FluoroSpheres Kodenr. K0110 6. udgave Kalibreringsperler til daglig overvågning af flow-cytometeret. Kittet indeholder reagenser til 40 kalibreringer. (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 1/9
Indholdsfortegnelse Tilsigtet anvendelse... 3 Oversigt og forklaring... 3 Analysens princip... 3 Reagenser... 4 A. Leverede materialer...4 B. Krævede materialer som ikke medleveres...4 Opbevaring... 4 Analyseprocedure og dataindsamling... 4 Dataanalyse, kalibreringskurve... 5 A. Definitioner...6 B. Manuel kalibrering. Vedrørende instrumenter som udtrykker MFI i lineære værdier...6 C. Manuel kalibrering. Vedrørende instrumenter som udtrykker MFI i kanalnumre....7 Side (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 2/9
Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. FluoroSpheres er beregnet til overvågning af flow-cytometer ydelsen. Oversigt og forklaring Kittet indeholder Blank Beads og Calibration Beads med en størrelse på 3,2 µm. Kalibreringsperlerne (Calibration Beads) er en blanding af 5 perleudvalg, som har forskellige fluorescens-intensiteter, samt et ikke-fluorescent perleudvalg. Indfanget i de fluorescente perler findes en kombination af unikke fluorokromer, som aktiveres af lys i enhver bølgelængde fra 365 til 650 nm. Da perle-fluorokromerne er anderledes end de fluorokromer, der normalt bruges i flow-cytometri, er de spektrale egenskaber forskellige. Derfor kan perlerne ikke anvendes til indstilling af fluorescent kompensation. Med molekyler der er tildelt ækvivalente fluorokrom (MEF) værdier for det fluorescente perleudvalg, muliggør brugen af FluoroSpheres transformering af arbitrære enheder, med middel fluorescens-intensitet (MFI), til absolute enheder i forbindelse med kvalitetssikring og rapportering af flow-cytometriske data. Analysens princip 1. Først analyseres Blank Beads (tomme perler) for at oprette optimale instrumentindstillinger for alle kanaler af interesse. 2. Derefter analyseres Calibration Beads (kalibreringsperler). Dataene bruges til at konstruere kalibreringskurven, hvor MFI plottes mod MEF. Kalibreringskurven, og de tilhørende statistiske parametre, bruges til evaluering af instrumentets linearitet. Desuden kan detektionstærskelen og instrumentets dynamiske område også bestemmes ud fra kalibreringskurven. (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 3/9
Kalibrering med FluoroSpheres kan foretages på to måder: Konstant instrumentindstilling. Når denne metode anvendes forbliver alle instrumentindstillinger uændrede. MFI for de forskellige spidser overvåges, og resultaterne vises som datoen for kalibrering versus MFI. Konstant instrumentresponse. Ved denne metode justeres PMT-spændingen, så MFI for en af de høje fluorescent-spidser vises nøjagtigt på samme kanal hver gang. Resultaterne vises derefter som datoen for kalibrering versus PMT-spænding. Reagenser A. Leverede materialer Flaske 1 1,7 ml I 0,02% natriumazid, 0,01% NP40 Flaske 2 1.7 ml Indeholder Blank Beads (tomme perler) og 5 perleudvalg med forskellige mængder fluorokromer, udtrykt i MEF-værdier for henholdsvist FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5 og APC. For lotspecifikke MEF-værdier henvises til det vedlagte Analytical Value Sheet. I 0,02% natriumazid, 0,01% NP40 B. Krævede materialer som ikke medleveres Almindeligt laboratorieudstyr til flow-cytometriske procedurer. Semi-logaritmisk og dobbelt-logaritmisk 5-cyklus grafisk papir. Kalkulator. Softwareprogrammer til analyse af flow-cytometriske data. Regneark-programmer som Microsoft Excel. Disse programmer er ekstraudstyr. Forholdsregler 1. Anvendes af professionelle brugere. 2. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3 ), et kemikalie, der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb. Opbevaring Opbevar kittet ved 2-8 C. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen på flaskerne. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de specificerede, skal disse betingelser verificeres af brugeren. Kontakt Dakos tekniske service, hvis der observeres uventede resultater, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med kittet. Analyseprocedure og dataindsamling 1. Bland perlerne kraftigt med enten en vortex-mixer eller ved rystning. (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 4/9
2. Tilsæt 0,5 ml passende fortyndingsbuffer, for eksempel fosfatjusteret saltvand, ph 7,2, til hver af de to testrør. Tilsæt én dråbe fra flaske 1, Blank Beads, til første rør og én dråbe fra flaske 2, Calibration Beads, til det andet rør. Bland med en vortex-mixer for at sikre at perlerne er opløst i blandingen. 3. Inden dataindsamling vælges logaritmisk udvidelse for de interessante fluorescensdetektorer, og fluorescenskompensationen for alle parametre sættes til nul. 4. Sæt røret med Blank Beads på flow-cytometeret. 5. Justér PMT-spændingen, så spidsen for Blank Beads vises i første tiendedel (dekade) i histogrammet. 6. Brug af fremadspredning versus sidespredning, indstilling af en levende gate på enkelte perler (se Figur 1). 7. Find minimalt 5.000 gatede hændelser for de tomme perler (Blank Beads). 8. Tilsæt røret med kalibreringsperler (Calibration Beads) på flow-cytometeret, og find data for mindst 5.000 gatede hændelser. 9. Seks forskellige spidser for fluorescens-intensitet bør være synlige i den interessante fluorescens-kanal (Se Figur 2). Dataanalyse, kalibreringskurve Analyse af resultaterne er begrænset til gatede, enkle perler som er fri for henfaldent væv, som defineret på en fremadspredt versus en sidespredt plot (se Figur 1). Individuelle markører eller områder bruges til at definere hver af de 6 perle-populationer for kalibrerede perler (se Figur 2). Områderne bruges til at bestemme MFI for hver perle-population. Figur 1. Fremadspredning versus sidespredning for Blank Beads (tomme perler). Gaten er indstillet til at indsamle enkelte perler. (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 5/9
855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts 427 213 0 100 101 102 103 104 FL1-H Figur 2. Histogram over FluoroSpheres perle-populationer. A. Definitioner Log offset Log offset repræsenterer fluorescens-værdien i kanal 0. Kanal 0 repræsenteres almindeligvist i producentens software i form af arbitrære værdier, dvs. 1 for de fleste Becton Dickinson programmer og 0,1 for de fleste Coulter programmer. AvgRes% Den gennemsnitlige restprocent (AvgRes%) er et ikke-vægtet mål for instrumentets responslinearitet. Det beregnes ved at bestemme den gennemsnitlige, absolutte procentdel, som regressionslinjen afviger fra de faktiske punkter. r 2 Bestemmelseskoefficienten (r 2 ) er et vægtet mål for linearitet. Den er meget nyttig når der analyseres log-data. Detektionstærskel Selv om Blank Beads (tomme perler) ikke har indfangede fluorokromer kan de forårsage et signal. Dette signal repræsenterer baggrundsstøjen, og dermed instrumentets detektionsniveau. MEF Molekyler af ækvivalent fluorokrom er mængden af fluorokrom pr. perle. Log-dekade Log-dekade er det totalt kalibrerede område, eller dynamiske område, for den fluorescensparameter som skal kalibreres. Flow-cytometre er i almindelighed udstyret med forstærkere med et dynamisk område på 3,5 eller 4 log-dekader, afhængigt af producenten. Nedsat ydelse af flow-cytometeret vil påvirke log-dekaden. B. Manuel kalibrering. Vedrørende instrumenter som udtrykker MFI i lineære værdier Konstruktion af kalibreringskurven: 1. Bestem MFI for hver af de 6 populationer af FluoroSpheres kalibreringsperler (Calibration Beads). (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 6/9
2. Plot log-mfi mod den tilsvarende log-mef for de forskellige spidser. Beregn den bedste ("best-fit") lige linje i henhold til følgende formel: log (MEF) = a x log (MFI) + b hvor a er hældningen og b er y-aksens afbrydelse, også kaldet log offset eller zero channel value. 3. Beregn de tilhørende statistiske parametre AvgRes% og r 2 for kalibreringskurven. 4. Forstærkerens dynamiske område udtrykkes i log-dekader. Log-dekader kan beregnes ud fra regressionslinjen ved at trække log (MEF min ) fra log (MEF max ). Log (MEF min ) og log (MEF max ) er udledt fra de henholdsvist laveste og højeste MFI-værdier. I det viste eksempel er MFI for MEF min og MEF max henholdsvist 10 0 og10 4. MEF (log-skala) Detektinstaerskel Detektionstærskel (MEF for perle 1) (MEF for perle 1) 1(tom) 1 (Tom) Log Log offset offset (Kanal-0 (kanal-o værdi) vaerdi) Figur 3. Kalibreringskurve (regressionslinje) baseret på FluoroSpheres. Beregningseksempel: MFI MFI (lineære (linear værdier) values) log-dekader = log (MEF max ) - log (MEF min ) log-dekader = log (188 735) - log (30,8) log-dekader = 5,28 1,49 log-dekader = 3,79 Kanaler pr. dekade: Da antallet af kanaler er 1024, er antallet af kanaler pr. dekade: 1024/3.79 = 270 C. Manuel kalibrering. Vedrørende instrumenter som udtrykker MFI i kanalnumre. Konstruktion af kalibreringskurven: 1. Bestem MFI for hver af de 6 populationer af FluoroSpheres kalibreringsperler (Calibration Beads). 2. Plot MFI mod log (MEF) og beregn den bedste ("best-fit") lige linje i henhold til følgende formel: log (MEF) = a x MFI + b hvor a er hældningen, og b er y-aksens afbrydelse. 3. Beregn de tilhørende statistiske parametre AvgRes% og r 2 for kalibreringskurven. (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 7/9
4. Forstærkerens dynamiske område udtrykkes i log-dekader. Log-dekader kan beregnes ud fra regressionslinjen ved at trække log (MEF min ) fra log (MEF max ). Log (MEF min ) og log (MEF max ) er udledt fra de henholdsvist laveste og højeste MFI-værdier. I det viste eksempel er MFI for MEF min og MEF max henholdsvist 0 og1023. MEF (log-skala) Detektinstaerskel Detektionstærskel (MEF for perle 1) (MEF for perle 1) 1(tom) 1 (Tom) Log Log offset offset (Kanal-0 (kanal-o værdi) vaerdi) Figur 4. Kalibreringskurve (regressionslinje) baseret på FluoroSpheres Beregningseksempel: MFI MFI (lineære (linear values) værdier) log-dekader = log (MEF max ) - log (MEF min ) log-dekader = log (188 735) - log (30,8) log-dekader = 5,28 1,49 log-dekader = 3,79 Kanaler pr. dekade: Da antallet af kanaler er 1024, er antallet af kanaler pr. dekade: 1024/3.79 = 270 (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 8/9
Symbolfork laringer Katalognummer Temperaturb egrænsning Anve ndes senest Medicin sk produkt til in vitro diagn ostik Se brugsanvisningen Ind eholde r tilstrækkeligt materiale til <n> tests L otnummer Prod ucen t Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 (105797-004) SSK0110CE_02/DK/2015.12 p. 9/9