Svampeendofytter i græs Fungal endophytes in grasses Anne Mette Dahl Jensen, Lise C. Deleuran, René Gislum og Birte Boelt Afdeling for Plantebiologi, Danmarks JordbrugsForskning, Forskningscenter Flakkebjerg, 42 Slagelse, Danmark Department of Plant Biology, The Danish Institute of Agricultural Sciences, Research Centre Flakkebjerg, 42 Slagelse, Denmark SAMMENDRAG Svampeendofytter tilhørende slægten Neotyphodium sp. findes i vilde græsser såvel som i græsser dyrket til frøavl i Danmark. Endofytter kan tilføre planten fordelagtige egenskaber, men fodres dyr med endofytholdigt græs, kan deres helbred og produktion påvirkes negativt. De negative effekter af endofytten skyldes produktionen af toksiner. I Danmark fremstilles i dag græssorter med endofytter med henblik på eksport. Det formodes, at markedet for endofytholdige græsser stiger inden for den nærmeste årrække og dermed også arealet med inficeret græs. De danske avlere og frøproducenter har ønsket en risikovurdering af biprodukterne fra frøgræsproduktionen, idet produkterne kan anvendes til foder. Desuden ønskes retningslinier i relation til anvendelse. Danske undersøgelser af toksinet lolitrem B produceret i almindelig rajgræs (Lolium perenne L.) viser, at der under visse forhold er en betydelig produktion. Dog er der observeret en stor variation i lolitrem B mængderne, og det er derfor vanskeligt at opstille entydige retningslinier. Et nyt forskningsprojekt i Danmark går nu bl.a. i dybden med nogle af de fordele, som endofytten tilfører græsser for derigennem at undersøge, om endofytter kan anvendes som biologiske kontrolorganismer under danske forhold. ABSTRACT Fungal endophytes of the genus Neotyphodium sp. occur in wild grasses as well as in grass grown for seed production in Denmark. The endophyte provides benefits to the plant. However, if livestock is fed with endophyte-infected grass it might have a negative effect on animal health and production. The negative effects of the endophyte are caused by the production of toxins. Today in Denmark endophyte-infected grasses are produced for export. It is assumed that the market for endophyte-infected grass will expand over the next couple of years and with that also area with infected grass. Danish growers and seed producers have demanded a risk assessment of waste products from this grass seed production because the products can be used as fodder. Additionally, guidelines in relation to use is desirable. The Danish investigation of the production of lolitrem B in perennial ryegrass (Lolium perenne L.) demonstrates that a pronounced production can occur. However, a large variation in the lolitrem B content is registered and therefore it is difficult to give final guidelines. A new research project in Denmark now tries to look into some of the advantages provided to the plant by the endophyte and to investigate whether the endophyte can be used as a biological control organism under Danish growing conditions. Key Words; Endophytes, seed grass, Lolium perenne L. lolitrem B, ergovaline, risk assessment, biological control organisms.
GRÆSENDOFYTTER Endofytter er svampe, der lever inden i græsser, uden at det kan ses på planterne. Planten og svampen lever i en naturlig symbiose, hvilket betyder at begge organismer drager fordel af dette samliv (Clay, 1993). Svampen får næring og beskyttelse af planten. Desuden er svampen fuldstændig afhængig af planten, når det gælder spredning, da den spredes med græssets frø. Endofytten producerer på intet tidspunkt sporer, der gør den i stand til at inficere en endofytfri plante. Planten derimod kan opnå resistens over for insektangreb, og under visse forhold påvirkes plantens vækst og frøsætning i en positiv retning (Clay, 1987, Popay & Wyatt, 1995). Disse effekter er oftest forårsaget af produktionen af stoffet peramin, samt forskellige plantehormoner. Der er mange konkrete eksempler på, at endofytten kan tilføre planten fordelagtige egenskaber, specielt når græsserne dyrkes under stressede forhold (Ravel et al., 1999). På New Zealand kan man for eksempel ikke dyrke alm. rajgræs (Lolium perenne L.), der ikke er endofytinficeret, da planterne i så fald vil blive angrebet af skadelige insekter. Det samme er tilfældet i det sydlige USA, hvor det meste strandsvingel (Festuca arundinacea Schreb.) er endofytinficeret, idet planterne herved bliver i stand til at modstå tørkestress. Desværre kan der også forekomme en produktion af toksiske stoffer i den inficerede plante. Stoffer der kan gøre dyr syge, hvis de afgræsser eller fodres med inficeret græs. De vigtigste stoffer i den forbindelse er lolitrem B og ergovalin. Dyr, som spiser inficeret rajgræs, kan få Stagger forårsaget af stoffet lolitrem B (Cosgrove et al., 1996). Lolitrem B produceres kun i endofytinficeret rajgræs. Stoffet ergovalin produceres derimod både i inficeret rajgræs og svingel. Symptomerne forårsaget af dette stof kaldes Fescue toksikoser (Read & Camp, 1986). Hvorvidt dyrene får alvorlige symptomer afhænger af dyreart, og i hvilke koncentrationer stofferne er til stede i deres foder. Heste og grise er de mest følsomme, hvorimod får og køer er mere tolerante. Hvis dyrene indtager disse giftstoffer, kan det være forbundet med store økonomiske tab på grund af lavere tilvækst og i værste tilfælde døde dyr. ENDOFYTTER I DANSKE GRÆSSER Neotyphodium endofytter er fundet i mange forskellige græsarter. En del af svampens mulige værter dyrkes med henblik på frøavl i Danmark (Tabel 1). Tabel 1. Græsser dyrket i Danmark med henblik på frøavl og som er mulige værter for Neotyphodium endofytten. Table 1. Grass grown for seedproduction in Denmark with a potential of being a host for the Neotyphodium endophyte. Art Species Ital. rajgræs (Lolium multiflorum Lam.) Alm. rajgræs (Lolium perenne L.) Rødsvingel (Festuca rubra L.) Strandsvingel (Festuca arundinacea Schreb.) Fåresvingel (Festuca duriuscula L.) Engsvingel (Festuca pratensis Huds.) Hvene (Agrostis spp.)
Igangværende undersøgelser af endofytternes udbredelse i Danmark viser, at vilde alm. rajgræs populationer indeholder svampen, og at den er almindeligt udbredt. En gennemgang foretaget af DLF-Trifolium af deres alm. rajgræs og strandsvingel sorter i produktion viser desuden, at en del af dem indeholder endofytter (Tabel 2). Danske frøfirmaer forventer, i den kommende årrække at få flere græssorter indeholdende endofytter til opformering, da der i udlandet er et marked for endofytholdigt græs. For eksempel skal plænegræs, der sælges til USA, i dag indeholde endofytter. Der er blevet sat spørgsmålstegn ved, om en høj endofytkoncentration kan opretholdes ved fremavl af græsfrø i Danmark. Undersøgelser af alm. rajgræs i danske endofytholdige frømarker og vilde græspopulationer indikerer, at endofytten kan opretholdes med de oprindelige infektionsprocenter. I de vilde populationer er endofytten jævnt udbredt, og i frøgræsmarkerne er der oftest ingen signifikante forskelle i endofytinfektionsprocenten fra basisfrø til frø høstet på en 2. års mark (Tabel 3). Faldet fra 87% i pre-basisfrø høstet i USA til ca. 3 % i basisfrø fremavlet i Danmark skyldes formodentlig, at frøet har været opbevaret under ugunstige forhold. Derfor har endofytten været død i en del af pre-basisfrøene, der er blev sået ud i Danmark. Dette viser, at det er vigtigt at være meget påpasselig med, hvordan man opbevarer endofytinficeret frø. Hvis endofytinfektion skal markedsføres som en kvalitetsparameter, er det nødvendigt at justere opbevarings forholdene, så endofytten ikke mistes. Tabel 2. Endofytindholdet i græssorter solgt af DLF-Trifolium (Roulund, ikke publiceret). Table 2. Endophyte content in grass sold by DLF-Trifolium (Roulund, not published). Art Antal sorter med endofytinfektion % >5 Sorter undersøgt Species Number of cultivars with infection % > 5 Cultivars investigated Lolium perenne 23 148 Festuca arundinacea 12 26 Tabel 3. Endofytinfektionsfrekvens i frø af alm. rajgræs cv. Delaware frø (Jensen, ikke publiceret). Table 3. Endophyteinfection frequency in seed of perennial ryegrass cv. Delaware (Jensen, not published). Infektions % Infection % Frø Lokalitet, 1998 Lokalitet, 1999 Lokalitet, 2 Seed Location, 1998 Location, 1999 Location, 2 FUa NL KK BR UG 1 GR FUb FUc 1 Fud 1 FV HA Pre-basis** 87, 87, 87, 87, 87, 87, 87, 87, 87, 87, 87, Basis 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 29,3 F1 3,3 2,* 32, 32,6 3,6 22,3* 29, 25,7 29,6 ND ND * = signifikant forskellig på 5 % niveau inden for lokalitet, ** = høstet i USA, 1 = frø høstet 2. år, ND = ikke registreret. a og c samme mark, a = 1. års frøhøst, c = 2. års frøhøst. b og d samme mark, b =1.års frøhøst, d = 2. års frøhøst.
Undersøgelser af myceliet i planterne viser desuden, at endofytten etablerer sig godt i de enkelte planter gennem vækstsæsonen (Figur 1). Der er dog store forskelle i infektionsgraden fra år til år, hvorimod der ikke er den store variation mellem de forskellige marker inden for samme år. Figur 1. Myceliets udbredelse gennem vækstsæsonen i Lolium perenne cv. Delaware. Figure 1. Mycelium distribution during the growing season in Lolium perenne cv. Delaware 3 Hyfer pr mm bladskede 25 2 15 1 5 31-3 28-4 9-5 17-5 26-5 7-6 14-6 23-6 5-7 12-7 21-7 15-8 18-8 15-9 21-9 12-1 Grevinge 1999 Fulby 1999 Fulby 1999* Fulby 1998 Nordruplund 1998 Kokkedal 1998 Brorfelde 1998 Ugerløse 1998 * Fulby 2 * RISIKOVURDERING AF BIPRODUKTER FRA GRÆSFRØ PRODUKTIONEN. Endofytholdigt græs dyrkes allerede til frøproduktion i Danmark og det areal vil stige over den næste årrække. Derfor ønsker avlerne og frøproducenterne en undersøgelse af toksinproduktionen i de endofytholdige marker. Det er praksis at biprodukterne (halm, genvækst) fra frøavlen anvendes til dyrefoder, og det kan være problematisk, da toksinproduktionen under visse forhold kan blive relativ høj. De seneste 3 år er der sat fokus på produktionen af toksinet lolitrem B i alm. rajgræs. Den generelle opfattelse har hidtil været, at dette ikke kan blive et problem i Danmark, til trods for at Stagger rent faktisk har været konstateret i det nordlige Europa bl.a. i England. Undersøgelserne har været koncentreret omkring sorten Delaware, der har været i produktion igennem de seneste 5 år i Danmark. Delaware er en plænetype med ca. 3 % endofytinfektion. Forskellige marker beliggende på Vestsjælland blev fulgt i 1998, 1999 og 2. Hver måned gennem vækstsæsonen er der udtaget prøver til bestemmelse af lolitrem B. Undersøgelser af lolitrem B produceret i danske Delaware marker (eks. Figur 2 og 3) viser en stor variation mellem de forskellige marker og mellem prøver taget i samme mark (Jensen, ikke publiceret). I visse marker er lolitrem B niveauerne problematiske, hvis halmen skal anvendes til foder. Normalt forårsager en koncentration på 2 ppm Stagger i får, men f.eks. heste kan få problemer ved lavere koncentrationer. Det har været svært at finde en sammenhæng mellem klima, dyrkningsforhold og lolitrem B produktionen, og det er derfor ikke muligt at udstikke konkrete retningslinier for, hvornår halm kan anvendes til foder. Undersøgelsen viser ligeledes, at der er en stor variation gennem året (Jensen, ikke publiceret). De største mængder findes i toppen om sommeren lige før frøhøst, mens der i basisdelen sker
en akkumulering over hele vækstsæsonen, der dog ikke når problematiske niveauer. Et økonomisk tab i form af lavere produktion kan dog forekomme, hvis dyr tvinges til at græsse tæt over en længere periode. I endofytinficeret strandsvingel produceres toksinet ergovalin. Ergovalin produceres sandsynligvis under danske forhold, men hverken tilstedeværelse eller eventuelle mængder er endnu undersøgt. Adcock et al. (1997) har vist, at ergovalin ikke produceres efter samme mønster som lolitrem B, og at det derfor kan giver problemer på andre tidspunkter af året. Lolitrem B produktionen afhænger af den enkelte svampe-plante genotype kombination samt af den tilførte mængde kvælstof (Hill et al., 1991, Rottinghaus et al., 1991). Dog er det stadigt uklart i hvilke situationer der produceres meget lolitrem B. Derfor har visse frøfirmaer valgt at fremkomme med nogle anbefalinger. DLF-Trifolium har bl.a. frarådet, at der anvendes restprodukter fra rajgræsmarker, der er mere end 15 % inficeret, og fra strandsvingelmarker, der er mere end 6-7% inficeret, indtil større viden er opnået. I den forbindelse er det vigtigt at få oprettet et testcenter ved Danmarks JordbrugsForskning, hvor avlere, konsulenter og frøfirmaer kan få testet endofytinficeret græs for tilstedeværelsen af forskellige toksiske stoffer. På denne måde kan der i konkrete tilfælde opnås viden om, hvorvidt endofytinficeret græs kan anvendes til foder. Visse steder i verden er problemet forsøgt løst ved at udvikle endofytholdige græsser, hvor svampen mangler evnen til at producere ergovalin og lolitrem B. Firmaet AGRICOM har bl.a. markedsført en endosafe i tetraploid hybrid rajgræs. Bliver dyr syge som følge af lolitrem B, kan de gives foder, der ikke er inficeret, og i løbet af nogle uger vil de være symptomfri. Det er derimod mere problematisk, hvis der er tale om ergovalin forgiftning. Figur 2. Produktion af lolitrem B under danske dyrkningsforhold, lokalitet Brorfelde (BR), 1998 (Jensen, ikke publiceret). Base, -5 cm over jorden. Top, alt over 5 cm. Figure 2. Production of lolitrem B under Danish growing conditions, location Brorfelde (BR), 1998 (Jensen, not published). Base, -5 cm above ground. Top, everything above 5 cm. Lolitrem B ppm 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4,2 Maj Juni Juli August September Oktober Base plot 1 Top plot 1 Base plot 2 Top plot 2
Figur 3. Produktion af lolitrem B under danske dyrkningsforhold, lokalitet Nordruplund (NL), 1998 (Jensen, ikke publiceret). Base, -5 cm over jorden. Top, alt over 5 cm. Figure 3. Production of lolitrem B under Danish growing conditions, location Nordruplund (NL), 1998 (Jensen, not published). Base, -5 cm above ground. Top, everything above 5 cm. Lolitrem B ppm 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4,2 Maj Juni Juli August September Oktober Base plot 1 Top plot 1 Base plot 2 Top plot 2 I relation til opbevaring af halm bør det bemærkes, at toksinerne ikke forsvinder særlig hurtigt. Det samme er tilfældet ved ensilering. Derimod kan mængden af toksin formindskes ved en ammonificering. KAN ENDOFYTTERNE GIVE BEDRE GRÆSSER? Endofytforskningen i Danmark har det seneste år fået nye vinkler. Forskningen er nu udvidet til også at fokusere på potentialet for at anvende endofytterne til biologisk kontrol. Det er sket med baggrund i, at der fra 1. januar 23 ikke længere må bruges pesticider på offentlige arealer. Indgåelsen af denne frivillige aftale har skabt stor bekymring i bl.a. offentligt anlagte golfklubber. Disse baner har traditionelt været afhængige af at kunne anvende pesticider bl.a. til bekæmpelse af sneskimmel på greens og insektangreb på fairways. Projektet har derfor til formål at undersøge, om endofytholdige plænegræsser har en forbedret persistens og resistens. Dette sker i samarbejde med Dansk Golf Union og DLF-Trifolium. Endofytter har en effekt på fotosyntesen (Jensen & Deleuran 21). Undersøgelsen viste at endofytterne kan forøge fotosyntesen, men effekten er afhængig af sort, klon og tilført mængde kvælstof (Figur 4 og 5). Det er med baggrund i disse observationer, at hypotesen om at endofytter kan anvendes til at forbedre græsserne, er fremsat. Som et resultat af fotosyntesen dannes bl.a. kulhydrater. Nogle af disse kulhydrater omdannes til fruktaner der menes at have en betydning for græssernes vinterpersistens (Tronsmo, 1984). Det undersøges derfor om mængden af fruktaner kan øges ved bl.a. at bruge endofytinficeret græs, og om denne forøgelse kan relateres til planternes modtagelighed over for sneskimmel samt deres udvikling i foråret. Det vil desuden være oplagt at undersøge, om endofytter, der producerer meget peramin, har nogen effekt på de insektproblemer, der til tider kan forekomme på bl.a. fairways på golfbaner. Et problem som klubberne med den nye ordning ikke mere kan sprøjte sig fra.
Figur 4. Endofytternes effekt på fotosyntesen (µmol CO 2 m -2 s -1 ) i relation til plantesort og genotype ved tilførsel af normal mængde kvælstof. * signifikans på 5 % niveau. Figure 4. Endophyte effect on photosynthesis (µmol CO 2 m -2 s -1 ) in relation to plant variety and genotype at normal nitrogen application. * significant at the 5 % level. Fotosyntese 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 * * 4 11 2 9 23 26 Achiever Achiever Achiever Delaware Delaware Delaware E- E+ Figur 5. Endofytternes effekt på fotosyntesen (µmol CO 2 m -2 s -1 ) i relation til plantesort og genotype ved tilførsel af høj mængde kvælstof. * signifikant på 5 % niveau. Figure 5. Endophyte effect on photosynthesis (µmol CO 2 m -2 s -1 ) in relation to plant variety and genotype at a high nitrogen application. * significant at the 5 % level. 2 18 16 Fotosyntese 14 12 1 8 6 * * 4 2 4 11 2 9 23 26 Achiever Achiever Achiever Delaware Deleware Delaware E- E+
Nye undersøgelser, som ikke er færdigbehandlet, tyder på, at visse komponenter såsom antallet af skud, fertile skud, frø etc., påvirkes af tilstedeværelsen af endofytten. Det vil derfor være spændende i fremtiden at undersøge, om etableringen af græsser kan forbedres, hvis de har endofytter. Specielt i blandinger hvor græsserne har en uens fremspiring. LITTERATUR Adcock, R. A., Hill, N. S., Boerma, H. R. & Ware, G. O. 1997. Sample variation and resource allocation for ergot alkaloid characterization in endophyte-infected tall fescue. Crop Science 37: 31-35 Clay, K. 1987. Effect of fungal endophytes on the seed and seedling biology of Lolium perenne and Festuca arundinacea. Oecologia 73: 358-362 Clay, K. 1993. The ecology and evolution of endophytes. Agriculture, Ecosystems and Environment 44: 39-64 Cosgrove, G. P., Anderson, C. B, & Berquist, T. R. N. 1996. Fungal endophyte effects on intake, health and liveweight gain of grazing. Proceedings of the New Zealand Grass Association 57: 43-48 Hill, N. S., Parrott, W. A. & Pope, D. D. 1991. Ergopeptine alkaloid production by endophytes in common tall fescue genotype. Crop Science 31: 1545-1547 Jensen, A. M. D. & Deleuran, L. C. 21. Effect of endophyte infection on photosynthesis in Lolium perenne grown at different nitrogen levels preliminary results. In: Paul V. H. and Dapprich P. D. Proceedings from the 4th International Neotyphodium/Grass interactions Symposium 369-374. Marks, S. & Clay, K. 1996. Physiological responses of Festuca arundinacea to fungal endophyte infection. New Phytologist 133: 727-733 Popay, A. J. & Wyatt, R. T. 1995. Resistance to argentine stem weevil in perennial ryegrass infected with endophytes producing different alkaloids. Proceedings of the 48 th New Zealand Plant Protection Conference 229-236 Ravel, C., Balfourier, F. & Guillaumin, J. J. 1999. Enhancement of yield and persistence of perennial ryegrass inoculated with one endophyte isolated in France. Agronomie 19: 635-644 Read, J. C. & Camp, B. J. 1986. The effect of the fungal endophyte Acremonium coenophialum in tall fescue on animal performance, toxicity and stand maintenance. Agronomy journal 78: 848-85 Rottinghaus, G. E., Garner, G. B., Cornell, C. N. & Ellis, J. L. 1991. HPLC method for quantitating ergovaline in endophyte infected tall fescue: Seasonal variation of ergovaline levels in stems with leaf sheaths, leaf blades and seed heads. Journal of Agricultural Food Chemistry 39: 112-115 Tronsmo, A. M. 1984, Predisposing effects of low temperature on resistance to winter stress factors in grasses. Acta Agriculturae Scandinavica 34:21-22