Differentieret genekspression Hvordan fås differentieret genekspression udfra samme genrepertoire? Differentieret gentranskription (DNA-methylering, dosage compensation) Selektiv RNA processering i kernen Selektiv mrna translation Posttranslational modifikation 1
DNA-methylering Primær transkriptional regulationsmekanisme i vertebrater. Stabiliserer gentranskriptionsmønstret. 5-methylcytosin hindrer transkriptionsfaktorer i at binde (d.v. s. inaktiverer genekspression). DNA-methylering er en betydelig del af differentieringsprocessen. Mekanisme bag genomic imprinting : Kun ægcellederiveret eller spermcelle-deriveret allel aktivt i det tidlige embryon for > 75 geners vedkommende. DNA-methylering 2
Inner cell mass ej DNAmethyleret Differentieret og DNA-methyleret kerne indsat i ægcelle Ved kloning af pattedyr skal ægcytoplasma enten fjerne eller overhøre methyleringsmønster i indsat kerne => <5% succesrate? Dosage compensation - I Drosophila og pattedyr har hunner to X-kromosomer, hanner ét X- og ét Y-kromosom. - I modsætning til Y-kromosomet koder X-kromosomet for tusinder af essentielle gener. - Selvom hunner har to X-kromosomer, findes der nogenlunde lige mange X-kromosom genprodukter i hunner og hanner. - Mekanismen, der udligner den potentielle forskel på XX og XY-celler kaldes dosage compensation. 3
Dosage compensation i Drosophila: Hunner: Begge X-kromosomer er aktive. Hanner: Der transkriberes tilsvarende større mængde RNA fra X-kromosomet. Acetylering af nukleosomer bevirker lettere tilgang for RNA-polymeraser til promotorer. Dosage compensation i pattedyr: - Som udgangspunkt er begge X-kromosomer aktive. - Inaktivering er tilfældig, d.v.s. nogle gange er det X et fra moderen, andre gange X et fra faderen, der inaktiveres. (OBS! I trofoblasten hos mus fortrinsvis X-kromosomet fra faderen inaktivt) - Processen er irreversibel. - Kromatinet i det inaktive X-kromosom er omdannet til heterokromatin: kondenseret i det meste af cellecyklus, og optræder som Barr body. 4
5
X Chromosome Inactivation in Mammals Clone Produced by Somatic Nuclear Transfer Klon Ophav Pigmentering bestemmes af X-kromosom inaktiveringsmønster 6
HUMARA (human androgen receptor assay): Methylering af HpaII og HhaI sites i det første exon af human androgen receptor locus korrelerer med X-kromosom inaktiveringsmønster. Am. J. Pathol., Petersen et al. 2003 Hvordan fås differentieret genekspression udfra samme genrepertoire? Differentieret gentranskription Selektiv RNA processering i kernen (translokation og differential splejsning) Selektiv mrna translation Posttranslational modifikation 7
Regulation på transkriptionsniveau Det primære transkript (hnrna) -> mrna Translokation fra kerne til cytoplasma Differential splejsning Roles of Differential RNA Processing During Development 8
Hvordan fås differentieret genekspression udfra samme genrepertoire? Differentieret gentranskription Selektiv RNA processering i kernen Selektiv mrna translation (mrna stabilitet/levetid; mrna lokalisation, mikrorna) Posttranslational modifikation Degradation of Casein mrna in the Presence and Absence of Prolactin 9
Eksempel på translational kontrol: Oocyter danner og lagrer mrna, som først tages i brug efter fertilisering. Opretholdelse af normal delingshastighed og kontrol i den tidligste udvikling kræver hos nogle arter (f. eks. Drosophila og søpindsvin) ikke tilstedeværelse af kerne, men fortsat proteinsyntese fra lagret (maternalt) mrna. a 10
Selektiv translation: mikrorna Beskrevet første gang i C. elegans i 1993: Transcript fra lin-4 binder 3 UTR af lin-14, d. v. s. endogen RNA interference. 21-24-nt non-coding RNA danner partiel duplex med 3 UTR i target mrna v.h.a. RISC. Ekspressionsprofil af mirnas forskellig mellem fysiologisk normal og syg tilstand. Terapi: Hæmning af slemme mirna eller ekspression af gode mirna. Problemer: Én mirna mange targets, delivery og design af magic bullet. MicroRNA in disease and potential therapeutic applications, Mol. Ther., Sept. 18, 2007 11
Hvordan fås differentieret genekspression udfra samme genrepertoire? Differentieret gentranskription Selektiv RNA processering i kernen Selektiv mrna translation Posttranslational modifikation 12
Celle-celle kommunikation Celle-celle kommunikation Induktion og kompetence Reciprocitet (gensidighed) Epitelial-mesenkymal interaktion 13
Induktion og kompetence Induktion kræver mindst to komponenter: en inducer og en responder Evnen til at respondere på induktion kræver kompetence (kompetencefaktor) Ectodermal Competence and the Ability to Respond to the Optic Vesicle Inducer in Xenopus 14
Induction of Optic and Nasal Structures by the Competence Factor Pax6 in the Rat Embryo Pax6 protein er nødvendig for ektoderms kompetence til at respondere på induktion fra optisk vesikel. Men hvilken af de to komponenter er defekt? 15
Recombination Experiments with Pax6-Deficient Rats Pax6 nødvendig for responder (ektoderm), men ej for inducer (optisk vesikel) Celle-celle kommunikation Induktion og kompetence Reciprocitet (gensidighed) Epitelial-mesenkymal interaktion 16
Reciprocitet Eksempel: 1. Optisk vesikel inducerer ektoderm til at respondere med linsedannelse. 2. Faktorer secerneret fra linsen inducerer den optiske vesikel til at danne optisk kop, hvoraf dele differentierer til pigmenteret retina og neural retina. Celle-celle kommunikation Induktion og kompetence Reciprocitet (gensidighed) Epitelial-mesenkymal interaktion 17
Regional Specificity of Induction in the Chick 18
Epitelial-mesenkymal interaktion Eksperiment (Kollar & Fisher 1980): Epitel fra kæben af 5d kyllingeembryo rekombineret med molar mesenkym fra 16-18d museembryoner. Vævsrekombinanter inkuberes i mus. Resultat: Kyllingetænder D. v. s. kyllingeepitel, som ikke har dannet tænder i 100 mio år har opretholdt evnen til at respondere på inducer (mesenkym). Image by Erica P. Johnson; original photo 2001 Eric L. Carlson 19
Ekstracellulære matriks komponenter Fibronektin Fibronectin in Xenopus during gastrulation, movement of mesoderm 20
The Binding of Cytoskeleton to the Extracellular Matrix Through the Integrin Molecule 21
Basalmembran ECM som kilde til udviklingssignaler 22
ECM som kilde til udviklingssignaler Differentieret genekspression udfra samme genrepertoire opnås ved: Differentieret gentranskription (DNA-methylering, dosage compensation) Selektiv RNA processering i kernen (translokation og differential splejsning) Selektiv mrna translation (mrna stabilitet/levetid; mrna lokalisation; mikrorna) Posttranslational modifikation 23
Celle-celle kommunikation omfatter: Induktion og kompetence Reciprocitet (gensidighed) Epitelial-mesenkymal interaktion Induktion og opretholdelse af udvikling og differentiering gennem løbende signalering og interaktion med ECM 24