TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Til detektering af 7 mutationer i K-RAS-genet

TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Til detektering af 7 mutationer i K-RAS-genet Til brug i Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (Katalognr. 05015278001) Og Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (Varenummer: 4351105) Inkluderer brugermanual til LightCycler Adapt Software v1.1 fra Roche Diagnostics (katalognr. 05474914001) til TheraScreen : K-RAS Mutation Kit CE-IVD Brugsvejledning Produktkoder Kitstørrelse DxS-produktkode Roche Diagnostics bestillingsnummer 20 reaktioner KR-21 05366216190 80 reaktioner KR-22 05366224190 Instruktionsversion: DU001g Revisionsdato: maj 2009 Opbevares ved -18 C til -25 C Side 1 af 38

Indhold 1. Tilsigtet brug / brugsindikationer...3 2. Opsummering og forklaring af testen...3 3. Teknologiske principper...4 4. Reagenser...6 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER...7 6. Opbevaringsforhold, stabilitet og forsendelsesbetingelser...8 7. Instrument...9 8. Prøver...9 9. K-RAS Mutationsdetekteringsprotokol... 13 10. Procedurebegrænsninger... 25 11. Karakteristika for analyseydelse... 26 12. Teknisk assistance... 34 13. Fabrikant- og distributørinformation... 35 14. Dato for udstedelse af seneste revision... 35 15. Referencer... 36 Information til køber:... 38 Side 2 af 38

VIGTIGT: Læs disse instruktioner grundigt igennem, og blive bekendt med alle K-RAS-kittets komponenter, inden udstyret tages i brug. 1. Tilsigtet brug / brugsindikationer Tilsigtet brug DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (K-RAS-kit) er en in vitro diagnostisk test, der er beregnet til påvisning af syv somatiske mutationer i K-RASonkogenet, og som vil give en kvalitativ vurdering af mutationsstatus. K-RAS-kittet skal anvendes af uddannet laboratoriepersonale i et professionelt laboratoriemiljø med DNA-prøver, der er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejret colorektalvæv. Brugsindikationer Resultaterne af K-RAS-kittet er beregnet til at hjælpe lægen med at identificere patienter med colorektal cancer, som måske ikke vil have gavn af behandling med antiepidermal vækstfaktor (EGFR) som panitumumab eller cetuximab. K-RAS-kittet er ikke beregnet til diagnosticering af colorektal cancer. Det er beregnet som et supplement til andre relevante prognostiske faktorer, der anvendes til udvælgelse af egnede patienter til behandling med anti-egfr behandlinger, baseret på patientens mutationsstatus. Patientens mutationsstatus vil sammen med andre sygdomsfaktorer blive vurderet af en kliniker for at træffe beslutning om behandling. Der bør ikke træffes nogen behandlingsbeslutninger for cancerpatienter, der alene er baseret på K-RAS-mutationsstatus. 2. Opsummering og forklaring af testen KRAS-kittet er CE-mærket diagnostisk udstyr i overensstemmelse med EU s Direktiv 98/79/EC om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik. Mutationer i K-RAS-onkogenet findes hyppigt ved human cancer (1-4). Tilstedeværelsen af disse mutationer falder sammen med en manglende respons på visse cancerbehandlinger med EGFR-hæmmere hos patienter med metastatisk colorektal cancer (5-10) (14-21). Det er muligt at detektere syv mutationer i K-RAS-genet i en baggrund af vildtype genomisk DNA i en real-time PCR-analyse, baseret på DxS Scorpions -teknologi. Denne metode er meget selektiv. Forudsat at der er tilstrækkelige kopier af DNA, er det muligt at påvise cirka 1% mutant i en baggrund af vildtype genomisk DNA. K-RAS-kittet påviser syv K-RAS-mutationer i codon 12 og 13 af K-RASonkogenet som vist i Tabel 1 nedenfor. Side 3 af 38

Tabel 1: K-RAS-mutationer påvist med DxS-kittet Kosmisk ID stammer fra Catalogue of Somatic Mutations in Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ Mutation Basisændring Kosmisk ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532 3. Teknologiske principper K-RAS-kittet kombinerer to teknologier, ARMS og Scorpions (11, 12, 13), til detektering af mutationer i real-time PCR-analyser. ARMS Allele- eller mutationsspecifik forstærkning opnås ved ARMS. Taq DNApolymerase er ekstremt effektiv til at skelne mellem en match og en fejlmatch i 3 -enden af en PCR-primer. Specifikke muterede sekvenser kan forstærkes selektivt, selv i prøver hvor størsteparten af sekvenserne ikke bærer mutationen som: Når primeren er fuldstændig matchet, fortsætter forstærkningen med fuld effektivitet. Når 3 -basen ikke er matchet, forekommer der kun baggrundsforstærkning på et lavt niveau. Scorpions Påvisning af forstærkning udføres med Scorpions. Scorpions er bifunktionelle molekyler, der indeholder en PCR-primer, der er kovalent kædet til en probe. Fluoroforen i proben reagerer med en quencher, der også er indeholdt i proben, hvilket reducerer fluorescensen. Under en PCR-reaktion, når proben binder sig til amplikonen, bliver fluoroforen og quencheren adskilt. Det fører til en forøget fluorescens i reaktionsrøret. Dataanalyse: Ct-metode Scorpions real time-analyser anvender det antal PCR-cyklusser, der er nødvendige for at påvise et fluorescerende signal over et baggrundssignal som mål for, hvor mange mål-molekyler der er til stede ved starten af reaktionen. Det punkt, hvorved signalet detekteres over baggrundsfluorescensen, kaldes for Cyklus-tærskelværdien (Ct). Prøvens Ct-værdier kalkuleres som forskellen mellem mutationsanalyse- Ct og kontrolanalyse-ct fra den samme prøve. Side 4 af 38

Prøverne klassificeres som mutationspositive, hvis de giver en Ct, som er lavere end 1% Ct-værdien for den analyse. Over denne værdi kan prøven enten indeholde mindre end 1% mutation (ud over analysens grænser), eller den er mutationsnegativ. Ved brug af ARMS-primere kan der forekomme en vis ineffektiv priming, hvilket giver en meget sen baggrunds-ct fra DNA, der ikke indeholder mutationen. Alle Ct-værdier, der kalkuleres fra baggrundsforstærkning, vil være højere end 1% Ct-værdierne, og prøven vil blive klassificeret mutationsnegativ. K-RAS-kittet er CE-mærket til in vitro-diagnostisk brug på enten Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler 480 Instrument) 96 brøndformat, Roche varenummer: 05015278001 eller Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System, varenummer 4351105 (ABI7500). For LightCycler 480 Instrumentet skal K-RAS-kittet anvendes sammen med LightCycler Adapt Software v1.1 til TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Denne software er udviklet til at automatisere bestemmelse af et positivt eller negativt forstærkningsplot og beregner en passende tærskel, hvorfra der skal hentes Ct-værdier. De anvendes til at beregne prøvens Ct-værdier, som sammenlignes med 1% cut-off-værdierne. Softwaren rapporterer et positivt eller negativt mutationsresultat og fjerner eventuel subjektivitet fra analysen og fortolkningen af K-RAS-kittets data. K-RAS-kittets format Der leveres otte analyser med K-RAS-kittet. En kontrolanalyse Syv mutationsanalyser Alle reaktionsblandinger indeholder en exogen kontrolanalyse (intern kontrol) mærket med HEX (til detektering af JOE-detektoren på ABI7500). Den kontrollerer tilstedeværelse af hæmmere, der kan medføre falsknegative resultater. Kontrolanalyse Kontrolanalysen, der er mærket med FAM, anvendes til vurdering af den totale DNA i prøven. Kontrolanalysen forstærker en region af exon 4 af K-RAS-genet. Primere og probe er designet, så alle kendte K-RAS-polymorfismer undgås. Mutationsanalyser Hver mutationsanalyse, der er mærket med FAM, indeholder en Scorpion plus en ARMS-primer for at skelne mellem vildtype-dna og den mutante DNA, der detekteres af en real-time PCR-analyse. Side 5 af 38

4. Reagenser Dette K-RAS-kit indeholder reagenser nok til udførelse af kvalitetsvurdering af prøver og køre KRAS-analyser til op til 20 eller 80 reaktioner, afhængig af kittets størrelser. Kitstørrelse DxS produktkode Roche Diagnostics ordrenummer 20 reaktioner KR-21 05366216190 80 reaktioner KR-22 05366224190 Antallet af prøver, som kan testes, afhænger af prøvernes batchstørrelse. Tabel 2: K-RAS-kittets indhold Leverede reagenser 20 reaktioner 80 reaktioner Rør Volumen Volumen Kontrolreaktionsblanding 1300 µl 5200 µl 1 12ALA reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 2 12ASP reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 3 12ARG reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 4 12CYS reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 5 12SER reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 6 12VAL reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 7 13ASP reaktionsblanding 650 µl 2600 µl 8 Blandingsstandard 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA-polymerase 60 µl 240 µl 10 Udstyr og reagenser, der ikke leveres med K-RAS-kittet Brugeren skal have følgende udstyr og forbrugsstoffer: LightCycler 480 Instrument eller ABI7500 Real-time PCR Machine, som kan foretage cycling som defineret i afsnit 9; K-RAS Mutation Detection Protocol. LightCycler Adapt Software v1.1 fra Roche Diagnostics (Katalognr. 05474914001). 0,2 ml DNAse-fri PCR-plader (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96, katalognummer 04729692 001 eller ABI MicroAmp Optical 96-brønd reaktionsplade, varenummer 4306737 med MicroAmp Optical Adhesive Film, varenummer 4311971). Sterile rør til forberedelse af masterblandinger. Dedikerede pipetter til klargøring af PCR-blanding. Dedikerede pipetter til dispensering af DNA-skabelon. Sterilt, nuklease-frit H 2 0. Side 6 af 38

5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro-diagnostisk brug. K-RAS-kittet er ikke beregnet til screening for, eller diagnosticering af, nogen som helst form for cancer, herunder colorektal cancer. Det er beregnet til anvendelse som et supplement til andre prognostiske faktorer, der aktuelt anvendes til udvælgelse af patienter, som ikke ville have gavn af anti-egfr cancerbehandling. Behandling af cancerpatienter bør ikke alene baseres på K-RASgenmutationsstatus. En kliniker bør vurdere mutationsstatus for patienten sammen med andre sygdomsfaktorer. K-RAS-kittets indhold kan nedfryses og optøs op til 8 gange uden negativ indvirkning på analysens ydeevne. K-RAS-kittets reagenser MÅ IKKE nedfryses og optøs mere end 8 gange. Bemærk, at tumorprøver er uhomogene, og data fra en tumorprøve muligvis ikke vil være samstemmende med data fra andre præparater fra den samme tumor. Tumorprøver kan også indeholde ikketumorvæv. DNA fra ikke-tumorvæv forventes ikke at indeholde de K-RAS-mutationer, der detekteres af K-RAS-kittet. Alle analyser i K-RAS-kittet genererer korte PCR-produkter. K-RASkittet fungerer imidlertid ikke på meget fragmenteret DNA. DNA-bedømmelser skal baseres på PCR og kan afvige fra kvantificering baseret på optiske densitetsaflæsninger. Der leveres yderligere kontrolreaktionsblanding for at gøre det muligt at vurdere kvalitet og kvantitet af DNA i prøver før kørsel med K-RAS-kittet. Reagenser til K-RAS-kittet er fortyndet optimalt. Yderligere fortynding af reagenserne anbefales ikke og vil medføre tab af ydelse. Brug af mindre end 25 µl reaktionsvolumen anbefales ikke og vil øge risikoen for falsk-negative resultater. Alle reagenser i K-RAS-kittet er formuleret specifikt til brug sammen med de angivne test. Reagenserne i K-RAS-kittet bør ikke erstattes, hvis den optimale ydelse skal bevares. For at sikre optimal aktivitet og ydelse bør Scorpions-primere (som det er tilfældet med alle fluorescens-mærkede molekyler) beskyttes mod lys for at undgå fotoblegning. Udvis ekstrem forsigtighed for at forhindre forurening af PCRreaktioner med syntetisk kontrolmateriale. Det anbefales, at der anvendes separate, dedikerede pipetter til opsætning af reaktionsblandinger og tilføjelse af DNA-skabelon. Klargøring og dispensering af reaktionsblandinger bør udføres i et område, som er adskilt fra skabelontilføjelsen. Rør bør aldrig åbnes efter en PCR-reaktion. Side 7 af 38

De enkelte analyser i K-RAS-kittet har deres egne unikke karakteristika. Beregning af resultatet skal ske med reference til de korrekte analyseparametre (se afsnittet om fortolkning af rapport/data). Mutations-Ct-værdier på 38 eller derover skal scores som negative eller som liggende under kittets grænser. Analyserne indeholder en exogen kontrolreaktion (intern kontrol) ud over reaktionen af interesse (se afsnittet Teknologiske principper). Hvis begge analyser mislykkes, skal dataene kasseres, da der kan være hæmmere til stede, som kan medføre falsk-negative resultater. Fortynding af prøven kan mindske hæmmernes effekt, men det bør bemærkes, at dette også vil nedfortynde DNA'et. Almindelige laboratorieforholdsregler skal overholdes, herunder men ikke begrænset til: a) Der må ikke pipetteres med munden b) Der må hverken ryges, spises eller drikkes på områder, hvor prøver og kittets reagenser håndteres c) Vask hænderne grundigt, efter at testen er udført Anvend kun den Taq-polymerase (Taq), som leveres med kittet. Taq må ikke erstattes med andre kit af den samme eller en anden type eller med Taq fra en anden leverandør. Optø kun de reagenser, der skal bruges til hver enkelt kørsel. Undgå at optø hele kittet hver gang for at minimere antallet af nedfrysninger/ optøninger. Sikkerhedsinformation Forsigtig: Alle kemikalier og alt biologisk materiale skal betragtes som potentielt farligt. Prøver er potentielt infektiøse og skal behandles i overensstemmelse hermed. K-RAS-kittet bør kun anvendes af personer, der har fået undervisning i passende laboratorieteknikker. Ved arbejde med komponenterne i dette K-RAS-kit skal der altid bruges egnet laboratoriekittel, engangshandsker og sikkerhedsbriller. Efter brug skal K-RAS-kittets komponenter bortskaffes som klinisk affald. 6. Opbevaringsforhold, stabilitet og forsendelsesbetingelser Opbevaringsforhold Alt indhold i K-RAS-kittet skal umiddelbart efter modtagelsen opbevares mørkt ved en temperatur på mellem -18 C og -25 C i en fryser med konstant temperatur. Undgå unødvendig nedfrysning/optøning af K-RASkittets indhold. Side 8 af 38

Stabilitet Anvend ikke K-RAS-kittet efter den angivne udløbsdato. K-RAS-kittets indhold er stabilt indtil udløbsdatoen, hvis det opbevares under de anbefalede forhold og i den originale emballage. K-RAS-kittets indhold kan nedfryses og optøs op til 8 gange uden negativ indvirkning på analysens ydeevne. K-RAS-kittets reagenser MÅ IKKE nedfryses og optøs mere end 8 gange. Forsendelsesbetingelser Indholdet af K-RAS-kittet transporteres på tøris og bør stadig være frosset ved levering. Hvis K-RAS-kittet ikke er i frosset ved levering, hvis den ydre emballage har været åbnet under transporten, hvis forsendelsen ikke indeholder en følgeseddel, brugsanvisning eller reagenserne, bedes du kontakte det lokale Roche Diagnostics-kontor. Se afsnit 12, Teknisk assistance, for kontaktdetaljer. 7. Instrument Der henvises til instrumentets brugermanual for fuld vejledning om installation og brug af real-time PCR-instrumentet. 8. Prøver Prøvemateriale skal være humant genomisk DNA, ekstraheret fra formalinfikserede, paraffinindlejrede colorektale tumorprøver. Prøveindsamling og klargøring 1. Transport af prøver: Standard patologisk metodik for at sikre prøvernes kvalitet. 2. Anbefalet proces til ekstrahering af prøver: DNA-ekstrahering med Qiagen QIAamp DNA FFPE-vævskit (katalognummer 56404). Følgende ændringer til Qiagen-protokollen skal benyttes: FFPE-præparater skal indsamles på objektglas. Overskydende paraffin skal skrabes bort rundt om vævsprøverne med en frisk, steril skalpel. Skrab vævspræparatet ind i mikro-centrifugeringsrør med en frisk skalpel for hver prøve, der ekstraheres. Proteinase K-fordøjelse skal fortsættes til afslutning. Det kan tage op til 48 timer. Prøverne skal elueres i 200 µl ATE-buffer fra Qiagenekstraheringskit. Eventuelle alternative metoder til klargøring af prøver skal valideres af slutbrugeren. Side 9 af 38

3. Opbevaring af ekstraheret DNA: Opbevares ved -20 C før analysering. Prøvevurderingsprotokol Den ekstra kontrolanalyseblanding, der leveres med K-RAS-kittet, skal anvendes til vurdering af den totale DNA i prøven. Denne kontrolanalyse forstærker en region af exon 4 af K-RAS-genet. Prøver bør kun sættes op med kontrolanalysen med den blandede standard som en positiv kontrol og vand som ikke-skabelon-kontrol. Bemærk, at prøver skal være samlede i batch for at opnå den optimale anvendelse af reagenser i K-RAS-kittet. Alle prøvekørsler skal indeholde kontroller. Hvis prøver testes individuelt, bruger det flere reagenser og reducerer antallet af prøver, som kan testes med K-RAS-kittet. Opsætningen af protokolplade til prøvevurdering 1. Optø kontrolreaktionsblandingen og den blandede standard fra K-RASkittet. Bland hver opløsning efter optøning ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokaliserede saltkoncentrationer. Klargør tilstrækkelige blandingsmængder til DNA-prøverne, én blandet standardreaktion og én kontrolreaktion uden skabelon samt 2 ekstra reaktioner. 2. Masterblandingen klargøres ved at benytte den mængde reagenser pr. reaktion, som er opgivet i Tabel 3. Tabel 3: Masterblandingsmængder til kontrolanalyse Analyse Masterblanding Reaktionsblanding Taq (µl)x1 (µ)x1 Kontrolanalyse 19,8 0,2 3. Taq og andre reaktionsblandinger, der indeholder Taq, MÅ IKKE vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. 4. Kontrollér, at Taq har stuetemperatur før brug. Centrifugér hætteglasset for at sikre, at alt Taq er samlet i bunden af hætteglasset, og pipettér derefter ved at placere pipettens spids lige under overfladen af Taq, for at minimere risikoen for, at spidsen bliver dækket af overskydende Taq. 5. Bland masterblandingen ved at pipettere forsigtigt op og ned. 6. Tilsæt straks 20 µl af kontrol-masterblandingen i hver reaktionsbrønd. 7. Tilføj straks 5 µl af prøven, blandet standard eller vand (til kontrollerne uden skabelon) til reaktionsbrøndene. 8. Pladen skal være sat op med den blandede standard tilsat brønd A1 og ingen skabelonkontrol (vand) tilsat A2. Alle andre brønde i brug skal indeholde prøverne. Side 10 af 38

9. Forsegl og centrifugér PCR-pladen kortvarigt for at samle reagenserne i bunden af brøndene. 10. Følg instrumentopsætningen for den relevante platform. Prøvevurderingsprotokol Opsætning LightCycler 480 Instrument 1. Placer straks pladen i LightCycler 480 Instrument. 2. Vælg ikonen for LightCycler 480 Software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Log på softwaren, og vælg fra skærmbilledet Overview New Experiment from Template. Vælg K-RAS LC480II Run Template fra de opførte kørselsskabeloner. Denne skabelon har følgende parametre: 1. Detekteringsformat er DxS IVD Assays. 2. Reaktionsvolumen er 25. 3. Et indledende holdetrin på 95 C i 4 minutter. 4. En 2-trins forstærkning for 45 cyklusser med en denaturering på 95 C i 30 sekunder og anneale ved 60 C i 1 minut. Fluorescensdetektion er en enkelt detektion ved 60 C-trinnet. 3. Vælg fanen Sample Editor, og vælg afkrydsningsfeltet Abs Quant under Step 1: Select Workflow. Kontrollér, at begge filtre er valgt (465-510 nm og 533-580 nm) under Select Filter Combinations. Opsæt prøvenavne under Trin 2 og Trin 3. Quantification Sample Type skal indstilles til unknown. Replikatkolonnen skal ikke udfyldes. 4. Vælg knappen Experiment, og klik på knappen Start Run for at gemme eksperimentet og begynde at køre cyklussen. 5. Når kørslen er afsluttet, vælges fanen Analysis og derefter Abs Quant/2nd Derivative Max fra vinduet Create New Analysis. Acceptér standarderne fra skærmbilledet Create New Analysis. Kontrollér, at knappen Filter Comb er 465-510, og vælg knappen Calculate. Ctværdier vises i tabellen Samples. 6. Vælg knappen Filter Comb, og skift filtre til 533-580 nm. Vælg knappen Calculate, og indhent de exogene Ct-kontrolværdier fra tabellen Samples. Opsætning til prøvevurderingsprotokol ABI7500 Instrument 1. Placer straks pladen i ABI7500-instrumentet. 2. Vælg ikonen for 7500 System Software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Åbn en ny kørselsfil fra filmenuen i 7500 Sequence Detection Software version 1.4. Side 11 af 38

3. Under Assay vælges Standard Curve (Absolute Quantification). Under Run Mode vælges Standard 7500. 4. Gå til detektor-opsætningsvinduet ved at vælge knappen Next. Tilføj en FAM- og en JOE-detektor med quencher indstillet til none på detektorlisten. Vælg knappen New Detectors, hvis disse detektorer ikke allerede findes, og sæt en FAM- og en JOE-detektor op med quencher indstillet til none. 5. Indstil Passive Reference til None, og vælg knappen Next. 6. Vælg hele pladen, og afkryds feltet for FAM- og JOE-detektorer for at sikre, at begge farver monitoreres i hver brønd. Vælg knappen Finish. 7. Opsæt cycling som vist i Tabel 4 under fanen Instrument. Tabel 4: ABI7500 cyklustilstande Temperatur Tid Cyklusser Dataindsamling Stadium 1 95 o C 4 min 1 Stadium 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 8. Vælg knappen Start for at gemme prøven og påbegynde cyklussen. 9. Sørg for, når kørslen er afsluttet, at den passive reference er indstillet på none på brøndinspektionsskærmen. Vælg alle de brønde, der er i brug, i fanen Amplification Plot, og vælg farve JOE fra detektorrullemenuen. 10. Kontrollér JOE-signalet fra hver prøve, og sammenlign med JOEsignalet i NYC-brønden. Notér eventuelle prøver med en senere forstærkningskurve eller mislykket forstærkning for den exogene kontrol sammenlignet med NTC. 11. Vælg alle de brønde, der er i brug, i fanebladet Amplification Plot, og vælg FAM-farve fra detektor-rullemenuen. Brug den automatiske baseline-indstilling og manuel Ct, og indstil derefter tærskelværdien manuelt i midten af den eksponentielle fase med logskalaen til Y-aksen, som beskrevet i brugervejledningen til ABI7500. 12. Vælg knappen Analyse for at få vist Ct-værdier. Side 12 af 38

Tolkning af prøvebedømmelse Bedøm NTC Ct-værdier for at sikre, at der ikke er nogen kontaminering, som giver positiv forstærkning i FAM-kanalen (Ct mindre end 40) eller en mislykket exogen kontrolreaktion i HEX-kanalen (ingen Ct), som tyder på et opsætningsproblem. Den blandede standard bør give en kontrolanalyse Ct (FAM-kanal) på 26-29 på ABI7500 og 29 på LightCycler 480 Instrumentet. Data må ikke anvendes, hvis en af disse to kørselskontroller er mislykket. Kontrolanalyse Ct 29-35: Fortolkes med forsigtighed, da meget lave mutationsniveauer måske ikke detekteres. Kontrolanalyse Ct 35-38: Der er kun få kopier af DNA i prøverne, der kan forstærkes, og mutationer vil sandsynligvis kun blive set, hvis de fleste kopier muteres. Kontrolanalyse Ct 38: Afvis prøven, da der er minimalt DNA til stede, og K-RAS-kittet ikke kan påvise mutationer. Bemærk, at hvis en prøve giver en sen kontrolanalyse-ct, skal prøvens exogene kontrol-ct sammenlignes med den exogene kontrol fra NTC. Hvis den exogene kontrol fra prøven er forsinket eller negativ sammenlignet med NTC, kan der være en hæmmer til stede. Det er muligt at reducere hæmmerens effekt ved at fortynde prøven, selvom dette også fortynder DNA et. Fortynding af prøven: En kontrol-ct på < 24 overbelaster mutationsanalyserne. Prøver med en kontrol-ct på < 24 skal fortyndes. Bemærk, at for LightCycler 480 Instrument kan Ct-værdier indhentet via den 2. derivatmetode være en smule forskellig fra værdierne, som fremkom via LightCycler Adapt Software. Det anbefales, at koncentrerede prøver fortyndes for at falde inden for området > 24 men < 29 (Ct-værdier baseret på 7500 Sequence Detection Software eller LightCycler 480 Instrument Software) med den basis, at ved at fortynde ½ stiger Ct med 1. 9. K-RAS Mutationsdetekteringsprotokol Læs disse instruktioner grundigt igennem, og blive bekendt med alle K-RAS-kittets komponenter, inden udstyret tages i brug. For at bruge K-RAS-kittet effektivt skal prøver samles i batchstørrelser på 10 (for at fylde en plade med 96 brønde). Mindre batchstørrelser betyder, at der kan testes færre prøver med K-RAS-kittet. Prøveopsætning af LightCycler 480 Instrument For hver DNA-prøve skal kontrol- og mutationsanalyser analyseres i samme PCR-kørsel for at undgå variationer mellem kørslerne. Side 13 af 38

1. Optø reaktionsblandingerne og den blandede standard fra K-RASkittet til stuetemperatur. Bland hver opløsning efter optøning ved at vende hvert rør 10 gange for at undgå lokaliserede saltkoncentrationer. Forbered tilstrækkelige blandinger til DNA-prøverne, den blandede standard og kontroller uden skabelon samt 2 ekstra reaktioner pr. blanding, som vist i Tabel 5. Tabel 5: Mængder til K-RAS-masterblandinger Analyse Reaktionsblanding (µ)x1 Masterblandinger Reaktionsblanding Taq (µl)x1 (µl) pr. plade (x14) Taq (µl) pr. plade (x14) Kontrolanalyse 19,8 0,2 277,2 2,8 Mutationsanalyser 19,8 0,2 277,2 2,8 2. Taq og andre reaktionsblandinger, der indeholder Taq, MÅ IKKE vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. 3. Kontroller, at Taq har stuetemperatur før brug. Centrifugér hætteglasset for at sikre, at alt Taq er samlet i bunden af hætteglasset, og pipettér derefter ved at placere pipettens spids lige under overfladen af Taq for at minimere risikoen for, at spidsen bliver dækket af overskydende Taq. 4. Bland masterblandingerne ved at pipettere forsigtigt op og ned. 5. Tilføj straks 20 µl af masterblandingerne i reaktionsbrøndene. 6. Tilføj straks 5 µl af prøven, blandet standard eller vand (til kontrollerne uden skabelon) til reaktionsbrøndene. Hver DNA-prøve skal testes med både kontrol- og alle mutationsanalyser. Opsætning af pladen vises i Tabel 6. Side 14 af 38

Tabel 6: K-RAS-kit pladelayout layout ved 96 brønde Analyse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontrol B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Blandet standard NTC Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 7. Forsegl og centrifugér PCR-pladen kortvarigt for at samle reagenserne i bunden af brøndene. 8. Placer straks pladen i LightCycler 480 Instrument. Opsætning for LightCycler 480 Instrument 1. Vælg ikonen for LightCycler 480 Instrument software på skrivebordet på den arbejdsstation, som er forbundet med instrumentet. Log på softwaren, og vælg fra oversigtssiden New Experiment from Template. 2. Vælg K-RAS LC480II Run Template fra listen Run Templates (se afsnittet LightCycler 480 Instrument prøvebedømmelse for detaljer). 3. Vælg fanen Sample Editor under Step 1: Select Workflow og vælg afkrydsningsfeltet Abs Quant. Kontroller, at begge filtre er valgt (465-510 nm og 533-580 nm) under Select Filter Combinations. Opsæt prøvenavne under Step 2 og Step 3. I kolonne 1 skal prøvenavnet være Mixed Standard. I kolonne 2 skal prøvenavnet være NTC. I kolonne 3-12 skal prøvenavnene indtastes. Navnene skal være identiske for alle brønde i 1 kolonne. Quantification Sample Type skal indstilles til unknown. Replikatkolonnen skal ikke udfyldes, da LightCycler Adapt Software ikke tager replikater i betragtning. 4. Vælg knappen Experiment, og klik på knappen Start Run for at gemme prøven og begynde at køre cyklussen. LightCycler 480 Instrument prøveanalyse 1. Når LightCycler 480 Instrument-kørslen er afsluttet, eksporteres prøven (.ixo fil) ved hjælp af navigator-vinduet til en egnet placering, hvortil LightCycler Adapt Software kan få adgang. Side 15 af 38

2. VIGTIGT: LightCycler Adapt Software er godkendt til brug på et enkeltcomputersystem defineret som en enkelt kontrolenhed (arbejdsstation) leveret af Roche Diagnostics til brug sammen med et enkelt LightCycler 480 Instrument II. Denne godkendelse af LightCycler Adapt Software er aktuelt kun gældende for kontrolenheden, som er en standalone computer (dvs. ikke del af et netværk). Det er ikke tilladt at benytte nogen anden computer, da softwaren måske ikke vil fungere efter hensigten. 3. Åbn LightCycler Adapt Software ved at klikke på ikonen LightCycler Adapt Software på arbejdsstationens skrivebord, og udfyld feltet til brugernavn. Dette navn indtastes som rapportforfatter. 4. Brug browserknappen i hovedvinduet for at vælge en enkelt LightCycler 480 Instrument kørselsfil (for at fjerne et valg skal softwaren lukkes og åbnes igen). 5. Vælg en rapporttype (pdf eller csv). Hvis csv vælges, oprettes der også automatisk en pdf-version. 6. Vælg Analyse for at oprette resultatrapporten. Rapporten gemmes automatisk i folderen med kørselfilen og får det samme navn som kørselsfilen. 7. Rapporten vises automatisk. 8. De rapporterede resultater vises i kolonnen Mutation Status i tabellen Sample Result Table. LightCycler Adapt Software rapportfortolkning 1. LightCycler Adapt Software-rapporten indeholder generel information om analysen. 1.1. Rapportforfatteren er personen, som har kørt softwaren og oprettet rapporten. 1.2. Dato og tidspunkt for analysen vises. 2. Rapporten giver en oversigt over analysen med detaljer om det anvendte kørselsfilnavn plus algoritmedefinitionsfil og algoritmesekvens. Algoritmedetaljerne er faste og kan ikke ændres. 3. Resultatafsnittet indeholder det fulde navn og filstien for LightCycler 480 Instrument-kørslen samt følgende detaljer: 3.1. LightCycler 480 Instrument-serienummer. 3.2. Instrument Name-identifikatior for LightCycler 480 Instrument i LightCycler 480 Instrument Software. 3.3. Run Date-Dato og tid for LightCycler 480 Instrument-kørsel. 3.4. Run Operator-navnet på personen, som var logget på LightCycler 480 Instrument-softwaren, da prøven blev kørt. 3.5. Experiment Name-Kørslens filnavn. 3.6. Software Version-version af den software, som er anvendt på LightCycler 480 Instrument. Side 16 af 38

3.7. Lot Number-fra feltet Lot No i prøvens opsætningsskærm i LightCycler 480 Instrument-softwaren. 4. Pladens layout opgives med prøvenavne fra LightCycler 480 Instrument softwarens prøveeditor-skærmbillede. 5. Der opgives et Run Summary Result, hvor kørslen mærkes med Valid eller Invalid. Dette afhænger af kørselskontrollerne i kolonnerne 1 og 2. 6. Kørselskontroller 6.1. LightCycler Adapt Software beregner automatisk Ct-værdien for den blandede standard ved hjælp af formlen Mutation Ct-Kontrol Ct= Ct 6.2. LightCycler Adapt Software sammenligner værdierne i de forventede værdier i Tabel 7. Tabel 7: LightCycler Adapt Software forventede Ct-værdier Analyse Blandet standard Ct 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. Ct- og Ct-værdierne rapporteres. 6.4. Følgende Flag/Advarsler rapporteres for kørselskontrollerne i kolonne 1 og 2: Tabel 8: LightCycler Adapt Software Flag/Advarsler for kørselskontrollerne Flag/Advarsler CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Betydning FAM Ct for kontrolanalyse er uden for måleområde For den blandede standard er den exogene kontrol- Ct<30 eller er negativ, når FAM-resultaterne er negative Mutations- Ct-værdier er uden for det indstillede område. Den exogene kontrolreaktion er mislykket i en NTC FAM-reaktionen har en positiv Ct-værdi i en NTC 6.4.1. Betydningerne af Flag/Advarsler findes mere detaljeret nedenfor:- 6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE-Kontrolanalysen for den blandede standard skal have en Ct-værdi på 26,60 ± 2. Side 17 af 38