Spiring og etablering af feltforsøg med in vitro klonede planter af nordmannsgran. 2-23. Støttet af: Produktionsafgiftsfonden for juletræer og pyntegrønt & Skov- og Naturstyrelsen
Rapport oktober 23 for projektet: Spiring og etablering af feltforsøg med in vitro klonede planter af nordmannsgran -.nr.: 1999-12. Projektperioden var fra 1. januar 2 til 31. december 22, men blev i juni 22 uden yderligere finansiering forlænget frem 31.juni 23 pga. forsinkelser med den aftalte frølevering. Baggrund: Brugen af vævskulturer som udgangspunkt for vegetativ formering (kloning) af elitetræer har for nåletræer været kendt i en årrække, men det har tidligere været vanskeligt at udvikle systemer, som kunne bruges i kommerciel produktion. I de seneste år er udviklingen dog gået stærkt og i lande som USA, Canada og New Zealand overtager klonet plantemateriale en stadig større del af markedet for skovplanter. I dansk skovbrug vil der være store økonomiske gevinster ved at udvikle metoder til kloning af elitemateriale i forbindelse med produktionen af juletræer og pyntegrønt. I dag er alle plantede nordmannsgran produceret fra frø. Kvaliteten af planterne er derfor stærkt varierende, hvorfor en stor del af produktionen må sælges til lavere priser. Traditionelle klonings og formeringsmetoder er ikke velegnede for nordmannsgran. Derfor er formering ved somatisk embryogenese (SE) i steril vævskultur meget interessant. SE er dannelsen af planter fra somatiske celler, dvs. celler, som normalt ikke indgår i den kønnede formering. Dette betyder at de somatiske kim er genetisk identiske med moderplantematerialet. Bortset fra at kimdannelsen ikke sker ved kønnet formering, udvikles de somatiske kim ligesom kim dannet ved kønnet formering i et frø. De somatiske kim kan på laboratoriet opformeres i meget store antal, og derpå prikles i jord på en planteskole. Den kommercielle interesse for somatisk embryogenese er yderligere øget i de seneste år i forbindelse med udvikling af metoder til genetisk transformation (gensplejsning). For de fleste skovtræers vedkommende er transformation i dag således kun praktisk muligt gennem anvendelse af somatisk embryogenese. Formålet med nærværende projekt har været at udvikle metoderne til spiring og udplantning af in vitro klonede planter af Nordmannsgran, herunder at metoderne i løbet af 3-5 år vil være så gode, at en egentlig kommercialisering af teknikken kan finde sted. 1
Målsætninger og opfyldelse af disse I projektansøgningen var der tre væsentlige målsætninger: Målsætning 1 Bred anvendelighed: Vi skulle vise at det var muligt at regenerere planter fra et bredt spektrum af cellelinje. Som en del af projektet skulle der etableres 5-1 nye cellelinier, Kim, som blev dannet fra disse kulturer skulle modnes og de modne kim spires. Det skulle undersøges, om den udviklede standard-metode var effektiv over for størstedelen af de dannede cellelinier (genotyper) eller om det ville være nødvendigt at udvikle modificeringer af standardproceduren. Er målsætning 1 opfyldt?: a, vi har etableret mere end 3 nye cellelinjer. Vha. standardmetoden er det lykkedes at modne og spire kim for 59 af de 6 udvalgte cellelinjer, dvs. omkring 98%. Dette er bemærkelsesværdige resultater, også set i en international målestok. Målsætning 2 Etablering i jord og videre vækst: Metoder til overførsel af planter fra laboratorium til jord skulle forbedres og metoderne udvikles, så de små planter fortsætte væksten, når de var overført til jord. Er målsætning 2 opfyldt?: a, planterne har gennemgået 1-2 vækstsæsoner, udvist fin rodudvikling, hhv. dannet og brudt vinterknopper. De første planter i projektforløbet var dog af ringe kvalitet, og kun få overlevede. Endelig er planternes udvikling ved projektets afslutning forsinket ca. 1 år mht. størrelse og udvikling sammenlignet med frøformerede planter. Målsætning 3. Etablering af feltforsøg: Så hurtigt så muligt skulle der etableres feltforsøg for at sammenligne væksten af klonede planter i forhold til frøformerede planter. Er målsætning 3 opfyldt?: Nej, for at kunne lave feltforsøg, skal planterne ligesom frøplanter 1-2 år gennem en planteskole, og det er ikke lykkedes i dette projekt at etablere et langvarigt og frugtbart samarbejde med en professionel planteskole. Dette skyldes bl.a. tidsnød idet vi først fik forædlede frø i april og oktober 22. De hidtidige resultater har dog vist, at planterne kan klare sig igennem på friland i en planteskole både sommer og vinter. 2
Projektforløb og resultater: Resultaterne har været gode, og næste trin i metodeudviklingen er at overføre planter fra laboratorium til en kommerciel planteskole. Målet er at dokumentere den praktiske anvendelighed af vore resultater, så de kan bruges inden for kommerciel intensiv skovdrift. Den praktiske side af det afsluttede projekt ønskes derfor viderført i et nyt projekt, Demonstrationsplantning af somatiske kimplanter af nordmannsgran fra elite-frø, som er blevet ansøgt hos PAF. Projektetet blev i 21 støttet af Fynske Skovbrugs Fordelingsforening, og resulterede i produktion af mere end 1. planter i iffy-briketter i Botanisk Have. I samarbejde med Peter Benfeldts planteskole fik vi i løbet af 21 forbedret metoderne, og der skete store fremskridt, dels mht. plantekvaliteten inden udplantning, dels mht. til overførsel af planter fra sterile forhold til jord. En væsentlig erfaring fra dette projekt er, at planterne på et tidligt stadie skal afleveres i sterile dyrkningsbeholdere til professionelle planteskolefolk. Desuden blev det klart, at det er nødvendigt at samle produktionen, så planterne kan afleveres 1-2 gange om året, hvilket kræver udvikling af metoder til synkronisering af produktionen, fx gennem udvikling af langtidsholdbare kim. Der resterer endnu nogle hundrede planter hos Peter Benfeldt, som passes ekstensivt. De største er 1-15 cm høje, og er mht. vækst forsinket i deres udvikling sammenlignet med frøformerede planter, men ser i øvrigt normale ud. Øverst th: Småplanter af nordmannsgran i iffy- briketter ca. 8-1 mdr. efter overførsel fra laboratoriet til jord. Disse planter blev leveret til Peter Benfeldt. Øverst th. Vi har i 21-22 arbejdet meget med at forbedret vores dyrkningsmedier. Skuddene og kimnålene var indledningsvis for spinkle og rødderne var tynde og uden synlige rodhår. Vi har i løbet af 21-22 ændret vore metoder væsentligt, hvilket har resulteret i planter med kraftigere skud og rødder. Nederst th. omkring 2 år gamle planter hos Peter Benfeldt. 3
Planter til Sunny Aps., Odense v. Bjarne Larsen Vi har i 22 vi leveret overført omkring 5 småplanter i sterile dyrkningscontainere til Sunny Aps., Odense v. Bjarne Larsen. Idéen var at overførslen til jord og den videre pasning skulle ske på en planteskole, og ikke i Botanisk Have, der kun har ringe erfaring med dyrkning af nordmannsgran. Alm. travlhed i planteskolen og manglende erfaring med vedagtige planter vanskeligjorde arbejdet for Sunny Aps. Vi håber i stedet at kunne indlede et samarbejde med Schjøtts Planteskole, der har stor erfaring med nordmannsgran. Planter i steril dyrknings-gelé, hvor de danner rod og bliver klar til udplantning i jord Bredal Planteskole I juni 22 blev omkring 1 små iffy-planter afleveret til Bredal Planteskole. Disse blev behandlet som frøplanter mht. gødning og sprøjtning m.m. Planterne klarede den strenge vinter med nattefrost ned til -22º C. Der var i august 23, 19 planter er tilbage, hvoraf 16 i størrelse befinder sig mellem almindelige 1/ og 2/. De sidste 93 er lidt mindre end 1/ i højden og lidt tykkere i rodhalsdiameter. I øvrigt ser det ud som om, de klonede har haft det ekstremt hårdt i den varme sommer 23, i modsætning til almindelige 1/ og 2/. Tv: Tv, to planter otte dage efter udplantning; højde over jord,8-1 cm. Th. to planter 2 måneder efter udplantning og dyrkning i Botanisk Have; højde over jord 3,5-5 cm. Th: To ca. otte dage gamle frøplanter fra Bredal Planteskole; samlet længde omkring 2 cm, højde over jorden ca. 13 cm 4
3-5 cm høje planter på Bredal Planteskole, august 23. Planterne er 2 år gamle og blev udplantet i juni 22. Foto fra august 23 Erfaringer fra ovenstående har vist, at der kan produceres nordmannsgran vha. somatisk embryogenese, men at disse planter indledningsvis er små sammenlignet med frøformerede planter. Dette problem kan formentlig løses ved intensive dyrkningsmetoder efter udplantning i jord. Etablering af cellelinjer og planter vha. standardmetode: I april 22 leverede Forskningscenter for Skov og Landskab (FSL) frø fra seks familier af nordmannsgran, der var udvalgt bl.a. pga. deres tilvækst, vækstform og insektresistens. Etablering af vævskulturer fra sådanne elitefrø, med henblik på opformering, kloning og udplantning har afgørende værdi for projektet. FSL ved Ulrik Bräuner vil i den forbindelse udfærdige planer for en videre afprøvning, herunder forsøgsdesign, antal rameter osv. Etablering af vævskulturer fra sådanne elitefrø, med henblik på opformering, kloning og senere udplantning til feltforsøg har afgørende værdi for projektet. Frøene kom desværre sent i projektperioden og var desuden for gamle til steril vævskultur, ligesom der var store problemer med at få gjort frøene sterile. 5
På trods af ovenstående lykkedes at etablere 146 nye cellelinjer af nordmannsgran udfra ovenstående materiale. Af disse blev 6 cellelinjer udvalgt for sammen med allerede etablerede cellelinjer at teste metodens anvendelighed på et bredt spektrum at cellelinier. G2 Familie Total antal frø Antal tomme frø Antal udtagne kim Antal rene kim Antal etablerede cellelinjer Antal initierede cellelinier 87.2 494 169 325 17 85 3 87.3 44 179 261 47 17 12 87.4 39 79 311 138 111 66 87.5 328 119 29 46 11 8 87.6 46 91 315 214 4 23 87.7 48 156 252 58 8 7 2466 793 1673 673 272 146 Resultater fra arbejdet med den første frølevering maj april 23. Vi anvendte knap 25 frø, hvoraf kun ca. 4% gav rene kim. Omkring 21,7% af de rene kim gav embryogene cellelinjer, i alt 146. I oktober 22 fik vi en ny levering af friske frø. Hvor det første frøparti kun gav få rene kim, blev næsten alle kim, omkring 9% rene i det andet frøpar, og i alt 157 cellelinjer blev etablerede. G3 Antal rene kim Antal etablerede cellelinjer Antal udtagne kim 9.1 285 225 36 9.2 234 182 17 9.3 22 21 23 9.4 212 187 39 9.5 2 199 5 9.6 215 211 37 1366 1214 157 Resultater fra arbejdet med den anden frølevering oktober 23. 1214 (88,9%) af de udtagne kim var sterile, fra disse kunne der etableres 157 cellelinjer (12,93%). Af de 146 cellelinjer fra det første frøparti har vi i 23 udvalgt 6 for at teste, hvor mange der kunne give modne kim og planter. Der er kommet modne kim og planter i jord fra de 59 ud af de 6 cellelinjer, 98 %, hvilket må siges at være flot. Fra et tilsvarende canadisk forsøg med 61 cellelinjer af californisk weymouth fyr (Pinus monticola) lykkedes det at modne 47 cellelinjer (77%) og 45 (58%) blev overført til jord. 6
Nedenstående viser den variation, der dels er mellem de forskellige cellelinjer, dels mellem de seks familier. Oversigt over antal kim pr familie: Familie 87.2 antal kim 4 35 3 25 2 15 1 5 G 2.143 G 2.25 G 2.23 G 2.231 G 2.1 G 2.11 G 2.13 G 2.17 G 2.134 G 2.26 G 2.122 G 2.4 genotyper Famile 87.3 4 35 3 25 2 15 1 5 genotyper Famile 87.4 antal kim 4 35 3 25 2 15 1 5 G 2.69 G 2.73 G 2.88 G 2.89 G 2.9 G 2.22 G 2.58 G 2.59 G 2.6 G 2.64 G 2.74 G 2.84 genotyper 7
Familie 87.5 4 35 3 25 2 15 1 5 genotyper Familie 87.6 4 35 3 25 2 15 1 5 G 2.212 G 2.214 G 2.215 G 2.218 G 2.226 G 2.211 G 2.233 G 2.234 G 2.24 G 2.248 G 2.252 antal kim genotyper Familie 87.7 4 35 3 25 2 15 1 5 Genotyper 8
Total antal kim pr. familie: antal kim 25 2 15 1 5 87.2 87.3 87.4 87.5 87.6 87.7 familie antal kim Eftersom der ikke sat lige mange petriskåle op af hver familie, er der lavet en beregning på antal kim per petriskål. Fra én petriskål med mindre end,2 g celler kan der fremstilles mellem 9 og 92 modne kim og planter i gelé. Familie Antal kim Antal petriskåle Gennemsnitligt antal kim pr. petriskål 87.2 1233 96 13 87.3 683 8 9 87.4 134 96 14 87.5 911 64 14 87.6 2156 88 25 87.7 118 56 18 i alt 7341 48 92 Middel 1223,5 8 15 std afv 513 17 5 middel pr. petri 3 25 2 15 1 5 middel pr. petri 87.2 87.3 87.4 87.5 87.6 87.7 familie De i alt mere end 6 planter fra de 59 cellelinjer, som er overført til jord i løbet af 23, vil løbende blive fulgt mht. vækst og overlevelse. Endeligt er 7 ampuller fra hver af de 146 cellelinjer af første frøparti og 1 ampuller fra hver af ca 4 cellelinjer fra det andet frøparti, blevet nedfrosset i flydende kvælstof. Dette har været et voldsomt ressourcekrævende arbejde, som fortrinsvis er blevet finansieret af Botanisk Have. 9
Konklusion: De opnåede resultater i dette projekt viser det er muligt, at danne et meget stort antal planter fra stort set alle testede cellelinjer. Resultaterne viser også: at der kan produceres nordmannsgran vha. somatisk embryogenese, men at disse planter indledningsvis er små sammenlignet med frøformerede planter. Dette problem kan formentlig løses ved intensive dyrkningsmetoder efter udplantning i jord. at planterne skal overføres fra gelé i sterile dyrknings-beholdere til jord på et tidligt udviklingsstadium. Dette kræver en intensiv metodeudvikling på en planteskole med en stram produktionsplanlægning, tilstrækkelig finansiering, og som samtidig har den fornødne ekspertise fra konventionel dyrkning af nordmannsgran. At produktionen af småplanter skal synkroniseres, fx vha. udvikling af langtidsholdbare kunstige kim som anført projektansøgningen: Demonstrationsplantning af somatiske kimplanter af nordmannsgran fra elite-frø, indsendt til PAF i 23. Metoden er endvidere med succes blevet afprøvet af kollegaer i Tyskland, som har vist stor interesse for metoden og dens videreudvikling. Formidling af resultater PR: Produktionen af klonede og af transgene træer af nordmannsgran har afledt mediedækning af projektet, fx indslag i tv-avisen i DR og radioindslag i tysk radio december 22. Desuden er tre populærvidenskabelige artikler om somatisk embryogenese publiceret i hhv. Naturens Verden og PS Nåledrys. Videnskabelige artikler. En videnskabelig artikel er under udarbejdning, og vil indeholde resultater fra arbejdet med de mange cellelinjer. Arbejdstitlen er Evaluation of somatic embryogenesis for clonal propagation of Nordmanns fir (Caucasian fir) og forventes i 24 indsendt til: In Vitro Cell. Dev. Biol Plant. A journal of the Society for In Vitro Biology published by CABI publishing. ISSN 154-5476. Med venlig hilsen Michel M.H. Kristensen Forskningsadjunkt E-mail: michelk@bot.ku.dk Tlf.: 35322239 Peter Krogstrup Lektor, laboratorieleder Oktober 23 1