Abstrakt. Abstract. Side 3 af 78

Transkript

1 Bachelorprojekt af Sidsel Salling Thorborg, Chalotte Poulsen og Grith Mai Tønnesen Vejledt af Lisbeth Birk Møller (seniorforsker på Kennedy Instituttet) Bachelormodul II/ Forår 2008 Medicinalbiologi / RUC Side 1 af 78

2 Forord Vi vil gerne takke Lisbeth Birk Møller, seniorforsker ved Kennedy Centret for god vejledning i forbindelse med udarbejdelsen af dette bachelorprojekt. Vejen var lang fra Kennedy Centret til Roskilde Universitetscenter og arbejdsmetoderne forskellige, men det har uden tvivl været et værdifuldt samarbejde. Ikke mindst på grund af de mange teoretisk tunge forskningsartikler, som skulle læses og forstås, før vi kunne komme i gang med skriveprocessen. Tak for hjælp til indsamling af den rette litteratur og til forståelsen af samme. Dette har sammen med vores eget engagement og interesse, bragt dette projekt om X-kromosominaktivering i kvinder til live. Side 2 af 78

3 Abstrakt X-kromosominaktivering sker under embryogenesen og er et fænomen, hvormed enten det paternelle eller det maternelle X-kromosom inaktiveres i samtlige celler i kvindens krop. Dette sker for at kompensere for den ellers ulige fordeling af arvemateriale mellem de to køn. Inaktiveringsprocessen er som udgangspunkt tilfældig, således at halvdelen af cellerne har inaktiveret det maternelle X-kromosom, og den anden halvdel har inaktiveret det paternelle X-kromosom. Det kan dog ske, at inaktiveringsmønsteret er skævt, så det i overvejende grad er det ene X-kromosom der udtrykkes. Dette kan være en tilfældighed, men som regel skyldes det at der på det ene X-kromosom er en mutation. Inaktiveringsmønsteret kan altså fungere som en beskyttende mekanisme, idet cellerne kan vælge at inaktivere det X-kromosom som bærer på en mutation. Da dette er muligt, vil kvinder, som er bærere af en X-bundet mutation ofte være symptomfri. Det har dog vist sig, at inaktiveringen også kan ske til fordel for den syge allel, og dette er et fænomen hvis baggrund man ikke endnu kan forklare. Det er netop denne problematik vi finder særlig interessant, og vores projekt omhandler derfor de humane sygdomme, der bliver udtrykt hos kvinder når X-inaktiveringsmønstret ikke virker beskyttende. Der er stadig mange løse ender i forbindelse med forskningen i X- inaktiveringsmekanismen, og dette kan gøre det svært for studerende og andre at sætte sig ind i emnet. Projektet tilstræber derfor at formidle fænomenet på en let tilgængelig måde, så en bredere gruppe af mennesker kan nås. Abstract X-chromosome inactivation occurs during embryogenesis and is a phenomenon, where either the paternal or the maternal X-chromosome is inactivated in all of the cells in the female body. This is to compensate for the uneven balance of genetic inheritance between the two sexes. The inactivation process is usually random, thus half of the cells inactivate the maternal X-chromosome and the other half inactivates the paternal X-chromosome. Sometimes the inactivation-pattern is skewed, meaning that one of the X-chromosomes is predominantly expressed. This can occur by coincidence, but usually it is due to a mutation on the other X- chromosome. The inactivation-pattern can function as a protective mechanism, where the cells can choose to inactivate the chromosome carrying a mutation. This can make women Side 3 af 78

4 carriers of diseases, without expressing any symptoms. Unfortunately it appears that the inactivation process sometimes inactivates the healthy X-chromosome, leaving the mutated chromosome, the functional one. This phenomenon s origin still remains unexplained. It is this subject we find very interesting and therefore our project deals with this exact issue about how the inactivation-pattern sometimes works against females so that they express diseases. There are still several problems to be resolved regarding the X-inactivation mechanism, and it can be difficult for students and others to obtain knowledge concerning these issues. Therefore this project aims to communicate the issues regarding X-inactivation on an accessible level, so that more people can acquaint with the phenomenon. Side 4 af 78

5 INDLEDNING...7 Generel introduktion til emnet...7 PRÆSENTATION AF PROBLEMFORMULERING OG RELEVANTE PROBLEMSTILLINGER... 9 Problemformulering...10 X-INAKTIVERING I KVINDER...10 Introduktion...10 Selve inaktiveringsprocessen...11 Kromatinstrukturens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering...15 X-REAKTIVERING...20 Hvorfor er der nogle gener på X i, som ikke er inaktiveret?...20 Undersøgelser af det humane X-kromosom viser, at nogle gener udviser et varieret inaktiveringsmønster...22 Reaktivering og ICF-syndrom...24 X-INAKTIVERINGSMØNSTER...24 Genetisk baggrund...25 Skæv X-inaktivering...25 BESTEMMELSE AF X-INAKTIVERINGSMØNSTRE...27 INTRODUKTION TIL SYGDOMSAFSNIT...32 MENTAL RETARDERING...34 Hvad er mental retardering?...34 Hvorfor opstår mental retardering?...34 Påvisning af skæve X-inaktiveringsmønstre hos bærere af XLMR-mutationer...35 Diskussion af forskningsresultaterne...36 ATR-X SYNDROMET Hvad er ATR-X og hvorfor opstår det?...37 Ikke-skæv X-inaktivering kan resultere i sygdomssymptomer hos kvinder...37 DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY (DMD)...38 Hvad er DMD?...38 Hvorfor opstår DMD? - Fysiologiske og genetiske årsager...39 Uensartet X-inaktivering i kvindelige tvillinger med DMD...40 HÆMOFILI BLØDERSYGDOM...41 Hvad er hæmofili?...41 X-inaktivering og hæmofili...42 Undersøgelse af et tvillingepar med svær hæmofili...43 Undersøgelse af et hæmofiliramt tvillingepar med raske forældre...45 Side 5 af 78

6 RETT-SYNDROM...47 Hvad er Rett?...47 Symptomer på Rett...47 Hvorfor opstår Rett? genetisk baggrund...48 Mutationer i MECP2 kan resultere i Rett-syndrom...50 X-kromosominaktiveringsmønstre og Rett-syndrom...50 X-INAKTIVERING OG AUTOIMMUNE SYGDOMME...52 Hvad er autoimmune sygdomme og hvorfor opstår de?...52 Autoimmune thyroid disease og X-inaktiveringsmønsteret...53 Resultater fra tre undersøgelser af patienter med AITD...55 OPSAMLING...57 DISKUSSION...60 Kan gener på det inaktiverede X-kromosom reaktivere, og hvilke konsekvenser kan det få?...60 Har alle bærere af en X-bunden sygdom et skævt X-inaktiveringsmønster?...60 Kan X-inaktiveringsmønsteret variere fra væv til væv?...61 Kan den store fænotypiske variabilitet, der ses hos forskellige kvinder med de samme mutationer, tilskrives X-inaktiveringsmønsteret?...62 Hvilken rolle spiller inaktiveringen, når man udvikler autoimmune sygdomme?...62 Kan raske kvinder have et skævt inaktiveringsmønster?...63 Bliver kvinders inaktiveringsmønster mere skævt med alderen?...63 Hvis der er mutationer på begge X-kromosomer, skelner cellen så mellem alvorlige og mindre alvorlige mutationer, og kan inaktiveringsdefekter på det ene X-kromosom spille ind her?...64 Er der andre faktorer end X-inaktiveringsmønsteret, der medvirker til den store fænotypiske variabilitet?...64 Kildekritik...65 PERSPEKTIVERING...65 ORDLISTE...69 LITTERATURLISTE...71 PRIMÆR LITTERATUR: Artikler...71 Bøger...75 Internetsider...75 Figurer...76 SEKUNDÆR LITTERATUR (BAGGRUNDSVIDEN): Artikler...76 Bøger...78 Side 6 af 78

7 Indledning Generel introduktion til emnet X-kromosom-inaktivering (XCI) er et fænomen, hvis eksistens man første gang fandt beviser for i 1949, da Murray L. Barr og Ewart G. Bertram observerede en dense staining nuclear structure i neurale cellekerner hos hunkatte [Wutz et al., 2002; Barr et al., 1949]. Senere i 1969 kom Mary Lyon med en hypotese, som gik ud på, at det ene X-kromosom i kvinder bliver inaktiveret i alle kroppens celler ved et tidligt stadie i embryogenesen. Endvidere mente hun, at dette inaktiveringsmønster nedarves til dattercellerne gennem celledelinger, og at processen, hvormed enten det paternelle eller det maternelle X-kromosom inaktiveres, er tilfældig [Okada et al., 2008]. Denne hypotese er siden hen blevet anerkendt som et faktum verden over. Det kvindelige og det mandlige kønskromosom er ikke lige store, og mængden af gener er derfor ikke ligeligt fordelt mellem dem. X-kromosomet indeholder elleve gange så mange gener som Y-kromosomet, og mange af disse gener har vigtige funktioner i kroppen, heriblandt regulering af immunforsvar og metabolisme. Til sammenligning indeholder Y- kromosomet kun ét vigtigt gen, nemlig det gen som er ansvarlig for testis [Migeon, 2007]. Da kvinder har to X-kromosomer og mænd kun har ét, vil kvinder som udgangspunkt have flest gener. For at kompensere for dette, sker der netop den omtalte inaktivering af det ene af kvindens X-kromosomer, så der i cellerne altid kun er ét aktivt X-kromosom pr. diploide kromosomsæt [Wutz m.fl., 2006]. X-kromosom-inaktiveringen i kvinder sker altså for at kompensere for den ellers ulige fordeling af arvemateriale mellem mænd og kvinder [Karen et al., 2006; Wutz et al., 2007; Salstrom, 2007]. Inaktiveringsprocessen er som udgangspunkt tilfældig, men i tilfælde hvor der er opstået en mutation på det ene X-kromosom, kan cellerne vælge at inaktivere det syge X, for at undgå følgerne af mutationen. Her kan fordelingen af raske og syge celler så være mere eller mindre skæv, afhængigt af hvor mange celler der har inaktiveret det raske X-kromosom, og hvor mange celler der har inaktiveret det syge X-kromosom. I henhold til dette kan kvinder, som er bærere af en given X-bunden sygdom, både være symptomfrie og de kan have mere eller mindre alvorlige symptomer. Mænd har, med deres ene X-kromosom, ikke samme mulighed for at undgå følgerne af en eventuel X-bunden mutation, da deres X-kromosom altid vil være Side 7 af 78

8 aktivt, uanset om det indeholder mutationer eller ej [Migeon, 2007]. En lang række X-bundne sygdomme er derfor letale for drengefostre, og vil således kun blive udtrykt hos kvinder i større eller mindre grad. Disse er de såkaldt dominante sygdomme. Det at en sygdom er dominant betyder at den allel, som bærer mutationen, udtrykker sin fænotypiske effekt, uanset om der også er en rask allel til stede. Der findes også mildere varianter af X-bundne sygdomme, og disse vil man stort set kun observere hos mænd [Migeon, 2007]. Disse sygdomme er de recessive sygdomme, altså sygdomme, der kun kommer til udtryk i kvinder, når begge alleler bærer på den samme mutation. I de senere år er man begyndt at koble X-inaktiveringsmønsteret sammen med en række fænomener såsom aldring og cancer, og man er også begyndt at overveje den mulighed, at reaktivering af ellers inaktiverede gener, kan bruges i behandlingen af forskellige sygdomme, hvor det raske X-kromosom, i størstedelen af cellerne, er blevet inaktiveret [Pan et al, 2008]. I en undersøgelse af inaktiveringmønsteret i forskellige kvinder har man sågar observeret, at en lang række kvinder som har oplevet gentagne aborter, har et skævt inaktiveringmønster. Også mødre til homoseksuelle mænd har i flere tilfælde vist sig at have et skævt inaktiveringsmønster [Reviewed af Uz et al., 2006]. Disse observerede fænomener vender vi tilbage til i vores perspektivering. Vi finder det meget interessant, at X-inaktiveringsmønsteret kan kobles sammen med så mange forskellige fænomener. Der ligger imidlertid stadig en stor opgave i nøjere at afdække dets rolle i disse forskellige sammenhænge. De mange løse ender gør det vanskeligt for studerende og andre interesserede at få overblik over området. Herudover er det svært at finde let forståeligt stof omkring emnet, og det tilgængelige materiale er primært at finde i svære teoretiske forskningsartikler. Vi mener således, at der mangler et let tilgængeligt materiale, som giver et overordnet overblik over emnet. Et materiale, som formår at formidle den svære teoretiske viden på en let tilgængelig måde, så en bredere gruppe af mennesker kan nås. Det er derfor vores mål med denne rapport netop at lave et materiale, som opfylder disse kriterier. Vi vil udforme et projekt, som præsenterer teorien i et forståeligt sprog, og som til sidst, i et opsamlende afsnit, gennemgår de vigtigste pointer, så man sidder tilbage med et samlet overblik over emnet. Vi vil desuden, i en perspektivering, diskutere hvilke nye muligheder der opstår, i Side 8 af 78

9 takt med at man via forskningen, opnår en bedre og bedre forståelse for de biologiske mekanismer og deres betydning for organismens funktionsevne. Præsentation af problemformulering og relevante problemstillinger Da vi nu kort har beskrevet det fænomen, vi har valgt at koncentrere os om i dette projekt, vil vi gå et skridt videre, og introducere læseren for en række relevante problemstillinger i forbindelse med emnet. Da vi valgte emnet X-inaktivering i kvinder, var det i høj grad, fordi det er et interessant fænomen, som vi ikke var bekendt med, og som vi fik lyst til at undersøge nærmere. Det viste sig også hurtigt at være velvalgt, da vi, efterhånden som vi opnåede større indsigt i emnet, blev mere og mere fascinerede af dette komplekse fænomen og dets betydning for organismen. Man har allerede i mange år forsket intensivt i X- inaktiveringsmekanismens betydning, men det er først i de seneste år at brikkerne i puslespillet langsomt er begyndt at falde på plads. Der er dog stadig en lang række spørgsmål, som rejser sig, hver gang forskningsteams rundt om i verden høster nye og interessante resultater. En særlig interessant observation forskningsverdenen har gjort sig, er den, at X- inaktiveringsmønsteret tilsyneladende har stor betydning for det fænotypiske udfald af en sygdom hos kvinder. Denne problemstilling samt en lang række andre interessante spørgsmål, præsenterer vi i punktform nedenfor. Vi vil ikke her gå nærmere ind på de enkelte spørgsmål, da vi løbende i rapporten vil gå mere i dybden med dem. Til sidst i rapporten vil vi diskutere, om vi har fundet svar på de spørgsmål, vi har valgt at koncentrere os om. Hvis ikke, vil vi diskutere, hvad et muligt svar kan være, og vi vil så præsentere vores egne tanker i forbindelse med de opdagelser, man har gjort sig i laboratorier verden over. Centrale spørgsmål i forbindelse med X-inaktiveringsmønsteret: Kan gener på det inaktiverede X-kromosom reaktivere, og hvilke konsekvenser kan det få? Har alle bærere af en X-bunden sygdom et skævt X-inaktiveringsmønster? Kan X-inaktiveringsmønsteret variere fra væv til væv? Kan den store fænotypiske variabilitet, der ses hos forskellige kvinder med de samme mutationer, tilskrives X-inaktiveringsmønsteret? Hvilken rolle spiller inaktiveringen, når man udvikler autoimmune sygdomme? Side 9 af 78

10 Kan raske kvinder have et skævt inaktiveringsmønster? Bliver kvinders inaktiveringsmønster mere skævt med alderen? Hvis der er mutationer på begge X-kromosomer, skelner cellen så mellem alvorlige og mindre alvorlige mutationer, og kan inaktiveringsdefekter på det ene X-kromosom spille ind her? Er der andre faktorer end X-inaktiveringsmønsteret, der medvirker til den store fænotypiske variabilitet? Alle disse spørgsmål kan ses som underspørgsmål til den problemformulering, vi præsenterer nedenfor, da det er spørgsmål, som er opstået undervejs i vores litteraturstudie, og som har hjulpet os til at finde ud af, hvad det helt konkret er, vi vil koncentrere os om i dette projekt. Problemformulering Hvilken rolle spiller X-inaktiveringsmønsteret i forbindelse med udviklingen af humane sygdomme hos kvinder? X-inaktivering i kvinder Introduktion Vores krop består af millioner af celler, som hver især indeholder 46 kromosomer, 44 autosomer og 2 kønskromosomer. De to kønskromosomer kan være XX eller XY afhængigt af, om der er tale om en pige eller en dreng. Som nævnt i indledningen er X-kromosomet større end Y-kromosomet, og X-inaktivering i kvinder sker således for at kompensere for den ulige fordeling af arvemateriale, der ellers vil være mellem de to køn. Der er, som nævnt, mange faktorer, som spiller ind, når inaktiveringen finder sted, og trods de mange endnu ubesvarede spørgsmål, er man kommet langt i forsøget på at opklare selve inaktiveringsprocessens forløb. I mennesker og andre pattedyr kaldes X-inaktiveringen for "random inaktivering", idet det i hver celle er tilfældigt, om det er X-kromosomet fra faderen, eller om det er X-kromosomet fra moderen som inaktiveres. Random inaktivering forekommer i det tidlige embryo, og denne proces bliver irreversibel, når cellerne differentieres [Valley et al., 2006]. I mennesker Side 10 af 78

11 uden X-kromosom-mutationer vil fordelingen af inaktive maternelle og paternelle X- kromosomer oftest være 50:50, men i tilfælde hvor der er sket en mutation på det ene X- kromosom, kan fordelingen være mere eller mindre skæv (dette kommer vi nærmere ind på i afsnittet om skæv X-inaktivering) [Franco et al, 2006; Chahrour og Zoghbi, 2007]. X-kromosomet indeholder flere gener og DNA-sekvenser, som samarbejder med adskillige af cellernes proteiner om at fuldføre inaktiveringsprocessen (se afsnittet Kromatinstrukturens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering). Hvis bare et enkelt protein mangler, kan det resultere i, at det forkerte X-kromosom inaktiveres. Selve inaktiveringsprocessen Et vigtigt locus på X-kromosomet i forbindelse med X-inaktivering er inaktiveringscenteret Xic. Xic er ansvarlig for at inaktiveringen starter, og i dette afsnit vil vi således indledningsvis redegøre for funktionen af inaktiveringscenteret. Begge X-kromosomerne indeholder Xicloci et, og forsøg tyder på, at de to X-kromosomer parrer umiddelbart før inaktiveringen, således at deres to Xic-loci kommer i kontakt med hinanden (se figur 1) [Wutz, 2007]. Dette indikerer, at kommunikation mellem de to Xic-loci er nødvendig, når det skal bestemmes, hvilket et kromosom der skal inaktiveres [Reviewed af Karen et al., 2006]. Nedenfor ses en figur som viser processens forløb. Figur 1. Figuren viser, hvordan de to Xic-loci bestemmer hvilket et X-kromosom, der skal inaktiveres. Ved start af denne proces, kommer de to loci i kontakt med hinanden, så X-kromosomerne kan tælles, og det kan afgøres, hvilket et X-kromosom der skal inaktiveres. Det inaktiverede X-kromosom vil, hvis processen er forløbet som den skal, forblive inaktivt efter at cellerne er differentierede. Kilde: [Internetside A] Side 11 af 78

12 Xic indeholder to gener der koder for ikke-translateret RNA, nemlig Xist og Tsix, som er involveret i inaktiveringsprocessen [Reviewed af Karen et al., 2006]. Xist-genet producerer Xist-RNA, som ved starten af inaktiveringsprocessen breder sig over hele det X-kromosom, der skal inaktiveres. Når Xist-RNA et spreder sig over kromosomet, forandres kromatinstrukturen, og DNA et bliver utilgængeligt for cellens transkriptionsfaktorer (se figur 2). Hermed er silencing af X-kromosomet påbegyndt. Figur 2. Denne figur viser, hvordan Xist-RNA et spreder sig over X-kromosomet, og inaktiverer det. Til venstre på figuren ses et aktivt X-kromosom med en ikke-kondenseret kromosomstruktur (eukromatinstruktur). I midten af dette kromosom ses Xic-loci et, hvorfra Xist-RNA et spredes. Efterhånden som RNA et spredes, bliver kromosomet mere og mere kondenseret, for til sidst at blive helt inaktivt. Billedet helt til højre viser, hvordan heterokromatin (den kondenserede udgave af DNA) ser ud. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside B]. Man har dog fundet ud af, at bestemte sekvenser skal være til stede på Xist, før transkriptionen af Xist-RNA kan starte. Inden for de seneste år har man nemlig opdaget sekvenser ved 5 - enden af Xist, som indeholder 7,5 gentagelser af et motiv, der menes at folde sig til en RNAstruktur bestående af to stem loop. Disse sekvenser er nødvendige for start af silencing, og de er bevaret i alle pattedyr, hvilket indikerer, at de måske fungerer som en slags platform for Side 12 af 78

13 faktorer, der medvirker til genrepression. Hvis Xist-RNA mangler det omtalte motiv, vil det stadig akkumuleres omkring X-kromosomet, men det vil ikke længere være i stand til at starte silencing [Karen et al., 2006]. Udover stem loop-strukturen har man også opdaget nogle andre sekvenser, de såkaldt long interspersed nuclear elements (LINEs), som højest sandsynligt medvirker til, at Xist-RNA et spredes. LINE-sekvenserne findes i større antal på X-kromosomerne end på autosomerne, hvilket forstærker ideen om, at de har en speciel rolle på dette kromosom. Det tyder på, at LINE-sekvenserne, som er fordelt over hele X-kromosomet, indeholder mange svage bindingssteder, til hvilke Xist og andre faktorer kan binde sig (se figur 3) [Karen et al., 2007]. Figur 3. Denne figur viser, hvordan LINE-sekvenserne menes at virke. Øverst på figur A kan man se, hvordan Xist-RNA et spredes fra Xic-loci et i midten, og derefter hjælpes videre langs kromosomet vha. LINEsekvenserne. På figur B kan man se, hvordan LINE-sekvenserne er fordelt over kromatinet, samt hvordan Xist-- RNA et binder sig til disse, når det spredes. Kilde: Modificeret udgave. [Karen et al., 2006]. En nuværende hypotese går ud på, at bindingen til LINE-sekvenserne foregår på en kooperativ måde, idet man har foreslået at binding af én faktor letter bindingen af den næste. Man har endnu ikke lavet forsøg, som har vist, at denne kooperative binding af Xist-komplekser finder sted, men alt peger i den retning [Karen et al., 2006]. Udover LINE-sekvensernes mulige kooperative effekt ved inaktiveringen, er det også sandsynligt, at de beskytter gener mod inaktivering, idet man har opdaget at bestemte oligomere i LINE-sekvenserne, er associeret med gener, som undgår X-inaktiveringen [Reviewed af Salstrom, 2007]. Det er desuden muligt at LINE-sekvenserne spiller en rolle i opretholdelse af X-inaktiveringen. Hvis dette er tilfældet, kan det være, at aktive gener på det ellers inaktiverede X-kromosom, i virkeligheden bare Side 13 af 78

14 midlertidigt har undgået inaktiveringen. I sådan en situation står det klart, at en høj koncentration af LINE-sekvenser, så vil gå hånd i hånd med en effektiv opretholdelse af gen-silencing ved X-inaktivering [Reviewed af Salstrom, 2007]. Ligesom Xic findes Xist også på begge X-kromosomer, og man har fundet ud af, at der foregår kommunikation mellem de to Xist-alleler i trans, idet man har bevist, at en deletion af Xist på X a (det aktive X-kromosom) ændrer timingen af replikationen på begge X-kromosomer [Salstrom et al., 2007]. Timingen af replikationen spiller en vigtig rolle i forbindelse med X- inaktivering, idet man har vist, at det inaktive X-kromosom altid replikeres sent i replikationsfasen. En deletion af Xist på X a vil, udover at ændre replikationstidspunktet, også ændre kromatinstrukturen på X i (det inaktive X-kromosom). I en normalt fungerende celle, hvor begge Xist-alleler er til stede, vil Xist-allelen på X a påvirke gensilencing på X i, og de to alleler arbejder således sammen om at opretholde inaktiveringen af X i [Salstrom, 2007]. Dette indikerer, at Xist-allelen på X a har biologisk aktivitet, selvom den ikke bliver transkriberet [Salstrom, 2007]. Tsix, det andet gen som Xic-loci et indeholder, transkriberes i modsat retning af Xist, og er en negativ regulator af dette, hvilket betyder at så længe Tsix bliver udtrykt, så vil Xist ikke blive det (se figur 4 nedenfor). Inden det bliver bestemt, hvilket et af X-kromosomerne der skal inaktiveres, vil Tsix derfor være til stede på begge kromosomerne, men når beslutningen er taget, nedreguleres Tsix på det kromosom, som skal inaktiveres. Når Tsix nedreguleres, får Xist-genet mulighed for at komme til udtryk, og dermed startes silencing af kromosomet. Figur 4. Denne figur viser Xic-regionen på X-kromosomet. Her kan man se, at Tsix, som er en negativ regulator af Xist-genet, transkriberes i modsat retning af dette. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside C]. Side 14 af 78

15 Kort opsummering Xist-genet, som koder for Xist-RNA, befinder sig i inaktiveringscentret Xic på begge X- kromosomer. Når Xic-loci erne på de to X-kromosomer parrer, bestemmes det hvilket et X- kromosom der skal inaktiveres, og Xist-RNA et vil herefter brede sig over dette. Silencingen afhjælpes af en stem loop-struktur, som befinder sig nær 5 -enden af Xist-RNA et, og selve spredningen af RNA et menes at ske vha. LINE-sekvenserne, som indeholder mange svage bindingssteder for Xist. Udover Xist-RNA ets samarbejde med LINE-sekvenserne, mener man også at Xist, idet det spredes, er i stand til at rekruttere andre faktorer til X i, som skal afhjælpe inaktiveringsprocessen ved at ændre kromatinstrukturen. I næste afsnit fokuseres derfor på kromatinstrukturen og dens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering. Kromatinstrukturens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering Man har fundet ud af, at der sker en række epigenetiske modifikationer af DNA og histoner, når Xist-RNA et spreder sig over kromosomet. Disse modifikationer er hypermethylering og hypoacetylering af DNA og histoner samt sen replikation i replikationsfasen [Wutz, 2007]. Hypermethyleringen på X i sker i høj grad ved de såkaldte CpG-dinukleotider og CpG-øer, som er DNA-sekvenser, hvor indholdet af cytosin og guanin er særlig højt [Tang & Ho, 2007]. Forskere mener, at de nævnte modifikationer bl.a. sker, fordi Xist-RNA et rekrutterer de såkaldte Polycomb-proteiner til X i. Helt specifikt er der her tale om de Polycomb repressive komplekser 1 og 2 (PRC1 og PRC2) [Wutz, 2007]. Inden vi går i dybden med funktionen af Polycomb-komplekserne og betydningen af CpGøerne, vil vi gøre rede for, hvad methylering og acetylering er, og hvorfor det finder sted. Endvidere vil vi redegøre for, hvad histoner er, og hvorfor de er vigtige i denne sammenhæng. Methylering og acetylering er påsætning af henholdsvis en methylgruppe og en acetylgruppe til f.eks. et nukleotid i DNA-strengen eller en aminosyre i en histone. Methylgrupper påsættes af de såkaldte methyltransferaser (se figur 5), og acetylgrupper påsættes af acetyltransferaser. Side 15 af 78

16 Figur 5. Denne figur viser hvordan cytosin får påsat en methylgruppe vha. en DNAmethyltransferase. Kilde: [Internetside D]. Hypermethylering og hypoacetylering er forbundet med tæt pakket/kondenseret kromatin, også kaldet heterokromatin. Omvendt er hypomethylering og hyperacetylering forbundet med eukromatin, som er den løst pakkede udgave af kromatin (se figur 2). Som tidligere nævnt inaktiveres X-kromosomet, når kromatinet bliver mere kondenseret. Det der sker når X- kromosomet inaktiveres, er netop en hypermethylering samt en hypoacetylering af DNA og histoner, så kromatinstrukturen ændres til heterokromatin, og kromosomets gener bliver utilgængelige for cellens transkriptionsfaktorer. Man mener, at de modifikationer der er tale om her, har til opgave at opretholde den kromatinstrukur, der er dannet [Salstrom, 2007; Karen et al., 2007]. Histoner er den vigtigste proteinkomponent i kromatin, da det er dem, der pakker cellens DNA. Histonerne H2A, H2B, H3 og H4 kaldes for core histoner idet de med to kopier af hver klasse, går sammen og danner en oktamer. Sådan en oktamer udgør et nukleosom. Et nukleosom kan derfor beskrives som en bold bestående af 8 histoner, rundt om hvilke cellens DNA er viklet to gange. Histoner har en såkaldt hale, som er deres amino-terminal-ende, hvor posttranslationelle modifikationer såsom acetylering, methylering, fosforylering m.m. kan finde sted (se figur 6 nedenfor). Side 16 af 78

17 Figur 6. Denne figur viser, hvordan histonerne er organiseret i et nukleosom. På figur a kan man se, at histone-halerne stikker ud fra nukleosomet, så deres aminosyrer er tilgængelige for methylering, acetylering og fosforylering m.m.. Figur b viser, hvordan histonerne er organiseret, når de er acetylerede og ikke-acetylerede. Når histonerne acetyleres, bliver kromatinstrukturen mindre kondenseret, og dermed kan generne på kromatinet transkriberes. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside E]. Helt specifikt er det bestemte lysin-rester på histone-halerne, som kan ændres ved at en methylgruppe eller lignende, binder sig kovalent til disse [Griffiths et al., 2008]. Idet kromatin består af histoner, og det bl.a. er histonerne som methyleres ved inaktivering af det ene X- kromosom, er det også dem, som sørger for, at kromatinet foldes op til en heterokromatinstruktur. Grunden til at de danner denne struktur, er, at deres affinitet for anioniske molekyler som DNA øges, når deres haler methyleres. Gener der er aktive, har derfor færre bundne histoner, mens inaktive gener har flere. Forskere mener, at ovennævnte histone-modifikationer kan etablere og opretholde transkriptionelt inaktivt heterokromatin ved at blokere bindingsstederne for transkriptions-aktivatorer, eller ved at skabe bindingssteder for proteiner som hæmmer transkription (her Polycomb- Side 17 af 78

18 proteinerne) [Reviewed af Salstrom, 2007]. Histone-halerne kan også rekruttere de føromtalte proteiner, nemlig methyltransferaser, som medvirker til at opretholde heterokromatinstrukturen. Deacetylaser som fjerner acetylgrupper fra histone-halerne, medvirker også hertil. Nu da vi kort har introduceret læseren for den vigtigste teori i forbindelse med kromatinstrukturens betydning for genekspressionen på X-kromosomet, vil vi fokusere på de føromtalte Polycomb-protein-komplekser samt de såkaldte CpG-øer og deres betydning for genekspressionen. De to Polycomb-repressive komplekser PRC1 og PRC2 rekrutteres som nævnt af Xist-RNA som et af de første led i inaktiveringsprocessen. Man ved endnu ikke, hvordan denne rekruttering foregår, men man ved, at Polycomb-proteinernes lokalisering til X i er fuldt ud afhængig af Xist, uanset hvilket udviklingsmæssigt stadie cellerne befinder sig i [Reviewed af Karen et al., 2007]. PRC1 og PRC2 har katalytisk aktivitet, idet de henholdsvis medierer histone H2A Lys119 ubiquitylering (H2aK119ub1) og histone H3 Lys27 trimethylering (H3K27me3). Man har opdaget, at sidstnævnte modifikation fremmer bindingen af PRC1 til kromatin, så det er blevet foreslået at PRC2 måske rekrutterer denne til kromosomet (se figur 7). Man har desuden fundet ud af, at Xist alene ikke er nok, når X-inaktiveringen skal opretholdes. Her har man fundet en faktor, den såkaldte memory -faktor som er påkrævet, for at X i kan forblive inaktivt [Reviewed af Karen et al., 2007]. Man kender endnu ikke memory-faktorens molekylære natur, men man ved, at Xist-ekspression etablerer denne i den tidlige differentiation, og at både Xist og memory-faktoren er påkrævet, for at H3K27me3 og H2A119ub1 kan finde sted på X i senere i differentiationen [Reviewed af Karen et al., 2007]. Nedenfor ses en figur, som viser, hvordan histone H3 på X i bliver methyleret. Side 18 af 78

19 Figur 7. Denne figur viser, hvordan de to Polycomb-repressive komplekser PRC1 og PRC2 samarbejder om at methylere histone H3. Helt ude til venstre kan man se, at histonerne er acetylerede, hvilket bevirker at kromatinet er aktivt. Den tredje histone fra venstre bliver metyleret af PRC2, og dette resulterer i, at PRC1-komplekser rekrutteres til kromatinet. Idet de rekrutteres, methylerer de samtlige H3-histoner langs kromatinet, så X-kromosomet inaktiveres. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside F]. Etableringen af memory-faktoren er observeret, når gen-silencing er blevet stabil og irreversibel, hvilket indikerer, at denne måske spiller en rolle i overgangen mellem start og opretholdelse af X-inaktiveringen [Karen et al., 2006]. Methyleringen af cellens DNA sker primært omkring de såkaldte CpG-dinukleotider, som er cytosiner der sidder på 5 -enden af guanin. CpG-dinukleotiderne er generelt underrepræsenteret i genomet, men der findes de føromtalte CpG-øer, der er defineret som værende DNAsekvenser, hvor cytosin og guanin-indholdet er større end 55 % [Waggoner, 2007]. Disse øer er bevaret i 1-2 % af genomet, og de varierer i længder fra 200 basepar (bp) til 5 kilobasepar (kb) [[Tang & Ho, 2007] et al., 2007]. Under normale omstændigheder er de fleste af disse øer umethylerede. Dette er dog ikke tilfældet i gener, som er genstand for X-kromosominaktivering. ca. 70 % af CpG-øerne, er associerede med DNA-sekvenser, som er mellem 200 bp og 2 kb lange. Disse DNA-sekvenser befinder sig i promoter-regionerne på ca. 40 % af generne i pattedyr [Waggoner, 2007], hvilket indikerer, at CpG-øerne er en vigtig del af genregulationen. Man har også opdaget en tydelig sammenhæng mellem genernes transkriptionshyppighed og mængden af methylerede CpG-øer i reguleringssekvenserne [[Tang & Ho, 2007] et al., 2007]. Det er især husholdningsgenernes promoter-regioner, som er genstand for methylering på X i, da disse gener normalt udtrykkes i særlig høj grad. Modsat, er de sam- Side 19 af 78

20 me gener på X a hypomethylerede, da ekspression af disse er nødvendige, for at kroppen kan fungere. Det forholder sig imidlertid omvendt med hensyn til methylering af gen body. Her er methylering nemlig observeret i større grad på X a end på X i [Salstrom, 2007]. X-reaktivering Efter en nærmere gennemgang af hvordan X-kromosom-inaktiveringen forløber, vil vi nu fokusere på et andet fænomen, nemlig reaktivering. Vi har valgt at præsentere dette emne i et afsnit for sig, da det vil gøre processerne bag inaktivering og reaktivering så enkle og forståelige som muligt. Hvorfor er der nogle gener på X i, som ikke er inaktiveret? Der er ikke fuldstændig klarhed over hvad der præcist sker, når nogle af generne på det inaktive X-kromosom viser sig at være aktive igen. Det er muligt at de undslipper inaktiveringen og derved forbliver aktive, men det kan også være, at de reaktiverer efter inaktiveringen og derved igen bliver aktive [Brown & Robinson, 2002; Brown & Greally, 2003]. Artiklerne omtaler dette fænomen forskelligt. Nogle beskriver det som en reaktivering, og andre mener, at de undslipper inaktiveringen. Der er dog bred enighed om at 15 % af generne på det inaktive X-kromosom er aktive. Vi vil i dette afsnit generelt beskrive disse 15 % af aktive gener som reaktiverede, dog med undtagelser de steder hvor artiklerne specifikt har beskrevet dem som undslupne gener. Inaktiveringsprocessen er meget stabil i de somatiske celler, og det er kun i fosterets kønsceller, at der findes et udviklingsprogram, der kan gøre processen reversibel [Migeon et al., 2005]. Interessant er det, at nogle X-bundne gener, ca. 15 %, undslipper X-inaktiveringen og derfor er udtrykt i både det aktive og det inaktive X [Franco & Ballabio, 2006; Brown & Greally, 2003]. Der er her tale om gener der stykvis udtrykkes fra det ellers inaktive X- kromosom, da det ikke er hele kromosomet der undslipper, men kun enkelte gener. Undersøgelser har vist, at det i forskellige individer, ikke er fuldstændig de samme gener der er aktive på det ellers inaktive X-kromosom. Nogle gener bliver udtrykt hos én og er inaktive hos en anden, og dette fortæller, at der er et relativt stort antal gener, der har mulighed for at Side 20 af 78

21 blive udtrykt på begge kromosomer [Brown & Greally, 2003]. De gener der er udtrykt på begge kromosomer varierer altså en smule fra individ til individ, men mange af generne der udtrykkes på det inaktive X-kromosom, er de samme. Dette kommer sig af, at nogle gener er nødvendige at have i to kopier for at man kan være rask, og det er sandsynligvis også gener vi deler med Y-kromosomet [Brown & Greally, 2003]. Dette bliver understøttet i en artikel af Carrel og Willard fra 2005, hvor de har fundet ud af at mange af de gener, der undslipper X- inaktiveringen har Y-homologer. Dette er dog ikke alene forklaringen på reaktivering, da det ikke er alle de undslupne gener, der har disse Y-homologer [Carrel & Willard, 2005 og Invernizzi, 2007]. Havde vi kun et aktivt X-kromosom, ville det resultere i "Turner syndrom". Turner piger har kun et X-kromosom, og ovariesvigt er bl.a. et af symptomerne på sygdommen. Da raske kvinder ikke har dette symptom, er det netop pga. reaktivering af nogle af de gener der sidder på det inaktive X-kromosom. Reaktivering associeres med mangel på methylerede CpG-øer på det X-kromosom der skal inaktiveres. Manglende methylering på disse "øer" resulterer i en ustabil inaktivering af X- kromosomet, hvilket betyder, at nogle af generne igen kan blive aktive. De reaktiverede gener replikeres synkront med autosomerne [Migeon et al., 2005]. Som nævnt i inaktiveringsafsnittet spreder Xist sig ud over X-kromosomet og forandrer kromatinstrukturen, så DNA et bliver utilgængeligt for cellens transkriptionsfaktorer. Fejl ved spredning af dette inaktiveringssignal kan muligvis forklare, hvorfor nogle gener undslipper inaktiveringen [Brown & Robinson, 2002]. De gener der undslipper inaktiveringen mangler DNA-methylering, histone-acetylering, histone-methylering og de replikeres desuden tidligt. Der er dog regioner af det inaktive X- kromosom, der synes at være mere eukromatine (aktiv del af kromatinet), end dem der undslipper, og disse regioner burde ifølge teorien være mere tilbøjelige til at blive reaktiveret. Dette fortæller, at det ikke er genernes specifikke egenskaber men nærmere deres placering, der har betydning for, om de undslipper inaktiveringen [Brown & Greally, 2003]. Side 21 af 78

22 Undersøgelser af det humane X-kromosom viser, at nogle gener udviser et varieret inaktiveringsmønster Udover de 15 % der undslipper inaktiveringen og fremstår som fuldt udtrykte gener på det inaktive X, findes der også 10 % X-bundne gener, der udviser et varieret X- inaktiveringsmønster. Dette betyder, at de hverken er fuldstændig inaktiverede eller fuldstændig udtrykte [Carrel & Willard, 2005]. Carrel og Willard har i deres artikel X-inactivation profile reveals extensive variability in X-linked gene expression in females præsenteret en omfattende X-inaktiveringsprofil af det menneskelige X-kromosom, hvor de har undersøgt ca. 95 % af generne i fibroblast (bindevæv). De præsenterer flere forsøg i artiklen, hvoraf en af disse undersøger, hvordan fordelingen af udtrykte gener på det inaktiverede X-kromosom ser ud. Interessant nok var kun 65 % af generne i alle prøverne fuldt inaktiverede. Til gengæld viste ca. 20 % af generne varieret mønster, hvor generne i nogle prøver var inaktiverede, mens de i andre prøver var udtrykte. De resterende 15 % var undslupne gener og var derfor fuldt udtrykte i alle prøverne [Carrel & Willard, 2005]. Deres forsøg gav altså resultater hvor 10 % flere gener end anslået, viste varieret mønster. Nedenfor ses en figur som viser, i hvilken grad de forskellige gener på det inaktive X-kromosom udtrykkes. Side 22 af 78

23 Figur 8. Generne på det inaktive X-kromosoms ekspressionssniveau. Til venstre på figuren ses det inaktive X-kromosom og til højre ses et farveskema. Farveskemaet angiver den procentvise aktivitet af de forskellige gener, og her repræsenterer de røde prikker de mest inaktive gener mens de lilla prikker repræsenterer de mest udtrykte. Det ses på figuren at størstedelen af prikkerne er røde (65 %), hvilket stemmer overens med at størstedelen af generne på det inaktive X- kromosom er inaktive. Ifølge Carrel og Willard udgør de aktive gener de estimerede 15 %, mens de resterende 20 % udgør gener, der er delvist aktive. Kilde: Modificeret udgave. [Carrel & Willard, 2005] Figuren viser genernes ekspressionsniveau på det inaktive X-kromosom. Det er klart, at det ikke er ens i alle væv, og at der kan være afvigelser fra individ til individ, men figuren giver et realistisk billede af, hvordan aktiviteten af generne på det inaktive X-kromosom kan variere. Det er ikke klart hvornår i cellecyklus reaktiveringen foregår, men den menes at finde sted før de oprindelige kønsceller, PGC er (Primordial Germ Cells), kommer ind i meiosen [Migeon et al., 2005]. Side 23 af 78

24 Reaktivering og ICF-syndrom En sygdom, der har forbindelse til reaktivering er den sjældne autosomale recessive sygdom ICF (immunodefieciency centromeric instable facial syndrom), som kun er beskrevet i omkring 50 patienter verden over. Symptomerne på denne sygdom er et deformt ansigt. Derudover er symptomerne væksthæmning, trivselssvigt og "psychomotor retardation", som er en forsinkelse af mentale og fysiologiske processer, der ofte ses i forbindelse med klinisk depression. Desuden består immundefekten, ifølge Ehrlich et al. til internetsiden pubmed, i en centromerisk ustabilitet i kromosomerne 1, 9 og 16 [Ehrlich et al.]. I en artikel af Barbara R. Migeon lægger hun vægt på at ICF er en kromatinsygdom, hvilket vil sige, at det er forstyrrelser på kromatinet, der giver sygdommen. Hun beskriver her, at sygdommen skyldes mutationer på kromosom nr. 20, og disse mutationer påvirker de gener, der koder for DNAmethyltransferase [Migeon, 2007]. Der er bred enighed om at ICF altid involverer begrænset hypomethylering samt mutationer på DNA-methyltransferasegenet DNMT3B. Netop dette gen menes at være ansvarlig for etableringen af CpG-methylering på det inaktive X, og på grund af mutationen på dette gen, mangler patienter med ICF, methylering af CpG-øerne på det inaktive X-kromosom [CsanKovski et al., 2001]. Ifølge Migeon, 2007 har patienter med ICF-syndrom således ikke kun sygdommen pga. mutationen på kromosom nr. 20, men også fordi de udtrykker gener fra det inaktiverede X- kromosom. Hun mener altså at reaktiveringen af ellers inaktiverede gener på X-kromosomet, er medvirkende til at sygdommen opstår. X-inaktiveringsmønster I dette afsnit vil vi fokusere på X-inaktiveringens rolle i forbindelse med X-bundne sygdomme. Inaktiveringsmønsteret er forskelligt fra person til person, og i nogle mennesker kan det være skævt. Dette skæve mønster vil vi komme nærmere ind på efter en kort introduktion til emnet, da det er vigtigt at kende grunden til at sådan et mønster kan opstå. Som beskrevet i de indledende afsnit har kvinder to kopier af X-kromosomet i hver celle, og de betegnes derfor som cellulære mosaikker, da den ene halvdel af deres celler udtrykker proteiner, der er kodet af det maternelle X-kromosom mens anden halvdel udtrykker proteiner, der er kodet af det Side 24 af 78

25 paternelle X-kromosom [Migeon, 2007]. Kvinder har derved en biologisk fordel i forhold til mænd, da de kan inaktivere uønskede gener på det ene X-kromosom. Genetisk baggrund Der foregår rigtig mange interaktioner mellem henholdsvis den maternelle og den paternelle cellepopulation. F.eks. er der et fænomen kaldet metabolic cooperation, hvor normale celler deler genprodukter med andre celler, der mangler dette produkt. Dette ses bl.a. i de X-bundne lysosomale sygdomme Hunter syndrom og Fabry s disease, hvor mænd med disse sygdomme ikke danner nok lysosomale enzymer. I kvindelige bærere af disse sygdomme vil de normale celler udskille de lysosomale enzymer, som herefter kan optages af de muterede celler ved pinocytose. Den metaboliske cooperation gør derved, at kvinden i de fleste tilfælde beskyttes mod at udvikle symptomer på sygdommen [Migeon, 2007]. Det omvendte gør sig gældende i cellulær interferens, som er en negativ konsekvens af at cellepopulationerne deler genprodukter. Den interaktion vi i dette projekt har valgt at fokusere på, er celle-elimination, som også er den mest almindelige måde hvorpå cellerne interagerer. Celle-elimination er et fænomen, hvor en cellepopulation elimineres til fordel for en anden [Migeon, 2007]. Ofte kan der ske en celle-elimination, hvis der i kroppen er to cellepopulationer, hvor den ene bærer på en mutation og den anden population er rask. Her vil de raske celler i langt de fleste tilfælde få en vækstfordel, der gør, at den pågældende cellepopulation vokser. Man har dog også observeret tilfælde, hvor celle-selektionen ikke er til fordel for de normale celler. I sygdommen Adrenal Leukodystrophy har de mutante gener en udviklingsfordel, så de udvikler sig hurtigere end de normale celler. Det samme gør sig gældende for de hurtigtvoksende cancerceller [Migeon, 2007]. Skæv X-inaktivering For det meste hvis kvinder i nogle af deres celler har en mutation på det ene X-kromosom, vil celle-selektionen virke til deres fordel, og det er dette fænomen, vi har valgt at fokusere på i dette projekt. Fænomenet benævnes skewing of X-inactivation, hvilket på dansk kan oversættes til skæv X-inaktivering. Skævheden består i, at der i cellepopulationen vil være en ulige fordeling af aktive og inaktive X-kromosomer fra faderen og moderen. Nedenfor ses en Side 25 af 78

26 figur, der illustrerer henholdsvis den primære tilfældige og den sekundære ikke-tilfældige X- kromosom inaktivering. I den tilfældige X-kromosom inaktivering vil der være en ligelig fordeling af celler med enten det maternelle eller paternelle X-kromosom som værende aktivt. I den ikke-tilfældige X-kromosom inaktivering kan der forekomme en selektion til fordel for det paternelle X-kromosom. De maternelle X-kromosomer vil da blive inaktiveret og inaktiveringsmønsteret vil blive skævt. I nogle tilfælde betegnes skævheden som ekstrem, da kvinderne her vil have det samme X-kromosom aktivt i mindst 90 % af cellerne. Skævheden kan være et resultat af tilfældigheder, men der er større sandsynlighed for, at skævheden skyldes at celler med X-kromosomer der ikke bærer en mutation, får udviklings- og vækstfordele, hvorved den ene cellepopulation reduceres (se figuren nedenfor). Figur 9. Skæv X-kromosom-inaktivering i kvinder. Figuren illustrerer at skæv X-kromosom inaktivering kan forekomme enten fra en primær tilfældig inaktivering eller en sekundær ikke-tilfældig inaktivering. Der er to aktive X-kromosomer i hunkønsembryonet, et fra moderen og et fra faderen (maternel eller paternel; X m (rød) og X p (blå)) Efter inaktivering, vil det ene X kromosom formes til et heterokromatint inaktivt X-kromosom vist på figuren med en mørk farvet cirkel. Cellerne er farvet enten blå eller røde for at vise hvilket X-kromosom der er aktivt. Selektiv vækst af enten den paternelle eller den maternelle cellepopulation fører til skæv X-inaktivering. Hvis der er en mutation i en allel på ét af de to X-kromosomer, så vil X-inaktiveringen ske til fordel for den raske allel. X-inaktiveringen kan dog også ske til fordel for den muterede allel. Kilde: Modificeret udgave. [Minks et al, 2008]. Side 26 af 78

27 I sjældne tilfælde kan skævheden skyldes en mutation i selve Xist-genet, hvilket resulterer i en ustabil inaktivering. Det kan også ske, at et af de to X-kromosomer slet ikke bliver inaktiveret [Migeon, 2007]. Det kan som nævnt både være godt og dårligt, at have et skævt inaktiveringsmønster, da en sådan skævhed både kan være til fordel for den syge og den raske allel på X-kromosomet. Hvis størstedelen af cellerne har valgt at inaktivere X-kromosomet med den raske allel, så vil det være det X-kromosom, som bærer på mutationen, der vil blive udtrykt i langt de fleste celler, og kvinden vil dermed have en større risiko for at udvikle sygdomme, der normalt kun udtrykkes i mænd [Migeon, 2007]. Det er formentlig dette der gør sig gældende, når flere undersøgelser peger på at bærere af X-bundne sygdomme, ofte udviser et skævt X- inaktiveringsmønster [Plenge et al, 2002; Wada et al, 2005 et al.]. Resultater fra disse undersøgelser tyder desuden på, at den skæve X-inaktivering kan være forskellig fra væv til væv, hvilket vi vil komme nærmere ind på senere. I følge Plenge et al er det ikke alle bærere af X-bundne sygdomme der har skæve inaktiveringsmønstre, og Andrew Sharp et al har desuden i en artikel fra år 2000 påvist, at det er helt almindeligt, at normale kvinder kan have skæve og også ekstremt skæve (90:10) inaktiveringsmønstre uden at være bærere eller vise tegn på sygdom. Deres forsøg indikerer desuden, at ældre kvinder har tendens til at være mere skæve end yngre kvinder. Disse opdagelser vil vi vende tilbage til i vores diskussion. Bestemmelse af X-inaktiveringsmønstre Den mest anvendte metode til bestemmelse af X-inaktiveringsmønstre i kvinder, er den androgene receptor-inaktiveringsanalyse. Det er helt essentielt, at man forstår principperne i denne forsøgsmetode, før man kan analysere de opnåede resultater, og vi har derfor valgt at medtage dette afsnit, hvor vi kort præsenterer den vigtigste teori i forbindelse med emnet. På X-kromosomet sidder det androgene receptor-gen HUMARA, hvis primære opgave er at fungere som DNA-bindende transkriptionsfaktor. Genet for den androgene receptor er mere end 90 kb langt, og befinder sig på position Xcen-q13 på kromosomet [Reviewed af Allen et al., 1992]. Genet indeholder en polymorf CAG-gentagelse i det første exon [Reviewed af Al- Side 27 af 78

28 len et al., 1992], og dette udnytter man, når man vil teste, om personer har et skævt inaktiveringsmønster i et bestemt væv (se figuren nedenfor) [Reviewed af Chitnis et al, 2000]. Det at genet er polymorft, betyder at den omtalte CAG-gentagelse i langt de fleste tilfælde, vil variere mellem de to X-kromosomer. CAG-sekvensen på det ene X-kromosom vil derfor oftest være lidt længere end den tilsvarende sekvens på det andet X-kromosom, og dette betyder, at man kan kende forskel på de to kromosomer. Der er dog tilfælde, hvor gentagelserne er identiske, og her må man opgive at teste inaktiveringsmønsteret, da man ikke kan adskille de to kromosomer ud fra de resultater man får. Disse tilfælde bliver af forskere kaldt for uninformative cases [Ozcelik et al., 2006]. Som tidligere nævnt er det inaktive X-kromosom methyleret flere forskellige steder, og et af de steder er ved CAG-gentagelserne i genet for den androgene receptor. Når DNA et er methyleret, kan det ikke klippes i stykker af methyleringssensitive restriktionsenzymer, og dette er en anden ting, man benytter sig af, når inaktiveringsmønsteret skal bestemmes. Første led i metoden hvor genet for den androgene receptor benyttes, er, at det DNA man vil undersøge, klippes i stykker af Hpa II og Hha I - to enzymer der netop er methyleringssensitive. Enzymerne er oplagte at bruge til dette forsøg, da de genkender CpG-dinukleotider, som de kun klipper i stykker, når disse er umethylerede. På denne måde kan man finde ud af, hvilket et X-kromosom der er aktivt og hvilket et, der er inaktivt, da det altid vil være det aktive, ikke-methylerede X-kromosom der klippes i stykker [Allen et al., 1992]. Nedenfor ses en figur som illustrerer, hvordan man med den omtalte metode udnytter, at genet for den androgene receptor er polymorft. Side 28 af 78

29 Figur 10. Denne figur illustrerer, hvordan man opformerer DNA vha. den androgene receptor inaktiveringsanalyse. Øverst kan man se de to alleler, X a og X i. X i er methyleret, og kan dermed ikke klippes i stykker af restriktionsenzymer. X a derimod er umethyleret og denne allel vil derfor blive klippet i stykker. Dette betyder at X a -allelen ikke kan opformeres vha. PCR, fordi DNA-polymerasen ikke kan lave et nyt DNA-stykke, som er langt nok til at blive opformeret. Når man er færdig med at køre PCR på det DNA man vil undersøge, vil det således kun være den inaktive allel som er blevet opformeret. Kilde: Modificeret udgave. [Minks et al., 2008]. Når enzymerne har gjort deres arbejde, skal DNA et opformeres vha. PCR (Polymerase Chain Reaction). Princippet i denne metode er kort fortalt, at man først udsætter DNA et for 95 grader så det denatureres. Herefter nedkøles blandingen, og der tilsættes primere, som er lavet således, at de vil binde sig til enderne af det DNA, der skal opformeres. Nu tilsættes polymerasen og nukleotiderne, så opformeringen kan gå i gang. De forskellige trin sker ved bestemte temperaturer, og hele processen gentages indtil man har nok DNA at arbejde med [Campbell & Reece, 7. udgave]. Når DNA et er blevet klippet i stykker af de omtalte restriktionsenzymer, og man har kørt PCR tilstrækkelig mange gange, kan man vælge at loade PCR-produktet på en gel eller man Side 29 af 78

30 kan anvende fluorescense-metoden. Vi vil ikke komme nærmere ind på disse metoder, men blot nævne at de begge bruges til at adskille DNA-strengene efter deres størrelse. Vi vil også nævne, at fluorescense-metoden er den letteste at bruge, idet resultaterne her vises i form af kurver på en computer, under hvilke arealet kan måles præcist. Ved den anden metode kan man anvende programmer, som kan måle intensiteten af båndene, men dette er ikke helt så præcist som flourescense-metoden. Figuren nedenfor viser resultaterne fra to forsøg, hvor der i det ene er brugt en gel-elektroforese mens der i det andet forsøg er anvendt en fluorescensmåling. Side 30 af 78

31 Figur 11. Øverst ses resultaterne fra en gel-vandring. De 3 grå rækker under hinanden er resultaterne fra 3 forskellige personer. M et står for markør, og båndene helt ude til venstre er således markører i forskellige størrelser. + et betyder at DNA et er blevet klippet med enzym, og - betyder at det ikke er klippet med enzym. Resultaterne fra blodet viser, at inaktiveringsmønsteret er ekstremt skævt i alle personerne. Dette kan man se, fordi det ene bånd er meget kraftigere end det andet, efter at DNA et har fået tilsat Hpa II. Dette ene bånd er fra det inaktive X-kromosom, da dette er methyleret, og derfor ikke er blevet klippet i stykker af restriktionsenzymet. DNA et fra det aktive X-kromosom derimod er umethyleret, og her har Hpa II klippet midt i genet for den androgene receptor, hvilket betyder, at polymerasen ikke kan kopiere DNA-sekvensen. Når DNA-sekvensen ikke kan kopieres vil der ikke komme noget PCR-produkt fra det aktive X-kromosom. Hvis man kigger på det DNA fra hårprøverne, som er klippet med enzym, kan man se, at de to alleler er mere ligeligt fordelt, da båndene er nogenlunde lige tydelige i alle personerne. Resultaterne fra thyroidbiopsien øverst på figuren viser at fordelingen af de to alleler ca. er 70:30, da det ene bånd er meget kraftigere end det andet. På den nederste figur til højre kan man se resultaterne fra en fluorescensmåling. A eren viser, hvordan kurverne kan se ud, når der er tale om tilfældig inaktivering. Højden af kurverne angiver intensiteten af hver allel, og to lige høje kurver betyder således at begge alleler er udtrykt i lige stor grad. Her er det igen det DNA der er klippet med enzym (de nederste kurver), som fortæller hvad fordelingen af de to alleler er. I midten ses en skæv fordeling. Her er der ca. en fordeling på 90:10 efter at DNA et er behandlet med enzym. Til sidst ses en kontrol fra en mand. Her er det intet PCR-produkt efter enzymbehandling, og det skal der heller ikke være, da mænd kun har ét X-kromosom, der altid vil være aktivt. Kilde: Figuren til venstre er en modificeret udgave [Ozcelik et al., 2006]. Figuren til højre er en modificeret udgave [Brix et al., 2005]. Side 31 af 78

32 Når man opformerer DNA-prøver fra en kvinde med et skævt X-inaktiveringsmønster, vil den ene, mest hyppige allel blive opformeret i større grad end den anden [Allen et al., 1992], og dette vil vise sig som et kraftigere bånd eller en højere kurve, afhængigt af om der er tale om en gel-vandring eller en fluorescensmåling. Dette fremgår også af figuren ovenfor. Ved "random" eller tilfældig inaktivering vil allelerne have samme intensitet efter enzymbehandling, hvilket vil vise sig ved to lige kraftige DNA-bånd eller to lige høje kurver. En ting man skal tage højde for, når aktiviteten af de to alleler skal udregnes, er at der kan være tale om allelspecifik konkurrence, hvor den ene allel opformeres lettere og hurtigere end den anden. Man kan korrigere for denne allelspecifikke konkurrence ved først at opformere DNA-prøverne, uden at tilsætte enzym. Når man gør det, kan man, hvis man f.eks. har brugt fluorescensemetoden, sammenligne arealerne under de to kurver. Hvis kurverne ikke er lige store, er der tale om allel-specifik konkurrence. Oftest vil den korteste sekvens blive opformeret hurtigere end den længere sekvens, og det er dette man skal tage højde for, når man skal udregne aktiviteten af allelerne. Det kan nemlig ske, at den allel som viste det største areal før enzymerne blev tilsat, pludselig er lige så stor som den anden kurve. Her er det så, at man skal huske at den korteste allel, som før havde den største kurve, er den allel som er mest aktiv, da arealet skulle have været større end arealet under den anden kurve, hvis de skulle have været lige aktive Introduktion til sygdomsafsnit I dette afsnit vil vi kort præsentere læseren for de sygdomme, vi har valgt at fokusere på i projektet. Vi vil kun koncentrere os om, hvordan sygdommene kommer til udtryk hos kvinder, og da X-inaktiveringen er et meget komplekst fænomen, har vi udvalgt forskellige X-bundne sygdomme, hvor det er tydeligt, at X-inaktiveringsmønsteret har stor indflydelse på det fænotypiske udfald. Vi har også valgt at medtage en gruppe af sygdomme, som ikke er X- bundne, men som man mener også har forbindelse til X-inaktiveringsmønsteret, og disse præsenterer vi til sidst i dette afsnit. Vi vil starte med at beskrive et studie af en række kvinder, som bærer på en mutation, der forårsager mental retardering, og som derfor falder ind under betegnelsen XLMR-sygdomme (X-Linked Mental Retardation). Dette har vi valgt at gøre, da studiet viser en klar tendens til, Side 32 af 78

33 at alle de raske bærere har et skævt inaktiveringsmønster til fordel for den raske allel. Efter gennemgangen af dette studie, vil vi fremhæve et andet studie af en bestemt form for XLMRsygdom, ATR-X. Dette gør vi fordi, studiet bekræfter, at det kan gå galt, hvis ikke de kvindelige bærere danner det skæve inaktiveringsmønster til fordel for den raske allel. Man har ved dette studie desuden gjort sig en interessant observation, som vi vil vende tilbage til i afsnittet om ATR-X. De XLMR-sygdomme vi er kommet ind på indtil nu er begge recessive X- bundne sygdomme, som normalt kommer til udtryk hos mænd, men som altså også kan udtrykkes hos kvinder. En anden X-bundet recessiv sygdom, hvor det samme gør sig gældende, er Duchenne muscular dystrophy. Denne sygdom er interessant idet en undersøgelse af et par tvillinger, bekræfter at X-inaktiveringsmønsteret har stor betydning for det fænotypiske udfald af en sygdom. En sidste X-bundet recessiv sygdom vi vil beskrive, er hæmofili. Undersøgelser af tvillinger med denne sygdom har såvel som de andre omtalte sygdomme frembragt nogle yderst interessante resultater, som vi vil komme nærmere ind på i afsnittet om hæmofili. Da vi vil komme så godt rundt om emnet som muligt, har vi valgt også at medtage den X- bundne dominante XLMR-sygdom Rett. Denne sygdom er et eksempel på en sygdom, hvor X-inaktiveringsmønsteret ikke altid kan forklare det fænotypiske udfald. Det er en meget kompleks sygdom, hvis karakter man endnu ikke har fuld forståelse for. Da undersøgelser af denne sygdom har ført nogle interessante hypoteser med sig, har vi valgt at beskrive denne som sidste led i kategorien X-bundne sygdomme. Grunden til at vi ikke præsenterer den i forlængelse af de andre XLMR-sygdomme er, at den er så kompleks og utilregnelig. En sidste gruppe vi vil beskrive, er de autoimmune sygdomme. Det har vist sig, at X- inaktiveringsmønsteret muligvis kan være skyld i, at autoimmune sygdomme udvikles, og dette er en problemstilling, som er yderst relevant i denne sammenhæng. Det er samtidig en sygdom som falder uden for kategorien X-bundne sygdomme, og af denne grund har vi valgt at præsentere afsnittet om autoimmune sygdomme til sidst. Side 33 af 78

34 Mental retardering Hvad er mental retardering? Mental retardering går ind i kategorien af XLMR-sygdom (X-Linked Mental Retardation) og kendetegnes ved markant nedsatte intellektuelle funktioner og en manglende evne til tilpasning. X-bundet mental retardering kan opdeles i tre klasser: X-bundne recessive og delvist dominante lidelser (syndromer, neuromuskulære sygdomme og stofskifte sygdomme), X- bundne dominante dødelige sygdomme og uspecifikke XLMR-sygdomme [Reviewed af Plenge et al, 2002]. Børn under 5 år kan være forsinkede i udvikling, eller de kan være decideret udviklingshæmmede, men det er først efter 5 årsalderen, at man kan karakterisere et barn som mentalt retarderet. En lille gruppe af mentalt retarderede kan identificeres relativt tidligt. Det gælder blandt andet tilstande som Downs syndrom, Edward syndrom og føtalt alkohol syndrom [Internetside nr. 1]. Hvorfor opstår mental retardering? Det er ændringer i hjernefunktionen som forårsager forsinket udvikling og mental retardering. Disse ændringer kan opstå på baggrund af biologiske, sociale og miljømæssige faktorer. De biologiske faktorer som ofte fører til mental retardering er mutationer på X-kromosomet. Det er det fordi dette kromosom indeholder mange kognitive gener, dvs. gener der er ansvarlige for udviklingen af de mentale processer, som er medvirkende til at danne associationer, begreber og indsigtskrævende indlæring hos mennesket. Det kan således være genetisk bestemte abnormiteter i hjernens struktur samt dysfunktion af centralnervesystemet, som fører til den mentale retardering. Denne dysfunktion kan være medfødt eller den kan udvikles. De sociale og miljømæssige faktorer kan blandt andet være toksiske substanser som overføres fra moder til foster eller fra omgivelserne til fosteret [Internetside nr. 1]. I dette projekt vil vi fokusere på de genetiske faktorer, da det har størst relevans i forhold til vores problemformulering. Flere forskningsresultater tyder som nævnt i afsnittet om skæv X-inaktivering på en øget tendens til skæve X-inaktiveringsmønstre hos bærere af X-bunden mental retardering [Raynard et al, 2000, Plenge et al, 2002 m.fl.], og disse resultater vil vi uddybe i følgende afsnit. Side 34 af 78

35 Påvisning af skæve X-inaktiveringsmønstre hos bærere af XLMRmutationer For at undersøge sammenhængen mellem skæv X-inaktivering i perifere blodceller og XLMR, studerede Plenge et al. 24 familier der kunne adskilles i tyve forskellige former for XLMR-sygdomme [Plenge et al, 2002]. Forskerne bestemte, ved hjælp af den tidligere beskrevne androgene receptor X-inaktiveringsanalyse inaktiveringsmønstre i alle kvinder i de tyve familier, både bærere og ikke-bærere (n = 155 kvinder). For at kunne sammenligne resultaterne med normale kvinder, bestemte forskningsgruppen endvidere X- inaktiveringsmønstre i en kvindelig kontrolgruppe (n = 205 kvinder). Nedenfor ses resultaterne fra deres undersøgelser. Figur 12. Figuren viser X-inaktiverings mønstre fra bærere af XLMR sygdomme. Figur (a) øverst viser toppe fra DNA-prøverne, der ikke er blevet tilsat restriktionsenzymet HpaII og repræsenterer derfor det uklippede DNA fra tre kvinder fra kontrolgruppen og fra en mandlig kontrol. De nederste kurver repræsenterer det klippede DNA, hvor der er tilsat restriktionsenzymet HpaII efter PCR. Den øverste figur til venstre viser, at kurverne er henholdsvis 45 % og 55 % aktive. Kurverne hos mænd forsvinder, da den ikke-methylerede allel på hans ene aktive X bliver klippet helt i stykker af restriktionsenzymet. Figur (b) viser fordelingen af X-inaktiveringsmønstre for XLMR bærere (sorte cirkler), ikke-bærere (ikke-sorte cirkler) og for kontrolgruppen (ikke-sorte cirkler). n = antallet af kvinder i de enkelte grupper. Kilde: Modificeret udgave. [Plenge et al, 2002]. Side 35 af 78

36 På figur 12 ses illustrative eksempler på X-inaktiveringsmønstre hos tre kvinder og en mand. Fordelingen af X-inaktiveringsmønstre for XLMR bærere (n = 94) og ikke-bærere (n =61) er vist på figur B. Omkring 9 % af kvinderne i kontrolgruppen viser et skævt X- inaktiveringsmønster der betegnes 80:20. Dette forhold henviser til den procentvise fordeling af henholdsvis inaktive og aktive X-kromosomer i kvindens celler. Dette stemmer godt overens med tidligere studier [Reviewed af Plenge et al, 2002] og med Sharp et als (2000) studier af normale kvinders inaktiveringsmønstre. Til sammenligning viser omkring 50 % af XLMR-bærere skæve X-inaktiveringsmønstre på 80:20 (se figur 12 og tabel 1 ). Tabel 1 viser frekvensen af skæv X-inaktivering ved tre udvalgte X-inaktiveringsmønstre. Resultaterne viser endvidere at næsten en tredjedel XLMRbærere viser et ekstremt skævt X-inaktiveringsmønster på 90:10 sammenlignet med kun få procent i kontrolgruppen. FREKVENS AF SKÆV X-INAKTIVERING (%) X-INAKTIVERINGS- MØNSTER Kontrolgruppen XLMR ikke-bærere XLMR bærere 90: : : Tabel 1. viser frekvensen af skæv X-inaktivering (%) fra undersøgelserne af tre udvalgte X-inaktiverings mønstre hos henholdsvis kontrolgruppen, XLMR ikke-bærere og XLMR bærere [Plenge et al, 2002]. For at finde den statistiske fordeling af X-inaktiveringsmønstre har forskningsgruppen lavet en χ 2 test, der sammenligner antallet af kvindelige bærere over og under de udvalgte tresholds ( 90:10, 80:20 og 70:30) Den statistiske signifikans (P-værdien) er sat til P < 0,01. Resultaterne fra XLMR ikke-bærere var ikke statistisk signifikante, men det var resultaterne fra XLMR-bærere i høj grad (P < 0,001). Kilde [Plenge et al, 2002]. Diskussion af forskningsresultaterne Resultaterne tyder på, at skæv X-inaktivering i perifere blodceller er et karakteristisk træk for XLMR-bærere [Plenge et al, 2002]. Resultaterne stemmer således godt overens med, at der sker en sekundær selektion, efter det tilfældige X-inaktiveringsmønster er blevet dannet. Ovennævnte undersøgelse viser at alle de kvindelige bærere, der udviser et skævt X- inaktiveringsmønster, havde XLMR-mutationen på det inaktiverede X-kromosom [Plenge et al, 2002], hvilket viser at celleselektionen er sket til fordel for den raske allel. Side 36 af 78

37 Spørgsmålet er, om dette skæve X-inaktiveringsmønster, er specifikt for bestemte klasser af X-bundne mutationer (f.eks. en XLMR-mutation) eller om fænomenet generelt kan overføres til mutationer i alle X-linkede gener. Disse forskningsresultater sammenfattet med tidligere studier tyder på, at det skæve X-inaktiveringsmønster er specifikt for bestemte typer af mutationer, der kan forbindes med bestemte klasser af X-bundne sygdomme [Reviewed af Plenge et al, 2002]. For at understrege at det skæve X-inaktiveringmønster ikke knytter sig til alle X-bundne sygdomme, ønsker vi også at inddrage eksempler på X-bundne sygdomme, hvis bærere ikke udviser det karakteristiske skæve mønster. Plenge et al. fremhæver X-bunden recessiv Duchenne muscular dystrophy (DMD) som et eksempel på dette. Det gør de på baggrund af egne undersøgelser af X-inaktiveringsmønstre hos raske bærere af DMD der viser, at de ikke afviger med en statistisk signifikant forskel fra kontrolgruppen [Plenge et al, 2002]. I det efterfølgende afsnit vil vi dog først præsentere en anden form for X-bundet mental retardering, der viser, hvorledes en ufuldstændig X-inaktivering kan komme til udtryk. ATR-X syndromet Hvad er ATR-X og hvorfor opstår det? ATR-X (α-thalassemia/mental Retardation Syndrome) er en form for X-bundet mental retardering, der forårsages af en mutation i ATRX-genet. Syndromet forekommer hos drenge og karakteriseres blandt andet ved indlæringsvanskeligheder, et karakteristisk deformt ansigt og en sjælden form for anæmi, kaldet α-thalassemia, der viser sig ved hæmoglobin H- (HbH) inklusioner i patienternes blod [Internetside nr. 2]. I dette afsnit vil vi tage udgangspunkt i et nyere studie af Wada et al (2005) der bekræfter, at et ikke-skævt X-inaktiveringsmønster hos bærere af ATR-X kan give sygdomssymptomer hos kvindelige bærere [Wada et al, 2005]. Ikke-skæv X-inaktivering kan resultere i sygdomssymptomer hos kvinder De eksperimentelle resultater fra Wada et als undersøgelser af ni kvindelige ATR-X bærere viser, at seks bærere har et skævt X-inaktiveringsmønster til fordel for den raske allel ( 90:10). To bærere kunne ikke afklares og én kvindelig bærer har et ikke-skævt X- inaktiveringsmønster (72:28) [Wada et al, 2005]. Den sidstnævnte ikke-skæve bærer af ATR- Side 37 af 78

38 X-mutationen udviser symptomer på sygdommen idet hun er moderat mentalt retarderet. Hun viser imidlertid ingen tegn på HbH-inklusioner i blodet, der ellers er et karakteristisk symptom på denne sygdom. Dette er interessant, da man ikke umiddelbart kan forklare, hvorfor blodet ikke er blevet påvirket, af den mutation hun bærer på. Wada et al mener, at kvindens moderate mentale retardering men manglende HbH-inklusioner kan forklares ved, at der er tale om celletype-specifik inaktivering. Med celletype-specifik mener forskerne her, at inaktiveringen af det syge X-kromosom kan være ufuldstændig i hjernevævet, mens den i andre væv kan være fuldstændig. Det kan således være, at ekspressionen af normalt protein i kvindens neuroner er forringet mens den raske allel er til stede i favorable mængder i blodcellerne, således at disse ikke er påvirkede. Da hjernen er det organ, som er mest påvirket af sygdommen, har Wada et al opstillet en hypotese som går ud på at neuroner, i hvilke vildtype-allelen er inaktiveret, har en signifikant selektiv vækstulempe som påvirker deres udvikling [Wada et al., 2005]. Det er meget svært at bestemme X-inaktiveringsforhold i hjernen, og det er nødvendigt at undersøge om denne celletype-specifikke X-inaktivering også gør sig gældende i den kvindelige bæreres mesodermale- (blodceller), endodermale- (epithelceller) og ektodermale- (hårceller) væv, før man kan drage nogen endelige konklusioner [Wada et al, 2005]. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) Hvad er DMD? "Duchenne muscular dystrophy" (DMD) er en X-bundet recessiv form for muskelsvind, som karakteriseres ved reduceret muskelmasse og et progressivt tab af muskelfunktion hos drenge. Symptomerne kommer som regel før seks års alderen, og efterhånden som sygdommen udvikler sig, svinder muskelmassen og erstattes af bindevæv og fedtvæv. De fleste patienter får brug for en rullestol omkring 12 års alderen, og dør før de når 30 år. Kvinder kan være bærere, men oplever generelt ikke symptomer på sygdommen [Internetside nr. 3]. Vi vil i afsnittet om DMD tage udgangspunkt i en undersøgelse af Richards et al, der har undersøgt et par kvindelige tvillinger, der begge er bærere af DMD, men hvor kun den ene har udviklet symptomer på sygdommen. Sygdommen er opstået de novo i moderens kimceller, hvilket vil sige, at det er en mutation, der er opstået i børn af raske forældre. I det følgende vil Side 38 af 78

39 vi kort beskrive de fysiologiske og genetiske årsager til at DMD opstår, hvorefter vi vil inddrage resultater fra undersøgelsen af DMD hos tvillinger. Hvorfor opstår DMD? - Fysiologiske og genetiske årsager DMD forårsages af en mutation i et specifikt gen på X-kromosomet, der regulerer dannelsen af proteinet dystrophin. Dystrophin er et vigtigt protein i muskelceller, som man mener, er medvirkende til at styrke muskelceller ved at forankre elementer fra det indre cytoskelet til cellemembranen (se figur 16). Sker der en mutation i det gen på X-kromosomet der regulerer dannelsen af dystrophin, vil cellevæggen blive permeabel for extracellulære komponenter. Dette vil forøge cellens intercellulære tryk så muskelcellen med tiden brister og dør. Den efterfølgende immunrespons vil forstærke nedbrydningen af muskelvævet [Internetside nr. 4]. Figur 13. Figuren viser et tværsnit af en muskel, der består af bundter af mindre muskelfibre. Hver enkelt muskelfiber er omgivet af en muskelfiber membran. Omkring muskelcelle membranen sidder der en række proteiner, som er essentielle for at musklen kan fungere normalt. I forbindelse med disse proteiner sidder dystrophin-proteinet (markeret med gul). Hvis ét af proteinerne forsvinder, eller ikke virker optimalt, kan det forårsage sygdommen duchenne muscular dystrophy. Kilde: [Internetside H] Side 39 af 78

40 Uensartet X-inaktivering i kvindelige tvillinger med DMD Undersøgelser af X-inaktiveringsmønstre hos monozygote (enæggede) tvillinger der begge er bærere af DMD, viser, at begge kvinder har et skævt inaktiveringsmønster. Den ene tvilling er rask, mens den anden tvilling har mange symptomer på DMD [Richards et al, 1990]. Ifølge teorien vil kvindelige bærere af mutationer som oftest inaktivere det X-kromosom, hvorpå mutationen sidder. I dette tilfælde viser de eksperimentelle studier dog, at det maternelle X- kromosom fortrinsvis er inaktiveret hos tvillingen uden symptomer, mens det paternelle X- kromosom fortrinsvis er inaktiveret i tvillingen med DMD-symptomer [Richards et al, 1990]. Analyser af udtrykt dystrophin i tvillingernes muskelceller, tyder endvidere på, at det er en uensartet X-inaktivering der forårsager de to tvillingers forskellige fænotyper [Richards et al, 1990]. Da den syge tvilling er skæv til fordel for den syge allel, tyder det på, at kvinder først udvikler DMD, når det i overvejende grad er det syge X-kromosom som er aktivt. Ovenstående resultater sammenfattet med andre undersøgelser af monozygote tvillinger tyder på, at de trods deres identiske arvemateriale, kan have en uensartet X-inaktivering [Reviewed af Richards et al, 1990]. Dette fænomen kobles, af flere forskere, til den såkaldte twinning proces. Det vil sige den proces, hvor zygoten deles i to og danner to voksende organismer. Burn et al (1986) har fremstillet en hypotese om, at tilfældig X-inaktivering vil producere områder med cellepopulationer, hvor det paternelle X-kromosom er inaktiveret og områder med cellepopulationer, hvor det maternelle X-kromosom er inaktiveret. Disse to cellepopulationer vil da se hinanden som fremmede og vil derfor separere til to forskellige organismer [Reviewed af Richard et al, 1990]. Denne hypotese vil dog ikke kunne forklare mandlig tvillingedannelse, idet mænd kun har ét X-kromosom. Richards et al har ikke undersøgt hvornår tvillingedannelsen i de undersøgte tvillinger har fundet sted og flere undersøgelser tyder på, at tvillingedannelse og X-inaktivering sker på forskellige tidspunkter i embryonets udvikling [Richards et al, 1990; Brown & Robinson, 2000]. Der er dog enighed om, at tvillingedannelsen og X-inaktivering kan være koblet på en eller anden måde, sådan at den ene proces måske fører til den næste [Reviewed af Richards et al, 1990]. Side 40 af 78

41 Hæmofili blødersygdom I dette afsnit vil vi introducere læseren for sygdommen hæmofili. Vi vil fokusere på mutationer der resultere i, at kvinder får symptomer på sygdommen og give eksempler på, hvordan sygdommen kommer til udtryk hos forskellige kvinder. Vi vil i dette afsnit også tage udgangspunkt i studier af kvindelige monozygote tvillinger, da disse eksempler, er gode til at illustrere X-inaktiveringsmønsterets betydning for det fænotypiske udfald. Hvad er hæmofili? Hæmofili er en blødersygdom, som karakteriseres ved mangel på koagulationsfaktorer i blodet. Patienter med denne sygdom bløder derfor længere tid end normale mennesker, og nogle af dem kan endda have spontane blødninger. Sygdommen er desuden også kendt for at give led og muskelblødninger [Internetside nr. 5]. Hæmofili er en recessiv X-bundet sygdom, som primært rammer mænd. Kvinder kan være bærere af sygdommen, og får kun i sjældne tilfælde symptomer [Schröder et al, 1997 og Chan et al, 1998]. Dette skyldes ligesom i andre X-bundne sygdomme, at kvinder har mulighed for at lukke ned for det syge X-kromosom ved inaktivering. På trods af at sygdommen er genetisk arvelig, er 30 % af hæmofili-tilfældene ikke tidligere registreret i familien. Dette kan skyldes, at moderen er bærer uden at vide det, eller det kan skyldes spontane genmutationer [Internetside nr. 6]. Sygdommen kan opdeles i to grupper, hæmofili A og B. Patienter med hæmofili A mangler, eller har begrænset, koagulationsfaktor VIII. Denne udgave rammer ca. 1 ud af Hæmofili B er mere sjælden og rammer ca. 1 ud af Patienter med denne udgave mangler eller har i begrænset mængde koagulationsfaktor IX [Internetside nr. 5]. Der findes 12 koagulationsfaktorer i menneskets blod, som opdeles efter romertal. Mangel på de to omtalte faktorer giver hæmofili A og B hvor mere sjældne blødersygdomme skyldes mangel på de andre koagulationsfaktorer. Disse mere sjældne blødersygdomme er dog ikke X-bundne, og vi vil derfor ikke beskæftige os med dem. For at få en fornemmelse af hvordan fordelingen af blødersygdomme ser ud, bringer vi her et skema over danske patienter med blødersygdomme. Side 41 af 78

42 Personer med blødersygdomme i Danmark, 2006 Hæmofili A 352 Hæmofili B 93 Von Willebrand 334 Andre blødersygdomme 109 Tabel 2. Skema over personer med blødersygdom i Danmark 2006 På skemaet ses det at Hæmofili A er mere udbredt end hæmofili B. Tilsammen udgør hæmofili (A og B) den mest udbredte blødersygdom i forhold til Von Willebrandt og andre mere sjældne blødersygdomme. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside I]. Ud over de to grupper af hæmofili opdeles sygdommen i yderligere tre grupper, efter hvor svære symptomerne er. Patienter der er hårdest ramt, med 0 1 % koagulationsfaktor i blodet, har det man kalder svær hæmofili. Disse patienter kan få spontant opstående blødninger. Patienter med 1 5 % koagulationsfaktor har moderat hæmofili, mens den sidste gruppe med mild hæmofili har 5 45 % koagulationsfaktor. Patienter med mild hæmofili mærker som regel ikke meget til sygdommen, der for det meste viser sig ved længere blødninger i forbindelse med tandudtræk eller andre operationer [Internetside nr. 5.]. X-inaktivering og hæmofili Som tidligere nævnt er det sjældent, at kvinder udtrykker symptomer på sygdommen, da det er en recessiv X-bundet sygdom. Alligevel er der registreret adskillige eksempler på kvinder med hæmofili A eller B [Schröder et al, 1997]. Det er særligt interessant i vores tilfælde, at se på de genetiske processer, der ligger til baggrund for, at netop disse kvinder får udtrykt symptomer. Der er en række faktorer, der kan have betydning for, om kvinder får symptomer på hæmofili. En af disse er en ekstremt skæv inaktivering, hvor det stort set kun er det syge X-kromosom der er aktivt. Der er meget usikkerhed omkring hvorfor disse kvinder har ekstrem skæv inaktivering til fordel for det syge X-kromosom, og årsagen er ikke umiddelbart klarlagt. Udover ekstrem skæv inaktivering, følger en række andre årsager; såsom forskellige former for muta- Side 42 af 78

43 tioner, mangel på det ene X-kromosom (turner syndrom), uregelmæssigheder på X- kromosomerne eller til sidst hvis begge forældre har sygdommen [Chan et al, 1998]. Vi vil nu skildre en række eksempler på hæmofili-kvinder med forskellig baggrund for sygdommens opståen. Artiklerne vi har brugt til at belyse fænomenet hæmofili hos kvinder, er af ældre dato, men det har ikke været muligt at finde nogle der var helt nutidige. Af de artikler der er brugt, er størstedelen fra slutningen af 1990 erne, og der må derfor tages forbehold for, at de problematikker de har, i forhold til noget af den viden de præsenterer, kan være blevet udvidet siden hen. Undersøgelse af et tvillingepar med svær hæmofili Et eksempel på ekstrem skæv inaktivering er fra en artikel af Schröder et al fra 1997, hvor et tvillingepar begge udtrykker svær hæmofili B. Deres far havde også svær hæmofili B, og det er pga. ekstrem skæv inaktivering af det maternelle X-kromosom, at pigerne udtrykker symptomer på sygdommen. Faderen til tvillingerne er død, og det var derfor ikke muligt for dem at undersøge ham eller hans baggrund. Derfor kunne det heller ikke klarlægges, hvordan sygdommen er nedarvet. Da det er kendt at faderen havde hæmofili B i svær grad, har vi valgt at præsentere et muligt nedarvningsskema nedenfor, der giver en ide om hvordan sygdommen kan være nedarvet. Side 43 af 78

44 Figur 14. Nedarvningsskema over de kvindelige tvillinger med svær hæmofili B. På figuren ses det at faderen til tvillingerne har hæmofili og er derfor markeret med grå. Moderen er derimod hvid og er derfor helt rask. Tvillingerne har fået et X-kromosom fra hver, og bærer derfor sygdommen på det ene X-kromosom, men udtrykker også sygdommen. Det er meget sandsynligt at faderen har haft hæmofili B i familien, men fordi man ikke har kunnet undersøge hans baggrund, er det usikkert hvorledes hans sygdomsgenetik har set ud og figuren er derfor kun et eksempel på hvordan det kunne se ud. Kilde: Modificeret udgave [Schröder et al, 1997]. Moderen og tvillingernes IX-koagulationsfaktor og deres inaktiveringsmønster blev bestemt. Moderen viste normale værdier af IX-faktoren og havde et normalt inaktiveringsmønster. Tvillingerne viste derimod ekstrem skæv inaktivering af det maternelle X-kromosom, samt et næsten ikke eksisterende IX-faktor-niveau under 2 %. Moderen er derfor afbilledet på figuren som rask, og hendes forældre er også afbilledet som raske selvom hendes mor hypotetisk set godt kunne være bærer. Figuren giver derfor kun en illustration af, hvordan sygdomsgenetikken for tvillingerne kan se ud. Da Schröder et al ikke kunne fremvise nogen beviser for, hvad der er ansvarlig for den ekstremt skæve inaktivering, giver de nogle mulige forklaringer. De mener, det kan være uregelmæssigheder på X-kromosomet eller et specifikt inaktiveringsmønster der nedarves ens i generationer [Reviewed af Schröder et al, 1997]. Schröder et al mener dog, at forklaringen på den ekstremt skæve X-inaktivering skal findes ved selve det, at patienterne er tvillinger (se afsnittet om DMD). Dette understøttes ved at henvise til flere andre rapporter hvor kvindelige tvillinger har udvist ekstremt skæv X-inaktivering [Reviewed af Schröder et al, 1997]. Side 44 af 78

45 Undersøgelse af et hæmofiliramt tvillingepar med raske forældre Et andet eksempel på tvillinger med hæmofili er fra en artikel af Valleix et al fra Artiklen beskriver et tvillingepar med hæmofili A, hvor ingen af deres forældre har sygdommen, og denne er således opstået de novo ligesom det var tilfældet med DMD-eksemplet. Tvillingerne har desuden en rask søster, som ikke er bærer af sygdommen. Endvidere er sygdommen udtrykt i forskellig grad hos de to tvillinger, da deres inaktiveringsmønstre er lidt forskellige. Den ene tvilling er mere skæv til fordel for den syge allel end den anden og har således en sværere grad af hæmofili. For at kunne bestemme hvad der helt præcist forårsagede hæmofili A i tvillingerne, blev der foretaget molekylære undersøgelser af deres DNA, og her fandt man en mutation hvor et basepar var blevet udskiftet på protein VIII-faktor-sekvensen. Denne mutation fandtes ikke hos andre i familien og er desuden, af andre, blevet sat i forbindelse med hæmofili A [Reviewed af Valleix et al, 2002]. Da begge tvillinger har sygdommen og desuden, i langt de fleste celler, har lukket det maternelle X-kromosom ned, er det blevet konkluderet at mutationen på VIII-faktoren må stamme fra det paternelle X-kromosom [Valleix et al, 2002]. Nedenfor ses en figur som viser resultaterne fra undersøgelsen. Side 45 af 78

46 Figur 15. Figur over familiens inaktiveringsmønster. På figuren er X-kromosomerne markeret som de blå toppe, og inaktiveringen er markeret som de sorte toppe. Faderens X-kromosom har en sort prik ud fra sig og moderens har henholdsvis en hvid og en sort trekant ud fra sine X-kromosomer. Det ses på figuren, at den raske datter har fået det X-kromosom med den hvide trekant fra moderen, og har en nogenlunde ligelig fordeling af X-inaktivering på begge X- kromosomer. Tvillingen med svær hæmofili A, har det X-kromosom med sort trekant fra moderen og har desuden inaktiveret størstedelen af det maternelle X-kromosom. Det samme gør sig gældende for tvillingen med mild hæmofili A. Kilde: Modificeret udgave. [Valleix et al, 2002]. Tvillingerne har fra deres moder ikke modtaget det samme X-kromosom, som deres raske søster har. Da det må være en de novo mutation på det paternelle X-kromosom, som har givet tvillingerne hæmofili, er det umiddelbart logisk, at deres søster er rask. Det er det fordi, denne mutation ikke findes på hendes paternelt nedarvede X-kromosom som ellers bærer på akkurat de samme gener. Der er imidlertid nogle løse ender i denne undersøgelse, da man ikke kan forklare hvorfor tvillingerne, i de fleste celler, har valgt at inaktivere X-kromosomet fra moderen, når det er det paternelt nedarvede X-kromosom som har givet dem hæmofili. Valleix et al skriver ikke noget om, hvad der kan have forårsaget, at det maternelle X-kromosom i størstedelen af cellerne er blevet lukket ned. Vi synes derfor, at dette kunne være en interessant problemstilling at se på, da det blandt andet er her forklaringen på tvillingernes hæmofili skal findes. Dette vil vi derfor uddybe i diskussionen. Side 46 af 78

47 Begge undersøgelserne af de hæmofiliramte tvillinger viser, at de alle har et ekstremt skævt inaktiveringsmønster til fordel for det syge X-kromosom, og dette indikerer, at kvinder ligesom kvindelige bærere af DMD sandsynligvis først får symptomer på sygdommen, når det i overvejende grad er det syge X-kromosom som udtrykkes. Rett-syndrom Hvad er Rett? Rett er en X-bunden dominant form for XLMR-sygdom, som rammer det centrale nervesystem og forårsager mere eller mindre alvorlige udviklingsmæssige komplikationer. Ofte er personer med sygdommen mentalt underudviklede, og Rett betragtes derfor som den anden mest almindelige anledning til udviklingen af mental retardering næst efter Downs syndrom [Reviewed af Weaving et al., 2004; Renieri et al., 2003]. Sygdommen blev først opdaget i 1966 af Dr. Rett, da han gentagne gange observerede den samme karakteristiske adfærd hos 22 forskellige patienter [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. I de første mange år efter at sygdommen blev opdaget, havde man endnu ikke observeret drenge med Rett, og man mente derfor, at sygdommen kun ramte piger. Denne teori blev dog falsificeret, da Jan et al. i 1999 identificerede en mand med Rett. Selvom man nu er klar over, at sygdommen kan ramme begge køn, er det i langt de fleste tilfælde piger som rammes af Rett. Mere præcist er det ca. 1 ud af piger som bliver født med sygdommen, og af disse tilfælde er over 99 % sporadiske [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007; Wan et al., 1999]. Grunden til at man sjældent ser drenge med Rett er, at sygdommen i de fleste tilfælde er letal for drengefostre, da de kun har et X-kromosom. Symptomer på Rett Rett kan opdeles i klassisk Rett og atypisk Rett. Den klassiske Rett-form starter som regel når patienten når 1-årsalderen, og her vil det første tegn på sygdommen være, at der pludselig sker et stop i barnets udvikling. Udover dette pludselige stop i udviklingen er de mest karakteristiske træk ved den klassiske form for Rett en mistet evne til at tale, karakteristiske håndbevægelser, microcephaly, hand dyspraxia, stereotype håndvaskningsbevægelser, ataxia, unormal vejrtrækning og nedsat vækst [Renieri et al., 2003]. Patienterne vil desuden miste Side 47 af 78

48 trangen til at have kontakt med mennesker, og de vil udvikle autistiske træk. Det er også almindeligt, at patienterne oplever regelmæssige anfald, som kan være mere eller mindre voldsomme. Når Rett-børnene når 10-årsalderen, vil der ske en yderligere somatisk og neurologisk forringelse, hvilket resulterer i spastisk quadriparesis [Reviewed af Renieri et al., 2003]. De atypiske former for Rett strækker sig fra milde tilfælde, hvor sygdommen starter senere i livet, til langt mere alvorlige tilfælde. I de mildere tilfælde starter regressionen mellem 1 og 3- årsalderen, og nogle gange vil de stereotype håndbevægelser være så minimale, at patienterne fortsat kan bruge deres hænder. De mere alvorlige tilfælde inkluderer den medfødte form, hvor barnet ikke oplever den tidlige periode med normal udvikling. Her vil anfaldene begynde, før barnet er 6 måneder gammelt [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. Både den klassiske og de atypiske former for Rett vil variere i omfang og intensitet mellem personer, men også hos den samme person over tid [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. Hvorfor opstår Rett? genetisk baggrund I 1999 fandt Amir et al. ud af, at det i langt de fleste tilfælde er mutationer i genet MECP2, som forårsager Rett. MECP2 findes på det bånd, der hedder Xq28 på X-kromosomet (se figuren nedenfor) og koder for proteinet MeCP2 (methyl-cpg binding protein 2), som består af tre domæner: Det methyl-bindende domæne (MBD), det transkriptionelle repressionsdomæne (TRD) og et C-terminal-domæne [Weaving et al., 2004; Chahrour og Zoghbi, 2007]. Figur 16. På figuren kan man se, at MECP2-genet befinder sig i region Xq28 på X- kromosomet. Kilde: [Internetside J] Side 48 af 78

49 Det methyl-bindende domæne binder sig til methylerede CpG-dinukleotider hvorfra det i samarbejde med andre proteiner, sørger for at modificere kromatinstrukturen. Det transkriptionelle repressionsdomæne, som befinder sig downstream i forhold til MBD, hæmmer transkriptionen med hjælp fra corepressorer og kromatin-ombygningskomplekser. C-terminalregionen i MeCP2 samt dens funktion ved man endnu ikke så meget om, men man ved, at den afgjort er essentiel, for at proteinet kan fungere, idet man i adskillige Rett-tilfælde har observeret en deletion af denne region [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. Da MeCP2- proteinet er med til at modulere kromatinstrukturen og hæmme genekspressionen, er det oplagt, at det spiller en vigtig rolle i forbindelse med op og nedregulering af bestemte gener. MeCP2 udtrykkes i store dele af kroppen, men er til stede i hjernen i særlig høj grad [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. Flere forskellige forskere har fundet ud af, at MeCP2- niveauet er lavt under embryogenesen, men at det forøges under den postnatale periode i takt med at neuronerne modnes. MeCP2 udtrykkes altså i færdigudviklede neuroner i hjernen, og man har derfor overvejet den mulighed, at proteinet er med til at regulere aktiviteten eller plasticiteten af disse [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007; Weaving et al., 2004]. Nedenfor ses en figur, som viser, hvordan MeCP2-proteinet menes at regulere aktiviteten af neuronerne. Figur 17. Denne figur viser, hvordan MeCP2-proteinet i samarbejde med andre proteiner regulerer neuronernes aktivitet. Til venstre ses en neuron, hvis cellekerne er blevet forstørret op. I midten af figuren kan man se, hvordan MeCP2-proteinet binder sig til methylerede CpG-dinukleotider på genet vha. det methylbindende domæne (MBD). Herfra rekrutterer det kromatin-ombygningsproteiner, så kromatinstrukturen ændres, og promoteren bliver utilgængelig for cellens transkriptionsfaktorer. Når transkriptionsfaktorerne ikke kan komme til, vil neuronen blive midlertidig inaktiv. Til højre på figuren kan man se, at MeCP2-proteinet er blevet fosforyleret, så det er faldet af genet. Dette resulterer i at neuronen aktiveres, da transkriptionsfaktorerne igen kan komme til. Kilde: Modificeret udgave. [Chahrour og Zoghbi, 2007]. Side 49 af 78

50 En observation som understøtter den teori, at MeCP2 hovedsageligt virker i færdigudviklede neuroner, er, at mutationer i MeCP2 ikke lader til at påvirke proliferationen eller differentiationen af de neurone forstadier. Hvis dette sammenholdes med det faktum, at regressionen i klassiske Rett-tilfælde først begynder efter, at barnet er fyldt 1 år, kan man se, at virkeligheden ligeledes stemmer godt overens med den omtalte teori. Det gør den, fordi sygdommen først viser sig, når neuronerne er modnet, og MeCP2-proteinets funktion bliver afgørende for, om man fortsat udvikles normalt. Mutationer i MECP2 kan resultere i Rett-syndrom Mere end 95 % af de klassiske Rett-tilfælde skyldes mutationer i MECP2-genet [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. De fleste mutationer opstår de novo i de paternelle kimceller, og for det meste involverer de et skift fra C (cytosin) til T (thymin) ved CpG-dinukleotiderne [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007; Weaving et al., 2004]. Mutationerne kan deles op i early-truncating, late truncating og missense-mutationer. Af disse er early-truncatingmutationer de mest alvorlige, da de sker i MBD og TRD-domænerne og fører til et komplet tab af MeCP2-proteinets funktion. MeCP2-proteinet mister sin funktion, fordi de early truncating mutationer introducerer et alt for tidligt stopkodon i genet. Late-truncating-mutationer og missense-mutationer er mindre alvorlige da de kun ødelægger dele af proteinet. Fordi størstedelen af mutationerne resulterer i at MeCP2-proteinet helt eller delvist mister sin funktion, er det oplagt, at det netop er dette fænomen, som forårsager Rett. Man har dog gjort en interessant opdagelse, idet man har fundet ud af, at overekspression af MeCP2-proteinet resulterer i lignende fænotyper [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. Proteinet må altså hverken være over eller underudtrykt, hvis organismen skal fungere optimalt. X-kromosominaktiveringsmønstre og Rett-syndrom Som nævnt tidligere varierer det fænotypiske udfald af Rett meget fra person til person, men også hos den samme person over tid. Denne store fænotypiske variabilitet associeret med forskellige mutationer i MECP2-genet tilskrives i særlig høj grad X- kromosominaktiveringmønsteret. Kvinder der er bærere af en mutation i MECP2-genet, kan som tidligere nævnt have et skævt inaktiveringsmønster. Årsagen til dette kan være, at de celler der udtrykker den raske allel får vækstfordele i forhold til de celler, der udtrykker den syge Side 50 af 78

51 allel. Når de raske celler langsomt kommer i overtal, kan det betyde, at Rett-fænotypen forbedres. Afhængigt af fordelingen af raske og syge celler kan nogle patienter således være fuldstændig symptomfrie, mens andre kan have milde tilfælde af sygdommen, ligesom det er tilfældet med forskellige andre XLMR-sygdomme [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007]. Ud fra disse kendsgerninger er det umiddelbart logisk at gribe til den konklusion, at personer med et skævt inaktiveringsmønster til fordel for den syge allel, vil have en alvorlig udgave af sygdommen. Dette er dog ikke altid tilfældet. Takahashi et al. fandt i 2007 en patient, hvis X- inaktiveringsmønster ikke kunne forklare fænotypen. Denne patient havde netop et skævt inaktiveringsmønster til fordel for den syge allel, men viste ingen tegn på sygdommen. I forsøget målte de dog på de perifere blodceller, og det er muligt, at inaktiveringsmønsteret i hjernen har set anderledes ud. Selvom fordelingen af raske og syge celler kan have været anderledes i patientens hjerne, er der meget der tyder på, at der i tillæg til X-inaktiveringsmønsteret er andre mekanismer, som bidrager til den fænotypiske variation. Rett opstår som nævnt oftest pga. de novo mutationer i MECP2-genet, og dette indikerer, at den genetiske baggrund under hvilke mutationerne opstår, har stor betydning for, hvordan disse kommer til udtryk. Man har opnået resultater, som understøtter denne teori, idet man har fundet de samme mutationer i forskellige personer med forskellige sygdomme. Man har bl.a. fundet en late truncating mutation (Q4006X) i en familie med XLMR, som også fandtes i en urelateret kvinde med Rett. Ligeledes har man fundet en missense mutation i TRD (R268X) i en anden familie med XLMR, som også fandtes i en anden urelateret Rett-kvinde [Reviewed af Renieri et al. 2003]. Mødrene til de syge børn i begge familier var asymptomatiske bærere af MECP2-mutationen, hvilket viser, at den samme mutation som opstår under forskellige genetiske baggrunde, kan resultere i XLMR hos mænd, og kan forblive silent i kvinder, som er bærere af mutationen, og den kan også forårsage klassisk Rett hos kvinder [Reviewed af Renieri et al. 2003]. Der er således en lang række undersøgelser og hypoteser som taler for, at der er andre mekanismer, som påvirker det fænotypiske udfald, og dette er man på nuværende tidspunkt i gang med at undersøge nærmere. Vi vil ikke komme ind på disse mekanismer og deres betydning for det fænotypiske udfald, da det falder uden for vores problemformulering. Vi vil blot nævne, at de er der, men at der samtidig ikke er tvivl om, at X-inaktiveringsmønsteret i høj grad også bidrager til den fænotypiske variabilitet. Et godt eksempel på X-inaktiveringsmønsterets rolle i forbindelse med denne variabilitet er enæggede tvillinger, som viser meget forskellige Rett-fænotyper pga. deres Side 51 af 78

52 forskellige inaktiveringsmønstre [Reviewed af Chahrour og Zoghbi, 2007; Weaving et al., 2004]. X-inaktivering og autoimmune sygdomme Hvad er autoimmune sygdomme og hvorfor opstår de? Autoimmune sygdomme er fællesbetegnelsen for en lang række forskellige sygdomme. De er kendetegnet ved, at kroppen går til angreb på sine egne celler, og de skyldes således en defekt i immunforsvaret. Denne defekt består i, at immunforsvaret ikke kan kende kroppens egne antigener, og derfor reagerer med en patologisk respons ved kontakt med disse. Man kender ikke årsagen til, at defekten opstår, men der er en række cellulære og molekylære mekanismer, som kan ligge til grund for udviklingen af sygdommene. Man mener, at genetiske faktorer har stor betydning i denne sammenhæng, men også infektioner og miljømæssige påvirkninger kan spille ind, når sygdommene udvikles. Det mest sandsynlige er, at det er komplekse interaktioner mellem krop og miljø, som resulterer i at autoimmune sygdomme udvikles [Invernizzi, 2007; Ozcelik et al., 2006] Autoimmune sygdomme inkluderer mere end 70 kroniske sygdomme [Ozcelik et al., 2006] og rammer 3-8 % af den samlede befolkning, hvoraf % er kvinder [Belniak E. et al., 2007]. Man har længe spekuleret på, hvorfor kvinder rammes i langt højere grad end mænd, og indtil for nyligt har forklaringen på dette været, at det skyldes hormonelle forskelle. Denne forklaring opstod fordi man i en række forsøg, har påvist at østrogener forværrer sygdomme, mens androgener kan hæmme dem [Cooper G. S. et al., 1998; Cutolo N. et al., 1998]. Der er dog ingen forsøg, som har vist en tydelig forbindelse mellem hormon-niveauer og modtagelighed over for autoimmune sygdomme [S. Chitnis et al., 2000], og man har derfor søgt andre forklaringer. Da nyere studier har vist, at flere kvinder med forskellige autoimmune sygdomme har et skævt inaktiveringsmønster [Invernizzi P., 2007], er man begyndt at undersøge om dette skæve mønster kan være skyld i at sygdommene udvikles. En sygdom der er særligt fokus på i denne sammenhæng, er Autoimmune thyroid disease (AITD), som er en autoimmun sygdom, der rammer skjoldbruskkirtlen. Side 52 af 78

53 Autoimmune thyroid disease og X-inaktiveringsmønsteret AITD kan inddeles i to hovedgrupper: Graves disease (GD) og Hashimotos thyroiditis (HT) [Brix. et al., 2005]. Graves disease er en sygdom, hvor autoimmunprocessen resulterer i en overproduktion af thyroidstimulerende antistoffer [Brix. et al., 2005]. Disse antistoffer medfører hyperthyroidisme, som er en overproduktion af thyroidhormoner, idet de binder sig til TSH-receptoren i skjoldbruskkirtlen, hvor de kronisk stimulerer den til at frigive thyroidhormonerne T3 og T4 (se figuren nedenfor). Dette overarbejde, resulterer i en forstørret skjoldbruskkirtel, som kan ses som en større eller mindre bule på halsen. Hashimotos thyroiditis forårsager, i modsætning til Graves disease, hypothyroidisme, som er en nedsat produktion af thyroidhormoner. Grunden til at der her produceres for lidt thyroidhormon er, at immunforsvaret går til angreb på kroppens thyroidceller, så de destrueres [Brix et al., 2005]. Nedenfor ses en figur som viser, hvordan kroppen gør opmærksom på, at der skal produceres thyroidhormoner. Figur 18. Denne figur viser, hvordan skjoldbruskkirtlen, i samarbejde med hypothalamus og hypofysen, regulerer niveauet af thyroidhormoner i kroppen. Når T3 og T4-niveauet er lavt, stimuleres hypothalamus til at frigive hormonet TRH. Dette hormon stimulerer så hypofysen til at frigive hormonet TSH, som får skjoldbruskkirtlen til at producere mere hormon. Når hormonniveauet igen er normalt, er der en negativ feedback-mekanisme, som hæmmer yderligere udskillelse af henholdsvis TRH og TSH fra hypothalamus og hypofysen. På denne måde sørger kroppen hele tiden for, at der er en tilpas mængde thyroidhormon i cirkulationssystemet. Kilde: [Internetside K]. Side 53 af 78

54 Man mener, at grunden til at immunforsvaret reagerer, som det gør i disse tilfælde, er at det ikke kan kende forskel på kroppens egne antigener, og udefrakommende antigener. En lang række forskere mener, at den skævhed man ser hos personer med AITD, er skyld i kroppens manglende tolerance over for egne antigener ( self -antigener) [Chitnis et al., 2000; Brix et al., 2005 & Xiaoming et al., 2007]. Den nuværende hypotese går ud på at en skæv fordeling af celler med henholdsvis det ene og det andet X-kromosom aktivt, kan resultere i, at det stort set kun er antigener fra det hyppigst forekomne aktive X-kromosom, som udtrykkes i skjoldbruskkirtlen. Hvis dette er tilfældet, kan den manglende eksponering af antigener fra det X- kromosom, som er inaktiveret i de fleste celler, betyde at kroppen ikke kan skelne mellem disse og udefrakommende antigener. Dette skal forstås på den måde, at kroppen vil gå til angreb på sine egne antigener fra det underrepræsenterede X-kromosom hvis de pludselig udtrykkes. Kroppens egne antigener kan komme i kontakt med immunforsvaret da det, som tidligere nævnt, er muligt at disse, i blodet samt i andre væv i kroppen, er udtrykt i samme grad som antigenerne fra det andet X-kromosom. Hvis nogle af disse self -antigener fra blodet kommer i kontakt med skjoldbruskkirtlen, hvor de er under-repræsenteret, vil det resultere i en patologisk respons fra immunforsvaret, fordi kroppen tror, den har at gøre med fremmede bakterier [Reviewed af Ozcelik et al., 2006; Brix et al., 2005; Chitnis et al., 2000]. Ifølge denne hypotese har kvinder med et skævt inaktiveringsmønster således større sandsynlighed for at få AITD end normale kvinder. På figuren nedenfor kan man se, hvordan man mener at fordelingen af celler med henholdsvis det ene og det andet X-kromosom aktivt, kan se ud i en normal kvinde og i en kvinde med en skæv fordeling af disse. Side 54 af 78

55 Figur 19. Figuren illustrerer, hvad konsekvensen af et skævt inaktiveringsmønster i skjoldbruskkirtlen kan være. Til venstre ses en skjoldbruskkirtel, hvor der er en lige fordeling af de to X-kromosomer. Her vil thymocytterne, som er forstadier til T-cellerne, under deres udvikling i skjoldbruskkirtlen blive præsenteret for antigener fra begge X-kromosomer, og de færdigudviklede T-celler vil således være tolerante over begge former for antigener. Til højre ses en skjoldbruskkirtel hvor fordelingen af celler med henholdsvis det ene og det andet X-kromosom aktivt er skæv. Her vil Thymocytterne kun blive præsenteret for én slags antigen, og T-cellerne vil derfor kun være tolerante over for antigener fra det X-kromosom som er aktivt i de fleste celler. Kilde: Modificeret udgave. [Chitnis et al., 2000]. Resultater fra tre undersøgelser af patienter med AITD Nogle af de forskningsteams som har undersøgt forbindelsen mellem X-inaktivering og AITD, er Brix et al., Xiaoming et al. og Ozcelik et al.. Disse tre teams har alle brugt føromtalte metode, nemlig den androgene receptor inaktiveringsanalyse. Xiaoming et. al. og Brix et. al. testede kun forsøgspersonernes blodceller, mens Ozcelik et. al. også testede skjoldbruskkirtlen, slimhinder og hår-follikler fra 5 personer der udviste ekstremt skæve inaktiveringsmønstre i blodet. Prøverne fra slimhinderne og skjoldbruskkirtlen viste også skæve inaktiveringsmønstre, dog i lidt mindre grad, mens hår-follikelprøverne fra alle fem forsøgspersoner lå meget tæt på 50:50. Alle de tre forsøg indikerede, at et skævt X-inaktiveringsmønster er tæt Side 55 af 78

56 forbundet med udviklingen af AITD. Nedenfor ses en tabel som sammenligner resultaterne fra forsøgene. Sammenligning af X-kromosom-inaktiveringsmønstre (XCI-mønstre) fra tre studier Skævt XCI (%) Ikke skævt XCl (%) ( 80% skævt XCI) P-værdier Brix Ozcelik Xiao- Brix Ozcelik Xiao- Brix Ozcelik Xiaoet al. et al. ming et al. et al. ming et al. et al. et al. ming et al. et al. Fænotype AITD 21 (66) 55 (66) 82 (73) 11 (34) 28 (34) 31 (27) < Control 85 (89) 114 (92) 53 (91) 11 (11) 10 (8) 5 (9) GD 12 (63) 11 (69) 50 (71) 7 (37) 5 (31) 20 (29) Control 49 (86) 114 (92) 53 (91) 8 (14) 10 (8) 5 (9) HT 9 (69) 44 (66) 32 (74) 4 (31) 23 (34) 11 (26) < Control 32 (92) 114 (92) 53 (91) 3 (8) 10 (8) 5 (9) Tabel 3. I tabellen er resultaterne fra de tre omtalte forsøg stillet op mod hinanden. Tallene i parenteserne angiver antal forsøgspersoner i procent. Boksen P-værdier helt ude til højre i tabellen, angiver om de opnåede resultater har statistisk signifikans, altså om deres P-værdier ligger under 0,005. Tabellen viser desuden, at der i to ud af tre forsøg, i forhold til kontrolpersonerne, er langt flere personer med AITD, som har et skævt inaktiveringsmønster. Det samme gælder for Graves disease og Hashimotos Thyroiditis, hvor de fleste forsøg viser, at personerne med disse sygdomme i langt større grad har et skævt inaktiveringsmønster. Dette bekræfter også teorierne om, at personer med autoimmune sygdomme ofte har et skævt inaktiveringsmønster. Kilde: Modificeret ugave. [Xiaoming et al., 2007]. Forsøgene bekræfter teorien om, at et skævt inaktiveringsmønster og udviklingen af AITD hænger sammen, men i hvor høj grad ved man endnu ikke. Som nævnt i afsnittet om skæv inaktivering har Andrew Sharp et al. i deres artikel fra år 2000 påvist, at det er helt almindeligt, at normale kvinder kan have skæve og også ekstremt skæve (90:10) inaktiveringsmønstre uden at vise tegn på sygdom. De mener også, at ældre kvinder har tendens til at være mere skæve end yngre kvinder. Dette står i direkte kontrast til de konklusioner Ozcelik et al. og Xiaoming et al. er kommet frem til, da deres resultater ikke viser nogen tendens til yderligere skævhed i ældre patienter. Forskellen på resultaterne er, at der i Sharps forsøg er tale om raske kvinder, mens der i de to andre forsøg er tale om syge kvinder. Om det er dette, der gør Side 56 af 78

57 forskellen, er ikke til at sige, det må undersøges nærmere, før man kan gribe til nogen som helst form for konklusion. Idet forsøg har vist, at raske kvinder over 50 år også kan vise ekstremt skæve inaktiveringsmønstre, er det muligt, at skævhed alene ikke kan forklare udviklingen af autoimmune sygdomme, og derfor kun skal ses som en mulig cofaktor, der kan medvirke til at sygdommene udvikles [Invernizzi, 2007]. Som nævnt i afsnittet om skævhed kan inaktivering ske på baggrund af mutationer på et af X-kromosomerne, således at raske celler får en vækstfordel i forhold til syge celler. Dette skæve inaktiveringsmønster kan så føre til øget risiko for udvikling af autoimmune sygdomme. Desuden mener Invernizzi, at en øget skævhed i bestemte X- linkede perifere lymfocytter, kan være en almindelig mekanisme i forbindelse med forringelse af immunforsvaret i takt med at man bliver ældre. Denne skævhed kan så forklare de ældres forøgede chancer for at få infektioner og muligvis også autoimmune sygdomme og cancer [Invernizzi, 2007]. Alle disse spekulationer er på nuværende tidspunkt stadig hypoteser som skal be eller afkræftes af flere forsøg, men de omtalte forskere er enige i at det meget muligt, at det er sådan tingene forholder sig. Vi vil bringe dette spørgsmål op til yderligere diskussion i vores diskussionsafsnit. Opsamling X-kromosominaktivering i kvinder sker for at kompensere for den ellers ulige fordeling af arvemateriale mellem de to køn. Inaktiveringen er en mekanisme, hvormed hver celle lukker ned for det ene X-kromosom, således at der kun er ét aktivt kromosom pr. diploide celle. Der er en lang række mekanismer som samarbejder om selve inaktiveringen, og af de vigtigste kan nævnes inaktiveringscenteret Xic, som er et locus på X-kromosomet hvorfra Xist-RNA spredes. Når Xist-RNA et spredes, startes silencingen, og denne proces, mener man, sker vha. LINE-sekvenserne, som højst sandsynligt indeholder mange svage bindingssteder, til hvilke Xist kan binde sig. Inaktiveringscenteret indeholder også genet Tsix, som er en negativ regulator af Xist, hvilket betyder at så længe Tsix bliver udtrykt, så vil Xist ikke blive det. Udover Xist-RNA ets samarbejde med LINE-sekvenserne, mener man også, at det er i stand til at rekruttere mekanismer som polycomb-proteinerne. Disse proteiner sørger for, at DNA et bliver methyleret, så kromosomet kondenseres til heterokromatin. Det inaktive X-kromosom Side 57 af 78

58 er således hypermethyleret på DNA og histoner, og især CpG-øerne omkring promoterregionerne er hypermethyleret. Denne hypermethylering sker for at undgå at promoterne aktiveres. Det er ikke alle gener på X i som inaktiveres. En del af generne vil helt undgå at blive inaktiveret, en anden del vil blive udtrykt til en hvis grad, og en sidste del kan i nogle tilfælde reaktivere. Nogle af de gener som forbliver aktive, er muligvis gener som også findes på Y- kromosomet, og som man mener, er nødvendige at have i dobbelt dosis, for at organismen kan fungere optimalt. I enkelte tilfælde kan det ske, at gener som af cellen er bestemt til at være inaktive, reaktiveres, og dette kan bl.a. føre til udviklingen af den sjældne autosomale recessive sygdom ICF. X-kromosominaktiveringen er som udgangspunkt en tilfældig proces hvor enten det maternelle eller det paternelle X-kromosom i hver celle, inaktiveres. Det er dog også mere eller mindre almindeligt, at finde skæve inaktiveringsmønstre i fuldstændig raske kvinder. Ofte vil dette mønster dog være skævt, som følge af en mutation på det ene X-kromosom. Denne skævhed kan så både være til fordel for det raske og det syge X-kromosom, og afhængigt af fordelingen af raske og syge celler, kan den kvindelige bærer både være fuldstændig rask, og hun kan også have svære symptomer. Når man vil undersøge kvinders inaktiveringsmønster, benytter man sig i langt de fleste tilfælde af den androgene receptor inaktiveringsanalyse, som er en nem og hurtig metode. Den androgene receptor inaktiveringsanalyse er også blevet brugt til at undersøge recessive XLMR-sygdomme. De undersøgelser af XLMR-sygdomme vi har beskæftiget os med har vist, at kvindelige bærere af disse er raske, hvis de i størstedelen af deres celler har inaktiveret det syge X-kromosom. Et studie af XLMR-sygdommen ATR-X bekræfter denne observation, idet man her har vist, at en kvinde med moderat mental retardering, ikke havde dannet det skæve inaktiveringsmønster til fordel for den raske allel. Studiet af ATR-X viste desuden, at denne syge kvinde kun havde nogle af symptomerne på sygdommen, idet hun ikke havde de karakteristiske HbH-inklusioner i blodcellerne. Forskerne der har lavet dette studie, mener at det er muligt, at hun ikke har disse HbH-inklusioner fordi den raske allel på trods af den ikkeskæve inaktivering udtrykkes i favorable mængder. De mener desuden, at kvindens moderate Side 58 af 78

59 form for mental retardering muligvis kan forklares ved, at der også er et ikke-skævt mønster i hjernen. Deres hypotese går ud på, at det ikke-skæve mønster i hjernevævet betyder, at hendes nerveceller ikke udtrykker nok normalt protein. Det er således sandsynligt, at disse nerveceller vil få en vækstulempe under deres udvikling, hvilket har ført til kvindens moderate mentale retardering. To andre X-bunde recessive sygdomme vi har beskrevet i projektet, som også er gode eksempler på, at det fænotypiske udfald kan variere meget, er Duchenne muscular dystrophy og hæmofili. Man har i studier af begge disse sygdomme undersøgt inaktiveringsmønsteret i monozygote tvillinger og i tilfældet med DMD, fandt man ud af, at det kun var den ene af tvillingerne som havde symptomer på sygdommen. Dette indikerede at deres inaktiveringsmønster var forskelligt. Studiet hvor man testede hæmofili-ramte tvillinger, viste at tvillingernes inaktivering var sket til fordel for den syge allel. Mutationen var tilsyneladende opstået de novo i de paternelle kimceller, men det forklarer ikke hvorfor den syge allel har fået lov at være aktiv. Dette efterlader os med spørgsmål om, hvorfor X-inaktiveringsmekanismen kan ske til fordel for den syge allel, og om det har noget med selve dannelsen af tvillinger at gøre. Undersøgelser viser nemlig, at der er sandsynlighed for at X-inaktivering og tvillingedannelse hænger sammen, selvom tvillingedannelsen rent udviklingsmæssigt sker før X-inaktiveringen. Denne teori kræver flere forsøg, før man kan drage konklusioner, og dette er blot endnu et bevis på, at man kun har opklaret en brøkdel af sygdommenes komplekse natur. En anden sygdom som i høj grad også er kompleks er Rett-syndromet. Rett er et eksempel på en sygdom, hvor inaktiveringsmønsteret ikke alene kan forklare det fænotypiske udfald. Det er umiddelbart logisk at en X-inaktivering til fordel for den syge allel vil resultere i sygdom, men undersøgelser af Rett viser, at det ikke nødvendigvis er tilfældet. Der er således meget der tyder på, at der er andre mekanismer som har betydning for hvordan Rett kommer til udtryk. En observation som bekræfter denne teori er, at den fænotypiske karakter af en bestemt mutation kan variere meget fra person til person. Rett-syndromet bekræfter endvidere, at X- inaktiveringsmønsteret også kan variere fra væv til væv. En sidste gruppe af sygdomme der her i projektet er blevet beskrevet, er de autoimmune sygdomme. Man mener nemlig, at et meget skævt X-inaktiveringsmønster udover dets ofte beskyttende effekt kan være medvirkende til, at øge risikoen for at en autoimmun sygdom ud- Side 59 af 78

60 vikles. Den nuværende hypotese går ud på, at autoimmune sygdomme udvikles fordi kroppens egne antigener ikke udtrykkes i tilstrækkelig grad fra det underudtrykte X-kromosom. Hvis immunforsvaret så pludselig kommer i kontakt med de undereksponerede antigener, vil den gå til angreb på disse, da det opfatter dem som fremmede. Der er dog den hage ved det, at raske kvinder som nævnt også være skæve uden at være bærere af mutationer, og dette indikerer at både endogene og exogene påvirkninger også spiller en rolle når X-bundne sygdomme udvikles. Diskussion Efter at have givet et overblik over X-inaktiveringsmønsterets betydning for forskellige humane sygdomme, står det klart, at de resultater forskningen har opnået indtil nu, efterlader os med en del ubesvarede spørgsmål. I det følgende vil vi diskutere svarene på de spørgsmål vi stillede os selv i indledningen. Hvis ikke vi ud fra vores litteraturstudium har fundet svar på spørgsmålene, vil vi diskutere, hvad et muligt svar kan være. Kan gener på det inaktiverede X-kromosom reaktivere, og hvilke konsekvenser kan det få? Vi ved, at nogle af de komponenter der er med til at opretholde inaktiveringen af X i er DNAmethylering og histone acetylering. Alt hvad der kan interferere med disse, kan derfor have betydning for, om der sker en reaktivering af de inaktive gener. Forstyrrelser i methyleringsog acetyleringsprocesser kan derfor også have betydning for, om uønskede mutationer reaktiveres og sygdomme udvikles. Et eksempel på en sygdom som opstår, fordi nogle bestemte gener er reaktiveret er ICF-syndrom, som er en kromatinsygdom. De epigenetiske modifikationer på X-kromosomet anses dog som ret stabile, og der må derfor igen være andre faktorer der kan påvirke opretholdelsen af inaktiveringen. Har alle bærere af en X-bunden sygdom et skævt X-inaktiveringsmønster? Ifølge de beskrevne undersøgelser af XLMR sygdomme kan vi slutte, at størstedelen af bærere af X-bundet mental retardering, har skæve X-inaktiveringsmønstre. De mutationer der for- Side 60 af 78

61 årsager XLMR må derfor tilhøre én gruppe af mutationer, der via X-inaktiveringsmekanismen selekteres fra til fordel for de raske alleler. Kvindelige bærere af mutationer som forårsager hæmofili udviser også i overvejende grad skæve X-inaktiveringsmønstre, men disse tilfælde viser, at skævheden ikke nødvendigvis er til fordel for den raske allel (se afsnittet Hvis der er mutationer på begge X-kromosomer, skelner cellen så mellem alvorlige og mindre alvorlige mutationer, og kan inaktiveringsdefekter på det ene X-kromosom spille ind her? ). Undersøgelser af bærere af mutationer der forårsager DMD viser, at det ikke er alle bærerne, der udviser et skævt X-inaktiveringsmønster. Dette tyder på, at mutationer der forårsager DMD tilhører en anden gruppe af mutationer. Rett som er den sidste og mest komplekse sygdom vi har beskrevet er ligesom hæmofili og DMD et eksempel på en sygdom, hvor bærerne kan være skæve til fordel for den syge allel. Der er dog stor forskel på hvordan sygdommen kommer til udtryk i forskellige individer og det er ikke alle bærerne som har et skævt inaktiveringsmønster. Vi kan i henhold til ovenstående konkludere, at det ikke er alle bærere af X- bundne sygdomme som har et skævt X-inaktiveringsmønster. Vi kan desuden konkludere, at et skævt inaktiveringsmønster til fordel for den syge allel ikke nødvendigvis resulterer i sygdom. Kan X-inaktiveringsmønsteret variere fra væv til væv? Variabiliteten af det fænotypiske udfald har været genstand for diskussion hele vejen igennem projektet, hvorfor forskningsresultater der tyder på, at X-inaktiveringsmønsteret kan være forskellig fra væv til væv også har fanget vores interesse. Der er som nævnt stor forskel på hvordan Rett-fænotypen kommer til udtryk og forsøg har vist, at kvindelige bærere kan have et skævt inaktiveringsmønster til fordel for den syge allel i blodet og alligevel være raske. Dette tyder på at inaktiveringsmønsteret i hjernen, ikke er det samme, som det der er i blodet, da hjernen tydeligvis ikke er påvirket af mutationen. Det forsøg som viste, at en kvinde kun havde nogle af symptomerne på ATR-X-syndromet er også en kraftig indikation på at inaktiveringsmønsteret kan variere fra væv til væv. Det er imidlertid også en indikation på, at udfaldet af et ensartet inaktiveringsmønster kan variere fra væv til væv. Vi har overvejende beskæftiget os med studier, hvor den androgene receptor inaktiveringsanalyse er blevet brugt til at undersøge inaktiveringsmønstre i perifere blodcel- Side 61 af 78

62 ler, da det er disse celler der er lettest at teste. Hvis man finder ud af, at inaktiveringsmønsteret i disse celler er ekstremt skævt, er det altså muligt, at det forholder sig anderledes i f.eks. hjernevævet. For at man kan afklare hvorfor bærere af X-bundne sygdomme udvikler variable symptomer, er det derfor nødvendigt, at der udvikles metoder, med hvilke man eksempelvis kan undersøge inaktiveringsmønsteret i neurone celler i hjernen. I denne kontekst er det også vigtigt, at kunne forholde sig kritisk til de resultater forskningen fører med sig, da en lang række forskningsresultater netop kun kan fortælle os, hvordan inaktiveringsmønsteret ser ud i blodcellerne og ikke i andre væv. Dette vil uddybe i et kildekritisk afsnit til sidst. Kan den store fænotypiske variabilitet, der ses hos forskellige kvinder med de samme mutationer, tilskrives X-inaktiveringsmønsteret? Den store fænotypiske variabilitet der ses hos kvinder med den samme mutation kan i høj grad tilskrives X-inaktiveringsmønsteret. Undersøgelserne af de monozygote tvillinger med DMD og hæmofili viste, at deres fænotypiske karakter var forskellig, og at de havde forskellige inaktiveringsmønstre. Da deres arvemateriale er identisk, må deres uensartede fænotyper tilskrives denne forskellighed i X-inaktiveringsmønsteret. Hvilken rolle spiller inaktiveringen, når man udvikler autoimmune sygdomme? Det fremgår i afsnittet om autoimmune sygdomme, at man mener, at X-inaktiveringen kan være skyld i, at kvinder udvikler en autoimmun sygdom. Denne teori er opstået på baggrund af en række forsøg i hvilke man har påvist, at kvinder med autoimmune sygdomme ofte har et skævt inaktiveringsmønster. Desuden viser statistikker, at det fortrinsvis er kvinder som rammes af autoimmune sygdomme. Den nuværende hypotese går som tidligere nævnt ud på, at sygdommene udvikles fordi kroppens immunforsvar ikke kan skelne mellem kroppens egne antigener og udefrakommende antigener. Man mener så at årsagen til dette er, at det angrebne væv i kroppen har et skævt inaktiveringsmønster og at antigener fra det underrepræsenterede X-kromosom ikke udtrykkes i tilstrækkelig grad til at kroppen kan kende dem. I henhold til denne hypotese vil kvinder med et skævt inaktiveringsmønster have en større risiko for at udvikle autoimmune sygdomme end kvinder med et ikke-skævt inaktiveringsmønster. Man Side 62 af 78

63 ved ikke, hvorfor mange af kvinderne er skæve, men man mener, at skævheden kan være opstået, fordi kvinderne har en mutation, som cellerne dækker over ved at inaktivere det syge X- kromosom. Det kan således være, at det skæve inaktiveringsmønster i første omgang har været positivt, men at det senere hen har ført til udviklingen af en autoimmun sygdom. Denne hypotese giver god mening i forbindelse med udviklingen af sygdommene hos kvinder, men den forklarer ikke hvorfor nogle mænd også udvikler autoimmune sygdomme. Det kan være, at der i disse tilfælde er tale om nedarvede mutationer. Det kan også være miljømæssige påvirkninger som spiller ind. Kan raske kvinder have et skævt inaktiveringsmønster? Det har vist sig, at raske kvinder kan have skæve X-inaktiveringsmønstre uden at være bærere af mutationer på et af X kromosomerne. Man ved ikke hvorfor nogle raske kvinder er skæve. Det kan være en tilfældighed, men det er også muligt, at der på det ene kromosom er en defekt i Xist-genet, som gør at det ene X-kromosom ikke kan inaktiveres. Hvis dette er tilfældet, og der ikke er mutationer på det andet X-kromosom, behøver defekten ikke at få konsekvenser for kvindernes helbredsmæssige status. Bliver kvinders inaktiveringsmønster mere skævt med alderen? Meget tyder på, at kvinders inaktiveringsmønster bliver mere skævt med alderen, og man har derfor overvejet den mulighed, at det skæve inaktiveringsmønster kan være skyld i, at immunforsvaret forringes i takt med at man bliver ældre. Det kan dog også være, at den øgede skævhed er en naturlig følge af det, at immunforsvaret forringes. Dette spørgsmål kan ikke besvares på nuværende tidspunkt, og vi må derfor lade det være åbent for diskussion. Side 63 af 78

64 Hvis der er mutationer på begge X-kromosomer, skelner cellen så mellem alvorlige og mindre alvorlige mutationer, og kan inaktiveringsdefekter på det ene X-kromosom spille ind her? Som tidligere nævnt kan inaktiveringen fungere som beskyttende mekanisme ved at dække over mutationer på det ene X-kromosom, men den kan tilsyneladende også være skyld i, at en mutation på det ene X-kromosom får lov at komme til udtryk i størstedelen af cellerne. Det er stadig uklart, hvad det er, der ligger til grund for, at cellerne undertiden vælger at lade et sygt X-kromosom være aktivt. Her kan det tænkes, at der er mutationer på begge X- kromosomerne, og at cellerne derfor må afgøre, hvilken en mutation der vil gøre mindst skade på organismen. Det er muligt, at det er det, der er tilfældet med de hæmofiliramte monozygote tvillinger, som vi skrev om tidligere. Disse tvillingers forældre er begge raske, og man mener derfor, at det er en de novo mutation i faderens kimceller, som er skyld i deres sygdom. Det der er mærkeligt i dette tilfælde, er, at langt de fleste af tvillingernes celler har valgt at inaktivere moderens X-kromosom, når det er det paternelle X-kromosom som bærer på mutationen. En sandsynlig forklaring på dette kan være, at der netop er en mere alvorlig mutation på det maternelle X-kromosom, og at cellerne har været nødt til at forholde sig til dette. Det er også muligt, at der på det paternelle X-kromosom har været en defekt i Xistgenet, som har bevirket at dette kromosom ikke kunne inaktiveres. Er der andre faktorer end X-inaktiveringsmønsteret, der medvirker til den store fænotypiske variabilitet? Undersøgelser af Rett-syndromet indikerer, at der må være andre faktorer som medvirker til den store fænotypiske variabilitet. Man har nemlig lavet undersøgelser af personer som bærer på den samme mutation, men som har forskellige symptomer. Mutationen har hos nogle forårsaget Rett, mens den hos andre har resulteret i XLMR. Der er altså kraftige indikationer på, at den genetiske baggrund i hvilken en mutation opstår, har stor betydning for det fænotypiske udfald af mutationen. Det er dog også meget sandsynligt, at exogene faktorer har betydning for det fænotypiske udfald. Det kan f.eks. være at en gravid kvinde overfører toksiske kemikalier til sit foster i form af hormonforstyrrende stoffer e. lign.. Side 64 af 78

65 Kildekritik En stor del af forskningslitteraturens undersøgelser underbygges af store laboratorieundersøgelser med mange medvirkende patienter, hvilket kan gøre det svært at sige noget om den enkelte patient. På den anden side er der også en stor del af forskningslitteraturen, der kun er underbygget af forsøg med meget få patienter, hvorfra det er svært at drage generelle konklusioner, da der er så stor fænotypisk variabilitet. Desuden refererer de enkelte forskningsartikler ofte til tidligere publicerede studier, hvis resultater de så drager konklusioner ud fra. Af denne grund kan eventuelle fejl og ikke ordentligt underbyggede studier forplante sig op igennem kæden af fremkomne forskningsresultater. Det er derfor vigtigt at vi bringer denne diskussion på banen, da man når man skriver et projekt ud fra andres resultater, er nødt til at kunne forholde sig kritisk til det man læser. Forskerne opnår nemlig ofte modstridende resultater, og det derfor er vigtigt at kunne bevare overblikket. Perspektivering Der opnås i forskningen konstant nye resultater, og en naturlig følge af dette er, at man opdager nye sammenhænge, som fører til nye hypoteser. Her i perspektiveringen vil vi diskutere nogle af de opdagelser man har gjort sig, og se på hvilke nye behandlingsmuligheder der opstår, efterhånden som man får en bedre forståelse for X-inaktiveringsmekanismen og dens funktion. Vi nævnte i indledningen, at kvinder som har homoseksuelle børn, og kvinder der har oplevet gentagne aborter, i langt de fleste tilfælde har et skævt inaktiveringsmønster. Dette har nogle perspektiver som vi her vil vende tilbage til. Også cancer er blevet koblet sammen med inaktiveringsmønsteret, og dette vil vi således også komme ind på. Desuden vil vi diskutere mulighederne for at anvende reaktivering af ellers inaktiverede gener som genterapi hos mennesker, der lider af en sygdom som skyldes, at det tilsyneladende raske X-kromosom er blevet inaktiveret. I denne sammenhæng vil vi også diskutere en spændende opdagelse, man har gjort sig inden for det seneste år, som indikerer, at man muligvis kan helbrede Rettpatienter. Til sidst vil vi diskutere en række etiske spørgsmål, som rejser sig i forbindelse med de nye behandlingsmuligheder som genforskningen fører med sig. Side 65 af 78

66 Som nævnt i afsnittet om skæv inaktivering kan inaktiveringen nogle gange ske til fordel for den syge allel, og dette vil i de fleste tilfælde resultere i sygdom. Det er i tilfælde som disse, man mener, at man muligvis kan helbrede folk, hvis en bestemt procentdel af de raske X- kromosomer kan reaktiveres. Spørgsmålet er bl.a. blevet bragt på bane i artiklen Reactivation of inactive X chromosome: A potential culprit and therapeutic target for systemic lupus erythematosus. Man ved at inaktive gener er methylerede, og at man kan forhindre methyleringen ved at hæmme methyltransferaserne i at sætte methylgrupper på de gener, der skal inaktiveres. Man har benyttet sig af denne teknik i forskellige forsøg, og det er således bevist, at det kan lade sig gøre in vitro. Spørgsmålet er, om det er en metode, man kan benytte sig af in vivo. Før man kan begynde at anvende metoden i praksis, er der en lang række spørgsmål man skal tage stilling til. Man skal bl.a. overveje mulige konsekvenser, og etiske spørgsmål kan man heller ikke komme uden om. Mulige konsekvenser kan bl.a. være at der, hvis man reaktiverer det inaktiverede X-kromosom, åbnes op for en mutation, som er værre end den patienten udtrykker (se diskussionen). Inden for det seneste år har en række forskere fundet ud af, at MECP2-mutationer som forårsager Rett, er reversible i mus [Reviewed af Chahrour & Zoghbi, 2007]. De opdagede, at MeCP2-defekte neuroner ikke er permanent skadede, idet de ved at aktivere MeCP2-proteinet afskaffede de neurologiske defekter i både unge og gamle dyr. Selvom disse resultater ikke har fremskaffet øjeblikkelige terapeutiske strategier til behandlingen af Rett, fastslår de, at konsekvenserne af et tab af MeCP2-funktionen er reversible, og at neurologiske defekter i Rett og andre MeCP2-sygdomme sandsynligvis kan helbredes [Reviewed af Chahrour & Zoghbi, 2007]. En sygdom man også er meget interesseret i at kunne helbrede, er cancer. Kristiansen et al. (2001) har i et forsøg, hvor de undersøgte inaktiveringsmønsteret hos 216 patienter med brystcancer, fundet ud af at patienterne har en øget tendens til skævhed i forhold til den undersøgte kontrolgruppe. En anden forskningsgruppe, Buller et al. har ligeledes påvist, at patienter med ovariecancer også har en øget tendens til skævhed i deres inaktiveringsmønster [Kristiansen et al., 2001]. I forsøget på at forklare denne skævhed har forskningsgruppen fremsat to hypoteser, som begge foreslår, at et X-linket tumorsupressor-gen er en risikofaktor for udviklingen af ovariecancer. I den første hypotese foreslår de, at det skæve inaktiveringsmønster er opstået, fordi det X-kromosom med den normale kopi af risiko-genet ved en til- Side 66 af 78

67 fældighed er blevet inaktiveret i de fleste celler. I den anden hypotese antages, at de celler som har den muterede allel aktiv, har en vækstfordel som fører til et skævt inaktiveringsmønster. Der skal mange flere undersøgelser til før, man kan udtale sig mere sikkert om årsagen til det skæve inaktiveringsmønster i de to former for cancer. Det vil også hjælpe at få en større forståelse for hvorfor en lang række andre cancertyper opstår [Kristiansen et al., 2001]. Finder man ud af, at det blandt andre faktorer som f.eks. miljø og livsstil også er et skævt inaktiveringsmønster, som i adskillige tilfælde forårsager cancer, er det så en viden man kan benytte i behandlingen af patienterne, og på hvilken måde? Disse spørgsmål er bare en brøkdel af de ting man inden for forskningsverdenen på nuværende tidspunkt prøver at opklare. En anden ting man forsøger at opklare, er inaktiveringsmønsterets rolle i forbindelse med de gentagne spontane aborter hos en række kvinder. Lanasa et al. har i 1999 fundet ud af, at disse kvinder har et ekstremt skævt inaktiveringsmønster, og de mener, at grunden til dette er, at de bærer på et X-bundet recessivt letalt træk, som cellerne vælger at inaktivere til fordel for det raske X-kromosom. Kvinderne er således symptomfrie bærere af trækket, men deres recessive allel kan ifølge de omtalte forskere, blive letale for et eventuelt drengefoster, idet dette foster kun har et X-kromosom. Om denne teori holder stik eller ej kan vi ikke udtale os om, før man har forsket mere inden for området og har opnået nogle resultater som tydeligt be- eller afkræfter teorien. En sidste interessant opdagelse vi vil diskutere, er den, at mødre som har homoseksuelle børn, også har vist sig at have et skævt inaktiveringsmønster. Bocklandt et al. har i en artikel fra år 2005 undersøgt inaktiveringsmønsteret hos 97 mødre og 103 kontrolpersoner, og her fandt de, at mødrene i langt højere grad end kontrolpersonerne viste ekstremt skæve inaktiveringsmønstre. Deres forsøg viser, at mødre som har to eller flere homoseksuelle sønner, er endnu mere skæve, end mødre som kun har en homoseksuel søn. Dette er meget interessant, da det forstærker hypotesen om, at den ekstreme skævhed har betydning for børnenes seksuelle orientering. Man er dog endnu ikke klar over, om det skæve inaktiveringsmønster direkte påvirkede sønnerne gennem en mekanisme som f.eks. selve fødslen, eller om det bare er en konsekvens af en anden mekanisme, som har indflydelse på den seksuelle orientering [Reviewed af Bocklandt et al., 2005]. Dette er noget man skal forske mere i, før dette spørgsmål kan besvares. Det er en interessant problemstilling, som kan føre en masse etiske spørgsmål med sig, hvis det f.eks. viser sig, at inaktiveringsmønsteret i høj grad afgør hvilket køn børnene er til- Side 67 af 78

68 trukket af. Hvad kan det eksempelvis betyde, hvis det bliver normalt at teste gravide kvinders inaktiveringsmønster, ligesom det er normalt at screene fostre for Downs syndrom? Hvis gravide pludselig kan få oplyst, hvor stor sandsynlighed, der er for, at deres barn bliver homoseksuelt, hvilke konsekvenser kan det så få? Kan det betyde, at nogle kvinder vælger at få en abort på baggrund af dette? Er det etisk korrekt at give dem sådanne informationer, når det ikke er sikkert, at deres børn bliver homoseksuelle? På nuværende tidspunkt er det som nævnt ikke til at sige, om X-inaktiveringsmønsteret har direkte forbindelse til udviklingen af forskellige cancertyper, eller om det er skyld i, at en række kvinder oplever gentagne aborter. Man er heller ikke sikker på hvorledes inaktiveringsmønsteret har indflydelse på, hvilket køn man er tiltrukket af. Det er derfor ikke til at sige, om man vha. denne mekanisme kan behandle cancer og gentagne aborter. Det er dog muligt, at man inden for en relativ kort årrække, kan benytte reaktivering af gener i behandlingen af X-bundne sygdomme, da det er denne mekanisme man ved mest om i forbindelse med inaktiveringsmønsterets indflydelse på udviklingen af disse. Det er også sandsynligt, at man i den nærmeste fremtid finder en måde, hvorpå man kan helbrede Rett-syndromet, da forskningen inden for dette område allerede er nået langt. Side 68 af 78

69 Ordliste Ataxia: Cytoskelet: Neurologisk symptom, hvor patienten ikke kan koordinere sine muskelbevægelser. Et netværk af kontraktile proteinfilamenter i cytoplasmaet i eukaryote celler. Netværket består af aktinfilamenter, intermediære filamenter og mikrotubuli. Cytoskelettet spiller en rolle for opretholdelsen af cellens ydre form. Downstream: Retningen fra 5 3 -enden af et DNA-molekyle eller fra enden i et mrna molekyle. Downs syndrom: Dyspraxia: Edward syndrom: Early truncating mutationer: Epigenetiske modifikationer:. Føtalt alkohol syndrom: I trans: Late truncating mutationer: Lysosomale enzymer: En form for mental retardering, der opstår pga. en kromosomfejl der resulterer i tre kopier af kromosom 21. Tab af evne til at koordinere bevægelser, pga. mangel på motoriske og sensoriske nervesignaler. En form for mental retardering, der opstår pga. en kromosomfejl der resulterer i tre kopier af kromosom nr. 18. En mutation som tidligt i genet introducerer et stopkodon, så proteinproduktet bliver ufuldstændigt. Epigenetik refererer til modifikationer af proteiner og DNA som er stabile igennem celledeling og ikke involverer ændringer i selve DNA-sekvensen. F.eks DNA methylering og histon acetylering. En form for mental retardering, der skyldes moderens indtag af alkohol under graviditeten. I dette tilfælde er det to gener der kommunikerer med hinanden fra hvert sit kromosom. En mutation som sent i genet introducerer et stopkodon. De er ikke ligeså alvorlige som early truncating mutationer. Fordøjelsesenzymer der nedbryder stof optaget ved fagocytose og nedslidte cellulære komponenter. Side 69 af 78

70 Pinocytose: Microcephaly: Missense mutation: Væskeoptagelse ved hjælp af endocytose Lille hovedstørrelse En mutation, hvor der sker en udskiftning af en enkelt nukleotid, hvilket medfører at en bestemt aminosyre i genproduktet udskiftes med en anden. Silencing: Mekanisme der slukker for genekspression i dette tilfælde X- kromosom inaktiveringsmekanismen. Spastisk quadriparesis: Stem loop: TSH-receptor: Spastiske lammelser, hvor hjernens evne til at styre musklerne er unormal. Viser sig ved spastiske, ustyrlige og/eller lammede bevægelser i begge arme og begge ben. Intramolekylær baseparring, der foregår i enkeltstrenget DNA eller mere frekvent i RNA. Strukturen er også kendt som hair pin loop. Strukturen forekommer, når to regioner af det same molekyle, typisk palindromer i nukleotidsekvenser, baseparrer til en dobbelthelix der ender i et uparret loop. Thyroidstimulerende hormonreceptor. Side 70 af 78

71 Litteraturliste Primær litteratur: Artikler Allen et al., 1992 R.C. Allen, H.Y. Zoghbi, A.B. Moseley, H.M. Rosenblatt, J.B. Belmont (1992). Methylation of HpaII and HhaI sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgen-receptor gene correlates with X chromosome inactivation. Am J Hum Genet. 1992, 51 (6): Amir et al., 1999 R.E. Amir, I.B. Van den Veyer, M. Wan, C.Q. Tran, U. Francke, H.Y. Zoghbi (1999): Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-cpg-binding protein. Nature Genetics 1999, 23: Belniak et al., 2007 E. Belniak, Stelmasiak Z., Papuc E (2007): Multiple sclerosis and other autoimmune diseases. Neurol Neurochir Pol. 2007, 41(3): Bocklandt et al., 2005 S. Bocklandt, S. Horvath, E. Vilain, D.H. Hamer (2005): Extreme skewing of X chromosome inactivation in mothers of homosexual men. Hum Genet 2006, 118: Brix et al., 2005 T.H. Brix, G.P.S. Knudsen, M. Kristiansen, K.O. Kyvik, K.H.Ørstavik og L.hegedüs (2005). High frequency of skewed X-chromosome inactivation in females with autoimmune thyroid disease: A possible explanation for the female predisposition to thyroid autoimmunity. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2005, 90: Brown & Greally, 2003 C. J. Brown, John M. Greally (2003) A stain upon the silence: genes escaping X inactivation. Trends in genetics 2003, 19: Brown & Robinson, 2000 C. J. Brown, W. P. Robinson (2000) The causes and consequences of random and non-random X chromosome inactivation in humans. Clinical Genetics 2000, 58: Carrel & Willard, 2005 L. Carrel, H. F. Willard (2005) X-inactivation profile reveals extensive variability in X-linked gene expression in females. NATURE 2005, 434: Side 71 af 78

72 Chahrour & Zoghbi, 2007 M. Chahrour, H.Y. Zoghbi (2007). The story of Rett syndrome: From clinic to neurobiology. Neuron 2007, 56: Chan et al., 1998 V. Chan, B. Yip, T.K. Chan (1998) Hemophilia B in a Female Carrier Due to Skewed Inactivation of the Normal X- Chromosome. Am American Jounal of Hematology 1998, 58: Chitnis et al., 2000 S. Chitnis, J. Monteiro, D. Glass, B. Apatoff, J. Salmon, P. Concannon, P. Gregersen (2000) The role of X.chromosome inactivation in female predisposition to autoimmunity. Arthritis Res 2000, 2: Cooper et al., 1998 G. S. Cooper, M. a: Dooley, E. L. Treawell, E. W. St. Clair, C. G. Parks, G. S. Gilkeson (1998) Hormonal, environmental, and infectious risk factors for developing systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 1998, 41: Csankovszki et al, 2001 G. Csankovszki, A. Nagy, R. Jaenisch (2001) Synergism of Xist RNA, DNA Methylation, and Histone Hypoacetylation in Maintaining X Chromosome Inactivation. The Journal of Cell Biology 2001, 4: Cutolo et al., 1998 N. Cutolo, A. T. Masi (1998) Do androgens influence the pathophysiology of rheumatoid arthritis? Facts and hypoteses. J. Rheumatol. 1998, 25: Ehrlich et al, 2006 M. Ehrlich, K.. Jackson, C. Weemaes (2006) Immunodeficiency, centromic region instability facial anomalies syndrome (ICF). Orphanet J Rare 2006, 1: 2. Franco & Ballabio, 2006 B. Franco, A. Ballabio (2006). X-inactivation and human disease: X-linked dominant male-lethal disorders. Current opinion in Genetics and development 2006, 16: Invernizzi, 2007 P. Invernizzi (2007). The X chromosome in female-predominant autoimmune diseases. Annals of the New York Academy of Sciences 2007, 1110: Jan et al., 1999 M.M.S. Jan, J.M. Dooley, K.E. Gordon (1999). Male Rett syndrome variant: Application of diagnostic criteria. Pediatr Neurol. 1999, 20 (3): Side 72 af 78

73 Karen et al., 2007 N.G., Karen, D. Pullirsch, M. Leeb, A. Wutz (2007) Xist and the order of silencing. European Molecular Biology Organization reports 2007, 8 (1): Kristiansen et al., 2001 M. Kristiansen, A. langerød, G.P. Knudsen, B.L. Weber, A-L Børresen-Dale, K.H. Ørstavik (2001) High frequency of skewed X inactivation in young breast cancer patients. Journal of Medical Genetics 2002, 39: Lanasa et al., 1999 M.C. Lanasa, W.A. Hogge, C. Kubik, J. Blancato, E.P. Hoffman (1999) Highly skewed X-chromosome inactivation is associated with idiopathic recurrent spontaneous abortion. Am J. Hum Genet 1999, 65: Migeon et al, 2005 B. R. Migeon, J. Axelman, P. Jeppesen (2005) Differential X Reactivation in Human Placental Cells: Implications for Reversal of X Inactivation. Am J. Hum Genet 2005, 77: Migeon, 2007 Barbara R. Migeon (2007) Why Females are Mosaics, X-chromosome Inactivation, and sex Differences in Disease. Gender medicine 2007, 4 (2): Minks et al, 2008 Jakub Minks, Wendy P. Robinson, Carolyn J. Brown (2008) A skewed view of X chromosome inactivation. J. Clin. Invest 2008, 118: Ozcelik et al., 2006 T. Ozcelik, E. Uz, C.B. Akyerli, S. Bagislar, C.A. Mustafa, A. Gursoy, N. Akarsu, G. Toruner, N. Kamel, S. Gullu (2006) Evidence from autoimmune thyroiditis of skewed X-chromosome inactivation in female predisposition to autoimmunity. European Journal of Human Genetics 2006, 14: Pan et al, 2008 H. F. Pan, D. Q. Ye, X. P. Li (2008) Reactivation of inactive X chromosome: A potential culprit and therapeutic target for Systemic lupus erythematous. Medical hypotheses 2008, 70: Plenge et al, 2002 R. M. Plenge, R. A. Stevenson, H. A. Lubs, C. E. Schwartz, H. F. Willard (2002) Skewed X-Chromosome Inactivation Is a Common Feature of X-Linked Mental Retardation Disorders The American Journal of Human Genetics 2002, 71: Raynard et al, 2000 M. Raynaud, M.-Pierre Moizard, B. Dessay, S. Briault, A. Toutain, C. Gendrot, N. Ronce, C. Moraine (2000) Systematic analysis of X-inactivation in 19 XLMR families: extremely skewed profiles in carriers in three families. European Journal of Human Genetics 2000, 8: Side 73 af 78

74 Renieri et al., 2003 A. Renieri, I. Meloni, I. Longo, F. Ariani, F. Mari, C. Pesucci, F. Cambi (2003) Rett syndrome: the complex nature of a monogenic disease. Journal of molecular medicine 2003, 81: Richards et al, 1990 C. S. Richards, S. C. Watkins, E. P. Hoffman, N. R. Schneider, I. W. Milsark, K. S. Katz, J. D. Cook, L. M. Kunkel, J. M. Cortada (1990) Skewed X inactivation in a Female MZ twin results in Duchenne muscular dystrophy. The American Journal of Human Genetics 1990, 45: Salstrom, 2007 J. L., Salstrom (2007) X-inactivation and the dynamic maintenace of gene silencing. Molecular genetics and metabolism 2007, 92: Sharp et al, 2000 A. Sharp, D. Robinson, P. Jacobs (2000) Age- and tissuespecific variation of X chromosome inactivation ratios in normal women. Hum Genet. 2000, 107: Schröder et al., 1997 W. Schröder, K. Wulff, K. Wollina, F.K. Herrmann (1997) Haemophilia B in Female Twins Caused by a Point Mutation in one Factor IX Gene and Nonrandom Inactivation Patterns of the X-Chromosome. Thromb Haemost. 1997, 78: Takahashi et al., 2007 S. Takahashi, J.Ohinata, Y. Makita, N. Suzuki, A. Sasaki, K. Murono, H. Tanaka og K. Fujieda. Skewed X chromosome inactivation failed to explain the normal phenotype of a carrier female with MECP2 mutation resulting in Rett syndrome. Clin. Genet. 2007, 73: Tang & Ho, 2007 W. Tang, S. Ho (2007) Epigenetic reprogramming and imprinting in origins of disease. Rev Endocr Metab Disord 2007, 8: Uz et al., 2006 E. Uz, I. Dolen, A.R. Al, T. Ozcelik (2006) Extremely skewed X-chromosome inactivation is increased in pre-eclampsia. Human Genetics 2006, 121: Valleix et al., 2002 S. Valleix, C. Vinciguerra, JM. Lavergne, M. Leuer, M. Delpech, C. Negrier (2002) Skewed X-chromosome inactivation in monochorionic diamniotic twin sisters results in severe and mild hemophilia A. Blood. 2002, 100: Wada et al, 2005 T. Wada, H. Sugie, Y. Fukushima, S. Saitoh (2005) Side 74 af 78

75 Non-skewed X-inactivation may cause mental retardation in a female carrier of X-linked α- thalassemia/mental retardation syndrome (ATR-X): X-inactivation study of nine female carriers of ATR-X. American Journal of Medical Genetics 2005, 138A: Wan et al., 1999 M. Wan, S.S.J. Lee, X. Zhang, I. Houwink-Manville, H. Song, R.E. Amir, S. Budden, S. Naidu, J.L.P. Pereira, I.F.M. Lo, H.Y. Zoghbi, N.C. Schanen, U. Francke (1999) Rett syndrome and beyond: Recurrent spontaneous and familial MECP2 mutations at CpG hotspots. American Journal of Human genetics 1999, 65: Weaving et al., 2004 L.S. Weaving, C.J. Ellaway, J. Gécz, J. Christodoulou (2004) Rett syndrome: clinical review and genetic update. Journal of medical genetics 2004, 42: 1-7 Wutz et al., 2002 A. Wutz, P.T. Rasmussen, R. Jaenisch (2002) Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains of xist RNA. Nature genetics 2002, 30: Wutz & Gribnau, 2007 A. Wutz, J. Gribnau (2007) X inactivation Xplained. Current opinion in Genetics and development 2007, 17: Xiaoming et al., 2007 Y. Xiaoming, R. Latif, Y. Tomer, T. Davies (2007) X chromosome inactivation in patients with autoimmune thyroid disease. Annals of the New York academy of science 2007, 1110: Bøger Campbell & Reese, 2005 N. A. Campbell, J. B. Reese (2005) Biology seventh Edition. International edition, ISBN Griffiths et al., J. F., Anthony, S. R. Wessler, R. C. Lewontin, S. B. Carroll. (2008) Introduction to genetic analysis. 9. Udgave. Freemann. USA. Internetsider Nr. 1. National sundhedsportal: 28/4-2008: Nr. 2. The Weatherall Institute of Molecular Medicine: 29/4-2008: 29/4-2008: Side 75 af 78

76 Nr. 3. The Muscular Dystrophy Association: 29/4-2008: Nr. 4. National center for biotechnology information: 28/4-2008: Nr. 5. Danmarks bløderforening: 5/5-2008: Nr. 6. Biotek virksomhed med fokus på bl.a. blødersygdom: 5/5-2008: Figurer A. 18/5-2008: B. 28/4-2008: [ C. 28/4-2008: [ D. 26/4-2008: [ E. 20/4-2008: [ F. 14/4-2008: [ G. 24/4-2008: [ H. 24/4-2008: [ I. 19/4-2008: [ J. 25/4-2008: [ K. 26/4-2008: [ Sekundær litteratur (baggrundsviden): Artikler Chan et al., 1998 V. Chan, V. W. Y. Chan, B. Yip, C. S. Chim, T. K. Chan Hemophilia B in a Female Carrier Due to Skewed Inactivatin of the Normal X- Chromosome American Journal of Hematology 1998, 58 :72-76 Side 76 af 78

77 Erlandson et al., 2000 A. Erlandson, B. Hallberg, B. Hagberg, J. Wahlström, T. Martinsson (2000). MECP2 mutation screening in swedish classical Rett syndrome females. European Child & Adolescent Psychiatry 2000, 10: Hagberg, 2002 B. Hagberg (2002). Clinical manifestations and stages of Rett syndrome. Mental retardation and developmental disabilities Research reviews 2002, 8: Hagberg et al., 2003 B. Hagberg, A. Erlandson, M. Kyllerman, G. Larsson (2003). Odd MECP2-mutated Rett variant-long-term follow-up profile to age 25. European journal of Paediatric Neurology 2003, 7: Hansen et al, 2000 R. S. Hansen, R Ströger, C. Wijmenga, A. M. Stanek, T. K. Canfield, P. Luo, M. R. Matarazzo, M. D Esposito, R. Feil, G. Gimelli, C. M. R. Weemaes, C. D. Laird, S. M. Gartler (2000) Escape from gene silencing in ICF syndrome: evidence for advanced replication time as a major determinant Human Molecular Genetics, : Kristiansen et al., 2005 M. Kristiansen, G.P.S. Knudsen, L. Bathum, A.K. Naumova, T.I.A. Sørensen, T.H. Brix, A.J. Svendsen, K. Christensen, K.O. Kyvik, K.H. Ørstavik (2005) Twin study of genetic and aging effects on X chromosome inactivation. European Journal of Human Genetics 2005, 13: Nolen et al, 2004 L. D. Nolen, S. Gao, Z. Han, M. R. W. Mann, Y. G. Chung, A. P. Otte, M. S. Bartolomei, K. L. Latham (2004) X chromosome reactivation and regulation in cloned embryos Developmental Biology 2004, 279: Nguyen & Disteche, 2006 D.K. Nguyen, C.M. Disteche (2006) Dosage compensation of the active X chromosome in mammals. Nat Genet. 2006, 38 (1): Puck and Willard, 1998 J. M. Puck, H. F. Willard X Inactivation in Females with X-Linked Disease. The New England Journal of Medicine 1998, 338: Sato et al., 2004 K. Sato, S. Uehara, M. Hashiyada, H. Nabeshima, J. Sugawara, Y. Terada, N. Yaegashi og K. Okamura (2004) Genetic significance of skewed X-chromosome inactivation in premature ovarian failure. American Journal of Human Genetics 2004, 130A: Seeler et al, 1999 Side 77 af 78

78 R. A. Seeler, C. L. Vnencak-Jones, L. M. Bassett, J. B. Gilbert, R. C. Michaelis Severe haemophilia A in a female: a compound heterozygote with nonrandom X- inactivation Heamophilia 1999, 5: Tonon et al, 1998 L. Tonon, G. Bergamaschi, C. Dellavecchia, V. Rosti, C. Lucotii, L. Malabarba, A. Novella, E. Vercesi, F. Frassoni, M. Cazzola. Unbalanced X-chromosome inactivation in the haemopoietic cells from normal women Blackwell Science British Journal of Haematology 1998, 102: Ørstavik et al, 1999 K. H. Ørstavik, R. E. Ørstavik, M. Schwartz (1999) Skewed X chromosome inactivation in a female with haemophilia B and in her non-carrier daughter: a genetic influence on X chromosome inactivation. J Med Genet 1999, 36: Bøger Nørby & Nielsen, 2006 Søren Nørby, Peter K.A. Nielsen, red. Medicinsk genetik dansk pensumbog med mange illustrationer og kliniske fotos. FADL s forlag 2006: , ISBN Side 78 af 78