Roskilde Universitet Foråret 2010 Det Naturvidenskabelige Basisstudium Hus 14.2. En tilbagevendende trussel

En tilbagevendende trussel Gruppe 8 Helene Nørgaard Bachmann Louise Nielsen Tugba Orhan Mette Rams Roskilde Universitet Foråret 2010 Det Naturvidenskabelige Basisstudium Hus 14.2 Vejleder Gustaw Kerszman

Abstrakt Årligt rammes verdens befolkning af sæsoninfluenza, og med jævne mellemrum udbryder epidemier eller pandemier, som verdenssamfundet er dårligt rustet til at modstå. I dette projekt udarbejdes et review med det formål at belyse den aktuelle viden om influenza As patogene og infektiøse egenskaber med Swine Origin Influenza Virus (SOIV) som eksempel. Overfladeproteinerne hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) spiller en vigtig rolle i viruspatogenitet, idet disse hhv. sørger for binding til værtscellen og frigivelse af nye viruspartikler. Receptoraffiniteten er ligeledes essentiel i forbindelse med infektion. Ud fra analyser af kløvningssitet for HA, må SOIV betragtes som værende en lav-patogen virus, men hurtig til at sprede sig mellem individer. Sammenligning af sæsoninfluenza (H1N1) med SOIV viste stor bevarelse af epitoper, som genkendes af immunforsvarets T-celler, hvilket kan være en anden forklaring på, hvorfor SOIV ikke har været så farlig som først frygtet. Gennem litteraturstudie gives en opsamlende vurdering af den viden, der foreligger på området. Herudfra konkluderes, at mange faktorer i samspil har betydning for infektion med og patogenitet af influenzavira, herunder særligt de otte virale gensegmenter samt værtens præeksisterende immunitet. Abstract Every year people worldwide are infected with a seasonal influenza virus and occasionally epidemics or pandemics emerge, which the world society is poorly protected from. This project Influenza a returning threat provides a review with the purpose of summarizing the existing knowledge of pathogenicity and infectivity concerning influenza A along with Swine Origin Influenza Virus (SOIV), as an example. The surface proteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) play an important part in the pathogenicity of virus as these are responsible for the binding and release of the virus particle, respectively. The receptor affinity is essential concerning infection. Based on analysis of the cleaving site of HA, SOIV must be considered to be low pathogenic but efficiently spreading in between individuals. Comparing seasonal flu (H1N1) with SOIV shows great conservation of the epitopes recognized by T-cells, which contributes to an explanation as to why SOIV has not had the lethal consequences which was feared. Trough a literature research, the report provides a summarizing evaluation of the present knowledge on the subject. It is concluded that several interacting factors play a key role in the pathogenicity and infectivity of influenza viruses, in particular, the eight viral gene segments and pre-existing host immunity. Side 2 af 50

Forord Vi vil gerne henvende en særlig tak til Lektor Morten Blomhøj, IMFUFA/NSM, RUC for engageret opponering samt Lektor Gustaw Kerszman, NSM, RUC for usvigelig støtte og vejledning Forside: Elektronmikroskop (SEM) billede af aviær influenza A virus fra 3DScience.com (PRNewsFoto/Zygote Media Group). Online på http://www.flickr.com/photos/45573003@n03/4399601187/ (25/05/2010). Side 3 af 50

Indholdsfortegnelse INDLEDNING... 5 PROBLEMFELT... 6 METODE... 7 REVIEW... 8 1 HISTORISKE INFLUENZAPANDEMIER... 9 2 INTRODUCERENDE OM VIRUS... 10 2.1 DET VIRALE GENOM... 10 2.2 DEN VIRALE LIVSCYKLUS... 12 2.3 REASSORTERING OG GENETISKE MUTATIONER... 13 3 IMMUNITET... 16 3.1 IMMUNRESPONS PÅ INFLUENZAINFEKTIONER... 16 3.2 MEDFØDT IMMUNITET... 16 3.3 ADAPTIV IMMUNITET... 19 4 OVERFØRSEL OG INFEKTION... 20 4.1 TEMPERATUR OG LUFTFUGTIGHED... 20 4.2 D-VITAMIN... 21 4.3 EPITOPBEVARELSE OG PRÆEKSISTERENDE IMMUNITET... 21 4.4 FOREBYGGELSE... 23 4.5 REPLIKATIONSHASTIGHED... 25 5 PATOGENITET... 28 5.1 VÆRTSSPECIFICITET... 28 5.2 OVERFLADEPROTEINERNE SOM BESTEMMENDE FAKTORER I PATOGENITET... 29 5.3 SPALTNING AF HÆMAGGLUTININ... 30 5.4 NEDREGULERING AF APOPTOSE... 33 5.5 BEHANDLING... 34 6 OPSAMLING... 37 DISKUSSION... 39 KONKLUSION... 43 LITTERATURLISTE... 44 Side 4 af 50

Indledning Sæsoninfluenza er ikke noget fremmedord for de fleste. Hvert vinterhalvår rammes verden i mindre grad af influenza, og hvert 2.-3. år opleves en større epidemi, hvor op mod 20% af befolkningen bliver smittet i løbet af få uger [www.sst.dk]. Den almindelige sæsoninfluenza er sjældent farlig for et ellers raskt menneske, men for børn, ældre og særligt personer med luftvejssygdomme kan sæsoninfluenzaen være livsfarlig. Fra tid til anden rammes verden af en influenzapandemi, hvor en smitsom virus er florerende i mere end 3 lande. Disse pandemier har i løbet af det 20. århundrede kostet mange menneskeliv. Af frygt for en ny dødbringende pandemi overvåges alle influenzatilfælde tæt af World Health Organization (WHO), som holder de nationale sundhedsmyndigheder orienterede om, hvilke vira, der forventes at ramme hvert år samt supplerer med statistikker og viden på området. Det årlige beredskab består både i udvikling og fremstilling af vacciner, og foregår for Danmarks vedkommende på Statens Seruminstitut. I april 2009 udbrød en ny influenzavirus af typen A, som mere populært blev kaldt svineinfluenza. Denne blev senere, af hensyn til svineavlere, omdøbt til A/California/04/2009 eller H1N1. Undertiden benævnes denne virus som Swine Origin Influenza Virus (SOIV), og da en almindelig sæsoninfluenza også er af typen H1N1, vil betegnelsen SOIV for klarhedens skyld fortløbende blive anvendt opgaven igennem. Det første tilfælde af SOIV blev registreret i Mexico, hvorfra virussen spredte sig til det meste af verden på kort tid. Da SOIV udsprang af samme undertype, som den spanske influenza fra 1918, som i øvrigt kostede 50 millioner menneskeliv, var der god grund til at være varsom og velberedt [Rev. Al- Hajjar & McIntosh, 2010]. Den 11. juni 2009 erklærede WHO pandemi på højeste niveau, som betyder omfattende overførsel af smitte på mindst to kontinenter. Beredskabet blev derfor sat ind for at beskytte verdens befolkning mod alvorlige følger af sygdommen. Selvom SOIV har kostet menneskeliv, har den ikke indtil videre vist sig at være så farlig som frygtet, men måske er det for tidligt at ånde lettet op. Hidtidige pandemier har ramt i bølger, den spanske influenza i hele tre. Det frygtes derfor, at dette også kunne være tilfældet med SOIV, og at virussen kan vende tilbage i en ny og farligere mutation. Men hvorfor gik det ikke så galt i denne omgang, og hvad har indvirkning på en influenzas patogenitet og infektiøse egenskaber? Nærliggende projekt ønsker, at belyse spørgsmål, som blandt andre disse, med fokus på følgende overordnede problemformulering: Hvad kan man forudsige om influenza As patogene og infektiøse egenskaber ud fra viruspartiklens opbygning? Side 5 af 50

Problemfelt Naturvidenskaben udgør mange vigtige roller i det moderne samfund, både ved udviklingen af nye teknologier og tilvejebringelsen af løsninger til de forskellige foreliggende trusler. I dette semester har vi derfor valgt at se nærmere på, hvordan naturvidenskaben kan udføre en sådan rolle, når en ny influenzavirus står for døren, og truer det globale samfund. Der tages udgangspunkt i influenza A med SOIV som aktuelt eksempel. Behovet for beredskab overfor SOIV viste sig at være overvurderet, idet der i Danmark kun blev brugt 380.000 ud af de 3.100.000 indkøbte vacciner [www.ssi.dk]. At dømme ud fra håndteringen af SOIV, tyder det altså på, at der endnu er behov for mere information om viras patogenitet og infektiøse egenskaber. Samtidig er der også indikationer på, at vaccine og efterbehandling ikke yder fuldstændig beskyttelse mod influenzavirus eller følgesygdomme deraf, men at der er behov for mere forskning og viden på området med henblik på at optimere beredskabet. Rapporten er bygget op omkring et review, som har til formål, at gøre status over hvilken viden, der på nuværende tidspunkt er tilgængelig omkring influenza A og herved give forslag til, hvilke tiltag man evt. kunne tage for at øge denne viden. Indledningsvis gives i reviewet en kort gengivelse af tidligere historiske pandemier. Dertil en præsentation af influenzavirus opbygning og livscyklus. Efterfølgende kapitel vil omhandle influenza immunitet, og vil, ved at give den nødvendige baggrundsviden herom, understøtte de næste to centrale kapitler, omhandlende hhv. infektion og patogenitet. Førstnævnte kapitel vil koncentrere sig om viras overførsel mellem organismer, og hvilke faktorer, der har indvirkning på en mere eller mindre effektiv infektion. Begrebet patogenitet dækker over virulens, eller med andre ord, det at være sygdomsfremkaldende. I kapitlet herom beskrives en række afgørende elementer for graden af patogenitet, herunder bl.a. faktorer som værtsspecificitet og receptoraffinitet. Disse kapitler vil munde ud i en indgående diskussion af influenza A og bidrage til en samlet vurdering af den eksisterende viden og de endnu foreliggende gråzoner på området. Reviewet henvender sig primært til læger eller lægestuderende med en vis baggrundsviden indenfor virussygdomme samt vaccine imod og behandling af disse. Side 6 af 50

Metode I den systematiske søgning samt indsamling af litteratur er anvendt videnskabelige databaser og opslagsværker, herunder PubMed, Scopus, ScienceDirect, Google Scholar og Science Citation Index. Søgningerne har været baseret på centrale nøgleord, såsom influenza A, H1N1 virus og lignende. Sekundære kilder er så vidt muligt forsøgt sorteret fra, således at reviewet grundlæggende bygger på primære kilder. Dog er sekundære kilder anvendt i forbindelse med mere eller mindre basal viden, og er anført i klammer med forkortelsen rev., som angiver, at her er tale om et review, og dermed en sekundær kilde. Hvis der i en artikel er blevet refereret til mere end én kilde på en given påstand, er det originalkilden, som her er foretrukket angivet. I det omfang det har været muligt er det blevet tilstræbt, at finde og sammenligne teorier, der har udgangspunkt i forskellige positioner. Side 7 af 50

Review Abstrakt: Årligt rammes verdens befolkning af sæsoninfluenza og med jævne mellemrum udbryder der epidemier eller pandemier, som verdenssamfundet er dårligt rustet til at modstå. I dette review belyses patogeniteten af og infektionen med influenza A, hvor Swine Origin Influenza Virus (SOIV) bruges som eksempel. Overfladeproteinerne hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) spiller en vigtig rolle i virus patogenitet, idet disse hhv. sørger for binding til værtscellen og frigivelse af nye viruspartikler. Receptoraffiniteten er ligeledes essentiel i forbindelse med infektion. Ud fra analyser af kløvningssitet for HA betragtes SOIV som værende en lav-patogen virus, men spreder sig hurtig mellem individer. Sammenligning af sæsoninfluenza (H1N1) med SOIV viste stor bevarelse af epitoper som genkendes af immunforsvarets T-celler. Dette kan være en anden forklaring på hvorfor SOIV ikke har været så farlig, som først frygtet. Gennem litteraturstudie gives der i reviewet en opsamlende vurdering af den viden der foreligger om influenza A. Side 8 af 50

1 Historiske influenzapandemier Influenza pandemier finder sted, når en influenzavirus med en hæmagglutinin (HA), som er fremmed for den humane population, introduceres og spredes effektivt blandt individer, der ikke besidder nogen præeksisterende immunitet overfor virussen (se afsnit 3.3) [Rev. Neumann et al., 2009]. Genomerne af de tre sidste pandemiske influenzavira (H1N1-1918, H2N2-1957 og H3N2-1968) udsprang dels eller helt fra nonhumane reservoirer, og HA generne af disse pandemiske stammer udsprang i sidste ende fra aviære influenzavira [Garten et al., 2009]. Influenzapandemier kommer typisk i bølger. Den første og hidtil værste pandemi var den spanske influenza, som ramte i 1918-19, og dræbte op mod 50 millioner mennesker på verdensplan. Denne ramte i tre omgange; først en mild omgang efterfulgt af to bølger med højere dødelighedsrate. Den spanske influenza ramte primært unge, ellers raske voksne [Rev. Neumann et al., 2009]. I 1957 udbrød den asiatiske influenza. Den havde sin oprindelse i Kina og spredtes derfra til størstedelen af Asien samt Amerika og England [Rev. Neumann et al., 2009]. Denne ramte i to omgange, og kostede op mod 70.000 menneskeliv. Pandemien skyldtes en human-aviær genomkombination af undertypen H2N2 [Rev. Neumann et al., 2009]. H2N2 cirkulerede i den humane population i de følgende 10 år, og blev dernæst efterfulgt af Hong Kong influenzaen i 1968 med undertype H3N2, som havde den samme NA som H2N2. Ligesom den asiatiske influenza kom denne pandemi i to bølger, og kostede omtrent 33.800 menneskeliv i USA [Rev. Neumann et al., 2009]. SOIV har allerede haft to bølger globalt set; en i det sene forår 2009 og en i det tidlige efterår 2009 [www.new-medical.net]. Spørgsmålet er, om en tredje bølge kan forventes i den nære fremtid? Side 9 af 50

2 Introducerende om virus Før der kan gives en vurdering af influenzaviras patogenitet og infektion, er det nødvendigt med en viden om viras opbygning af gensegmenter og deres overordnede funktion. Samtidig skal der opnås en generel forståelse for den virale livscyklus, da virus har brug for en værtsorganisme for at overleve. Kapitlet vil derudover også omhandle de mutationer i virus, som har betydning i forbindelse med patogeniteten af og infektionen med virus. Slutteligt vil SOIVs baggrund og oprindelse kort præsenteres med det formål at belyse et aktuelt eksempel i forbindelse med influenzapandemier. 2.1 Det virale genom Influenzavirus opdeles i tre grupper betegnet A, B og C. Disse hører til familien Orthomyxoviridae, som er karakteriseret ved at have et genom bestående af segmenteret og enkeltstreget negativ-sense RNA [Rev. Al-Hajjar & McIntosh, 2010]. I modsætning til positiv-sense RNA, som direkte kan kode for dannelse af proteiner, må den negative RNA-streng først konverteres til den komplementære, positive RNA-streng af et enzym, RNA polymerase, som viruspartiklen selv medbringer. Influenza A og B virusgenomer består af otte særskilte segmenter (7 i influenza C), som er nummeret efter den største til den mindste (se tabel 1). Tabel 1. Genom af influenza A virus [egen tabel]. Segment: Polypeptid: Funktion: 1 PB2 (Polymerase Basic 2) 2 PB1 (Polymerase Basic 1) 3 PA (Polymerase Acidic) P-proteiner/transkriptaser; Transkription samt replikation af viral RNA. 4 HA (Hemagglutinin) Overflade glykoprotein; Binding af virus til værtscellen. 5 NP (Nucleocapsid Protein) Nukleoprotein; RNA-binding, en del af transkriptasekomplekset, cytoplasmisk transport af viral RNA. 6 NA (Neuraminidase) Overflade glykoprotein; Frigørelse af virus fra inficerede celler. 7 M1 (Matrix Protein) Multifunktionel protein. M2 (Matrix Protein) Integreret membran protein, ionkanal; Faciliterer viral RNA frigivelse. 8 NS1 (Nonstructural Protein) Regulerer splejsning samt transport af mrna. NEP (Nuclear Export Protein) Medierer den nukleare eksport af viral RNA. Side 10 af 50

Hvert segment koder for en eller flere proteiner. Tre af segmenterne koder for proteiner som til sammen danner det virale polymerasekompleks: PB2, som styrer genkendelsen af værtscellens RNA; PB1, som katalyserer nukleotidtilførsel og PA, som formodes at have en transkriptase og/eller protease aktivitet [Rev. Nelson & Holmes, 2007]. Dette polymerasekompleks er ansvarlig for transskriptionen og replikationen af det virale genom (se afsnit 4.5). To segmenter koder for overflade glykoproteiner, der fungerer som virale antigener: hæmagglutinin (HA), som er ansvarlig for binding til sialinsyrereceptorer på værtscellens overflade og som er delt i to underenheder, HA 1 og HA 2 samt neuraminidase (NA), som er involveret i knopskydning af nye viruspartikler fra inficerede celler [Rev. Nelson & Holmes, 2007]. Et enkelt segment koder for NP, som binder sig til det virale RNA. Det syvende segment koder for to proteiner, som deler en kort overlappende region: M1 koder for hovedkomponenten af det virale kapsid, og M2 er et integreret membranprotein, der fungerer som en ionkanal (se afsnit 5.5) [Rev. Nelson & Holmes, 2007]. Segment otte er det mindste segment af det virale genom, og koder for to ikke-strukturelle proteiner: NS1, som påvirker cellulær RNA transport, splejsning samt translation (se afsnit 5.4); og NEP, en mindre komponent af viruspartiklen, som medierer eksporten af virale ribonukleoproteiner *O Neill et al., 1998+. Figur 1. Opbygning af influenza A virus. Til venstre ses den strukturelle opbygning af influenza A virus med de otte segmenter, som udgør genomet [Nelson & Holmes, 2007]. PB2 styrer genkendelsen af værtscellens RNA, PB1 katalyserer nukleotidtilførelsen, PA formodes at have en transkriptase og/eller protease aktivitet, HA er ansvarlig for binding til værtscellens sialinsyrereceptorer, NA sørger for frigivelse af nye viruspartikler fra inficerede celler, NP binder sig til det virale RNA, M1 koder for hovedkomponenten af det virale kapsid, M2 fungerer som ion-kanal, NS1 påvirker cellulær RNA transport, splejsning samt translationen og NEP medierer eksporten af virale ribonukleoproteiner. Til højre ses et elektronmikroskopisk (SEM) billede af influenza A virus [Ebrahim, 2010]. Side 11 af 50

En moden influenza A viruspartikel er sammensat af et nukleokapsid, og dertil et omsluttende lag af M1 samt en membrankappe, som indeholder HA, NA og M2 proteinerne [Rev. Nelson & Holmes, 2007]. Strukturen af en influenza A virus er nærmere illustreret på figur 1, som til venstre viser en skematisk afbildning og til højre et elektronmikroskopbillede. 2.2 Den virale livscyklus Overfladen af en viruspartikel er belagt med førnævnte glykoproteiner: HA og det slimfordøjende enzym NA. Disse inddeles i hhv. 16 og 9 undertyper, hvoraf kun 3 ud af 16 HA underklasser (H1-3), og 2 ud af 9 NA underklasser (N1-2) cirkulerer i mennesker [Stevens et al., 2006]. Proteinerne er fæstnet i membrankappen, der består af et dobbelt-lipidlag, som er taget fra den inficerede celle [Rev. Hilleman, 2002]. Viruspartiklen optages i cellen ved endocytose, se figur 2. I endosomet er ph lav, hvorved HAs konformation ændres. Virusmembranen smelter herved sammen med den endosomale membran, og det genetiske materiale frigives. Figur 2. Skematisk diagram af influenzavirussens livscyklus. Virus bindes til værtscellens membran vha. HA og optages i cellen ved endocytose. Virusmembranen og endosommembranen smeltes sammen og det genetiske materiale frigives. RNA trænger ind i cellekernen og benytter værtscellens mrna cap til at gøre sit eget mrna funktionelt i værtens cytoplasma. I cytoplasmaet vil det syntetiserede RNA fungere som skabelon for dannelse af nye virusproteiner. Herefter vil viruspartiklens RNA og proteiner samles ved værtscellens membran og den nye viruspartikel frigives ved knopskydning [Neumann et al., 2009]. Side 12 af 50

RNA trænger ind i værtscellens kerne, og benytter værtscellens mrna cap til at gøre sit eget mrna funktionelt i værtscellens cytoplasma, hvor proteinerne syntetiseres [Rev. Hilleman, 2002]. Capstrukturen beskytter mrna mod at blive nedbrudt af enzymer og spiller en vigtig rolle for translationen, da et mrna-molekyle uden cap ikke kan bindes til ribosomerne. Transskription og replikation sker ved hjælp af nukleoproteinet NP og de tre tidligere omtalte polymerase underenheder: PB1, PB2 og PA [Rev. Neumann et al., 2009]. Grundet det virale RNAs plasticitet i form af punktmutationer og reassortering (se afsnit 2.3), har virus en formidabel evne til at variere genomkombination og derved tilpasse sig nærmest alle tænkelige forhold [Rev. Neumann et al., 2009]. Nyt syntetiseret RNA sendes til cytoplasmaet, hvor det fungerer som skabelon for dannelsen af nye virusproteiner. Den nye viruspartikels RNA og proteiner samles ved værtscellens membran, og overfladeproteinerne indlejres i cellemembranen inden frigørelse [Rev. Hilleman, 2002]. Frigivelsen fremmes af NA, som fjerner sialinsyren fra membranproteinerne, som ellers ville binde HA og fastholde virussen [Rev. Neumann et al., 2009]. 2.3 Reassortering og genetiske mutationer Epidemiske sygdomme er forårsaget af influenzavirus type A og B, mens type C influenzavira er relativt harmløse [Rev. Hilleman, 2002]. Type A influenza er blevet opdelt i adskillelige undertyper, og den naturlige vært for de fleste af disse er diverse fuglearter [Hinshaw et al., 1980]. Influenzavirussen har ingen evne til at proofreade det genetiske materiale under replikation, hvilket resulterer i hyppige genetiske fejl i filial-generationen, og dermed hyppige mutationer [Rev. Al-Hajjar & McIntosh, 2010]. Når sådanne mindre ændringer indtræffer i HA og NA proteinerne, resulterer det i antigenisk drift, hvilket vil sige en gradvis ændring i aminosyresekvenserne grundet mutationer med ændring af antigenspecificitet som resultat [Rev. Al-Hajjar & McIntosh, 2010]. Bestemte forandringer i HA undertype, med eller uden lignende forandringer i NA, kan finde sted, når nye HA eller NA gensegmenter erhverves ved en proces kaldet reassortering [Rev. Al-Hajjar & McIntosh, 2010]. Større genetiske forandringer af denne karakter betegnes antigenisk shift. Dette kan indtræffe ved sammenblanding af genetiske segmenter under dobbelt-infektion med menneske- og dyrevira. Når to influenzavira inficerer den samme celle på samme tid, kan de udveksle gener under replikationen, og den nydannede influenzavira vil derfor indeholde en kombination af genetisk materiale fra begge influenzavira [Rev. Hilleman, 2002]. Antigenisk drift ses ved influenza A og B, mens antigenisk shift således kun ses ved influenza A, idet denne virus kan inficere både dyr og mennesker [Rev. Al-Hajjar & McIntosh, 2010]. Side 13 af 50

Influenza A H1N1 vira af svineherkomst med gener fra aviær-, human- og svineinfluenzavira begyndte først at cirkulere i svinepopulationen i Nordamerika i slutningen af 1990erne. Den nylige influenza A variant SOIV, udspringer af H1N1 formen af svineinfluenza og er en efterkommer af influenzavirusstammen, som forårsagede 1918 pandemien [Rev. Ebrahim, 2010]. SOIV består af klassiske svine RNA segmenter af Nordamerikansk oprindelse, et segment fra den sæsonbestemte H3N2 virus, et segment af aviær oprindelse og segmenter fra den eurasiske svineslægt (se figur 3). SOIV har en høj overførselsrate mellem mennesker med en sekundær angrebsrate (antallet af familiemedlemmer der er blevet syge, efter det første familiemedlem blev syg) på 25-30%, sammenlignet med på 5-20% i sæsoninfluenza [Rev. Ebrahim, 2010]. Figur 3. Oprindelse af SOIV I de sene 1990ere resulterede reassortering mellem human H3N2, nordamerikanske aviære- og klassiske svinevira i en tredobbelt reassortant, H3N2 og H1N2 svinevira, som siden har cirkuleret i den nordamerikanske svinepopulation. En tredobbelt reassortant svinevirus, som er reassorteret med en eurasisk aviær-lignende svinevirus har resulteret i SOIV, som nu er i omløb hos mennesker [Neumann et al., 2009]. Side 14 af 50

Virusepidemier er altså stadig en trussel og nye kan opstå ved mutationer og reassortering, som det senest er set ved SOIV. Overfladeproteinerne spiller en afgørende rolle for binding og indtrængen til værtscellen samt frigivelse af virusafkom, og det er særligt i disse proteiner ændringerne sker. Influenza A er den type, der kan ændre sig mest, både ved shift og drift, hvilket giver ændringer i aminosyresekvenserne. Disse ændringer må have en betydning i forhold til en præeksisterende immunitet, siden virus fortsat kan angribe mennesker. Derfor redegøres der i det følgende for virus interaktion med immunsystemet. Side 15 af 50

3 Immunitet En vis baggrundsviden om det humane immunforsvar samt de faktorer, der er afgørende for bekæmpelsen af influenzainfektioner, er nødvendig før betydningen af mutationer og reassortering i influenzavirus kan vurderes. Derfor gives her en beskrivelse af, hvordan hhv. den medfødte og den adaptive immunrespons reagerer på en infektion, samt hvordan den sidstnævnte kan ændres gennem livet. Immunitet forstås som værtens niveau af resistens overfor infektionssygdomme. 3.1 Immunrespons på influenzainfektioner I forbindelse med det humane immunsystem skelnes mellem medfødt og adaptiv immunitet. Det er værtens medfødte immunsystem, der først reagerer ved et virusangreb, og selvom immunresponserne er rettet mod mange influenza antigener, er immunsystemets neutraliserende antistoffer i høj grad rettet mod HA [Rev. Sambhara & Poland, 2010]. HA undergår hurtigt og kontinuert mutationer, hvilket gør det sværere for immunsystemet at genkende den. Dette er blandt andet blevet vist af Greenbaum et al. (2009). Antistoffer mod influenza genkender epitoper i HAs hypervariable regioner, som omgiver receptorbindingssitet og medvirker til binding til værtscellen [Fleury et al., 2000]. En epitope er den del af antigenet, som genkendes af immunsystemet. Antistoffer mod NA er ikke særligt effektive i at forhindre infektion, men begrænser derimod den virale infektion og dermed omfanget af sygdommen, idet frigivelsen af nye vira fra inficerede celler begrænses [Kasel et al., 1973]. Eftersom disse antistoffer mod HA eller NA ikke er krydsreaktive 1 blandt undertyperne, kan introduktionen af nye glykoprotein undertyper af aviære vira til den humane population have potentiale til at generere de næste pandemiske stammer [Takada et al., 2003]. Ved begyndelsen af en influenza pandemi er den præeksisterende immunitet overfor virussens HA protein relativ lav (se afsnit 3.3). Dette er med til at sikre en stor pulje af modtagelige værter for en hurtig overførsel samt infektion af en stor del af befolkningen [Xu et al., 2010]. 3.2 Medfødt immunitet Når virus inficerer respiratoriske epitelceller, frigiver de inflammatoriske kemokiner 2, som rekrutterer Natural Killer (NK) celler til stedet for infektion [Grégoire et al., 2007]. Gennem undersøgelser med immunohistokemisk analyse ved blandt andre Welliver et al. (2007) er det blevet påvist at, patienter med alvorlige influenzainfektioner har færre NK-celler i perifert blod og en næsten fuldstændig 1 Krydsreaktion henviser til en reaktion, hvor et materiale bindes til antistoffer, der er specifikke for et andet stof. 2 Familie af små cytokiner, som er signalproteiner. Side 16 af 50

mangel på lunge NK-celler. Data tyder altså på, at influenzavira direkte angriber NK-celler, som en del af deres immunundvigelsesstrategier, og på denne måde fremmer den virale overførsel og muligvis bidrager til virus patogenitet [Mao et al., 2010]. Immunsystemets genkendelse af patogener sætter gang i produktionen og frigivelsen af forskellige peptider og proteiner, som angriber mikrober eller hæmmer deres reproduktion. Interferoner er proteiner, der yder medfødt forsvar mod virale infektioner. Interferon-α (IFN-α) er et velkendt cytokin, som produceres i respons til virale infektioner, [De Maeyer & De Maeyer-Guignard, 1998] og spiller en vigtig rolle i værtsresistens mod virus [Orange & Biron, 1996]. Kaiser et al. (2001) har undersøgt omfanget af viral replikation, feber og symptomer, som korrelerer med niveauet af forskellige cytokiner i naturligt opståede influenza-infektioner. Ved disse undersøgelser blev det påvist, at IFN-α niveauet var højt både i udskylninger fra næsen og i blodplasma, og at dette forblev påviseligt i de fleste tilfælde til og med dag 8, hvilket er foreneligt med deres formodede rolle i regulering af immunrespons. Der blev også observeret høje niveauer af IFN-γ i udskylninger fra næsen, mindre end 24 timer efter introduktion af antiviral behandling, som korrelerede med faldet af den virale koncentration. Ud fra disse data formodes det altså, at IFN-γ spiller en rolle ved begrænsningen af videre viral replikation og indikerer, at IFN-γ er en potentiel inhibitor af influenza replikation [Kaiser et al., 2001]. IFN-γ er en god indikator på immunrespons, og bruges flittigt i eksperimentelle sammenhænge (se afsnit 4.3). Svitek et al.s (2008) undersøgelser har haft til formål at identificere immune sammenhænge med hensyn til sygdommens styrke og omfang. Dette blev gjort ved at inficere fritter med human H1N1 og H3N2 isolater, som var forskellige i patogenitet. Ved analyse af cytokin mrna niveauet i celler fra næsen blev det observeret, at alvorlige infektioner resulterede i en forsinket og overordnet reduceret IFN respons. Disse resultater tyder på, at effektiviteten af den medfødte immunrespons har betydning for sygdommens styrke og omfang [Svitek et al., 2008]. De influenzastammer, der i undersøgelsen medførte milde sygdomme, fremkaldte en hurtig og stærk opregulering af interferoner, mens de mere patogene stammer inducerede signifikant lavere niveauer [Svitek et al., 2008]. En hurtig igangsættelse af værtens medfødte immunsystem sker ved hjælp af de patogene sensorer, som genkender patogeners strukturelle særpræg (PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns), og aktiverer derved antimikrobielle responser for at eliminere dem [Rev. Sambhara & Poland, 2010]. Toll-like receptorer (TLR) er en sådan klasse af patogene sensorer, som spiller en vigtig rolle i det medfødte immunsystem. Når influenzavira trænger igennem fysiske barrierer, såsom hud eller slimhinder, bliver de genkendt af TLR, herunder TLR3 og TLR7, i endosomerne samt af Retinoic acid 3- Inducible Gene I (RIG-I) og RNA-dependent Protein Kinase (PKR) i cytosolen, som aktiverer 3 Retinsyre, oxiderede form af vitamin A. Side 17 af 50

immuncellerespons. Mens TLR3 og PKR genkender dobbelt-strenget RNA strukturer, aktiveres RIG-I og TLR7 af enkelt-strenget RNA [Rev. Sambhara & Lehrer, 2007]. Stimulering af TLR fører via komplekse intracellulære signaleringsveje til aktivering med udskillelse af proinflammatoriske cytokiner, kemokiner og interferoner samt til antigenpræsentation. Således aktiverer patogeners TLRstimulation formentlig den samlede immunologiske respons (se figur 4) [Blach-Olszewska, 2005]. Influenzavirussens NS1 er kendt for at hæmme funktionen af RIG-I og PKR, men basis for denne hæmning er endnu ikke klarlagt [Rev. Sambhara & Poland, 2010]. RIG-Is genkendelse af influenzavira leder til produktion af IFN-β, som til gengæld hæmmer virus replikationen. Influenza A virus bekæmper således denne medfødte forsvarsmekanisme ved hjælp af NS1, som udviser en hæmmende anti-interferon egenskab. Behandlingsmæssige tilgange, som har til mål at kontrollere de inhibitoriske effekter af NS1 proteinet, og derved genoprettelsen af den afbrudte RIG-I signalering i inficerede celler, kan derfor udgøre en ny strategi i kampen mod influenzavirusinfektioner [Opitz et al., 2007]. Figur 4. TLRs aktivering af den samlede immunologiske respons. Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMP) stimulerer toll-like receptorer (TLR), hvorved aktivering af det samlede immunologiske respons indledes. Aktiveringen medfører en forøgelse af cellens antimikrobielle aktiviteter. Samtidig frigiver den stimulerede celle proinflammatoriske cytokiner, kemokiner og interferoner. De proinflammatoriske cytokiner og kemokinerne virker rekrutterende og aktiverende på medfødte immunceller. Interferonerne har i samspil med de proinflammatoriske cytokiner både antivirale effekter og indflydelse på udviklingen af det adaptive immunrespons. TLRstimulation på antigen-præsenterende celler leder til deres modning og antigenpræsentation, hvorefter de aktiverer det adaptive immunrespons [Pedersen et al., 2007]. Side 18 af 50

3.3 Adaptiv immunitet Hvis det medfødte system ikke effektivt forhindrer virusangreb, dannes respons fra det adaptive immunsystem [Rev. Sambhara & Poland, 2010]. Ved T-celle responsen omdannes CD4 og CD8 T-celler, som ikke besidder evnen til at genkende antigener, til effektor CD4 + og CD8 + T-celler, som genkender nogle influenzavirusproteiner. Disse influenzaspecifikke T-celler spiller en afgørende rolle i reguleringen af viral influenza-infektion, da de er i stand til at producere cytokiner, dræbe de inficerede celler [McMichael et al., 1986], samt tilegne sig hukommelse overfor antigenet [Kaech et al., 2002]. Med alderen forøges antallet af forskellige antistoffer, hvilket kan forklare, hvorfor der ses færre tilfælde af influenza i den ældre del af befolkningen. Mennesker udsættes livet igennem for gentagne infektioner med antigeniske varianter af influenzavirus, hvilket giver en antistofsammensætning overfor et større antal antigener, og derfor grundlag for en større immunitet overfor flere forskellige vira [Davenport et al., 1953]. Hvis en person tidligere har været inficeret af en primær viral stamme og senere inficeres af en variant af denne stamme, kan der forekomme det, der kaldes antigenisk synd. Den antigeniske synd refererer i dette tilfælde til, at der dannes en øget mængde antistoffer mod den stamme, man tidligere har været eksponeret for, og kun i mindre grad for den aktuelle stamme [Fazekas de St. Groth & Webster, 1966]. Denne svage reaktion mod den nye stamme kan gøre det svært at eliminere virus i populationen [Combadière et al., 2010]. Immuniteten overfor influenzavirus kan forstærkes ved kontinuerlig eksponering for cirkulerende antigener, og derved lede til en forøget immunhukommelse afhængig af ligheden i overfladestruktur ml. de tidligere influenzavira og den nye stamme [Combadière et al., 2010]. SOIV har antigene epitoper tilfælles med human og svine H1 vira fra tidligere i det 20. århundrede, hvilket forklarer, hvorfor folk, født i starten af det 20. århundrede besidder en præeksisterende immunitet overfor nogle influenza [Xu et al., 2010]. Det humane immunsystem består således af den medfødte respons, som giver en generel reaktion uafhængig af tidligere eksponering for det specifikke antigen, og den adaptive, som aktiveres hvis de medfødte egenskaber ikke er effektive nok til at eliminere virussen. Før immunsystemet kan aktiveres, skal virussen kunne detekteres, hvilket besværliggøres af de kontinuerlige ændringer i overfladeproteinerne. Den primære respons mod overfladeproteinerne er, at angribe HA, så virus ikke kan binde sig til værtscellen, samt NA, så infektion med vira i værtsorganismen kan begrænses. Der dannes T-huske celler, som kan give en hurtigere respons ved senere og lignende infektioner. Det betyder, at jo flere infektioner et individ har været udsat for livet igennem, jo bredere hukommelse er der mod forskellige virussammensætninger. Immunresponsen forstærkes altså med alderen, hvilket forklarer, at den ældre del af befolkningen ved influenza ikke er ligeså hårdt ramt som den yngre. Side 19 af 50

4 Overførsel og infektion Udbrud af influenza epidemier og pandemier skyldes, at virus har en evne til at sprede sig effektivt mellem en stor del af verdens befolkning, hvilket til dels skyldes de mange mutationer, virus undergår (se afsnit 2.3). En afgørende faktor for dette er bevarelse af epitoper, der kan fremme en hurtig immunrespons, da immunsystemet kan genkende disse, og aktivere det nødvendige forsvar. Der er dog også andre faktorer, som virus ikke selv kan ændre, der har betydning for infektion. Disse indbefatter klima og de sæsonbetingede ændringer, samt menneskelige tiltag mod virusinfektion i form af vacciner. 4.1 Temperatur og luftfugtighed Det faktum at influenzavirus i høj grad er sæsonbetinget giver anledning til en række overvejelser. Det er almen opfattelse, at dette delvist skyldes, at vinterhalvåret tilbringes indendørs i længere tid af gangen og mennesker derfor tilbringer mere tid i nærheden af hinanden end i sommerhalvåret. Da årstiderne medfører skift i temperatur og luftfugtighed, er det også sandsynligt, at overførsel af vira herved får gunstige betingelser. Lowen et al. (2007) har udført eksperimenter med marsvin for at undersøge dette. I bokse hvor vindretningen var kontrolleret, og temperaturen og den relative luftfugtighed kunne varieres, placerede holdet 4 inficerede marsvin overfor 4 uinficerede marsvin og registrerede hermed transmissionen af influenza under forskellige temperatur- og luftfugtighedsforhold [Lowen et al., 2007]. Holdet konkluderede, at overførsel af vira var mere effektiv ved 5 C end ved 20 C, og at ingen transmission blev registreret ved 30 C. Derudover blev der observeret højere grad af overførsel ved lave luftfugtigheder (20%-35%), mens der ved 80% slet ingen overførsel skete [Lowen et al., 2007]. Resultaterne giver en god forklaring på, hvorfor influenzavira trives bedst i vinterhalvåret, hvor temperaturen udenfor falder, og den relative luftfugtighed indenfor sænkes som følge af indendørs opvarmning [Lowen et al., 2007]. Endvidere gives yderligere et bud på en influerende faktor med hensyn til overførsel af vira som følge af faldende luftfugtighed, nemlig værtsorganismens respiration, idet tør luft medfører udtørring af næseslimhinden med eventuelle skader til følge, som kan gøre værten mere modtagelig for aerosole 4 influenzavira [Lowen et al., 2007]. 4 Luftbårne submikrone partikler, dvs. partikler mindre end 1 μm. Side 20 af 50

4.2 D-vitamin Udover de årstidsbestemte ændringer i luftfugtighed og temperatur, menes mængden af soleksponering også at kunne have betydning. Soleksponering er den største kilde til dannelsen af D- vitamin. Derfor kan mennesker typisk få mangel på D-vitamin, når de ikke eksponeres for tilstrækkeligt sollys, hvilket især kan være gældende i vinterhalvåret. Dette kan have betydning for, hvor effektivt virus kan spredes. D-vitamin antages nemlig, at have en afgørende betydning for det medfødte immunforsvar [Rev. Cannell et al., 2008], idet et fald i D-vitamin niveauet lader til at svække de antimikrobielle peptider (AMP) i immunsystemet, som udviser hurtig og bred antimikrobiel aktivitet mod virus [Hypponen & Power, 2007]. Cannell et al. mener derfor, at et lavt D-vitamin niveau i befolkningen, som følge af lav soleksponering, kan være forklaringen på, at influenzaepidemier er årstidsbestemt. Der refereres til en undersøgelse, hvor 104 post-menopausale kvinder blev givet 50µg D-vitamin hver dag i et år, hvilket udryddede alle symptomer på forkølelse og influenza [Aloia & Li-Ng, 2007]. Det bemærkes at den anbefalede daglige dosis D-vitamin er 5µg. Eftersom vinterhalvåret er præget af lav fugtighed, lave temperaturer og lav soleksponering, menes disse således at udgøre tre helt afgørende faktorer for effektiv infektion med influenzavirus. 4.3 Epitopbevarelse og præeksisterende immunitet Udover klimaets betydning for overførelse blandt mennesker, har virussens infektion inde i værtsorganismen også en betydning. Infektion kan forhindres af et effektivt immunforsvar og en afgørende faktor for dette er, hvorvidt immunsystemet har en præeksisterende immunitet mod typer og subtyper af influenzavira. Ved forudsigelsen af epidemiers forløb kunne en indsigt i mængden af bevarede epitoper mellem den nye virus og tidligere eksponerede sæsoninfluenzaer tænkes at være en indikator på, hvor patogen virussen ville vise sig at være for befolkningen. Greenbaum et al. (2009) har undersøgt hvorvidt immunforsvarets T- og B-celler kan besidde hukommelse overfor en specifik virus, og dermed i højere grad være modstandsdygtige overfor denne. Holdet sammenlignede den almindelige H1N1 sæsoninfluenzas epitoper med SOIVs for at bestemme, hvor stor lighed, der var mellem epitoperne. Holdet påviste en bevarelse på 31% af epitoperne genkendt af B-celler, 17% af overfladeproteinerne HA og NA, mens hele 69% af CD8 + epitoperne, som genkendes af T-celler var fuldstændig konserverede. Ud fra dette dannedes en hypotese om, at siden T-cellerne er kendt for at mildne graden af sygdom, kunne den store lighed i T- celle virusepitoperne mellem H1N1 og SOIV være en medvirkende årsag til, at SOIV ikke har været nær så dødelig som først frygtet [Greenbaum et al., 2009]. Greenbaum et al. eksponerede perifert blods mononukleare celler (PBMC) for puljer af de epitoper, der var fundet bedst bevarede de to vira Side 21 af 50

imellem; epitoper genkendt af CD4 + og CD8 + T-celler fra H1N1 sæsoninfluenza, som enten ikke var bevaret eller fuldstændig bevaret i SOIV. Der blev målt på interferon-gamma (IFN-γ) produktionen ved ex vivo ELISPOT assays [Greenbaum et al., 2009]. Som det ses figur 5, viste resultaterne stor lighed i produktionen af IFN-γ. Figur 5. ELISPOT assays. Fire grupper af peptid epitoper blev syntetiseret, heraf en gruppe bestående af CD4 + celle epitoper, fuldstændig konserveret i SOIV sekvenser; en gruppe bestående af CD8 + celle epitoper konserveret i SOIV; og to yderligere grupper med peptider bestående af hhv. CD4 + og CD8 + T-celler, som ikke var konserverede i SOIV sekvenser. Disse fire separate peptidpuljer blev testet med perifert blods mononukleare celler (PBMC) fra 20 individer for hæmning af IFN-γ produktionen vha. ex vivo ELISPOT assays. Som det ses af figuren, er responsen til de konserverede SOIV epitopepuljer nogenlunde ens med responsen til de modsvarende non-konserverede puljer, og den observerede forskel er således ikke statistisk signifikant. Disse data viser, at både CD4 + og CD8 + T-celle huske responser mod SOIV epitoper kan påvises ex vivo, og at responser mod epitoper konserveret i SOIV er sammenlignelige med epitoper i nylig cirkulerende influenzastammer [Greenbaum et al., 2009]. Derudfra blev tolket, at immunforsvarets CD4 + og CD8 + T-celler besidder hukommelse overfor virus epitoper [Greenbaum et al., 2009]. Greenbaum et al. (2009) påpeger derudover, at overfladeproteinernes epitoper er vigtige for virus overlevelse, derfor sker der en markant større forandring i disse, idet forandringer fungerer som forsvar mod immunsystemet [Greenbaum et al., 2009]. Greenbaum et al.s (2009) konklusion vedrørende hukommelse i T-celler understøttes af Ge et al. (2010), som har udført lignende eksperimenter. Holdet ville undersøge om dannelsen af H1N1 sæsoninfluenza-specifikke T-celler i PBMC kunne stimuleres af SOIV-peptider. I T-cellerne var inkorporeret radioaktivt thymidin (specifik for DNA), hvorved en forøgelse i antallet af disse kunne detekteres ved måling af radioaktiviteten. Niveauet af radioaktivitet ville dermed vise antallet af funktionelle T-celler, og derved kunne T-celle proliferationen ved eksponering for henholdsvis H1N1 sæsoninfluenza og SOIV sammenlignes. Resultaterne af eksperimentet fremgår af figur 6. Side 22 af 50

Figur 6. T-celle respons. H1N1 sæsoninfluenza-specifikke T-cellers respons på SOIV-peptider (grå) og H1N1 sæsoninfluenzas peptider (sort), målt i Counts Per Minute (CPM). I T-cellerne var inkorporeret radioaktivt, og dermed målbar, thymidin. Alle SOIV peptider, undtagen to (HA204 og HA256) bibeholdt evnen til T-celle proliferation. Samlet indikerer disse data, at 15 ud af 17 SOIV peptider er i stand til at krydsreagere med sæson influenza virus-specifikke T celler [Ge at el., 2010]. Figur 6 viser, at responsen på H1N1 epitoper hos de H1N1-specifikke T-celler nærmest er den samme som T-cellernes respons på SOIV epitoperne. Herudfra konkluderes, at individer, der tidligere har været eksponeret for H1N1 virale antigener, vil danne et betydeligt niveau af T-celler, som er krydsreaktive mod SOIV, og altså besidder en præeksisterende immunitet [Ge et al., 2010]. Det fremgår af disse to studier, at en undersøgelse af epitope sammensætningen i en ny virusstamme vil danne grundlag for en vurdering af, hvor effektivt befolkningens immunsystem reagerer, og på denne måde begrænse virus patogenitet og infektion. 4.4 Forebyggelse Selvom immunsystemet besidder en hukommelse overfor tidligere viruseksponering, er det svært at forudsige, hvor god immunsystemets respons vil være ved eksponering for nye vira. Vacciner er et almindeligt led i forebyggelsen af influenzainfektioner, og har til formål at optimere det adaptive immunforsvar. Rizzo et al. (2006) har fundet, at en øget vaccinationsrate ikke har medført en reduktion i antallet af influenzarelaterede dødsfald hos italienske ældre ( 65) [Rizzo et al., 2006]. En vaccines effektivitet er afhængig af i hvor høj grad vaccinen er identisk med den kommende florerende virusstamme, men eftersom en virusvaccine tager ca. 6 måneder at fremstille, gøres dette altid på baggrund af forudsigelser om den kommende virus' sammensætning. Normalt vaccineres med inaktive/dræbte mikroorganismer eller virusekstrakter, men der eksperimenteres også med at anvende aktive vacciner. Belshe et al. (2007) har undersøgt effektiviteten af en Live Attenuated Side 23 af 50

Influenza Vaccine (LAIV) i forhold til den almindelige inaktive influenzavaccine. 7852 børn i alderen 6-59 måneder uden astma eller andre åndedrætssygdomme, blev delt i to grupper (1:1) og henholdsvis behandlet med LAIV og almindelig vaccine i et randomiseret, dobbeltblindet eksperiment. I tilfælde af symptomer blev der udtaget slimprøver fra næsen indenfor 24 timer med henblik på at konstatere om virus var antigen-lignende eller forskellig fra vaccinen [Belshe et al., 2007]. Figur 7. Influenza tilfælde ved vaccination. Viser antallet af influenzatilfælde hos børn efter vaccination med hhv. inaktiv vaccine og Live Attenuated Vaccine (LAIV). Som det kan ses på figuren, så er LAIV mere effektiv end den inaktive vaccine da der er langt færre tilfælde af influenzasmittede [Belshe et al., 2007]. På baggrund af resultaterne, illustreret i figur 7, konkluderer Belshe et al. (2007), at LAIV er mere effektiv end den inaktive vaccine [Belshe et al., 2007]. Udover at kende effektiviteten af LAIV, er det også vigtigt at undersøge, hvor sikker den er at anvende. Nichol et al. (1999) har undersøgt LAIV for bivirkninger på 4561 sunde voksne i alderen 18-64 år, der inddeltes i 2 grupper (2:1) og tildeltes henholdsvis LAIV og placebo i et randomiseret, dobbeltblindet eksperiment. Der blev holdt øje med følgende symptomer/bivirkninger; feber, løbende næse, øm hals, hoste, hovedpine, muskelømhed, koldsved og træthed. Der blev observeret en anelse flere tilfælde af løbende næse og øm hals symptomer hos LAIV-gruppen, men ingen af grupperne oplevede kritiske symptomer, og det blev konkluderet, at LAIV var en sikker vaccinationsform [Nichol et al., 1999]. Disse to studier viser altså, at aktive vacciner kunne give en mere aktiv forebyggelse af influenza epidemier, uden at være mindre sikker end den traditionelle inaktive vaccine. Der er dog også andre tiltag i forsøget på at optimere vacciner. Side 24 af 50

De Groot et al. (2009) har udført analyser, hvor HA og NA sekvenser i Conventional Influenza Vaccine (CIV) 5, blev sammenlignet med sekvenserne i SOIV. De Groot et al. undersøgte hypotesen om, at krydsreaktive T-celle responser har bidraget til færre tilfælde af influenza og SOIV. De undersøgte derfor, om der var nogle bevarede T-celle epitoper mellem SOIV samt CIVs HA og NA, for at vurdere CIVs evne til at beskytte mod SOIV [De Groot et al., 2009]. Konklusionen var, at der er en større bevarelse af epitoperne i HA end der er af NA, hvilket tillægges NAs generelle foranderlige natur, og at der muligvis er tilstrækkelig bevarelse af T-celle epitoper mellem CIV 2008-2009 og SOIV til at vaccinen kan yde god beskyttelse [De Groot et al., 2009]. Den overordnede aminosyresekvens i CIV 2008-2009 var kun 72-73% identisk med aminosyresekvensen i SOIV [Gallaher, 2009]. Denne procentsats vurderes til at være lav i forhold til de seneste sæsoninfluenzaer med 97% og 98% lighed, og beskrives som medvirkende faktor til den manglende krydsreaktivitet mod SOIV i individer, som var immuniserede med CIV [De Groot et al., 2009]. Overordnet konkluderer forskerholdet, at der er et presserende behov for udvikling af bedre vacciner end CIV, der er mere effektive mod nye influenzastammer. Eftersom det tager lang tid at udvikle en vaccine mod en ny influenzastamme, er der brug for en vaccine, der kan udvikles mere effektivt end CIV, da der også er risiko for antigenisk variation af HA og NA i den tid, det tager at udvikle vaccinen. De Groot et al. foreslår en vaccine med krydsede undertyper og som deler en stor del af T-celle epitoperne med de florerende virusstammer [De Groot et al., 2009]. 4.5 Replikationshastighed En faktor som har indflydelse på virussens infektion i kroppen er replikationen og hastigheden af denne. Den virale polymerase består af proteinerne PB1, PB2 og PA (se afsnit 2.1) og samles med det virale RNA og NP, for at mediere replikation af det virale genom [Mehle & Doudna, 2009]. Mehle og Doudna (2009) har blandt andet undersøgt en enkelt aminosyresubstitution i proteinet PB2 samt dennes indflydelse på polymerase-aktiviteten in vitro. PB2 fra alle humane vira besidder lysin på plads 627 (K627), hvorimod aviære vira har glutamat på samme plads (E627) [Chen et al., 2006]. Der blev observeret markant højere polymerase-aktivitet hos PB2 K627 end hos PB2 E627 (se figur 8). 5 Årlig vaccine sammensat af en sæsoninfluenza A H1N1 og en influenza A H3N2 virus samt en influenza B type virus. Side 25 af 50

Figur 8. Polymeraseaktivitet. Viser forskellen i polymeraseaktivitet imellem henholdsvis PB2 K627 (lysin på plads 627 sorte søjler) og PB2 E627 (glutamat på plads 627 grå søjler). På figuren er der sammenlignet humaninfluenzavira, aviærinfluenzavira og SOIV fra 2009. Som det kan ses på figuren, så er polymerasens aktivitet langt højere, når der sidder et lysin på plads 627, end når der sidder et glutamat. Derudover kan man se, at polymerasens aktivitet generelt er højere for SOIV med begge aminosyresubstitutioner end ved alm. humane- og aviære influenzavira [Mehle og Doudna, 2009]. Eftersom lysin er positivt ladet og glutamat er negativt ladet, antages det derfor, at der er korrelation mellem en positivt ladet overflade på 627 domænet i virusproteinet PB2 og polymeraseaktiviteten i humane celler in vitro [Mehle & Doudna, 2009]. Figur 9 viser i øvrigt en anden observation som holdet gjorde. I sekvensanalyse af SOIV opdagede Mehle og Doudna (2009) to aminosyrevarianter, som indtil 2009 kun er set i 3 ud af 2.849 humane virus isolater, nemlig serin på plads 590 og arginin på plads 591 (R591). Figur 9. Strukturel model af Single Residue (SR-polymorfismen) i PB2 627 domænet. Strukturen af PB2 627 i hhv. det humane, aviære og 2009 A(H1N1)(SOIV) virusdomæne. E627 betyder, at der er glutamat på plads 627 i aminosyrefrekvensen, hvilket menes at forstyrre den store positivt ladede overflade på domænet, dette kan ses på SOIV og det aviære domæne. I det humane domæne er der lysin på plads 627 (K627) i aminosyresekvensen og dette forstyrrer ikke ladningen på domænet. På det humane og aviære domæne kan ses Q591, glutamin på plads 591 i aminosyrefrekvensen, og på SOIV domænet ses R591, som er arginin på plads 591 i aminosyrefrekvensen. Single Residue polymorfismen (SR-polymorfismen) R591 forekom kun i tilfælde, hvor E627 var til stede, hvilket antyder et samspil mellem disse to pladser [Mehle & Doudna, 2009]. Side 26 af 50

Denne parrede Single Residue polymorfisme (SR-polymorfisme) forekom kun i tilfælde, hvor E627 var til stede, hvilket antyder et samspil mellem disse to pladser. R591 illustrerer hvordan SOIV har tilpasset sig omstændighederne, idet mutationen genskabte den positive overflade, som er favorabel for polymeraseaktiviteten i humane celler. Fravær af R591 medførte nemlig en reduktion i polymeraseaktiviteten på 50% i alle de 3 kendte virus isolater [Mehle & Doudna, 2009]. Alt i alt ses heraf at adaptive mutationer sker på kompleks vis og at enkelte aminosyresubstitutioner kan have stor betydning for infektion med og patogenitet af vira. Influenza er altså sæsonbestemt, hvilket delvist skyldes dens levevilkår ved forskellige luftfugtigheder og temperaturer, som findes mest gunstige i vinterhalvåret. Vira kan overleve over længere perioder, idet der er vinter, og dermed gunstige livsbetingelser på forskellige tider af året rundt om i verden. En anden gunstig faktor menes at være den mindre soleksponering i vinterhalvåret, hvilket medfører en mindre D-vitaminproduktion og derved en svækkelse af immunforsvaret hos befolkningen, som gør mennesker mindre modstandsdygtige overfor infektioner. Infektion i kroppen er afhængig af, hvor hurtigt immunsystemet kan genkende virussen og komme med en hurtig respons. Det er af stor betydning, hvor mange epitoper, der er bevaret i den nye virus i forhold til tidligere eksponerede vira, da disse kan genkendes af immunforsvarets celler. SOIV har vist at have mange bevarede epitoper i forhold til normal sæsoninfluenza, hvilket har givet anledning til en effektiv immunrespons og en mindre alvorlig pandemi. Der kan dog ikke sættes lid til, at nye vira har nok bevarede epitoper til at sikre en effektiv immunrespons, derfor udvikles vacciner, for at optimere den adaptive immunrespons. Der arbejdes imidlertid med at udvikle nye aktive vacciner, da traditionelle vacciner har vist sig ikke at kunne bekæmpe virusinfektioner effektivt. Derudover er der stadig meget viden der endnu mangler, for at kunne forudsige, hvor godt en virus spreder sig. Selvom der er fundet evidens på, at bestemte aminosyrer på en bestemt plads har en særlig indflydelse på viras polymeraseaktivitetet, kan intet forudsiges med sikkerhed. Andre aminosyrer længere væk i kæden kan ligeså vel have indflydelse og dermed give en uventet aktivitet. Side 27 af 50

5 Patogenitet Patogeniteten af virus afhænger først og fremmest af hvilken vært den kan binde sig til, idet overfladeproteinet HA binder sig til bestemte receptorer, som er artsspecifikke. Receptorspecificiteten kan dog ændres ved reassortering, som det er tilfældet med SOIV. Flere gensegmenter i det virale genom spiller en rolle i forbindelse med virus patogeniteten. For at dæmpe patogeniteten, når virus har inficeret værtsorganismen, er der taget forskellige tiltag og mange behandlingsformer er stadig under udvikling. 5.1 Værtsspecificitet Receptorbindingsspecificitet skelnes hovedsageligt ved genkendelse af den terminale sialinsyre og dens binding til den nærliggende galaktose. Aviære vira binder sig fortrinsvis til α2,3-bundne sialinsyrereceptorer på epitelceller i tarmen, hvorimod humane vira er specifikke for α2,6-bindingen på epitelceller i lungerne og det øvre respirationsorgan (se figur 10) [Stevens et al., 2006]. Den subtile overgang fra α2,3 til α2,6 receptorspecificitet antages at være et kritisk trin i tilpasningen af aviære vira til en human vært, og synes at forhindre de fleste aviære influenzavira fra direkte at krydse artsbarrieren til den humane population. Figur 10. Receptorbinding. Binding af sialinsyre til galaktose, som genkendes af influenzavira. Til venstre ses den aviær-specifikke receptorbinding, hvor C2-atomet på sialinsyren binder sig til C3-atomet på galaktosen (sialinsyre α2,3-galaktose), og til højre ses den humanspecifikke receptorbinding, hvor C2-atomet på sialinsyren, til forskel fra den aviære konfiguration, binder sig til C6-atomet på galaktosen (sialinsyre α2,6-galaktose) [Arias et al., 2009]. Side 28 af 50

Indtil for nylig var man overbevist om, at aviære vira kun kunne krydse fugle-menneske barrieren via en mellemvært, såsom et svin. I forhold til mennesker har fugle en anden konfiguration af sialinsyre i cellemembranerne. Svin har imidlertid både den aviære- og humane konfiguration i epitelceller i luftrøret, altså α2,3 og α2,6-bundne sialinsyrereceptorer. Dette forklarer, hvorfor svin er modtagelige overfor aviære, såvel som humane vira [Rev. Ebrahim, 2010]. Mens fuglen således er reservoir for influenzavira, udgør svinet en ideel vært for replikation og reassortering af influenza A vira med pandemisk potentiale [Weingartl et al., 2010]. Det lader dog til, at ekstremt høje doser af aviær virus kan inficere mennesker direkte uden mellemvært. Siden 1997 har der indtruffet syv udbrud af aviær influenza i mennesker, herunder serotyperne 6 H5, H7 og H9, som grundet aviære viras høje patogenitet har medført høj dødelighedsrate hos de inficerede [Stevens et al., 2006]. α-2,3-bundne sialinsyrer er nu blevet fundet på cilierede celler på det humane luftvejsepitel, og har vist sig at modvirke de hæmmende effekter af de respiratoriske slimstoffer. Dette kunne forklare, hvorfor disse aviære vira har inficeret mennesker, specielt under tilstrækkeligt høje doser og tæt kontakt med fugle [Stevens et al., 2006]. Som følge heraf er det en almen opfattelse, at en dødelig pandemisk influenzavirusstamme i fremtiden er uundgåelig. 5.2 Overfladeproteinerne som bestemmende faktorer i patogenitet Det første trin ved viral infektion er at hæfte sig fast på værtscellen (se afsnit 2.2). I influenzas HA findes en smal bindingslomme med højt konserverede aminosyrer. Den eksakte struktur af HA spiller en afgørende rolle i virussens binding til receptorerne. Derfor kan en enkelt aminosyresubstitution i bindingslommen resultere i ændret receptorbindingsspecificitet og dermed ændret værtsspecificitet for den pågældende virus (se afsnit 5.1) [Wagner et al., 2001]. Den virale NA opfører sig som et receptor-nedbrydende enzym i influenzavira (se afsnit 2.1). Når NA aktiviteten blokeres af enten antistoffer, inhibitorer eller temperaturfølsomme mutationer, dannes der derfor store aggregater på overfladen af de inficerede celler på samme måde som med vira, der mangler NA enten helt eller delvist [Wagner et al., 2001]. Følgelig anses viral NA for at være en vigtig faktor i frigivelsen af nye virus fra værtscellen, og er dermed af væsentlig betydning for den effektive udvikling af en infektion. Chen et al. (2008) har forsøgt, at generere reassorterede vira mellem A/Thailand/16/04 (H5N1) og A/Wyoming/3/03 (H3N2) samt en yderligere virus, og testede herved virulensen i mus af 39 af de reassorterede vira, som blev dannet. De fandt følgelig, at disse reassorterede vira udviste et bredt spektrum af patogenitet i musemodellen, men i forhold til vildtypen demonstrerede reassortanterne en svækket patogenitet [Chen et al., 2008]. 6 Virusstamme som kan identificeres immunologisk ved reaktion med specifikt antistof, og derved adskilles fra andre stammer. Side 29 af 50

Dette kan pege på, at selvom reassortering mellem H5N1 og human H3N2 vira er mulig ude i naturen, er generationen af kompetitive og stærkt patogene vira ikke nær så sandsynlig, som frygtet [Li et al., 2010]. En produktiv infektion hviler nemlig endvidere på, at influenzavirussens HA og NA arbejder strengt balanceret i forhold til hinanden [Wagner et al., 2001]. En større receptorbindings-affinitet må derfor ledsages af en ligeså stor receptor-nedbrydende aktivitet hos den virale NA. I modsat fald vil den forøgede receptorbindingsaffinitet betyde en alvorlig ulempe i det sidste stadie i infektionen ved at forhindre frigivelsen af nye vira fra værtscellen [Wagner et al., 2001]. 5.3 Spaltning af hæmagglutinin Udover binding af viruspartikler til sialinsyre, medierer HA, som nævnt (se afsnit 2.2), sammensmeltning af den virale og endosomale membran efterfulgt af endocytose. HA syntetiseres som et precursor-protein i cellerne, HA0, og må spaltes af værtscellens protease enzymer (oftest trypsin) til underenhederne HA1 og HA2, for at kunne opnå sin fusiogene egenskab [Lazarowitz & Choppin, 1975]. Dette spaltningstrin spiller en betydelig rolle i virus patogenitet, da det aktiverer HAs membran-fusions-potentiale. Den nyligt skabte HA2-amino-ende er en nonpolær sekvens, kaldet fusionspeptidet. Dette fusionspeptid er essentielt for at fremme fusionen mellem den virale og cellulære membran, som gør det muligt for det virale RNA at trænge ind i cytoplasmaet [Stegmann et al., 1990]. For naturligt forekommende aviære influenza A vira er strukturen på kløvningssitet hos HA precursoren den mest afgørende faktor i patogenitet. Dette var først demonstreret i studier over aviære vira med 9 forskellige HA undertyper, hvor det blev vist, at patogenitet for kyllinger direkte hang sammen med virussens evne til at producere spaltede HA i inficerede celler i kultur [Bosch et al., 1979]. Analyse af HA1-HA2 kontaktregionerne af disse vira afslørede tilstedeværelsen af en sekvens med basiske residues i patogene stammer [Porter et al., 1979]. Kløvningssitet er en prominent overflade-sløjfe, som ligger nær et hulrum. Aminosyre indsættelser ved kløvningssitet i HAer fra patogene aviære vira forlænger denne overflade-sløjfe og giver således anledning til intracellulær spaltning [Chen et al., 1998]. Sekvenserne ved HA kløvningssitet er nu kendte for et stort antal højpatogene vira isolerede på forskellige tidspunkter fra adskillelige arter på verdensplan [Wood et al., 1993; Senne et al., 1996; Perdue et al., 1997]. Humane og apatogene aviære influenza virusstammer forårsager lokaliserede infektioner som resultat af den begrænsede række celler, der udskiller en protease, som kan spalte HA0-percursoren ekstracellulært [Klenk et al., 1975]. Imidlertid spaltes høj-patogene aviære stammer af en familie af mere udbredte intracellulære proteaser, som derved resulterer i systemiske infektioner. Forskellen i patogenitet hænger sammen med strukturelle forskelle ved HA0 kløvningssitet. Patogene stammer Side 30 af 50

har indsættelser af basiske aminosyrer ved selve sitet eller andre sekvens-modifikationer omkring det [Webster & Rott, 1987]. Hvorimod lav-patogene stammer har HA-proteiner med kun en arginin residue ved deres kløvningssite, og spaltes kun af vævsspecifikke proteaser, såsom tryptasen Clara, hvilket som regel blot resulterer i milde infektioner [Horimoto et al., 1994]. Influenza A 2009 stammer, eller SOIV, besidder kun en arginin ved HA kløvningssitet [Garten et al., 2009]. Konformationen af precursor HA0 er stabil ved lavt ph, men spaltet HA er angiveligt metastabil. Når først HA er spaltet, er den således følsom overfor ph, og gennemgår ved endosomets lave ph den molekylære omlejring, som er nødvendig i forbindelse med membran-sammensmeltning [Bullough et al., 1994]. Røntgenstrålingsstrukturen af en mutant HA0 viser, hvordan variation i strukturen på en precursor kløvningssite kan medføre variation i patogeniteten af vira. Mutante virus med asparagin- 112 og histidin-17 substitutioner gennemgår den ph-inducerede konformationelle ændring ved højere ph end wild-typen. Dette kunne tyde på, at disse residues enten spiller en rolle i stabiliseringen af den neutrale ph struktur, udløsningen af den lav-ph-inducerede konformationelle ændring, eller begge dele [Daniels et al., 1985]. HA0s kløvningsegenskaber samt fordelingen af infektions-aktiverende proteaser i værtscellen er hovedfaktorer for viras tendens til at angribe forskellige væv i kroppen, og kapaciteten for systemisk infektion [Steinhauer, 1999]. Men hvad er det, der sætter spaltet HA i stand til at gennemgå en irreversibel, ph-afhængig, konformationel ændring, når den uspaltede precursor HA0 ikke gør det? Når fusionspeptidet bevæger sig ind i hulrummet i HA0 og indsætter ioniserbare residues (se figur 11), er det muligt, at den herved faciliterer en phændring. I dette tilfælde vil precursor-spaltningen altså være nødvendig, før den konformationelle ændring kan induceres af lavt ph. Alternativt kunne den kovalente binding mellem HA1 og HA2 i HA0 i sig selv tænkes at begrænse bevægelsen af fusionspeptidet, og forhindre den omfattende refoldning, som observeres efter lav-ph behandling af de spaltede molekyler [Chen et al., 1998]. HA0 molekyler med indsættelser fra 4 til 20 residues ved kløvningssitet rejser endnu et spørgsmål. Hvorfor kan fusionspeptidet, med så lange sløjfer, ikke trænge ind i HA0 overflade-hulrummet uden precursor spaltning? Svaret kan være, at HA0 hulrummet i en vis forstand er delvis fyldt. Arginin-321, prolin-324 og glutamat-325 er alle nødt til at bevæge sig ud af den øverste del af hulrummet (se figur 11 nederst; residues ovenover pilespidsen) før fusionspeptidet kan passe ind. Side 31 af 50

Figur 11. Spaltning af HA. (Øverst) Bånddiagram af uspaltet (venstre) og spaltet HA. HA1 er vist i blåt, HA2 er vist i rødt, og residues som er flyttet efter spaltning er vist i gult. Pilen indikerer kløvningssitet i den uspaltede HAs sløjfe. Placeringen af disulfid-bindingen mellem HA1 og HA2 og oligosakkaridet, som er bundet til HA1 residue 22 er også indikeret. (Nederst) Space-filling model af kløvningssite-regionen før og efter spaltning. Kløvningssløjfen kan ses orienteret mod læseren, og de residues, som udgør C- terminalen af HA1 (gult) og N-terminalen af HA2 (grønt) er indikeret. Pilen viser HA0 hulrummet, omgivet af ioniserbare residues. Syreholdige residues er skraveret rødt, mens basiske residues er skraveret blåt. Det ses, at N-terminal domænet af HA2 efter spaltning omplacerer sig til hulrummet og nedgraver et antal af ioniserbare residues [Steinhauer, 1999]. Side 32 af 50

Det er sandsynligt, at precursor-spaltning formentlig gør det muligt for disse tre HA1 residues at bevæge sig væk fra deres placering i HA0 sådan, at N-terminal sekvensen kan udfylde hulrummet. Som følge heraf er carboxyl-enden af HA1 og amino-enden af HA2 separeret med 22 Å i spaltet HA [Wilson et al., 1981]. Den negative elektrostatiske ladning i hulrummet (gul i figur 11 nederst) tyder på, at den spaltede positivt-ladede N-terminal aminogruppe sørger for en elektrostatisk kraft til at guide sammenkoblingen af fusionspeptidet. Et elektrostatisk ladet hulrum på overfladen af HA0 kan tænkes evt. at tiltrække et andet ladet peptid end fusionspeptidet, som derved kan spærre for dette og blokere for konformationsændringen af den spaltede HA, hvorved infektion ikke er mulig. En tilstrækkelig høj koncentration af fusionspeptider efter spaltning kan dog udfylde hulrummet, så der ikke er adgang for andre peptider. En inhibitor kan dog stadig være effektiv, hvis det lykkes den at forsinke konformationsændringen. Med fusionspeptidet eksponeret kan det kortvarige og ustabile intermediat efter spaltning nemlig enten aggregere eller gennemgå en anderledes konformationel ændring, som resulterer i tab af aktivitet [Chen et al., 1998]. 5.4 Nedregulering af apoptose Derudover har proteinerne NS1 og PB1-F2 (se afsnit 2.1) også betydning for patogeniteten. Som forsvar imod en virusinfektion kan værtscellerne gå i apoptose. Zhirnov et al. (2002) sammenlignede en vildtype virus (WT) med en virus, hvor NS1 ikke var til stede (delns1). Ved apoptose nedbrydes DNA til brudstykker som i elektroforese gel vil vandre længere end intakt DNA. Holdet viste en lille størrelsesforskel mellem DNA fra Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler, der havde været eksponeret for hhv. WT og delns1 [Zhirnov et al., 2002]. Heraf fremgik det, at virussen uden proteinet NS1 i højere grad fremkaldte apoptose i værtscellen (se figur 12). Det konkluderedes derfor, at tilstedeværelsen af NS1 i virus har en nedregulerende effekt på værtscellernes tendens til at gå i apoptose ved infektion [Zhirnov et al., 2002]. PB1-F2 har derimod vist sig at have proapoptotisk effekt. Eftersom muterede vira med nedsat udtryk af PB1-F2, har vist sig at fremkalde apoptose i mindre grad [Chen et al., 2001]. PB1-F2 kan altså, ligesom NS1, muligvis udvikle antiapoptotiske egenskaber og dermed øge patogeniteten af vira. Side 33 af 50

Figur 12. Elektroforese af MDCK-celler og PB1-F2. Til venstre; Når en influenzavirus angriber værtens celler, kan værtscellerne gå i apoptose, hvilket medfører nedbrydning af DNA. Billedet viser elektroforese resultaterne af DNA fra MDCK-celler (Madin-Darby Canine Kidney) eksponeret for hhv. WT (wild type virus) og delns1 (virus uden NS1). Som man kan se på billedet, har delns1 fremkaldt apoptose i højere grad end WT, idet mindre DNA brudstykker vandrer længere i elektroforesen end intakt DNA [Zhirnov et al., 2002]. Til højre; Billedet viser det proapoptotiske protein PB1-F2 fra H1N1/1918. Det er påvist, at polymerase proteinet PB1-F2 har propapoptotisk effekt, da muterede vira med nedsat udtryk af PB1-F2, fremkalder apoptose i mindre grad. Dette kan muligvis udvikle antiapoptotiske egenskaber og dermed øge patogeniteten i influenzavira [McAuley et al., 2010]. 5.5 Behandling Der findes to velkendte måder at dæmpe en influenzavirus patogenitet. Den ene går ud på at blokere viras transmembrane M2 ionkanaler, hvilket bl.a. besværliggør replikation af vira, mens den anden handler om at hæmme NA for derved at begrænse virusinfektion i kroppen. M2 ionkanalen spiller en rolle i replikation af vira samt tjener en strukturel funktion [Hay et al., 1985]. Proteinet består af en transmembran tetramer af tætpakkede helixer. Strukturen af tetrameren i kompleks-binding med lægemidlet, Amantadin, blev bestemt af Schnell og Chou ved Nuclear Magnetic Resonance (NMR) i 2008 [Schnell & Chou, 2008]. Strukturen af Amantadin og illustrationer af M2 ionkanalen i kompleks med Amantadin vises i figur 13. Side 34 af 50

Figur 13. Amantadin og struktur af M2 ionkanalen. Fra venstre til højre; Yderst ses lægemidlet Amantadin som gives mod influenza. Amantadin fungerer ved at blokere M2 ionkanalen i en influenzavirus, så det virale RNA ikke kan passere ind i værtscellen til replikation. På de næste to billeder ses M2 ion-kanalen lukket ved en ph-værdi på 7,5, og de sidste to billeder viser M2 ionkanalen åben ved en ph-værdi på 6,5 [Cady et al., 2010]. Desværre blev langt de fleste vira hurtigt resistente overfor gruppen af adamantaner herunder Amantadin, og lægemidlet benyttes nu i begrænset omfang. Bright et al. (2005) rapporterer om en forøgelse i resistensen på 11,9 % i løbet af 11 år (0,4 % i 1994 og 12,3 % i 2005) [Bright et al., 2005]. Men hvad skyldes denne resistens? I den transmembrane tetramer (M2 ionkanalen) findes en port som holdes sammen af van der Waal bindinger mellem tryptophans indolringe. Porten holdes lukket af hydrogenbindinger mellem ringene og protoneret aspartat. Ved sænkning af ph, som følge af kontakt med den eukaryote værtscelles cytoplasma, protoneres histidins imidazolringe og tetramerkonformationen destabiliseres, hvorved ionkanalen åbnes [Schnell & Chou, 2008]. Amantadin binder sig til 4 ækvivalente sites på ionkanalens lipidside og stabiliserer lukningen, hvorved der skabes blokade [Schnell og Chou, 2008]. Resistensen over for adamantaner kommer som følge af en eller flere mutationer på M2 proteinet. Blandt andet kan en valin alanin substitution forstørre åbningen i N-terminalen, hvorved tetramerens pakning svækkes og åbning af ionkanalen favoriseres. Derudover kan alanin threonin og glycin glutamat substitutioner i kanalen facilitere hydration med åbning til følge. Og sidst kan substitution af leucin og serin udover at destabilisere pakningen også sænke energiomkostningerne ved åbning af ionkanalen [Schnell og Chou, 2008]. Hæmning af NA går i al sin enkelthed ud på at forhindre frigivelsen af viruspartiklen fra værtscellen. Princippet benyttes i forbindelse med antiviralerne, Oseltamivir og Relenza, som begge er NAhæmmere. Til gengæld kan hæmning af NA også højne patogeniteten af en virusinfektion. Lin et al. (2009) viser in vitro, hvordan behandling af influenza med Oseltamivir kan forværre sygdomstilstanden. Idet virus ikke frigives, efterlader den flere af værtscellernes overfladereceptorer ubenyttede, hvilket giver bedre bindings-muligheder for de viruspartikler, der allerede eksisterer i kroppen [Lin et al., 2009]. Den gennemsnitlige effekt af Oseltamivir er dog patogenitet-dæmpende og lægemidlet benyttes i udbredt grad. Side 35 af 50