling af specialiseret medicin. Kroppen selv er udstyret naturligt med mange mekanismer, som skal forsvare os mod sygdom. Et af disse forsvarssystemer er komplementsystemet, der findes i blodet som en del af vores immunforsvar. Komplementsystemet består af mere end 30 proteiner, der kan angribe bakterier og fjerne døde celler. En vigtig del af denne forsvarsmekanisme er proteinet kaldet komplement faktor 5, forkortet C5. Strukturen af C5 er for nyligt blevet bestemt ved hjælp af krystallografi og såkaldt småvinkelspredning med røntgenstråler (SAXS, efter small angle X-ray scattering ). SAXSmetoden tillader at måle på proteinet i en opløsning og derfor under betingelser, der er meget lig de fysiologiske. Den visuelle repræsentation af C5 bidrager til en langt bedre forståelse af komplementsystemets funktion. Resultatet har et klart anvendelsesorienteret perspektiv, da regulering af C5 med lægemidler med fordel kan bruges til sygdomsbehandling og ved organtransplantationer. Når C5 er aktiv spaltes det i to dele, C5a og C5b. C5a genkendes af receptorer, binder sig til dem, og giver signal ind i cellen, hvorefter cellerne forsvarer sig mod de indtrængende mikroorganismer. C5b dræber bakterierne ved at lave små huller i dem. Når folk for eksempel dør ved blodforgiftning, er en væsentlig faktor en overreaktion af C5a processen. Den vil man naturligvis gerne kunne forhindre. Når vi kender strukturen af C5, kan vi bedre forstå, hvordan man ved at binde andre molekyler til C5 kan forhindre, at proteinet kløves i to dele. Først når vi forstår de enkelte elementer i cellens liv, kan vi for alvor gå igang med at hjælpe og opretholde det. Cellens liv kan trues af infektioner, genetiske defekter og sygdomme. Gennem den strukturelle biologi lærer vi blandt andet, hvor og hvordan de forskellige angreb bliver sat ind. Det hjælper os til at sætte det rigtige forsvar op eller designe et nødvendigt modangreb. Om forfatterne Thomas Boesen er lektor, ph.d. Center for Kulhydratgenkendelse og -signallering (CARB) Molekylærbiologisk Institut Aarhus Universitet E-mail: thb@mb.au.dk Tlf.: 8942 5026 Rikke Schmidt Kjærgaard er project manager på grundforskningscenteret PUMPKIN og visiting post doctoral fellow på MRC Dunn, Cambridge University. E-mail: risk@bioxray.au.dk Tlf.: +44 1223 252790 Artiklen er baseret på interviews med professor Poul Nissen, lektor Gregers R. Andersen og lektor Søren S. Thirup, alle tilknyttede Center for Strukturel Biologi ved Aarhus Universitet. Se også www.bioxray.au.dk Videre læsning Fredslund, F. et al., Den rumlige opbygning af proteiner fra immunforsvaret, i dansk kemi, 89, nr. 9, 2008. Proteinfabrikkens hemmeligheder, Aktuel Naturvidenskab nr. 1-2002.