Humane embryonale stamcellers insulinproducerende

Elise Hoffmann Munk Nielsen STAMCELLER 649 Humane embryonale stamcellers insulinproducerende potentiale Samt terapeutiske kloningsmuligheder Dette er den første af 5 artikler, der gør status over de senere års resultater inden for human embryonal stamcelleforskning. Artiklerne beskriver først forskning inden for en specifik vævstype, dernæst gives et generelt perspektiv på det, såsom terapeutisk kloning, teratomdannelse, transplantatsafstødning og etiske problemstillinger. I denne artikel behandles dels udvikling af insulinproducerende celler og dels de store etiske problemer ved den af afstødningen foreslåede kloning. biografi: Forfatteren er turnuslæge. Hun har som lægestuderende i samarbejde med endokrinologisk afdeling på Odense Universitetshospital lavet et literaturstudie om de seneste års udvikling inden for stamcelleforskning. forfatters adresse: Nørrebrogade 164 A, 5. sal, 2200 København N. E-mail: eniel99@student.sdu.dk Forskning i udvikling af insulinproducerende celler til behandling af diabetes går i flere retninger. Der arbejdes med voksne, føtale og embryonale stamceller i udvikling af isolerede β-celler i pancreaslignende væv. Senest har man frembragt umodne ø-lignende klynger af insulin-, glukagon- og somatostatinproducerende celler fra humane embryonale stamceller. Endvidere forskes i brugen af terapeutisk kloning i forbindelse med stamceller. Debatten om stamceller er interessant netop nu, fordi stamceller og kloning udgør spydspidsen af fremtidens behandlingsmuligheder. Begrebet»regenerativ medicin«er en betegnelse for en fremtidig behandling af sygdomme, karakteriseret ved dysfunktion eller mangel på en bestemt type celler. Defekte eller manglende celler erstattes af nye celler, der evt. er genereret fra humane embryonale stamceller (hes). Diabetes er en metabolisk sygdom, hvor kroppen mangler insulins effekt på sukkeroptaget i cellerne. Diabetes type 1 forårsages af en autoimmun destruktion af β-cellerne i pancreas. Type 2-diabetes udvikles på grund af insulinresistens i cellerne førende til en øget insulinproduktion, der udtrætter β-cellernes produktion. Diabetes behandles i dag overvejende med substitution af insulin, men desuden har det øgede kendskab til immunapparatet muliggjort transplantation, en behandling som begrænses af mængden af donorvæv. Diabetes er altså en degenerativ sygdom på cellulært

650 plan, hvilket gør den til en mulig kandidat for behandling med regenerativ medicin. Ideen er, at stamceller kultiveres og dirigeres til insulinproducerende celler, der inden transplantation kan manipuleres til at undvige immunrejektion. Forskning i stamceller Det debatteres, hvorvidt det vil være mest hensigtsmæssigt via stamceller at generere et blandet pancreatisk væv bestående af alle de endogene celler, som findes in vivo, eller at udvinde isolerede β-celler. De forskellige endokrine kirtler i den færdigudviklede krop befinder sig i Langerhanske celle-øer og udgøres af β-celler, der producerer insulin, α-celler, der producerer glukagon, δ- celler, der producerer glukagon, og endelig pp-celler, der producerer pancreatisk polypeptid. Nogle forsøg peger angiveligt i retning af, at de endogene celler interagerer, hvorved der sker en finjustering af insulinsekretionen. Gennem en årrække er der blevet forsket i humane stamceller med forskelligt ophav. Man mener nu at kunne identificere voksne progenitorstamceller i føtalt væv. Disse celler har umiddelbart en bedre evne til at producere insulin end kultiverede celler, men det har vist sig vanskeligt at ekspandere kulturer af disse celler in vitro. Voksne stamceller fra kadavere er, via proliferationsgener manipuleret ind i deres eget DNA, blevet i stand til af proliferere, men cellerne mister herved evnen til at producere insulin. Andre forskere kan manipulere voksne stamceller til at udtrykke DNA-markøren PDX-1, der koder for et protein, som initierer transkriptionen af insulin. Hovedproblemet mht. voksne stamceller i denne forbindelse er balancen mellem proliferation og differentiering. De celler, der prolifererer, kan ikke danne insulin, og de celler, der producerer insulin, kan ikke proliferere. Andre forskere arbejder med at tage biopsier fra voksne levende patienters pancreas, for herefter at ekspandere disse celler til kulturer indeholdende alle de endokrine celler, der normalt findes i pancreas. Det er vist, at disse celler kan producere insulin afhængigt af den omgivende sukkerkoncentration, men man kan endnu ikke etablere langtidslevende cellelinjer. Det er endvidere værd at bemærke, at ekspanderede celler kultiveret på baggrund af celler, der allerede har vist sig genetisk defekte, kan være problematisk (1). Forskning i embryonale stamceller Man ved i dag, at nogle procent af de celler, der findes i en embryoid body udviklet fra embryonale stamceller, spontant har uddifferentieret sig til celler, der kan producere insulin samt udtrykke markørerne glut-2 og glukokinase. Glut-2 er et glukosetransportprotein, der medierer insulinuafhængigt glukoseoptag i leveren. Glukokinase et det enzym, der katalyserer omdannelsen af glukose til glukose 6-fosfat. Også transkriptionsfaktoren, PDX-1,

651 der initierer transkription af insulingenet, kan identificeres efter, at de embryonale stamceller spontant har dannet embryoide bodies. Tilsvarende udtrykker disse celler Ngn3, en transkriptionsfaktor, der er med i reguleringen af den endokrine celles differentiering. Interessant men også forventeligt er det, at ekspressionen af transkriptionsfaktoren Oct4, som er karakteristisk for udifferentierede celler, falder i takt med specialiseringen af cellerne (2). Behandling af den embryoide body med forskellige vækstfaktorer, heriblandt nervevækstfaktor og basisk fibroblast-vækstfaktor (bfgf), har muligvis positiv indflydelse på formationen af celler, der udtrykker disse gener, og spiller altså en afgørende rolle for udviklingen af β-celler. Forskning i at dirigere differentieringen af humane embryonale stamceller til insulinproducerende celler går i flere retninger. En metode går ud på at sætte noget af genet, der koder for insulin, kombineret med et gen, der medfører antibiotikaresistens, ind i hes-celler. Disse kulturer får herefter lov at vokse under tilstedeværelse af antibiotika. De eneste celler, som overlever og udvikler sig i dette medie, er dem, der indeholder kombinationsgenet. Fra denne kultur dannes flere subkloner, som dyrkes videre under forskellige vækstbetingelser (1). Cellernes produktion af insulin viser sig at være afhængig af sukkerkoncentrationen i mediet. Man transplanterer forsøgsvis Stamcellekarakteristika Betegnelsen»stamcelle«bruges om celler med forskellig oprindelse og egenskaber. I vekslende grad er følgende dog fælles for alle typer af stamceller: Stamceller er udifferentierede celler, hvorfor de udtrykker markører, som er karakteristiske for udifferentierede celler (SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81), men ikke udtrykker markører specifikke for differentierede væv. Stamceller kan proliferere. Når en stamcelle deler sig, dannes to ens datterceller. Stamceller evner i modsætning til andre celler at forny sig selv kontinuerligt. Disse celler bevares i kraft af høj telomerase- og OCT- 4-ekspression således som en udødelig celle i kroppen. Telomerase er et enzym der sætter telomerer på kromosomerne således at disse kan replikere sig selv. OCT-4 er en transkriptionsfaktor for udifferentieret væv. Stamceller kan differentiere, dvs. udvikles til en af kroppens specialiserede celler. Embryonale stamceller udviser pluripotens, hvilket vil sige, at de kan udvikle celler fra ethvert af de tre kimlag: endoderm, mesoderm eller ektoderm. Voksne stamceller benævnes derimod totipotente, da de er prædestinerede til kun at kunne uddifferentiere til specialiserede celler med karakteristika og funktion svarende til det væv, de befinder sig i. Megen forskning retter sig mod voksne stamcellers plasticitet, dvs. mulighed for under manipulation at udvikle sig til andre celler end det, de oprindeligt har anlæg for (1). Boks 1. disse celler ind i immundefekte diabetiske mus, hvorefter man håber, at cellerne kan reducere eller måske helt fjerne diabetessygdommen. Netop i forbindelse med transplantation er det af stor betydning, at man via antibiotikavækstmediet sikrer, at kun de

652 Humane embryonale stamceller hes klumper sammen og danner embryoid body (EB). Embryoid body plantes i DMEMmedie hvilket medfører vækst af nestinproducerende celler. Tilsætning af vækstfaktor (bgfg) og dyrkning i specialmedie bevirker dannelse af ø-klaser. Glukosekoncentrationen sænkes hvilket øger insulinekspressionen. bfgf trækkes ud, nikotinamid tilsættes. Dissociering af celler og dyrkning i suspension øger insulinekspression og forlænger levetid for cellerne. PCR og immunfluorescensundersøgelser afslører umodne endokrine pancreasceller der producerer glukagon eller somatostatin. Cellernes insulinsekretion er mindre afhængig af glukosekoncentrationen end modne cellers. EB N2, B27 og bfgf bgfg Nikotinamid DMEM-medie Nestinproducerende celler Ø-klaser af celler [Glukose] sænkes => øget insulinekspression Dissociering af cellerne Cellerne undersøges med PCR og immunfluorescens Dyrkning i suspension => øget insulin + levetid Fig. 1. Insulinproducerende celler. differentierede celler forbliver i kulturen og senere transplanteres. Udifferen tierede celler kan alternativt udvikles til tumorer. En anden forskningsretning inden for diabetes og hes-celler går imod at udvikle cellekulturer, der udviser alle de egenskaber, som in vivo-pancreasvæv gør. Forskere arbejder med over flere trin at udvikle umodne ø-lignende klynger af insulin-, glukagon- og somatostatinproducerende celler. Når embryoide stamceller får lov at klumpe sammen, dannes embryoide bodies. Herfra selekteres celler, der udtrykker nestin, en markør for nerveceller. Via vækst i forskellige medier håber man at kunne udvikle hes-celler til væv med egenskaber svarende til alle pancreas endokrine funktioner (1). I et forskningsprojekt fra 2004 forbedrer man således protokoller, der følger ovenfor beskrevne metode. Humane embryonale stamceller får indledningsvis lov at klumpe sammen i et suspensionsmedie og danne embryoide bodies. Disse plantes nu i et insulin-, transferrin-, selenium- og glutaminholdigt medie (DMEM), som angiveligt skulle berige de celler, der udtrykker nestin. Mediet suppleres med N2, B27 og bfgf, som tidligere er vist at have positiv indflydelse på dannelsen af ø-klaser ud fra embryoide bodies. N2 og B27 er betegnelser for medier, der bl.a. indeholder insulin, transferrin, progesteron og putrascine selenite. Tredje trin er at sænke glukosekoncentrationen, trække bfgf ud af mediet og erstatte med nikotinamid. Afslutningsvis dissocieres cellerne og dyrkes videre i et suspensionsmedie (Fig. 1 ). Via PCR-teknik påviste man, at celler i den endelige kultur i deres DNA kodede for insulin, proinsulin samt enzymerne PC1/3 og PC2, der er med i omdannelsen af proinsulin til insulin. Yderligere blev det påvist, at delelementer til K-kanalen også

653 Fig. 2. Mikroskopibillede af umodne pancreaslignende celler fremdyrket fra hes, cellerne er immunfluorescensmærkede, A er C-peptidmærket, C-peptid fraspaltes proinsulin når denne bliver til insulin. D er somatostatinmærket. G er glukagonmærket. B, E og H er alle insulinmærkede. C er mærket for både insulin og C-peptid, F er mærket for insulin og somatostatin. I er mærket for insulin og glukagon. (Billedet er venligst udlånt af Alphamed Press). blev transkriberet ud fra cellernes gener. Også GLUT2 og glukokinase, der er vigtige elementer i insulinproducerende cellers signaltransduktion, kunne spores ved PCR. Endelig præsterede cellerne også at syntetisere en række transkriptionsfaktorer. Ved immunfluorcensundersøgelser bekræftede man, at disse celler producerer både insulin og glukagon eller somatostatin, hvilket indikerer, at de fremdyrkede celler er umodne endokrine pancreasceller (Fig. 2). Denne formodning bekræftes af, at cellernes insulinsekretion viste sig at være mindre afhængig af glukosekoncentrationen og tilsætning af antagonister end først antaget. Dette forsøg er en forbedring i forhold til tidligere forsøg, dels pga. sænkningen af glukosekoncentrationen, hvilket medfører øget insulinekspression, dels pga. afsluttende dyrkning i suspension. Denne dyrkningsmetode medfører aggregation af cellerne, som ser ud til at øge insulinekspressionen samt forlænge cellernes levetid (3). Den her beskrevne udvikling af umodne ø-lignende klynger af insulin-, glukagon- og somatostatinproducerende celler, er altså en forbedring af en teknik, man har arbejdet med i flere år. Den videre forskning er rettet mod forbedringer af eksisterende protokoller, således at det bliver muligt at udvinde modne β-celler til transplantation. Herefter må det udforskes, hvorvidt cellerne bliver i stand til at regulere sukkerkoncentrationen i patienters blod. Fremtidens forskning må endvidere klarlægge, hvorledes sådanne celler interagerer med patientens eget væv efter en eventuel transplantation. Nogle forskere mener, at celler udviklet in vitro fra hesceller vil have mindre tendens til at aktivere immunsystemet end færdige organer fra et andet individ. Man håbede tidligere, at

654 stamcellerne ville være privilegerede i forhold til immunsystemet ved ikke at udtrykke HLA-vævstypeproteinerne på deres overflade, men nyere studier hævder at have dokumenteret udtryk af sådanne proteiner, om end i små mængder (4). Der bliver derfor nødvendigt i forbindelse med fremtidig transplantering af insulinproducerende stamceller at kunne imødegå afstødningsproblematikken på andre måder end de på nuværende tidspunkt mulige. Løsningen på denne problematik kan være terapeutisk kloning en løsning der dog rummer både tekniske og etiske problemstillinger. Terapeutisk kloning Begrebet kloning bruges almindeligvis om frembringelse af genetisk identiske individer eller celler ved ukønnet formering. Rent medicinsk kan man skelne mellem kloning ved kernetransplantation, svarende til definitionen ovenfor, og kloning ved embryodeling. Kloning ved embryodeling betegner den intrauterine deling, nogle æg naturligt undergår, hvorved fosteranlægget bliver til enæggede tvillinger. Terapeutisk kloning er den potentielle mulighed, der ligger i at udnytte kloning ved kernetransplantation kombineret med stamceller, til at generere væv, som kan benyttes i behandling af forskellige sygdomme heriblandt pancreasvæv til diabetikere. Oocytten råder i sig selv over alle de egenskaber, der skal til for at danne en blastocyt, hvis blot den tilføres genetisk information i form af DNA, hvilket normalt sker ved befrugtning med et spermie. Ved kloning fjernes oocyttens eget DNA ved mikrokirurgi, og nyt DNA fra en donorcelle inkorporeres på tilsvarende vis, hvorved dannelsen af et præembryon igangsættes. Rent praktisk er der en del problemer med blastocytter deriveret på denne måde: de implanteres dårligt, aborteres tit, og de dannede dyr har ofte øget sygdomshyppighed i forhold til andre dyr. Desforuden er der en del etiske problemstillinger i forbindelse med kloning. Terapeutisk kloning benytter sig af tilsvarende metoder, men genererer celler til transplantation. Således kan man ud fra stamceller generere væv, som genetisk set er ens med en given patients egne celler. Væv deriveret fra sådanne stamceller vil således være forlignelige med patientens eget væv, hvorfor immunsupprimerende behandling efter transplantering i teorien overflødiggøres (Fig. 3) (5). Terapeutisk kloning reproduktiv kloning Terapeutisk kloning og regenerativ kloning er i teknisk øjemed næsten det samme. Forskellen består i, at hvor terapeutisk kloning genererer væv, genererer reproduktiv kloning»kopier«af individer. Regenerativ kloning skræmmer os, måske fordi vi føler os truet på vores individualitet. Det kan

655 Patientens DNA isoleres fra en somatisk celle. Doneret oocyts DNA fjernes ved mikrokirurgi. DNA fra donorcelle inkorporeres. Donorcellens kromatin og oocyttens cytoplasma skal være i samme fase af cellecyklus. 2. meiotiske deling fuldføres, hvilket medfører præembryonets dannelse. Udvikling til en blastocyt hvorfra den indre cellemasse kan isoleres. hes-cellerne dyrkes og differentieres til den ønskede celletype. Cellerne transplanteres til patienten og erstatter de dysfunktionelle celler. Hvorfra DNA isoleres DNA Somatisk cellekultur Oocyt Mikrokirurgi Oocyt uden arvemateriale DNA Embryonal stamcelle-kultur Transplanteres til patient Indre cellemasse + Fusioneret cellekerne og oocyt Blastocyt Resten af blastocytten benyttes ikke Fig. 3. Terapeutisk kloning. diskuteres, hvorvidt en sådan intuitiv afvisning er rimelig. Terapeutisk kloning med sit store behandlingspotentiale er vi umiddelbart mere modtagelige for. Er det muligt at tillade en teknik, nemlig kloning, til et forskningsbrug, men ikke til et andet? Forskning i dette ene felt vil medføre øgede kundskaber inden for kloning; kundskaber, der vil medføre nye lokkende muligheder inden for andre felter. Vil en tilladelse til terapeutisk kloning medføre behov/krav om yderligere tilladelser senere? Hvor og hvordan sætter vi grænsen, og er der overhovedet mulighed for at styre denne glidebaneeffekt? det etiske råd er splittet i denne stillingtagen Nogle af rådets medlemmer mener, at det menneskelige embryon har en moralsk status, der ikke tillader nogen form for forskning med dette. De fremhæver endvidere, at det må betragtes som værende usandsynligt at kunne tillade terapeutisk kloning, uden senere at blive tvunget til også at tillade reproduktiv kloning. Andre medlemmer vurderer, at stamceller fra embryoner principielt kan anvendes i forskning, men at der endnu ikke er behov for at frembringe dem via in vitro-fertilisering eller via kloning, fordi forskningen kan udføres på tiloversblevne befrugtede æg frembragt med henblik på in vitro-fertilisering. Der argumenteres for, at eksempelvis embryonets optagelse i livmoderen samt andre udviklingstrin har væsentlig betydning for embryonets udvikling. Man mener ikke, at embryonet har krav på helt samme beskyttelse som et barn. Yderligere vurderer disse medlemmer, at det vil være muligt også i fremtiden at opretholde en lovmæssig skelnen mellem terapeutisk og reproduktiv kloning.

656 En sidste gruppe mener, at terapeutisk kloning i forbindelse med forskning i stamceller er etisk acceptabelt. I Danmark er det i dag tilladt at forske med op til 14 dage gamle embryoner fra in vitro-fertiliserede æg. Den sidstnævnte gruppe af medlemmer af Det Etiske Råd mener, at man også bør tillade klonfremstilling af embryoner til denne forskning (6, 7). Debat synes at udspille sig mellem to forskellige paradigmer: et videnskabeligt og et mere humanistisk, hvilket også i andre sammenhænge lader til at medføre vanskeligheder. Hvem skal forklare og forsvare forskellige holdninger, når der sættes spørgsmålstegn ved samfundsrelaterede etiske problemstillinger? På den ene side kræver forskerne og videnskaben retten på deres side, fordi udviklingen vil kunne rede liv, eller som det er tilfældet med diabetes: bedre livet for en meget stor gruppe mennesker. Jeg mener ikke, at argumentet»vi skal sidde med ved bordet«for at få indflydelse på resultaterne og del i evt. fordele, forholder sig alvorligt til de væsentlige og grundlæggende etiske overvejelser, som er nødvendige. Modsat kan det synes rigidt og destruktivt for debatten at forholde sig alt for urokkeligt til de normer og værdier, vores samfund bygger på. Et frit samfund bestående af selvstændigt tænkende individer er for alvor truet på sin eksistens og udvikling, hvis vi opfatter dets værdier som noget eviggyldigt og helligt, som går i stykker af at blive revurderet gennem diskussion. Interesskonflikter: ingen angivet. litteratur 1. Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001: Kapitel 7. 2. Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldo J, Skorecki KL, Tzukermann M. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 2001; 50: 1691 7. 3. Segev H, Fishman B, Ziskind A, Shulman M, Itskovitz-Eldor J. Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cells 2004; 22: 265 74. 4. Vogel G. Stem cells not so stealthy after all. Science 2002; 297(5579): 175 7. 5. Sunde A, Eftedal I. Embryonale stamceller og terapeutisk kloning. Tidsskr Nor Lægeforen 2001; 121: 2407 12. 6. Kloning udtalelser fra Det Etiske Råd og Det Dyreetiske Råd. Det Etiske Råd, 2001. 7. Menneskeligt livs begyndelse og fosteranlæggets etiske status. Et debatoplæg. Det Etiske Råd, 2003.