ELISA. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) forsøg bruges til at detektere og kvantificere stoffer såsom proteiner, peptider, antistoffer o.lig.

ELISA ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) forsøg bruges til at detektere og kvantificere stoffer såsom proteiner, peptider, antistoffer o.lig. Teknikken er ganske snedig, og muliggør at man inddirekte kan måle små koncentrationer af stofferne. Den direkte måling er et optisk signal relateret til koncentrationen. Kvalitativt gælder at større koncentration større signal Vi skal se, hvordan vi kan kvantificere denne sammenhæng lidt nøjere. p. 1/16

DNase data Run 1 0 2 4 6 8 10 12 koncentration Run 2 0 2 4 6 8 10 12 koncentration p. 2/16 optisk signal 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 optisk signal 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

DNase data Run 1 3 2 1 0 1 2 log koncentration Run 2 3 2 1 0 1 2 log koncentration p. 3/16 log optisk signal 4 3 2 1 0 1 log optisk signal 4 3 2 1 0 1

DNase data Run 1 Run 2 Conc. Density Conc. Density 0.05 0.02 0.05 0.04 0.05 0.02 0.05 0.05 0.20 0.12 0.20 0.14 0.20 0.12 0.20 0.12 0.39 0.21 0.39 0.23 0.39 0.21 0.39 0.21 0.78 0.38 0.78 0.40 0.78 0.37 0.78 0.38 1.56 0.61 1.56 0.67 1.56 0.61 1.56 0.68 3.12 1.02 3.12 1.12 3.12 1.00 3.12 1.08 6.25 1.33 6.25 1.55 6.25 1.36 6.25 1.53 12.5 1.73 12.5 1.93 12.5 1.71 12.5 1.91 p. 4/16

DNase linear regression Vi foreslår den lineære regressionsmodel log(signal) = α + β log(koncentration) på de log-transformerede målinger. Dvs. X = log(koncentration) og Y = log(signal). Run 1 Run 2 n = 16 n = 16 X = 0.018 Ȳ = 1.027 X = 0.018 Ȳ = 0.853 x 2 = 47.48 xy = 37.40 x 2 = 47.48 xy = 33.51 b 1 = 37.40 47.48 = 0.79 b 1 = 33.51 47.48 = 0.71 a 1 = 1.027 0.79 0.018 = 1.04 a 1 = 0.853 0.71 0.018 = 0.87 s 2 Y X = residual SS 14 = 0.093 s 2 Y X = residual SS 14 = 0.024 p. 5/16

DNase linear regression Run 1 3 2 1 0 1 2 log koncentration Run 2 3 2 1 0 1 2 log koncentration p. 6/16 log optisk signal log optisk signal 4 3 2 1 0 1 4 3 2 1 0 1

DNase konfidensintervaller Spredningen (run 1) på en ny Y -måling for en given X-værdi er (sŷ ) 1 = 0.093 [ 1 + 1 14 Run 1 konfidensbånd for en ny måling + (X 0.018)2 47.48 ]. log optisk signal 4 3 2 1 0 1 3 2 1 0 1 2 log koncentration p. 7/16

DNase invers prediktion Angiv et konfidensinterval for koncentrationen, hvis det optiske signal er 0.5 (run 1). log(0.5) = 0.693 ˆX = 0.693+1.04 0.79 = 0.439 Conc ˆ = exp( ˆX) = 1.55 Med t = t α(2),14 = 2.144 er K = 0.79 2 2.144 2 (0.093/47.48) = 0.61. Et 95% konfidensinterval for X beregnes ved formel (17.31) til [ 0.41, 1.32]. Et 95% konfidensinterval for koncentrationen er derfor [exp( 0.41), exp(1.32)] = [0.66, 3.71]. p. 8/16

DNase - modeldiskussion Fitter modellen? Tilsyneladende ikke særligt godt for store og små koncentrationer. Konsekvensen er bl.a. stort variansestimat og store konfidensintervaller. Vigtig anvendelse af regressionsanalyse i ELISA-forsøg er netop til invers prediktion ved fornuftige koncentrationer. Vi prøver at se bort fra den mindste koncentration samt de to største koncentrationer vel vidende at det begrænser variationsområdet for koncentrationer, hvor modellen kan bruges. p. 9/16

DNase modificeret linear regression Run 1 Run 2 n = 10 n = 10 X = 0.24 Ȳ = 1.03 X = 0.24 Ȳ = 0.96 x 2 = 10.06 xy = 9.83 x 2 = 10.06 xy = 9.77 b 1 = 9.83 10.06 = 0.77 b 1 = 9.77 10.06 = 0.78 a 1 = 1.03 + 0.77 0.24 = 0.84 a 1 = 0.96 + 0.78 0.24 = 0.77 s 2 Y X = residual SS 10 = 0.0013 s 2 Y X = residual SS 10 = 0.0028 p. 10/16

DNase nye konfidensintervaller Spredningen (run 1) på en ny Y -måling er nu (sŷ ) 1 = 0.0013 [ 1 + 1 8 Run 1 konfidensbånd for en ny måling + (X + 0.24)2 10.06 ]. log optisk signal 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 log koncentration p. 11/16

DNase ny invers prediktion Angiv et konfidensinterval for koncentrationen, hvis det optiske signal er 0.5 (run 1). log(0.5) = 0.693 ˆX = 0.693+0.84 0.77 = 0.19 Conc ˆ = exp( ˆX) = 1.21 Med t = t α(2),14 = 2.144 er K = 0.77 2 2.144 2 (0.0013/10.06) = 0.59. Et 95% konfidensinterval for X beregnes ved formel (17.31) til [0.078, 0.30]. Et 95% konfidensinterval for koncentrationen er derfor [exp(0.078), exp(0.30)] = [1.08, 1.36]. p. 12/16

Test for ens varianser Alle koncentrationer: F = 0.093 0.024 = 3.88 F 0.05(1),14,14 = 2.48 vi forkaster, at varianserne er ens. Centrale koncentrationer alene: F = 0.028 0.013 = 2.15 F 0.05(1),8,8 = 3.44 vi acceptere, at varianserne er ens. p. 13/16

Test for ens hældning Alle koncentrationer: s 2 b 1 b 2 = 0.058 47.48 + 0.058 47.48 = 0.0024 t = 0.79 0.71 0.0024 = 1.63 t 0.05(2),28 = 2.05 vi accepterer, at hældningerne er ens. Det fælles hældningsestimat er b c = 0.75. Centrale koncentrationer alene: s 2 b 1 b 2 = 0.00041 t = 0.77 0.78 0.00041 = 0.50 t 0.05(2),16 = 2.12 vi accepterer, at hældningerne er ens. Det fælles hældningsestimat er b c = 0.78. p. 14/16

Test for ens intercept Idet X er den samme i de to grupper, simplificeres t-teststørrelsen for ens intercept til Ȳ 1 [ Ȳ2 ]. (s 2 Y X ) 1 c n 1 + 1 n 2 Alle koncentrationer: (s 2 Y X ) c = 1.88 28 = 0.067 t = 0.853 1.03 0.067(1/14 + 1/14) = 1.81 t 0.05(2),29 = 2.05 vi accepterer hypotesen om ens intercept. Centrale koncentrationer alene: s 2 b 1 b 2 = 0.033 17 = 0.00196 t = 0.96 1.03 0.00196(1/10 + 1/10) = 3.54 t 0.05(2),17 = 2.11 vi forkaster hypotesen om ens intercept. p. 15/16

Konklusioner Vi drager forskellige konklusioner afhængigt af, om vi tager alle koncentrationer med eller ej. I lyset af det bedre modelfit for de centrale koncentrationer alene samt godkendelse af testet for ens varianser i dette tilfælde, må vi lægge mest vægt på konklusionerne i dette tilfælde. For de centrale koncentrationer ser det ud til, at den rette linje fitter data fint, samt at hældningen tilsyneladende ikke afhænger af forsøgsgangen (run). Derimod er interceptet afhængigt af forsøgsgang. Der er således en variation indenfor hver forsøgsgang, som er ganske lille, men så er der ydermere en variation mellem forsøgsgangene. Det er derfor vanskeligt at lave en kalibreringskurve, som kan bruges til invers prediktion for alle fremtidige forsøg. Normalt laver man derfor i hver forsøgsgang en ny kalibreringskurve (standardkurven). Bedre standardkurver, som kan dække et større koncentrationsområde, kan opnås med ikke-lineær regression, men i det centrale koncentrationsområde, hvor usikkerheden på de ikke-lineære regressionsfunktioner også er mindst, vil selv en ikke-lineær regressionsfunktion være stort set lineær. p. 16/16