Holdbarhedsundersøgelse af leukocytter til differentialtælling på Sysmex XN-9000

UNIVERSITY COLLEGE LILLEBÆLT Professionsbachelorprojekt Holdbarhedsundersøgelse af leukocytter til differentialtælling på Sysmex XN-9000 Durability study of leukocytes for differential count on Sysmex XN-9000 Af Olena Dovgan Studienr.: 32110543 Modul 14 SB510 Antal anslag: 6462 D. 11-12-2013 Uddannelses sted: University College Lillebælt Blangstedgårdsvej 4, 5220 Odense SØ Vejleder fra Vejleder fra University College Lillebælt Odense Universitet Hospital Aino Elmegaard Larsen Erling Birkemose Nielsen Dorte Viborg

Resume Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi(KBF) Odense Universitet hospital(ouh) erhvervet nye hæmatologi udstyr Sysmex XN-9000(XN-9000). Dette udstyr er nyeste generation inden for hæmatologi analyseudstyr som kan udfører alle hæmatologiske analyser, bland dem total leukocyttal(wbc) og differential tælling af leukocytter (DIFF). Producenten oplyser at analyseprincip på XN-9000 gør muligt at udfører WBC og DIFF på prøvematerialer, som er fuldblod og opbevaret ved stuetemperatur, fra prøvetagningstidspunkt i op til 72 timer med pålidelige resultater. Formålet med dette projekt var bekræftet eller afkræftet oplysninger fra producenten, der leukocytternes levetid væsentlig kortere in vitro. Dette projekt er et holdbarhedsforsøg af analysematerialer for udførelse af WBC og DIFF på XN- 9000 i op til 72 timer. Til dette holdbarhedsforsøg var udvalgt 70 patientprøver fra rutine. Disse prøver analyseret inden for to timer efter blodprøvetagning, denne er tiden 0 og er referencen for forsøget, herefter prøverne analyseret efter 24-48 - 72 timer. I projektet anvendt statistiske tester for at se om kan udføres DIFF i op til 72timer fra tiden 0 uden at overskride de 5 % signifikansniveau eller hvornår overskridelse fremdrage. Hvis producentens oplysninger bekræftes, dette vil være meget nyttig, både for sundhedsvæsnet og patienter, fordi her kan spares penge og ressourcer især på prøver fra praksis, som kommer til analysering efter 24 timer, og efterbestillinger. 1

Indholdsfortegnelse Indledning 3 Problemformulering.4 Fremgangsmåde...4 Statistik 5 Materiale og metode 7 Teori.8 Leukocytter..8 Analyseprincipper.9 WNR-kanalen 10 WDF-kanalen.11 Low WBC mode 12 Kontrolsystem 12 X-barM...13 CellaVision DM96.14 Resultater 14 Diskussion..19 Konklusion.25 Perspektivering..25 Referencer.27 Bilag 1, 3, 6 og 7.... se vedlagt usb-pind Bilag 2..29 Bilag 4..30 Bilag 5..31 2

Indledning Klinisk Biokemi og Farmakologi afdeling (KBF) på Odense Universitetshospital(OUH) har erfaring med patient prøver, der kommer fra praksis og efterbestillinger, som er ældre end 24 timer. På KBF s udføres forskellige analyser inden for hæmatologi blandt andet totalt leukocytantal (WBC) og differentialtælling af leukocytter (DIFF). Denne type af analyse kan bruges til diagnosticering, behandling og udredning af forskellige sygdomme, fordi leukocytter er en del af kroppens immunforsvar. De forskellige leukocyttyper er neutrofilocytter, eosinofilocytter, basofilocytter, lymfocytter og monocytter og de udøver forskellige funktioner i kroppen. Ved bestemte sygdomme vil en eller flere af de 5 leukocyttyper være fremtrædende(1). Leukocytter har forskellige holdbarhedstid in vivo, som produceres jævnlig i knoglemarv, mens in vitro deres leve vilkår ændres og dette påvirker holdbarhedstid (2). Inden for KBF s hæmatologi afdeling er proceduren for måling af WBC og DIFF på SysmexXN- 9000 (XN-9000) med modultypen XN-10, analyseres prøverne inden for 24 timer efter blodprøvetagning. Prøverne opbevares ved stuetemperatur på ca. 20-25C. I tilfælde af en prøve ankommer til afdelingen efter 24 timer, vil prøven stadig blive analyseret. Her vil svaret blive autovalideret ud fra parametre XN-9000 programmeret til og frigivet. Derimod vil en overtrædelse af validerings parametre udløser et flag på XN-9000 information process unit( IPU) og analysesvaret bliver ikke autovalideret men tilbageholdt. Et alarmflag, som udløses af en brudt i parametre, kunne for eksempel være flaget Abnormal WBC scattergram. Hvert flag kommer med en handlings mulighed formuleret i tekst. I dette eksempel Abnormal WBC diff mesauring, som reaktion skal udføres manuel DIFF. I OUH s laboratoriestyresystem, BCC, bliver prøven undersøgt for patientens syge historie, for at se om patienten er kendt med f.eks. blaster. Hvis patientens sygehistorie er ukendt, bestilles en udstrygning på prøven til manuelt DIFF på CellaVision DM96(CellaVision). Hvis analysesvaret ikke kan frigives pga. påviste flag og overtrædning af parametre, samt at udstrygning viser at cellernes morfologi er drastisk forandret, bliver rekvirenten kontaktet og oplyst om, at prøven er mislykket og derfor skal prøven tages om (se bilag 1). Producenten oplyser at XN-9000 kan analysere prøvemateriale at fuldblod for WBC og DIFF i op til 72 timer med valide resultater, samt at prøvemateriale kan opbevares ved stuetemperatur (3). 3

Af ovenstående årsager er KBF interesseret i at undersøge holdbarheden af leukocytter i analysematerieler, som er fuldblod, på afdelings hæmatologiudstyr Sysmex XN-9000. Prøvemateriale til at analysere WBC og DIFF tages i ethyl-diamin-tetra- acetate(edta)-rør. Formålet med dette projektet er, at undersøge om prøvematerialer er holdbare i op til 72 timer, for udførelse af WBC og DIFF på XN-9000. Vi fastsætter vores signifikans niveau på 5%, for at se om XN-9000 kan udfører WBC og DIFF i op til 72 timer, uden overskridelse af de 5 % signifikans niveau. Vi vil overvære forandringer i blodbilleder fra CellaVision til tiderne 0, 24, 48 og 72 timer, hvor 0 timer er referencen. Dette kan bruges til sammenligning med resultatet fra XN-9000 for at se om forandringer på billederne fra CellaVision stemmer overens med forandringer fra resultaterne fra XN-9000. Problemformulering Hvor lang tid er prøvemateriale holdbare ved stuetemperatur, dvs. er prøvematerialet velegnet til udførelse af differentialtælling af leukocytter i op til 72 timer? Hvornår begynder resultaterne at overskride de 5 % signifikans niveau i forhold til 0 time? Fremgangsma de Automatisk hæmatologianalyse udstyr, Sysmex XN-9000, med integreret moduler XN-10 og SP-10 som er kalibreret og eftersynet af producenten den 24/09/2013, inden den taget i brug til projektet. XN-9000 kalibreres og eftersynes hvert 6 måneder. Der udføres dagligt vedligeholdelse og kontrolmålinger af kvalitetskontroller i tre niveauer før analysens opstart, som anbefalet af analyseudstyr producenten (3). Til vores projekt har vi udvalgt 70 patients fuldblodsprøver fra rutine, som ligger indenfor referenceområdet angivet fra afdeling KBF(se bilag 2), til differentialtælling af leukocytter på Sysmex XN-9000. De 70 prøver fordeles over 3 uger, hvor vi hver uge udvælger 20-25 prøver til analysering. I den første uge på første dag kl. 10 udvælges 21 prøver. Prøverne blev analyseret på XN-9000 inden for 3 timer efter blodprøvetagning, mellem kl. 10 og 12, og analysesvar på disse prøver 4

betragtes for tiden 0 og vil anvendes som referenceværdi i forbindelse med de statistiske tester i opgaven. Ud fra de 21 prøver, udvælger man 10 prøver til analysering på CellaVision. De 10 prøver analyseres først på XN-9000, herefter de udstryges manuelt og farves på SP-10 modulet. Efter farvningen sættes præparatet ind i CellaVision, hvor apparatet så afbilder de enkelte leukocytceller på en computerskærm. Til dette projekt vil vi analysere prøverne i op til 72 timer, hvor de 21 prøver analyseres på XN- 9000, hver dag fra kl 10, i tiden 24, 48, og 72 timer. De 10 prøver, som er valgt fra dag 0, bliver også analyseret på XN-9000, udstrøget manuelt og farvet på SP-10 modul til CellaVision. I anden uge udvælger vi 24 prøver og i den tredje uge 25 prøver. Prøverne udvælges mellem kl. 10 og 12, kravet er at de skal ligger indenfor afdelingens referenceområde. Prøverne udvalgt fra første dag, tiden 0 vil anvendes som referenceværdi, og de analyseres til tiden 24, 48 og 72 timer. Til forskel fra den første uge, så skal prøverne i de sidste to uger ikke analyseres på CellaVision. I løbet af de tre uger, hvor prøver bliver analyseret på tiden 0, 24, 48 og 72 timer, opsamles rådata løbende. Efter den sidste dag i tredje uge, anvender vi statistik til beregning af resultaterne. Statistik Vi starte med anvende probit-plot til behandling af rådata, for at se om vores data er normalfordelt. Dette gøres ved at rangordne data med den mindste værdi først og i stigende rækkefølge. Derefter giver man hver data et rangnummer (se eksempel 1). Hvis der opstår to eller flere ens tal, skal de have samme rangnummer hvilken gøres ved at tage gennemsnittet af de rangnumre, man er kommet frem til ved rangnummeringen(4). Eksempel 1: rangnummering af værdier. 0 timer rang 3,72 1 3,73 2,5 3,73 2,5 3,77 4 3,86 5 Ved hjælp af EXCEL udregnes teoretiske sandsynligheder, ved brug af formlen: p, hvor p står for sandsynlighed, r for rangnummer og n for antal prøver. Den udregnede teoretiske 5

sandsynlighed bruges til at udregne N(0,1) fraktilen, som er nomineret normalfordeling og den udregnes i EXCEL, ved benyttelse af følgende kommando: =NORM.INV(teoretisk sandsynlighed;0;1). Derefter indsætter man det fundne data i et XY-plot, hvor N(0,1) fraktilen sættes på Y-akse, og ens målinger på X-akse.(4) Ved normalfordeling vil ses en ret linje mellem dataene i probit-plottet, ved eksempelvis at tilføje en tendenslinje(se bilag 3). For at finde ud af om der er varianshomogenitet over resultaterne, kan man benytte F-test. Hvis man anvender 95 % sandsynlighed, er p-værdien 0,05. Hvis man ved beregning får en p-værdi mindre end 0,05, er der 5 % sandsynlighed for at der ikke er tale om tilfældige fejl og derfor er der ikke varianshomogenitet og vice versa. Hvis data ikke udviser varianshomogenitet, vil man udføre en T-test to stikprøver med forskellige varians. Dette gøres følgende ved at i EXCEL vælges under Data, Dataanalyse og T-test to stikprøver med forskellige varians. Her vælges de data man vil teste for signifikans forskel. Der observeres for tabellens p-tabel i forhold til p-værdi på 0,05. Hvis p-tabel er større end p-værdi, betyder det at der ikke er påvist signifikans forskel. Er p-tabel mindre end p-værdi, betyder det, at der er påvist signifikans forskel.(4) For at bestemme hvornår der er signifikans forskel for holdbarheden af leukocytter, i forbindelse med differentialtælling, vil vi anvende statistiske test to-faktor ANOVA uden gentagelse. Kravene til denne ANOVA-test er, at dataene er normalfordelt, og at der er varianshomogenitet. To-faktor ANOVA uden gentagelse testen, vælges i denne sammenhæng på grund af, man har to faktorer der ikke afhængig af hinanden. Disse faktorer er forskellige patientprøver analyseret på forskellige tidspunkter, dvs. patientprøve og tid. I dette projekt bliver ikke udført dobbeltbestemmelse på patientprøver. Vi bruger værdier fra tiden 0, som er vores referenceværdi, og sammenligner referenceværdierne med 24 timer, 48 timer og 72 timer. Ved indsættelse af resultaterne på EXCEL med følgende kommando: ANAVA to-faktor uden gentagelse, får man en tabel frem(se bilag 3). Hvis tabellen viser at F-værdien er større en F-krit, så er der er signifikans forskel på tiden, og omvendt hvis F-værdien er mindre en F-krit, er der ikke 6

påvist signifikans forskel. Differenceplot anvendes til illustrering af resultaterne visuelt. Dette gøres ved at tage differencen mellem referenceværdien tiden 0 med 24 timer, 48 timer og 72 timer. Differencen udregnes på følgende måde: for hver enkelt prøve tages værdi for 24 timer og subtrahere værdi for 0 time, dvs. 24 timer -0 time = differensen. Differenserne for 48 timer og 72 timer udregnes efter samme formel. Differencen indsættes i et XY-plot, hvor tiden er på X-aksen, og differencen på Y-aksen( se bilag 3) Derefter indsættes den øvre og nedre grænse. Grænserne beregnes med følgende formel: 0 SD T, hvor 0 er tiden 0 man sammenligner med, derfor substrahere/adderer man med 0. 1,96 er tabelværdien for 5% signifikans niveau(4). SD T er beregnet ud fra formlen:, hvor SD er angivet fra Valideringsrapport for SYSMEX XN-9000 på side 23-25, hvor vi har taget SD ud fra totalleukocytter for hver enkelte leukocyttyper. Materiale og metode Analysemateriale er fuldblod fra patienter udtaget i EDTA-rør fra BD Vacuvette, som analyseres på Sysmex XN-9000. XN- 9000 har integreret fire XN-10 moduler og en SP-10 modul, som udstryger og farve analysematerialet til manuel DIFF der udføres på CellaVision DM96. XN-10 moduler er valideret at de måler alle hæmatologiske parametre i prøverne ens (5). Reagenser (se bilag 5), apparatur og utensilier (se bilag 4). Litteratursøgning foretaget på Pubmed, som er mest opdateret databasen, samt google, scholar, sciensdirekt. Brugte søger ord er: sysmex xn, effects of storage of blood room temperature, stability+ blood+ differential count, leucocytte differential+room temperature osv. Der var ikke mange relevante videnskabelige artikler som kan være brugbar til projektet pga. Sysmex XN-9000 er forholdevis nye analyseudstyr. 7

Teori Leukocytter Leukocytter dannes i knoglemarv ud fra stamceller hvor efter de diffunderer ud i blodet og det lymfatiske system. De spiller en vigtig rolle i immunforsvars bekæmpelse af invasive fremmede organismer. Leukocytter opdeles i to grupper, baseret på deres morfologi til granuleret og agranuleret. De granulerede leukocyttyper er neutrofilocytter, basofilocytter, eosinofilocytter. Kendetegn ved granulerede celler er blandt andet at de er polymofrnuklerære og derfor kaldes segmentkernede granulocytter. De agranulerede leukocytter er lymfocytter og monocytter, som har kun en kerne i cellen, og derfor betegnes som mononukleære celler.(6) Neutrofilocytter bekæmper bakterier og svampe ved fagocytose af partikler og har en væsentlig rolle ved betændelsesprocesser. De tiltrækkes af en række kemiske stoffer fra plasma, som udløses af andre celler involveret i betændelsesprocessen, såsom døde celler og bakterier. Cellens granulaer indeholder enzymer eksemplevis lysozym, proteinase og kollagenase. Deres funktion er f.eks. at nedbryde bakteriens cellemembran.(6) Basofilocytter reagerer ved anafylaktiske reaktioner og udløser histamin. I deres granulaer findes forstadiet til histamin. På overfladen af disse celler sidder en IgE-receptor og når en allergen bindes til denne receptor udtømmes granula og histamin aktiveres.(6) Eosinofilocytters funktioner hovedsagelige rettet mod bekæmpelse af parasitter men de er også involveret i allergiske reaktioner pga. histamin. Deres granulaer indeholder histamin, enzymet major basic protein (MBP) og eosinophil cationic protein (ECP), som fremskynder blodets koagulation. Disse enzymer hjælper med bekæmpelse af parasitter mens histamin hjælper ved allergiske reaktion.(6) Lymfocytter inddeles i T- og B-lymfocytter. B-lymfocytter modnes i knoglemarv og modne celler kaldes også plasmaceller. De lokaliseres i alle væv, især i inflammatoriske områder i tarmkanalen, lymfeknuder og knoglemarv. B-lymfocytter findes ikke i blodet normalt kun ved plasmocytose. Ved dannelse af antistof, gennemgår B-lymfocytter en aktiveringsprocess, som foregå ved at den møder sit antigen, og præcenter det for en T-lymfocyt, der til gengæld sender et signal tilbage til B lymfocytten. Reaktionen på signalet er at B-lymfocytten begynder en proliferere og danne antistof 8

mod antigen B cellen blev præcenteret for (7). T-lymfocytter modnes i thymus og cirkulerer mellem blodkredsløbet og lymfesystemet. Ved infektion forlader de blodbanen og migrere i det inficerede område. De optræder sent i immunresponset og vil være de dominerende celler ved kroniske betændelsesprocesser (6). Monocytter reagerer kemotaktisk og diffundere over i forskellige væv, hvor de kaldes makrofager. Ved invasion af fremmede organismer nedbryder T- lymfocytter de fremmede celler, og præsenterer dem for monocytter der fagocyttere de døde celler (6). Analyseprincipper Flowcytometri er en metode til måling af celler i en opløsning. Analyseprincippet for flowcytometri er at cellerne passerer enkelvis en laserstråle i flowcellen. Dette laserlys bliver reflekteret og en del af den refleksion detekteres. Forward scatter(fsc), er det lys som spredes fremadrettet når cellen rammes af laserlyset, og giver indikation om cellens størrelse. Jo større cellen er, jo højere vil FSC være.(3,8) Side scatterede light (SSC) er den del af laserlyset, som rammer cellens granula hvorefter lyset spredes til siden. Størrelsen af SSC afhænger af cellens interne kompleksitet. Forskellen i cellernes kompleksitet kan med andre unikke kendetegn bruges til at skelne celler fra hinanden. Ved hjælp af metoden kan man skelne mellem forskellige leukocyttyper, som f.eks. at skelne en neutrofil leukocyt fra en basofil leukocyt, da basofilen har en polymorfnuklerær med 2-3 lapper og store basofile granulaer i cytoplasmaet. Mens neutrofilens kerne kan bestå af 2-5 lapper som bundet af tynde broer med små svagt violette granulaer i cytoplasmaet.(3,8) Flowcytometeret kan identificere en celle via FSC og SSC pga. flowcytometerets opbygning. Den mest betydelige del af apparatet er flowcellen, som er opbygget af et rør, der er sat ind i et større rør. Opbygningen gør at man kan have en væske indeholdende celler, man ønsker at måle på ind i en anden væske, kaldet bærervæske. Væsken med celler er under højere tryk end bærervæsken. Ved justering af de to væskers viskositet, kan de løbe ved siden af hinanden uden at blive blandet Dette kaldes laminært flow.(3,8) 9

Grunden til at cellerne vil kunne passerer laserstrålen enkelvis skyldes forskel i forholdet mellem trykket i de to væskers viskositet også kaldet hydrodynamisk fokusering.(3) Ved at indsætte en tærskelværdi, bliver celler som ikke er relevante for analysen ikke målt. En tærskelværdi kan være fjernelse af et FSC-data, og derfor viser man kun SSC(3). For at sikre at flowcytometeret fungerer optimalt, skal flowsystemet være frit for luftbobler og debri fra ødelagte celler. Disse vil forstyrre den hydrodynamisk fokusering ved at skabe turbulens, hvilket resulterer i at cellerne ikke passerer enkelvis laserstrålen. For at sikre reproducérbare resultater, skal trykkene i systemet være optimale, f.eks. under andre trykforhold, vil cellerne passere laseren for hurtigt eller for langsomt, og derved vil resultatet blive anderledes.(3,8) XN-9000 har forskellige kanaler til WBC og DIFF. Disse kanaler benytter fluorocence flow cytometri. Herfra en semikonduktiv laser udsendes monokromatisk lys på en bølgelængde på 633 nm gennem en collimator linse, der samler strålerne og sender dem hen til en kondenser linse. Kondenser linsen fokuserer strålerne, så disse samles og rammer flowcellen samlet. Når lyset fra laseren rammer målcellen i flowcellen brydes dette i forskellige retninger og registreres af fotodioder. Fotodioderne omdanne lys til FSC som viser cellens størrelse, og SSC som rammer cellens organeller og giver information om cellens indhold. Til disse organeller er der tilført et flourokrom, så når SSC rammer cellen, opnås der også et scatter fluorens light (SFL), der viser cellens RNA og DNA, dvs. celleskærne form. Derved kan kombineres SSC og SFL for at sorterer cellerne i klassifikationer af bestemte leukocytter. XN-9000 benytter ikke FSC, som afgørende parameter for cellernesklssifikation, da celler kan varier i størrelse indenfor den sammen type af leukocytter.(3,8) WNR-kanalen XN-9000 benytter WNR-kanal til at analysere en blodprøve for indhold af WBC, basofilocytter (BASO) og nucleated red blood cells (NRBC), som er umodne erytrocytter. Det målte antal af leukocytter er en reaktion på, at prøven tilsættes reagens Lysercell WNR som lyser red blood cells (RBC) og platelets (PLT). Foruden lysering sker der en skrumpning af leukocytter med undtagelse af basofile leukocytter. Så tilsætter XN-9000 flourokromet Fluorocell WNR, som binder til RNA og DNAet i leukocytterne og NRBC. Blandingen af prøvemateriele og reagens indeholdende fluorkrom, føres forbi et flowcytometer. Resultaterne kan ses på et scattergram. FSC angiver 10

størrelsen af cellen mens SFL viser hvor meget aktivitet der er i RNA og DNA. Grafisk afbilledet er størrelsen på Y aksen og SFL er på x aksen. (3,9) Fig.1 illustrer en WNR scattegram hvor Y-aksen præsenterer forward scatter light (FSC)og X-aksen side fluorescent light (SFL). WDF-kanalen. WDF-kanalen kaldes for DIFF kanalen, da det er denne XN-9000 benytter til at lave en differentialtælling af en prøve. Også prøve med en abnorm WBC tal måles i WNR kanalen. Prøven tilsættes reagens Lysercell WDF som lyserer RBC og PLT. Dernæst tilsættes fluorokromet Fluorocell WDF som binder sig til RNA/DNA i leukocytter. Detektion af de forskellige celler foregå på samme fremgangsmåde som i WNR-kanalen. XN-9000 bruger SSC til udtryk for indhold af organellerne i cellen mens SFL viser RNA og DNA. Da fluorokromet bindes RNA og DNA betyder cellens holdbarhed ikke så meget. For selv om cellen vil undergå en morfologisk forandring, vil SSC og SFL ikke påvirkes betydende inden et hvis tidsrum. Dette gør at XN-9000 ifølge fabrikanten har minimum 48 timers holdbarhed på en DIFF.(3,9) Og da cellestørrelse ikke afgørende parameter til at skelne celler fra hinanden, dette vil minimere fejlkilde, såsom opsvulmede celler i prøvemateriale ældre end 4-8 timer, ikke vil være hindring for DIFF(9). 11

Fig.2 illustrere en WDF scattegram på Y-aksen præsenterer side fluorescent light(sfl) og X-aksen side scatter light(ssc). WNR- kanal tælle WBC og adskilt fra alle andre leukocyttyper basofilocytter, mens i WDF-kanal neutrofilocytter ikke adskilles fra basofilocytter, de tælles sammen. For at udregne antal af neutrofilocytter i blodprøve, XN-9000 subtraherer basofilocyttal fra fælles antal af neutrofilocytter og basofilocytter. Lymfocytter, monocytter og eosinofilocytter tælles adskilt fra hinanden i WDFkanalen(9). Hermed ses kontrol mellem WBC og DIFF, da XN-9000 adderer alle klassificeret leukocyttyper og sammenligne med WBC-tal om de to tal ens, hvis de har afvigelse betyder dette at der er fejl i målinger. Low WBC mode XN-9000 sysmex har også en mekanisme til mere præcise målinger i det lave område for måling af WBC 0,01-1,0*10 9 /L. og det er en mode hvor i prøver med en koncentration mindre end 1,0*10 9 /L reanalyseres ved at der tages 3 gange så stort et målevolumen(9). Kontrolsystem Levey- Jennings (L-J) kontrolplot bruges til kontrol af en analyses spredning, og indikerer analysens pålidelighed. L-J plot er opbygget af en mean value i midten, valgt fra en kendt værdi, 12

som analyseresultatet ønskes så tæt op af så muligt. Jo tættere målinger fra prøverne ligger til den kend værdi jo mere præcise de er.(10) L-J plot anvendes til påvisning af ændringer i en analyses præcision målt over et hvis tidsrum. Det er metoden til kontrol, som angiver om der er fejl med analysen, som illustreres grafisk på IPU. Denne kontrol type påviser forskydninger (shifts) af et analyses resultat, både faldende og stigende i en serie på 4 punkter eller mere. Hvis kontrol er ikke ok, f.eks. kontrolmålinger forskydes meget op tyder det på en tilfældig fejl, antages prøven, som ukorrekt analyseret og resultatet kan ikke godkendes.(10) Påvirkning en analyse kan skyldes af tilfældige eller systematiske fejl. Tilfældige fejl påvirker alle målinger forskellige dette kan skyldes eksempelvis fejl i afpipettering. Mens systematiske fejl påvirker alle målinger ens, dette kan skyldes fejl i kalibrering(10). Man kan også se en trend på L-J plottet udtrykt ved at kontrolresultaterne vil falde og stige inden for en hvis tidsperiode. Dette kan skyldes krydskontamination af prøver enten, som en følge af ukorrekt vask, eller at proberne ikke tømmes korrekt, eller reagenser forældet. På XN-9000 mærkes skiftede reagens med dato og initialer fra medarbejderen som foretog skiftet.(10) X-barM Den ekstra kvalitetskontrol som XN-9000 har, kaldes X-barM, der er en patient median, hvor 300 patientprøver analyseres og gennemsnittet tages og plottes ind i et kontrolskema(9). X-barM kan anvendes til alle parametre, herunder DIFF og WBC. En X-barM alarm udløses eksempel pga. en række prøver med høj leukocytantal blev analyseret på samme dag. Kontrollen udløser først alarm når et punkt overskrider øvre eller nedre acceptgrænser, som er sat af afdelingen.(9,11) X-barM har de fordele overfor kvalitetskontroller, at det ikke er afhængigt af lotnummer og opdateres selvstændig efter 300 punkter afsat på kontrolkortet. Hvis denne kontrol udløser alarmen vil en fagkyndig kontrollere årsagen til alarm.(9,11) 13

CellaVision DM96 CellaVision DM96 er automatisk mikroskop, som bruger udstrygningspræparater til manuel DIFF. Udstrygningspræparater kan fremstilles og farves både manuelt og ved hjælp af Sysmex SP-10 modul. Færdig fremstillet udstrygningspræparater mærkes med barkode og indsættes i en kassette, som placeres i CellaVision. CellaVision aflæser barkode, mikroskopere og fotograferer cellerne på udstrygningspræparatet. Derefter sendes billederne til en computerskærm, hvor de sorteres efter leukocyttype. Dog skal en fagkyndig vurderer om CellaVision har identificeret leukocyttyperne og sortere dem korrekt efter typerne. Der vil forekomme uidentificeret celler som CellaVision ikke kan identificere og inddele, fordi cellen falder udenfor identifikationskriterier, som CellaVision er blevet programmeret til. (12) Resultater Følgende tabeller viser på resultaterne for to-faktor ANOVA uden gentagelser testen. Hypotese og modhypotesen er opstillet på følgende måde: F F-krit: Ho accepteres. F> F-krit: Ho forkastes. Tabel 1. Tabel 1.1.: ANOVA test for total leukocyttal, WBC WBC F F-krit Resultat 24 timer 3,532563 3,979807 H 0 accepteres 48 timer 1,467682 3,97981 H 0 accepteres 72 timer 7,82713 3,97981 H 0 forkastes Tabel 1.2.: ANOVE test for neutrofilocytter Neutrofile F F-krit Resultat 24 timer 16,58989 3,979807 H 0 forkastes 48 timer 19,30794 3,979807 H 0 forkastes 72 timer 25,47436 3,979807 H 0 forkastes 14

Tabel 1.3.: ANOVA test for lymfocytter Lymfocytter F F-krit Resultat 24 timer 0,137994 3,979807 H 0 accepteres 48 timer 1,795047 3,979807 H 0 accepteres 72 timer 1,989889 3,979807 H 0 accepteres Tabel 1.4.: ANOVA test for monocytter Monocytter F F-krit Resultat 24 timer 5,558407 3,979807 H 0 forkastes 48 timer 28,57899 3,979807 H 0 forkastes 72 timer 100,7167 3,979807 H 0 forkastes Tabel 1.5.: ANOVA test for basofilocytter Basofile F F-krit Resultat 24 timer 0,83306 3,979807 H 0 accepteres 48 timer 0,091579 3,979807 H 0 accepteres 72 timer 2,246185 3,979807 H 0 accepteres Tabel 2 er fra en T-test: to stikprøver med forskellige varians. Hypotesen for T test. P>p-værdi: accepteres Ho. P < p værdi: Ho forkastes. 15

Tabel 2: T-test for eosinofilocytter Eosinofilocytter P-værdi fra T-test p=0,05 Resultat 0time - 24 timer 0,980774 0,05 H 0 accepteres 0 time - 48 timer 0,910023 0,05 H 0 accepteres 0 timer- 72 timer 0,87542 0,05 H 0 accepteres 24timer - 48 timer 0,890468 0,05 H 0 accepteres 24 timer- 72 timer 0,891998 0,05 H 0 accepteres 48 timer - 72 timer 0,796228 0,05 H 0 accepteres 16

Differencen til tiden 0 Differencen til tiden 0 Studienr. : 32110543 Dato 10-12-2013 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2-0,4-0,6 Differenceplot Neutrofilocytter øvre grense nedre grænse 24 48 0 20 40 60 80 72 Tid Fig.3 Viser differenceplot for neutrofilocytter. Y-aksen afbilleder koncentration af neutrofilocytter i forhold til X- aksen som viser tid 24 timer, 48 timer 72 timer. Der er afsat øvre og nedre acceptgrænser. 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0,2-0,3-0,4-0,5 Differenceplot Monocytter 0 20 40 60 80 Tid øvre grænse nedre grænse 24 48 72 Fig.4 Viser differenceplot for monocytter. Y-aksen afbilleder koncentration af monocytter i forhold til X- aksen som viser tid 24 timer, 48 timer 72 timer. Der er afsat øvre og nedre acceptgrænser. 17

0 time 24 timer 48 timer 72 timer Neutrofilocytter Lymfocytter Monocytter Eosinofilocytter Basofilocytter Fig.5 Illustrer morfologiske celleforandringer af de forskellige leukocyttyper igennem tiden fra 0 time til 72 timer. 18

Diskussion Leukocytter har forskellige leve tid i menneskellige krop fra få dage og op til knap 20 år (6). De produceres jævnlige i organismen, men når de udtages fra kroppen deres levevilkår samt levetid ændres. Formål med dette projekt var at undersøge om oplysninger fra producenten af automatisk hæmatologianalyse udstyr Sysmex. Producenten oplyser at XN-9000 kan udfører WBC og DIFF i op til 72 timer og analyseresultater er pålidelige og kan udgives som svar på analysen til rekvirenten. I projektet opsamlet forsøgsdata testet med statistiske teste for at se, om analyse resultat overskrider grænse på 5 % statistisk signifikant niveau i løbet 72 timer. Dette betyder at der vil ses på, om tiden har betydning for holdbarheden af prøvemateriale, dvs. kan de forskelige leukocytypper holde sig i op til 72 timer uden at ske meget ændringer i cellemorfologien og XN- 9000 kan ikke opdele dem i leukocyttyper. Prøverne var analyseret på automatisk hæmatologi analyse udstyr som afdeling har - Sysmex XN-9000 med integreret analysemoduler XN-10. Der er inddraget mikroskopi billeder af manuel DIFF lavet på CellaVision DM96 af 10 udvalgte patientprøve. Disse billeder anvendt for at se på morfologiske celleforandringer af forskellige leukocyttyper i løbet 72 timer og kunne sammenlignes med resultater fra de statistiske tester. Dette holdbarhedsforsøg designet på samme måde som er KBF OUH har til hverdag. Dette betyder at opsamling, analysering og opbevaring prøvemateriale til forsøg ens med afdelingsrutine. Prøvemateriale er fuldblod udtaget i EDTA-rør. EDTA-antikoagulant anbefalet til WBC og DIFF af International Council of Standardization in Haematology(ICSH)(13). Rådata (se bilag 6) opsamlet ved at prøvemateriale analyseres på forskellige XN-9000 integreret analyse moduler XN-10 (id.:11516 og 11467) som analysere ens(5). Rådata testet for normalfordeling og varianshomogenitet. Data var plotet i Probitplot, hvor kan aflæses at rådata er tilnærmelsesvis normalfordelt. Varianshomogenitet testet via F-test hvor kan aflæses at rådata varianshomogen for alle leukocyttyper, men ikke for eosinofilocytter. På bagrund resultater fra Probit plot og F-test testes rådata for signifikans niveau via to-faktor ANOVA uden gentagelser. Disse faktorer er patienter og tider. Eosinofilocytter testes via T-test, på grundt af at deres data ikke er varianshomogen. (se bilag 3) Analyseresultater fra tiden 0 betragtes som referenceområde i forsøget. 19

ANOVA og T-test giver information om signifikans mens Differenceplot giver information om analyseresultater afviger. For at se om resultater afviger opsættes øvre og nedre acceptgrænser på Differenceplotet, som beregnet ud fra værdi af standart deviation (SD). I projektet, anvendt SD værdier fra impræsicionsforsøg udført af KBF OUH i forbindelse med validering af XN-9000. Impræsicionsforsøg udført på flydende kontrolmateriale med kendt værdi, som er sande værdi2, for høj, middel og lav niveau. Kontrolmateriale var analyseret i løbet af 19 dage på XN-9000, hvor analyseresultater var opsamlet og statistisk testet (5). Alle udregninger, brugte formler og Differenceplot for hvert for leukocyttype og WBC kan ses i bilag 6. Anførte acceptgrænser giver information om, hvornår og hvor mange prøver afviger. ANOVA-test af analyseresultater vist, at overskridelse de 5% statistisk signifikant niveau ved 24-48-72 timer for neutrofilocytter og monocytter, mens lymfocytter og basofilocytter har ikke overskridt signifikans niveau. WBC vist at overskridelse sket ved 72 timer, mens 24-48timer ligger inden for de 5% signficans niveau. Eosinofilocytter testede med T-test vist, at ved 24-48-72 timer der er ikke overskrides de 5% signifikans niveau. Hvis overskrides de 5% statistisk signifikant niveau, tolkes dette, at tiden har signifikant betydning for holdbarheden af prøvemateriale, dvs. at der vil forventes forskel i analyseresultater, og vice verta. Forskel i analyseresultater skyldes at leukocytcellemorfologi forandrer sig meget med tiden og maskine kan ikke genkende dem for at opdele efter leukocyttyper og måle, eller de gå til grunde. Differenceplot afbillede hvornår man overskride acceptgrænser, men skal tages forbehold for biologisk variation, som ligger uden for acceptgrænser, ved aflæsning af plot. Differencerne på prøver vil koncentreres tæt på midten mellem øvre og nedre acceptgrænser. Der nogen enkelte prøver ligger uden for acceptgrænser, vil aflæses som afviger, men ikke som ligger udenfor 5% statistisk signifikant niveau. Afvigelse kan skyldes af biologisk variation, eller fejl, som vil undfanges, hvis forsøg blev designet andeledes eksempelvis udført dobbeltbestemmelse for hver enkelt prøver ved forskellige tidspunkter. Differencerne på 24-48-72 timer for WBC og DIFF var plottet i Differencensplot med acceptgrænser. WBC vist afvigelse af 2 prøver ved 24 timer, mens andre differenser var inden for acceptgrænser tæt koncentreret i midten. Efter 48 timer og 72 timer er 1 prøve, som afviger og ligger under nedre acceptgrænse. Koncentrationsspredning fra midten forskydes nedad og sprede sig mere ved 72 timer, men differencerne ligger inden for acceptgrænser. 20

Differenceplot for neutrofilocytter (se Fig.3) ved 24 timer, viser at 3 prøve ligger udenfor acceptgrænser, og koncentration af differenserne forskudt lidt oppe, tættere til øvre acceptgrænse. Forskydningstendens mod øvre acceptgrænser ses mere tydelig ved 48 timer og 72 timer. Plottet viser stigning af neutrofilocytkoncentration med tiden. Differenceplot for lymfocytter viser, at 1 prøve afvige ved 24 timer, men differencerne koncentreret pænt i midten mellem acceptgrænser. Par enkelte prøver afviger ved 48 timer og 72 timer. Differencernes koncentration spredes mellem acceptgrænser ved 48 timer og mere ved 72 timer. Forskydning af koncentration ses mod nedre acceptgrænse, dvs. lymfocytkoncentration i prøvemateriale falder med tiden. Differenceplot for monocytter ( se Fig. 4) viser at koncentration forskydes mod nedre acceptgrænse ved 24 timer, men alle differencerne ligger inden for acceptgrænser, udtage 1 prøve. Ved 48 timer ses kraftig koncentrationfald i monocytter langt under nedre acceptgrænser, som forsætter ved 72 timer. Dette tyder på at monocytkoncentration i prøvemateriale falder kraftigt med tiden, dvs. monocytter går til grunde. Eosinofilocytter på Differenceplottet viser at nogen enkelt prøve afviger mens andre ligger inden for acceptgrænser. Koncentrationen forskydes nedad go spredes mellem grænserne. Basofilocytter i Differenceplottet ligger jævnlig fordelt mellem øvre og nedre acceptgrænser i forløbet 24-48- 72 timer, men noget enkelt prøve er afviger. ANOVA-test og T-test viste at tiden har ikke signifikant betydning for holdbarheden af leukocytter, basofilocytter og eosinofilocytter, dvs. at der ikke forventes stort forskel i analyseresultater fra tiden 0 i op til 72 timer. Differenceplot for disse leukocyttyper vist afvigelse af noget enkelte prøver. Disse prøver kan afviger af forskellige årsager eksempelvis biologisk variation eller sygdomsforløb. Alle prøver udvalgt fra rutine, dvs. at det er patientprøver og er ikke fra raske mennesker. Det samme vedrører afvigende prøver ved WBC. ANOVA-test for neutrofilocytter og monocytter vist, at tiden har signifikant betydning for holdbarhed af disse typer i prøvematerialet, dvs. forventes forskel i analyseresultater med tiden. Differenceplottet for neutrofilocytter vist at koncentration stige med tiden mens, differenceplottet for monocytter vist at monocytkoncentration falde drastisk med tiden. Drastisk faldt i koncentration af monocytter kan forbindes med overskridelse af signifikans niveau i WBC ved 72 timer. 21

Monica E.de Baca at al.(14) udført forsøg hvor de vil se påvirkning af opbevaring prøvemateriale ved stuetemperatur på hæmatologiske parametre. De analyserede prøve på automatisk hæmatologianalyser Sysmex XE-2100(XE-2100). Deres holdbarhedsforsøg designet på følgende måde: analysemateriale taget fra rutine og er fuldblod udtaget i EDTA-rør. Hermed prøver både med normale værdier og abnorme værdier, som skyldes af forskellige hæmatologiske sygdommer. Prøvemateriale opbevaret ved stue temperatur gennem hele forsøg og analyseret en gang daglig i løbet af 5 dage. Rådata behandlet med kriterier der omfattede relativ procent og absolut nummer, dette betyder, at de vil se om analyseresultat forandre sig i løbet af tid både procentvis og talvis. Analyseresultater fra dag 0 anvendes som referencen i forsøget. Opsamlet forsøgsrådata bearbejdes og vist progressiv stigning i begge kriterier over tid, som startede allerede ved dag1, for neutrofilocytter. Progressivt fald i begge kriterier over tid, som startede allerede på dag 1, ses ved monocytter. Observeres fald for lymfocytter over tiden, som startede på dag 1, men dette fald er ikke progressiv, som ved monocytter. Eosinofilocytter vist relativ stabilitet, mens basofilocytter, som er mindste del af WBC, vist minimale forandringer. Alle resultater demonstreret grafisk i artiklen. På bagrund af observationer i databearbejdelse har de konkluderet, at WBC og DIFF kan ikke udføres på analysemateriale som er ældre end 1dag, fordi analyseresultater er ikke pålidelige. DIFF kan absolut ikke udføres på analysematerialet, som er 2 dage ældre og mere. Forsøgsdesign beskrevet i artiklen(14) har ligheder, med vores holdbarhedsforsøg af prøvemateriale, i at prøver udtaget fra rutine, opbevaret ved stuetemperatur og analyseret en gang daglig for WBC og DIFF i løbet mere end tre dage. Monica E.de Baca at al. fik samme resultater, som i vores holdbarhedsforsøg. Deres hæmatologiske analyseudstyr brugt til analysering af prøver er XE-2100 mens vores XN-9000, men både XE-2100 og XN-9000 analyseprincip er fluorescens flowcytometri anvendes til måling af WBC og DIFF. Carol Briggs at al.(15) har udført evaluering af Sysmex XN-9000 i forhold Sysmex XE-2100. Forsøget er en sammenlignins studie, som baseret på arbejdsgang i rutine, hvor prøverne analyseret på begge analyse apparater. Til denne sammenligningsstudie taget 390 prøve som var analyseret i rutine. 131 ad dem er normal, dvs. analysesvaret har været inden for reference område af bestemt laboratoriet, og resten med forskellige hematologiske sygdommer. Også var taget 1000 prøve på forskellige tidspunkter og ugedage for at imitere arbejdsgang i rutine. De undersøgt bland anden præcision, linearitet og stabilitet for forskellige parametre også for WBC og DIFF. For stabilitet undersøgelse prøverne opbevaret ved stuetemperatur og 4C. Prøverne opbevaret ved 4C, taget ud i 22

stuetemperatur og varmes ca.15 minutter inden analysering på analyseudstyret. Alle prøver var analyseret straks efter blodprøvetagning, disse analysesvar anvendt til reference for forsøget, og efter 24-48-72 timer. Carol Briggs at al. angiver ikke noget tal eller tydelig beskrivelse hvordan rådata bearbejdet, men i artiklens resultat afsnit om stabilitet for WBC og DIFF stå, at alle prøver var inden for præcisionsgrænse over for 72 timer (15). DIFF var suppleret med manuel DIFF af 400-celler. Jeg undrer mig over, at de ikke har nævnet præcisionsgrænser for DIFF og at de ikke angiver på hvilken måde rådata er bearbejdet, noget tal eller procent der kan bekræfte deres udtalelse om stabiliteten over for 72 timer. Deres fund, at XN-9000 er stabil i drift, bruger mindre prøvemateriale, hurtige og mere præcis arbejde i rutine. Analyseringstid er reduceret for 10% og udstrygninger til manuel DIFF reduceret mere end 49% i forhold til XE-2100. XN-9000 har godt sensitivitet, mere præcis og nøjagtig især ved lave celletal (15). I artiklen gjort tydelig at XN-9000 mere effektivt i rutine end XE-2100. Vores holdbarhedsforsøg vist stigning i neutrofilocytkoncentration over tiden. Dette kan, muligvis, skyldes, at XN-9000 forveksle en leukocyttype med anden leukocyttype, dvs. at cellemorfologi i leukocytterne forandre sig så meget med tiden at XN-9000 klassificerer dem forket. XN-9000 programmeret til at sammenligne forskellige celleparametre målt via fluorescen flow cytometry, og ud fra dem cellen identificeres og klassificeres efter typen, men den kan ikke måle om prøvematerialet er gammel til analyseudførelse. Cellensmorfologi forandre sig med tiden, den svulmer op, cellemembran brydes og kærneform ændres. Dette kan tydelige ses på billeder fra CellaVision, hvor præsenteret alle leukocyttyper over tiden fra 0 time og op til 72 timer (se bilag 7). XN-9000 bruger fluorescens flow cytometri til celleidentifikation og klassificering i leukocytter ud fra cellestørrelse, kærneform og cellenstæthed. Men hvis ske ændringer med cellekærne så analyseapparat kan fejidentificere og klassificere cellen. Koncentration af celler i analysematerialet falder med tiden, fordi det er naturlig levecyklus, cellen bliver dannet, modnet op og går til grunde med tiden. Forskellige leukocyttyper har forskelige levetid, derfor ses drastisk fald i monocytkoncentration og mere langsom koncentration fald ved andre leukocyttyper. Differenceplot for forskellige leukocyttyper viser, at der er mere eller mindre, spredning i leukocytkoncentration med tiden. Dette kan forklares af biologisk variation, fordi det er generelt at i noget blodprøve cellerne går til grunde hurtigere end i en anden blodprøve. Dette ses på leukocytbilleder fra CellaVision, hvis man se på de forskellige leukocyttyper som helhed, gennem 23

tid (se bilag 7). Der kan være forskellige årsager til det, eksempelvis patient i kemoterapi behandling. Ud fra vores forsøgsdesign vi kan se, at det vil være interessant undersøge holdbarheden med kortere mellemrum. Fordi leukocyttyper, som neutrofilocytter og monocytter, vist overskridelse af de 5% signifikans nuveaue allerede ved 24 timer. Kortere mellemrum i tiden vil mere præcisere hvornår overskridelse ske, om 6 timer eller 10 timer, eller muligvis 16 timer. Man kan lave dobbelt bestemmelse ved analysering af prøver, at minimerer mulighed for fejl. Producenten oplyser at analysemateriale kan opbevares både ved stuetemperatur og 4C, dette vil ikke påvirke analysen af prøver (9). Fatime Imeri at al. i artikel om stabilitet af analysemateriale (16), hvor de brugt blødprøver fra 64 raske voksne frivillige. Til forsøget var taget to rør med blodprøve fra hver af frivillige, en rør til opbevaring ved stue temperatur og anden rør ved 4C. Forsøgsformål er at undersøger holdbarhed af prøvemateriale ved forskellig opbevaringstemperatur i forhold til tid, 4-10-24-48-72 timer. Prøverne analyseret inden for 30 minutter efter blodprøvetagning. Prøverne var analyseret på forskellig automatisk hæmatologi apparater bland anden Sysmex XE-2100. Forsøg vist, at stabilitet af WBC ved rumtemperatur er indtil 24 timer, mens ved 4C indtil 72timer. DIFF stabilitet vist, at forskellige leukocyttyper udviser forskellige holdbarhedstid ved forskellige temperatur. Neutrofilocytter stabile indtil 72 timer ved begge temperaturforhold, monocytter stabile indtil 24 timer ved stuetemperatur og 48 timer ved 4C. Lymfocytter udvist stabilitet ved stuetemperatur indtil 24 timer mens ved 4C indtil 72 timer. Stabilitet beregnet i coefficient of variance (CV%). Ud fra det man kan konkluderer at det er sammenhæng mellem tid og temperatur samt stabilitet af analysematerialet (16). I artiklen beskrevet, at holdbarheden prøvemateriale er længere ved 4C, på bagrund af det finder jeg meget interessant undersøger holdbarheden af prøvemateriale til DIFF opbevaret både ved stuetemperatur og 4C, og analyseret på XN-9000. KBF OUH interesseret i at automatisk hæmatologiudstyr kunne udføre DIFF 24 timer af hensyn til efterbestillinger og praksisprøver(17). Dette vil nytte både økonomisk og patienten. Til daglig, blodprøverne fra praksis opsamles to gang i løbet af dagen og leveres til laboratorie. Patienter, der kommer efter anden gangs opsamling til læge bliver enten henvist til KBF s ambulatoriet eller tilkald igen for at blodprøve kan tages. Økonomisk set, parkteserendelæge modtage samme patient en ekstra gang, dette kræve tid og betaling til læge. Patienten skal tage fri fra arbejde for at 24

blodprøve tages, dette kræver tid og tab i en arbejdsdag. Men hvis man kunne udfører DIFF efter 24 timer, dette spare ekstra lægebesøg og fridag, som bliver til betalt arbejdsdag for patienten. Lægen kan modtage flere patienter, dvs. blive mere effektiv. Dette vil også nytte indlagte patienter, fordi hvis der kommer efterbestilling på deres blodprøve, behøve de ikke stikkes igen. Ekstra stik betyder rigtigt meget eksempelvis for patienter i kemobehandling, hvor deres immunforsvar er væsentlig nedsat og de modtagelige overfor forskellige infektioner. Udførelse DIFF på analysemateriale efter 24 timer vil medvirker på økonomisk besparelse og ressourcer forbrug uden negativ indvirkning på behandling af patienter. Konklusion På bagrund udført holdbarhedsforsøgs, statistiske databearbejdelse og observationer kan konkluderes, at prøvemateriale er ikke holdbart til udførelse af differentialtælling af leukocytter i op til 72 timer. Dette fordi WBC kan udføres i op til 48 timer og herefter overskrides grænse på 5% signifikansniveau i forhold 0 time. DIFF kan ikke udføres på analysemateriale efter 24 timer, fordi analyseresultat overskride grænse på 5% signifikansniveau i forhold til 0 time allerede ved 24 timer hos neutrofilocytter og monocytter. Perspektivering Afdelingspersonale oplyser, at nogen gang, prøver fra praksis kan være 24 timer efter bodprøvetagning og blive analyseret inden for 38 timer. På bagrund observationer og viden fra udført holdbarhedsforsøg vil jeg se at dette forsøg skal designes andeledes for at få mere præciseret pålideligt resultater. Her er min forslag på forsøgsdesign: prøverne analyseres straks, dvs. inden for to timer, efter blodprøvetagning med dobbeltbestemmelse. Til forsøget vil bruges prøverne, som analysesvar ligger inden for afdelings referencer og dem der udenfor afdelings referencer. Analysesvar fra time 0 vil anvendes som reference område for forsøget. Prøverne analyseres på XN-9000 ved 6-10- 14-18-22-26-30-34-38 timer efter blodprøvetagning med dobbeltbestemmelse på alle tidspunkter. Dobbeltbestemmelse for hver prøve ved alle tidspunkter vil minimerer 25

systematiske fejl og resultater vil være mere pålidelig. Analysemateriale vil opbevares en del ved stuetemperatur og anden del 4C. Prøve som opbevares ved 4C tages ud fra køleskabet ca.15 min før analysering, fordi dette skal opnår stuetemperatur for at blive analyseret på automatisk hæmatologiudstyr - Sysmex XN-9000. Dette kan suppleres med manuel DIFF på CellaVision af udvalgte prøver. Der kan man vurdere mere præcis holdbarhedstid af analysemateriale til DIFF, men dette er meget ressourcer krævende og tids krævende. 26

Referencer 1. Lyngbye J., Kjær A., Ladefoged S., Nissen P.H. Lyngbyes Laboratoriemedicin. 2.udg. Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck, 2010; 161-162 2. KBA, Midtjylland. 5.12.14 B-Leukocyttyper(differentialtælling). (Set 10-12-2013; tilgængelig på URL: http://e-dok.rm.dk/edok/d_hove_labkba.nsf/soegeview/a8a897d636db612ac12571430034e565 3. Brugervejledning XN-serien (til XN-9000 systemet), SYSMEX CORPORATION, April 2012; Kap.15.;459-460,465,467. 4. Bendsen, T. Nota i statistik., VIA University College Bioanalytikeruddannelsen, 2009-2013, (Set 10-12-2013; tilgængelig på URL: http://statnoter.biolyt.dk/) 5. Pedersen, L. Valideringsrapport for hæmatologiske analyser udført på Sysmex XN-9000., Version 1.0., 26-07-2013 6. Karle H, Birgins H. Hæmatologi,. 5 udgave.2 oplag ed. Special-Trykkeriet Viborg a-s: Munksgaard Danmark; 2008; 19-21,22,40,46. 7. Vyberg M., Patologi og farmakologi. 3 udgave 2 oplag. ed. Danmark: Munksgaard Danmark; 2011. p. 82. 8. Petersen, M.la Cour. Kompendium i generelle Analyseprincipper. Bioanalytikeruddannelse København, Maj 2009:96-95. 9. Sysmex Danmark. Generel produktinformation Sysmex. Maj 2012; 15-16,17,18. 10. Cooper, G. Basic Lessons in Laboratory Quality Control. Bio-Rad Laboratories. Inc., 2008; Kap.3; 21-29 (Set 10-12-2013, tilgængelig URL: http://www.qcnet.com/portals/50/pdfs/qcworkbook2008_jun08.pdf.) 11. Sysmex Corporation. The XbarM control program use it wisely. 2010.(Set 28-10-2013, tilgængelig på URL: http://www.sysmex.ru/files/articles/xtra_online_xbarm_en.pdf.) 12. Cellavision. Product Overvieu.(Set 19-11-2013, tilgængelig på URL: http://www.cellavision.com/?id=4112 ) 13. Recommendations of the International Council for Standardization in Haematology for Ethylenediaminetetraacetic Acid Anticoagulation of Blood for Blood Cell Counting and Sizing. International Council for Standardization in Haematology: Expert Panel on Cytometry. Am J Clin Pathol. 1993 Oct;100(4):371-2. 27

14. Baca, M.E, Gulati, G, Kocher W, Schwarting. Effects of storage of Blood at room Temperature on Hematologic Parameters Measured on Sysmex XE-2100. Am J LABMEDICINEA, 2006 Jan; 28-36 (Set 10-12-2013, tilgængelig URL: http://labmed.ascpjournals.org/content/37/1/28.full.pdf+html ). 15. Briggs, C., Longair, I., Kumar, P., Singh, D., Machin J, Samuel. Performance evaluation of the Sysmex haematology XN modular system. Am J Clin Pathol, 2012 Jyl; 1024-1027,1028.( Set 10-12-2013, tilgængelig URL: http://jcp.bmj.com/content/65/11/1024.abstract ) 16. Imeri, F., Herklotz, R., Risch, L., Arbetsleitner, C., Zerlauth, M., Risch, G.M., Huber, A. R. Stability of hematological analytes depends on the hematology analyser used: A stability study with Bayer Advia 120, Beckman Coulter LH 750 and Sysmex XE 2100. Am J ELSEVIER, 2008 Jul; 68-71.( Set 10-12-2013, tilgængelig URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0009898108003720 ) 17. Bekendtgørelse med henblik på frivillig forudgående gennemsigtighed - Tildeling af kontrakt uden forudgående offentliggørelse., 27-04-2012.( Set 10-12-2013, tilgængelig URL: http://ted.europa.eu/udl?uri=ted:notice:133758-2012:text:da:html&tabid=1:03/12/2013 ) Bilag 1 se usb-pind. Bilag 2 Bilag 3 se usb-pind. Bilag 4 Bilag 5 Bilag 6 se usb-pind. Bilag 7 se usb-pind. 28