Aminosyrer. onstyrke. Bufferkapacitet. Biologisk vigtige aminosyrer er af formen H 2 N CH(R) COOH, hvor sidekæden R f. eks. kan indeholde alifatiske grupper som methyl eller ethyl, eller den kan indeholde polære grupper som en alkoholgruppe. COOH-gruppen kan fraspalte en proton med en syrekonstant på omkring pk 2.3. Tillige indeholder molekylet en aminogruppe NH 2, der i lighed med ammoniak, NH 3, er en base. Den korresponderende syre for aminer en en alkyl-ammoniumion (i lighed med NH + 4 ), der er en svag syre typisk med syrekonstant på omkring pk 9.5. Den fuldt protonisere form af aminosyren er derfor H 3 N + CH(R) COOH, som tilegnes syrekonstanten pk 1 2.3. Herefter kan ph beregninger foretages som for en standard diprot syre H 2 B +, der dissocierer efter H 2 B + HB B. Da den første proton spalter af fra COOH-gruppen, bliver amfolytten HB = H 3 N + CH(R) COO. Dette er den form, som aminosyren H 2 N CH(R) COOH i det væsentlige har i vandig opløsning, idet COOH-gruppen i H 2 N CH(R) COOH vil afgive en proton til aminogruppen NH 2 under dannelse af amfoionen HB = H 3 N + CH(R) COO. Formen H 2 N CH(R) COOH findes kun i ganske ringe mængde i praksis, men der er tradition for at skrive aminosyrerne på denne form. Vi har H 3 N + CH(R) COOH H 3 N + CH(R) COO + H + K 1 (1) H 3 N + CH(R) COO H 2 N CH(R) COO + H + K 2 (2) Lad os kalde disse species H 2 B +, H + B og B ved opskrivning af ligevægtskonstanter. En opløsning af aminosyren er en opløsning af amfolytten H 3 N + CH(R) COO, der f. eks. har ph (pk 1 + pk 2 )/2 (2.3 + 9.5)/2 = 5.9. H 2 N CH(R) COOH kan sidegruppen R selv indeholde COOH eller NH 2 grupper. Man taler da om henholdsvis sure eller basiske aminosyrer. Som eksempel på en sur aminosyre har vi Asparaginsyre, hvor sidegruppen er R = CH 2 COOH. Syren er da en triprot syre med formerne H 3 B +, H 2 B, HB, B 2 svarende til H 3 N + CH(CH 2 COOH) COOH K 1 = 10 2.10 (3) H 3 N + CH(CH 2 COOH) COO K 2 = 10 3.86 (4) H 3 N + CH(CH 2 COO ) COO K 3 = 10 9.82 (5) H 2 N CH(CH 2 COO ) COO (6) Asparaginsyre er i vandig opløsning hovedsagelig på amfoionformen H 3 N + CH(CH 2 COOH) COO og den er dermed en amfolyt med ph (pk 1 + pk 2 )/2 = (2.10 + 3.86)/2 = 2.98. Et eksempel på en basisk aminosyre er Lysin, hvor R = (CH 2 ) 4 NH 2. Syren er da igen en triprot syre med formerne H 3 B 2+, H 2 B +, HB, B svarende til 1
H 3 N + CH((CH 2 ) 4 NH + 3 ) COOH K 1 = 10 2.18 (7) H 3 N + CH((CH 2 ) 4 NH + 3 ) COO K 2 = 10 8.95 (8) H 2 N CH((CH 2 ) 4 NH + 3 ) COO K 3 = 10 10.53 (9) H 2 N CH((CH 2 ) 4 NH 2 ) COO (10) og Lysin er amfoionen H 2 N CH((CH 2 ) 4 NH + 3 ) COO med ph (pk 2 + pk 3 )/2 = (8.95 + 10.53)/2 = 9.74. Titrering af aminosyrer følger reglerne for titrering af di- eller triprote syrer (baser). Med en neutral aminosyre som eksempel skal man imidlertid gøre sig klart, at den fuldt protoniserede form H 2 B + svarende til K 1 ikke er aminosyren selv, men fås fra denne ved tilsætning af et ekvivalent stærk syre som f. eks. HCl. Titrerer man direkte på aminosyren H + B med stærk base, er startpunktet ph for amfolytten H + B, svarende til 1. ekvivalenspunkt for en diprot syre. Sammenhæng mellem protonbinding til baser, kompleksdannelse og proteiners optagelse af ligander. Binding af ligander til et centralatom kendes fra kompleksdannelse i uorganisk kemi. Et eksempel er Cu 2+ der reagerer successivt med NH 3 under dannelse af Cu(NH 3 ) 2+, Cu(NH 3 ) 2+ 2, Cu(NH 3 ) 2+ 3 og Cu(NH 3 ) 2+ 4. Helt analogt kan makromolekyler som proteiner successivt binde små species som Ca 2+, glukose m.m.m. Et bestemt protein P kan ofte danne såkaldte oligomere, hvor f. eks. 4 P danner P 4. En sådan oligomer kan optage f. eks. Ca 2+ eller andre ligander L under dannelse af P 4 L, P 4 L 2, P 4 L 3 og P 4 L 4. Endelig falder sædvanlige syre-base ligevægte ind under den samme formalisme, der beskriver de ovennævnte processer. En diprot base B kan optage H + under dannelse af BH + og BH 2+ 2, hvor liganden altså er en proton. Traditionelt behandler man imidlertid syre-base ligevægte ud fra sidste trin (den diprote syre) og beskriver processerne som de tilhørende dissociationer af syreformerne, der også traditionelt betegnes som H 2 B 2+, HB + etc. Herved fås de velkendte syrekonstanter K 1 og K 2, der er massevirkningskonstanterne for processerne H 2 B 2+ HB + + H + K 1 (11) HB + B + H + K 2 (12) beskrivelsen med ligandoptagelse ville man i stedet have de omvendte ligevægte, og dermed også ligevægtskonstanter, der er de reciprokke af de ovenstående: B + H + HB + K = 1/K 2 (13) HB + + H + H 2 B 2+ K = 1/K 1 (14) 2
eksemplet ovenfor med oligomeren P 4 er det rimeligt (af symmetrigrunde) at forvente, at liganden kan sætte sig på 4 pladser med samme sandsynlighed. For simpelheds skyld betragter vi binding til en species M med 2 ens bindingssteder, så ligandoptagningen kan beskrives med processerne L + M LM K (15) M + L ML K (16) LM + L LML K (17) L + ML LML K V (18) Sådanne mikroskopiske ligevægtkonstanter er relaterede til makroskopiske konstanter som K og K. Hvis bindingsstederne for liganden er så langt fra hinanden, at de i praksis er uafhængige, kan vi sætte K = K = K = K V = K (19) For den makroskopiske proces L + M LM, hvor vi ikke skelner mellem, om liganden er bundet til den ene eller den anden ende af molekylet, får vi K = [LM] [M][L] = [LM ] + [ ML] = 2K (20) [M][L] K = [LML] [LM][L] = [LML] ([ ML] + [LM ])[L] [LML] = [LML]/K + [LML]/K = K (21) 2 For det specielle tilfælde, at M er en diprot base, hvor de to basegrupper sidder så langt fra hinanden, at protonoptagelsen i de to ender er uafhængige af hinanden, bliver ligning (13-14) ifølge (20-21) til K = 1/K 2 = 2K K = 1/K 1 = K/2 (23) og for de tilhørende syrekonstanter gælder da K 1 = 4K 2, en relation der er nogenlunde bekræftet for diprote organiske syrer af typen HOOC (CH 2 ) n COOH for voksende værdier af n For ligandbinding til oligomere proteiner med uafhængige bindingssteder vil der også ifølge ligning (20-21) gælde K = nk. Den første binding er altså af statistiske grunde større end den næste (der er flere bindingssteder for liganden i det første tilfælde). midlertid findes der proteiner, hvor de makroskopiske ligevægtskonstanter stiger med antal bundne ligander. Man taler da om kooperativ ligandbinding. Fænomenet kan forstås hvis oligomeren P 4 ikke binder liganden særligt godt, men dannelse af P 4 L vil ændre konformationen af den protomer P, som liganden binder til, dvs PL TL. Denne ændring kan medføre, at en eller flere af de øvrige protomerer ligeledes ændrer konformation til T-formen. Hvis denne form binder liganden bedre end P, har den første ligandbinding induceret en oligomer P i T j L, der optager L bedre end P 4 L, og resultatet kan blive bindingskonstanter, der stiger med antallet af bundne ligander (positiv kooperativitet). (22) 3
Appendix. Syrekonstanters afhængighed af ionstyrken Til semikvantitative beregninger er det ofte en tilstrækkelig god tilærmelse at antage, at ligevægtskonstanter som syrekonstanter er uafhængige af species, der ikke indgår i ligevægten. midlertid er dette en tilnærmelse, og det kan vises, at ligevægte, der indeholder ioner ofte er påvirkelige af den såkaldte ionstyrke, der ikke blot indeholder koncentrationer af ligevægtens egne ioner, men også fra andre ioner. Hvis man ud fra en titrerkurve forsøger at bestemme pk a er det ofte nødvendigt at korrigere for ionstyrkens afvigelse fra nul. Da ionstyrken baseret på systemets egne ioner ændrer sig som titreringen skrider frem, er det ofte hensigtsmæssigt fra starten at tilsætte et fremmed salt i væsentlig koncentration, og derved forholdsvis høj ionstyrke, der så procentisk ikke ændrer sig så meget under titreringen. De fundne pk s er bliver da bestemt ved denne ionstyrke, og de må derpå korrigeres til ionstyrke nul, som er de værdier, man finder i tabeller (pk a ). Man finder pk a = pk s + η (24) (se appendix), hvor korrektionen η kan udregnes for en række syrer ved en bestemt ionstyrke, f. eks. 0.1. Aktivitetskoefficienter og ionstyrke. Definitionen af ionstyrke er = 1 c i z 2 i 2 i (25) hvor c i er koncentrationen og z i er ladningen af den i-te ionart. Summationen går over samtlige ioner i opløsningen. Hvis vi skelner mellem syrekonstanten K a beregnet ud fra thermodynamiske data, og syrekonstanten givet ved koncentration, partialtryk etc, K s gælder K a = a(h+ )a(b) a(s)a(h 2 O) (26) hvor aktiviteterne af de forskellige species indgår. Vi vil sætte a(h 2 O) = x(h 2 O) 1 i det følgende. Aktiviteterne af syren og basen kan med tilnærmelse sættes til koncentrationerne af disse, men alment er a i = c i γ i, hvor aktivitetskoefficienten γ i kan afvige fra een. Specielt for ioner gælder, at γ i kan falde til under 0.5 for ionstyrker af størrelsesorden 0.1 M, med andre ord en betydelig korrektion. 4
Vi vil antage at aktivitetskoefficienterne er nær 1 for alle uladede molekyler og at aktivitetskoefficienterne for ladede molekyler kan beregnes udfra den udvidede Debye-Hückel formel log γ i = Az 2 i (27) 1 + B i hvor er ionstyrken og A har værdien 0.509 M 1 2 ved 25 C. Op til ionstyrker på ca 0.1 M kan man ofte med tilstrækkelig tilnærmelse lade B i være uafhængig af den specifikke ion. B = 1M 1 2 er her en god fællesværdi og formlen kaldes med denne værdi for Güntelbergs formel. denne approksimation afhænger aktivitetskoefficienten kun af ionladningen og ionstyrken og er iøvrigt uafhængig af ionens art. Da det målte ph ikke er log[h + ], men loga(h + ), har vi a(h + a(s) ) = K a a(b) = K [s]γ s a (28) [b]γ b Når vi anvender bufferligningen på formen ph = pk s + log(c b /C s ) er ( ) γ s pk s = log K a = pk a + Az 2 s γ b 1 + Az2 b 1 + (29) = pk a + 0.509 1 + (z2 s z 2 b) (30) Eksempel: For syre-base parret HB, B 2 og en ionstyrke på 0.1 finder vi korrektionsleddet 0.1 0.509 1 + (z2 s z2 b ) = 0.509 1 + (1 4) = 0.367 (31) 0.1 Vi har da, at der til den målte pk s skal adderes 0.367 for at få en værdi for pk a, der kan sammenlignes med tabelværdier. øvelsen tilsættes en opløsning af 0.1 M KCl før titreringerne for at opnå en nogenlunde konstant ionstyrke på 0.1, og korrektionsværdien η i pk a = pk s + 0.509 1 + (z2 b z 2 s) (32) = pk s + η (33) kan da udregnes for en række syre-base par til at give resultatet i tabel 1. Species z s z b η HB + 1 0-0.122 HB 0-1 0.122 HB -1-2 0.367 HB 2-2 -3 0.611 H 2 B + 1 0-0.122 H 2 B 0-1 0.122 H 2 B -1-2 0.367 H 3 B 2+ 2 1-0.367 H 3 B + 1 0-0.122 H 3 B 0-1 0.122 5
Bufferkapacitet Til sidst skal vi nævne begrebet bufferkapacitet. Titrerer man en svag syre med stærk base vil ph ikke variere så meget nær pk a for syren, medens der modsat kan forventes en betydelig ændring i ph nær ekvivalenspunktet. Hældningen af kurven ph mod ml tilsat base, dph/dv sb er derfor lille, hvor systemet bufrer mest. Et mål for systemets evne til at holde ph konstant er derfor den reciprokke værdi dv sb /dph. Traditionelt definerer man bufferkapaciteten β = dc sb dph (34) hvor C sb = n sb /V opl = c sb V sb /V opl. den traditionelle udledning antager man nu, at det tilsatte volumen er lille i forhold til det oprindelige volumen, dvs at V opl V o. β bliver derved proportional med dv sb /dph. β er størst i nærheden af ph pk a, hvor vi kan anvende bufferligningen. Vi har C sb C b C sb ph = pk a + log n b = pk a + log (35) n s C 0 C sb hvor C 0 er antal mol af den svage syre ved titreringens start divideret med det aktuelle volumen. Som nævnt ovenfor antages det, at C 0 er konstant. Anvender vi ln(x) = ln(10) log(x) =2.303 log(x), kan vi skrive bufferligningen ph = pk a + 1 ( ) 2.303 ln C sb C 0 C sb (36) = pk a + 1 2.303 ln C sb 1 2.303 ln (C 0 C sb ) (37) Differentierer vi ph i ligning (37) med hensyn til C sb (idet dln(x)/dx = 1/x), får vi 2.303 dph = 1 1 + dc sb C sb (C 0 C sb ) (38) midlertid har vi C sb = C b og C 0 C sb = C s for den svage syrers koncentrationer, så ligning (38) kan skrives ( dph 1 = 2.303 + dc sb C b 1 C 0 C b og dermed den søgte reciprokke værdi ) = 2.303 C 0 C 0 C b C 0 C s (39) β = dc sb /dph = C 0 2.303 x bx s (40) hvor vi har indført basebrøken og syrebrøken for den svage syre. Disse kan udtrykkes ved syrekonstanten og ph: 6
Vi har K a = [H + ][b]/[s] der kan omskrives til K a /[H + ] = [b]/[s] hvoraf x b = [b] [s] + [b] = På samme måde vises, at x s = 1 x b = K a [H + ] + K a (41) [H + ] [H + ] + K a (42) ndsættes dette i ligning (40) fås endelig β = C ( ) ( 0 K a [H + ) ] = C 0 [H + ]/K a (43) 2.303 [H + ] + K a [H + ] + K a 2.303 ([H + ]/K a + 1) 2 Bufferkapaciteten er dermed proportional med den svage syres totalkoncentration, og afhænger af [H + ]/K a der kan skrives [H + ] K a = 10 pka ph (44) β er derfor en funktion af afstanden mellem pk a og ph. For en polyprot syre eller en blanding af flere syrer kan det vises, at bufferkapaciteten bliver en sum af de enkelte systemers bufferkapacitet. For en polyprot syre vil det ofte være en god tilnærmelse kun at tage hensyn til det dissociationstrin, hvor ph ligger tættest på pk a. 7