Sund stivelse, vegetabilsk vingummi og spiselig plastik

Sund stivelse, vegetabilsk vingummi og spiselig plastik Stivelse er det vigtigste energidepot i planter og udgør også den største energikilde i menneskers kost. Ny viden om de enzymer, som danner og reorganiserer stivelse i planter, gør det muligt at fremstille stivelse, som ikke feder, og stivelsesbaserede bionedbrydelige materialer, der kan erstatte fossilbaseret plastik. Af Andreas Blennow og Inga C. Bach, Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet Planter lagrer solenergi i form af stivelse for at sikre energiforsyning på både kort og lang sigt. Når fotosyntesen er aktiv om dagen dannes et midlertidigt lager af stivelse (såkaldt transitorisk stivelse) i bladenes grønkorn (kloroplaster). En del af denne stivelse forbrændes allerede den efterfølgende nat og leverer energi til vækst og vedligeholdelse af plantens væv. Langsigtet oplagring af solenergi sker ofte som et led i planternes formeringsstrategi. Store mængder oplagringsstivelse lagres f.eks. i kartoflernes knolde og i frøhviden i kornplanters kerner. Her dannes i stivelseskorn i en særlig type organeller, som kaldes amyloplaster. Amyloplaster minder om kloroplaster og er dannet ud fra proplastider ligegesom kloroplaster, men de er specialiserede til lagring af stivelse og indeholder ikke klorofyl. Når kartoffelknolden eller kornkernen spirer, nedbrydes stivelsen, og den oplagrede energi frigives. Stivelse fungerer dermed som energiforsyning for spirende planter, der endnu ikke har blade nok til at skaffe energi via fotosyntese. Stivelsesholdige organer som rod- og stængelknolde, frugter eller frø fra planter har i årtusinder været blandt menneskets vigtigste næringsmidler. Menneskets påvirkning af planterne via selektion og dyrkning af udvalgte planter med veludviklede spiselige organer har Figur 1. Bananer indeholder meget stivelse. Foto: Ole Søgaard Lund medført, at kulturplanter oftest danner større lagerorganer og producerer mere stivelse end deres vilde forfædre. Stivelsesholdige planteorganer har forsynet klodens befolkning med basisfødevarer i årtusinder, men pga. fedmeepidemiens fremmarch, diskuteres det, hvor godt det er for menneskers helbred, at en meget stor del af kalorieindtaget stammer fra stivelse. I moderne tid er der fundet en lang række nye 1

anvendelser for stivelse, som er en stadigt vigtigere råvare i både fødevareindustrien og den kemiske industri. Til disse formål skal stivelsen have specielt designede kemisk strukturer. Det kan opnås ved kemisk eller fysisk modificering af stivelsen, men nu prøver man på at udvikle alternative metoder, som er både mere effektive og mere miljørigtige. Dels udvikles metoder til enzymatisk modifikation af de former for stivelse, som planter normalt producerer. Dels forsøger man at ændre biosyntesen af stivelse direkte i planterne. Stivelse i fødevarer ernæring og sundhed Stivelse er uhyre udbredt i fødevarer og udgør størstedelen af energiindholdet i basisfødevarer som ris, majs og hvede samt kartofler og kassava. På grund af fattigdom får befolkningen i mange ulande meget lidt kød og få grønsager. Kosten består hovedsageligt af en eller flere stivelsesrige basisfødevarer, og næsten hele kalorieindtaget stammer fra stivelse. Man får den nødvendige energi, men den ensidige kost er uheldig, og mangel på vitaminer og mineraler er meget udbredt. I den rige del af Verden associeres et stort indtag af stivelse med andre helbredsmæssige problemer. I følge Statens Institut for Folkesundhed er omkring 600.000 danskere svært overvægtige. Der er sket en fordobling af antallet af fede danskere siden 1994 og mange lider af fedmerelaterede livsstilssygdomme med tab af livskvalitet og store samfundsmæssige omkostninger til følge. I en del år har der været fokus på fedt i kosten, og et væld af lightprodukter er i dag på markedet. Alligevel øges antallet af overvægtige, og kulhydrater især sukker og stivelse i kosten har fået en del af skylden. Indtag af store mængder stivelse kan medføre udsving i blodets indhold af glukose, præcis som ved indtag af rent sukker. Sådanne udsving er i nogle undersøgelser blevet associeret med øget risiko for at udvikle bl.a. type-2- diabetes og hjertekarsygdomme. Nogle ernæringsforskere mener desuden, at også appetitreguleringen påvirkes, og at store udsving i blodsukkerniveauet kan føre til dårlig appetitregulering og overvægt. Der findes imidlertid mange forskellige typer af stivelse (Faktaboks 1), og der er stor forskel på, hvordan de nedbrydes og optages i mave-tarmsystemet. I de fleste forarbejdede fødevarer findes stivelsen i en meget lettilgængelig form. Andre fødevarer, for eksempel rå grønsager og frugt, især bananer, har såkaldt resistent stivelse. Resistent stivelse nedbrydes kun i beskedent omfang af de enzymer, som findes i mund, mavesæk og tyndtarm. Det nedbrydes først i tyktarmen, hvor det ernærer mikrofloraen og ikke mennesket. Denne form for stivelse Faktaboks 1. Stivelseskorn Stivelse er et polysakkarid, der fortrinsvis består af lange kæder af glukose. Stivelsesmolekyler er blandt naturens største molekyler, og et enkelt molekyle kan indeholde flere millioner glukoseenheder. De lange glukosekæder kan være mere eller mindre forgrenede. Stivelsesmolekyler med få eller ingen forgreninger kaldes amylose, mens forgrenede molekyler kaldes amylopektin. I planter lagres stivelsen i stivelseskorn, hvor glukosekæderne er mere eller mindre tæt pakket. Amylopektin kan danne dobbelthelixer, som ordner sig i koncentriske krystallinske lag i stivelseskornene, og amylose lægger sig ind imellem de krystallinske amylopektinlag. I nogle plantearter indeholder stivelsen fosfat, som sidder bundet til glukosen. Kartoffelstivelse indeholder meget fosfat, mens majsstivelse er næsten helt fri for fosfat. Stivelse, som indeholder meget fosfat, er ikke pakket så tæt som stivelse uden fosfat. Det er fortrinsvis den fysiske pakning af stivelseskæderne, der er afgørende for, om stivelsen er resistent eller letnedbrydelig, men stivelsens kemiske struktur, dvs. forgreningsgrad og molekylevægt, har også betydning. Meget tæt pakket stivelse (rå stivelse i de naturlige stivelseskorn eller re-krystalliseret stivelse) er resistent mod nedbrydning. I varm vandig opslemning opløses de krystallinske strukturer i stivelseskornene, og stivelseskæderne danner en geleagtig substans og bliver lettilgængelige for nedbrydende enzymer. Rå stivelseskorn fra kartoffel set i almindeligt lys (tv) og med polariseret lys (th). I almindeligt lys ses de koncentriske krystallinske lag. I polariseret lys ses de såkaldte malteserkors, hvoraf man kan udlede, at stivelseskæderne er rettet radialt fra udgangspunktet til overfladen. 2

har således en effekt svarende til opløselige kostfibre, idet den ikke øger blodsukkeret, ikke feder og beskytter mod f. eks. type 2 diabetes, tyktarmsbetændelse og kræft. I fødevareindustrien bruges modificeret stivelse i vid udstrækning som emulgatorer, så man kan få vand og fedt til at forblive sammen. Særligt designet stivelse tilsættes f.eks. for at give fedtfattige produkter en passende konsistens. Stivelse, der er modificeret for at øge processtabilitet og for at generere en specifik funktionalitet, er en velkendt ingrediens i mange fødevarer. Nogle af disse modificeringer er beskrevet herunder. Stivelse kan også erstatte visse animalske produkter. I dag bruges gelatine, som er udvundet af hud og bindevæv fra grise til at give en passende konsistens i vingummi mv. For eksempel kan man bruge modificeret stivelse til at stivne slik. For at give den rigtige konsistens behandles stivelsen med amylomaltase, et enzym som flytter stivelseskæderne rundt i molekylet. Efter denne behandling kan stivelsen danne en gel, som smelter i munden, præcis som gelatine. Stivelse som råstof i industrien I papirindustrien har stivelse i høj grad erstattet oliebaserede og potentielt miljøskadelige kemikalier, som tidligere blev brugt til fremstilling af glittet papir. Man er også begyndt at bruge stivelse til fremstilling af biologisk nedbrydelig emballage. Stivelse fra planter bruges også i medicinalindustrien bl.a. til overtrækning af piller. Stivelse er en polymer, som har mange egenskaber tilfælles med polymerer eller plastik, som er produceret ud fra mineralolie. Med særlige stivelsestyper som råstof, kan der dannes plastlignende materialer, hvor stivelsen bliver gummiagtig og gennemsigtig, når den er varm, og meget hård, når den er kold. For at give produktet de ønskede egenskaber tilsættes ofte stoffer, såkaldte blødgørere, som gør polymeren bøjelig. Både sukker og glycerol kan fungere som blødgørere, men stivelsens struktur er også vigtig. Vi kan nu producere kartofler med stivelse, der har meget lange sukkerkæder og meget fosfat på disse kæder. Denne type af stivelse kan blødgøre sig selv og danner temmelig hårde og komposterbare materialer. Og så kan den stadigvæk spises. Stivelsens fysiske og kemiske egenskaber Forholdet mellem amylose og amylopektin samt mængden af fosfat har stor betydning for stivelsens fysiske egenskaber. De former for stivelse, som planterne danner, har sjældent præcis de egenskaber, som efterspørges i industrien. For at gøre plantestivelsen egnet til specifikke formål, ændres stivelsens struktur derfor ved hjælp af fysiske og kemiske processer. Stivelse, der er opløselig i koldt vand, kan fås ved fysisk modificering f eks. pregelatinisering, hvor stivelsen gelatiniseres ved opvarmning og derefter spraytørres. Nogle typiske kemiske modifikationer er oxidering, delvis nedbrydning ved syrefortyndning, kemisk inducerede krydsbindninger eller påsætning af acetylgrupper eller hydroxygrupper. Modificering af stivelse med enzymer Kemisk og fysisk modificering af stivelse kræver meget energi og ofte er den industrielle proces ikke miljøvenlig. For at kunne fremstille miljøvenlige former for modificeret stivelse til nye, nyttige formål forskes der i at modificere plantestivelse ved hjælp af enzymer frem for kemikalier. Man kender en lang række enzymer fra mikroorganismer eller dyr, som kan klippe stivelsens glukosekæder i mindre stykker, og man kender også enzymer, der kan flytte rundt på kæderne eller lave nogle af de ændringer som efterspørges. De mikrobielle enzymer er dog langt fra tilstækkelige. Da planternes stivelseskorn er meget kompakte, kan disse enzymer kun ændre de yderste molekyler i et stivelsekorn. Et vigtigt trin tidligt i processen er derfor en ændring af stivelseskornenes pakning. Hidtil har man hverken fundet mikrobielle eller animalske enzymer, som kan åbne stivelseskornene effektivt. I industrien er man derfor nødt til at varme stivelsen op og køle den ned igen før videre processering. For få år siden blev det påvist, at pakningen af stivelseskornene i planters frø, blade og lagerorganer ændres ved, at der sættes fosfatgrupper på glukosekæderne. Det blev også påvist, at denne fosforylering er nødvendig for effektiv nedbrydning af stivelseskornene. En lang række enzymer medvirker til nedbrydning af stivelse i spirende frø eller knolde, eller når planter er i mørke og behøver energi. De lange kæder af glukose klippes over af hydrolytiske enzymer (amylaser) og bliver til sidst fordøjet til glukose, som skal fosforyleres for at kunne gå videre i metabolismen. Plantens egne enzymer kan komme til at spille en stor rolle for udvikling af miljøvenlige metoder til fremstilling af modificeret stivelse, og man har derfor ledt efter enzymer, som har disse funktioner i planten. Som beskrevet er der ofte behov for at tilføre ekstra fosfatgrupper til stivelsen. Stivelsen bliver meget fosforyleret lige før, den skal nedbrydes i planten, og vi er nu i gang med at identificere og karakterisere de enzymer, som modificerer stivelsen i levende planter. Vi har karakteriseret enzymet AtGWD3 fra modelplanten Arabidopsis (Faktaboks 2). Dette enzym sætter fosfatgrupper på stivelsen i starten af nedbrydningen af et stivelseskorn og sørger for, at den krystallinske struktur brydes op. Derefter kan amylaser hydrolysere stivelsen, og fosfataser kan fjerne fosfatgrupperne. Modificerede planter Enzymatisk modifikation af stivelse ventes at erstatte mange af de kemiske processer, som anvendes i dag. En anden strategi er at ændre på biosyntesen af planternes stivelse, så de producerer netop de former for stivelse som efterspørges af industrien. Vi kender en del af de enzymer, som medvirker til biosyntesen af stivelse i planter, og ved at 3

Faktaboks 2. Identifikation og karakterisering af et planteenzym til modifikation af stivelse En type planteenzymer ved navn glukan vand dikinase (på engelsk glucan, water dikinase, GWD), som kan fosforylere stivelse i planter, er nu blevet identificeret. Vi har sammenlignet et GWD-enzym fra kartoffel og tre forskellige varianter af GWD fra modelplanten Arabidopsis thaliana (gåsemad). GWD-enzymerne består af to underenheder (subunits) og indeholder bl.a. et domæne, som binder til stivelse. Vi har karakteriseret GWD enzymet AtGWD3 fra Arabidopsis i detaljer. CBM20, et stivelsesbindende domæne GWD enzymets binding til stivelse er vigtig for funktionen, fordi de reaktioner, som foretages, sker netop på stivelseskornet. Derfor har enzymet et domæne, som får enzymet til at binde til stivelsen. På baggrund af DNA-sekvensen, som koder for det stivelsesbindende domæne i AtGWD3 fra Arabidopsis, regnes dette domæne for at høre til en særlig type (en familie) af stivelsebindende domæner, som kaldes CBM20 (på engelsk Carbohydrate Binding Module 20). Stivelsesbindende domæner af denne type findes i mange mikrobiologiske enzymer, som nedbryder stivelse, men det er første gang, at et CBM20 domæne er fundet i planter. De mikrobielle CBM20 findes i enzymer, som udskilles fra bakterien for at nedbryde stivelse i miljøet og derved danne sukker, som bakterien bruger som energikilde. Transport til cellens grønkorn GWD enzymet fra kartoffel og to af de tre GWD enzymer fra Arabidopsis har en kort aminosyresekvens, et transitpeptid, som får proteinet til at vandre til cellens kloroplaster, hvor de sukkermolekyler, som dannes ved fotosyntesen omdannes til stivelse. For at verificere at transitpeptidet får enzymet til at vandre ind i kloroplasterne, fremstillede vi en variant af enzymet med en fluorescerence del (YFP), som er en variant af green fluorescent protein (GFP). Dette protein kunne tydeligt lokaliseres i plantecellens kloroplaster, og samtidig kunne det bekræftes at enzymets bindes til overfladen af stivelseskornene. Til venstre ses fluorescens fra klorofyl i grønkornene, i midten fluorescens fra YFP, som via det stivelsesbindende domæne fra AtGWD3 er bundet til stivelseskornene. Til højre ses fluorescens fra både klorofyl og YFP. Bar = 10 μmeter. CBM20 fra Arabidopsis udtrykt i bakterie Vi udtrykte den DNA-sekvens, der koder for CBM20 domænet fra AtGWD3, i bakterien Escherichia coli. Det gjorde det muligt at sammenligne CBM20 domænet fra planten med de kendte CBM20 domæner fra mikroorganismer. De mikrobielle CBM20 domæner er karakteriseret ved, at de bindes meget hårdt til stivelse. Karakterisering af det tilsvarende CBM20 domæne fra AtGWD3 viser, at CBM20 fra planten har en meget svagere binding til stivelse end de tilsvarende mikrobielle CBM20 domæner. Enzymer med lav affinitet for substratet er mere dynamiske end enzymer, som har domæner med høj affinitet for et specifikt bindingssted. De kan nemmere flytte rundt i cellen og binde til forskellige steder, hvor der er behov for reaktioner. Udformningen af CBM20 domænet i plantens enzym har derfor stor biologisk betydning. En computermodel af CBM20 Med molekylemodellering i computeren har vi fundet en strukturel forskel mellem CBM20 domænet fra Arabidopsis og CBM20 domænerne fra mikroorganismer. Domænet har to bindingssites og i det ene site, site 2, mangler dele af et loop. Vi er nu ved at undersøge, om det er denne forskel, som er årsagen til, at CBM20 domænet fra planter har en lavere affinitet for stivelse. Vi vil også undersøge om CBM20 domænerne i planternes enzymer kan bruges til at forbedre de mikrobielle enzymer, som bruges i industrien. For eksempel til fremstilling af bioethanol er der behov for enzymer med forskellig affinitet til forskellige stivelser, så stivelsen kan nedbrydes hurtigt og effektivet. Molekylemodeller af CBM20 domænet fra enzymet glukoamylase i svampen Aspergillus niger (blå) og CBM20 domænet fra GWD3 i fra Arabidopsis thaliana (grøn). Modellerne er lavet med NMR (nuclear magnetic resonance). Strukturerne er meget ens, men i det øvre venstre hjørn (Y556 og W 115) mangler en del af et loop. Denne forskel er muligvis årsag til at CBM20 fra planten har lavere affinitet for stivelse end CBM20 fra mikroorganismer. Illustrationer i denne faktabboks er fra Christiansen C, Abou Hachem M, Glaring MA, Viksø-Nielsen A, Sigurskjold BW, Svensson B, Blennow A (2009). A CBM20 low-affinity starch-binding domain from glucan, water dikinase. FEBS Letters 583:1159-1163. 4

ændre på disse enzymers aktivitet i planterne, kan man få planterne til at producere stivelse med nye egenskaber. Enzymerne SS1-SS4 er stivelsessyntaser som forlænger stivelseskæderne i amylopektin. Når disse gener nedreguleres ændres forholdet mellem amylose og amylopektin, så der dannes relativt mere amylopektin. F.eks. er det vist. at en knockout mutant i byg resulterer i amylopektin med kortere kæder og mere amylose. GBSS (Granule Bound Starch Synthase) er også en stivelsessyntase, men dette enzym danner udelukkende amylose (som ikke er forgrenet). GBSS bindes til stivelseskorn. Hvis genet, der koder for GBSS inaktiveres, dannes der amylopektin, men ingen amylose. Der findes naturligt opståede eller inducerede mutationer i GBSSgenerne hos mange afgrødearter, f.eks. ris, majs, hvede og byg. Når stivelsen kun består af amylopektin, bliver den mere klæbrig ved kogning, end når stivelsen er en blanding af amylose og amylopektin. Korntyper med denne mutation betegnes Waxy fordi kernens frøhvide ligner voks. For polyploide arter som hvede (hexaploid) og kartoffel (tetraploid) skal alle kopier af genet inaktiveres for at få fuld effekt. Det er vanskeligt at opnå ved mutation, så i stedet kan man nedregulere alle de homologe gener på samme tid ved at indsætte en kopi af et GBSS-gen i omvendt orientering (antisense). På LIFE har vi lavet en GBSSantisense kartoffel, som næsten kun danner amylopektin. Denne egenskab er meget attraktiv for industrien, og en amylopektin-kartoffel, som er udviklet af BASF, er nu på vej mod markedsføring. SBE1 og SBE2 (Starch Branching Enzyme) er forgreningsenzymer, som laver forgreningspunkter i amylopektin. Hvis disse gener nedreguleres, dannes amylopektin med lange kæder. Danisco Biotechnology lavede en kombineret SBE1/SBE2-antisense-kartoffel for år tilbage, men pga. den generelle modvilje mod brug af genetisk modificerede planter i Europa, opgav de projektet. Vi bruger nu denne kartoffel i forskningen. BASF har siden lavet en tilsvarende kartoffel. Isa1 og Isa3 er isoamylaser, som kløver fejlagtigt placerede forgreningspunkter i stivelseskornet. Mutationer i disse gener i majs medfører, at der ophobes mere sukrose i kernerne end normalt. Supersøde hybridmajs, som er homozygotiske med hensyn til de muterede Isa-gener, har været på markedet i en del år. Mutationerne er formentligt induceret med enten kemikalier eller bestråling, men da disse metoder regnes som konventionelle forædlingsmetoder, er forædlingsfirmaerne ikke forpligtet til at oplyse, hvordan de supersøde majssorter er lavet. GWD1-GWD3 er tre glukan, vand dikinaser, som fosforylerer stivelsen. Vi har påvist, at dette enzym er tæt bundet til stivelsen ved hjælp af et særligt domæne (Faktaboks 2). Ved antisense-nedregulering af GWD1, er der meget lidt fosfat i stivelsen. Ved at indsætte en ekstra kopi af det gen, som koder for GWD1 i kartoffel, har vi påvist, at det er muligt at ved at få kartoffelplanter til at lave en hyperfosforyleret stivelse, der egner sig til at lave bioplastik. Fremtidig forskning Mange af de enzymer, der er involveret i biosyntesen af amylose og amylopektin i planer er nu identificeret og karakteriseret, men vi ved stadigvæk ikke, hvordan selve stivelseskornet dannes i planten. Vi kan se at et stivelseskorn har et specifikt udgangspunkt, hvorfra der dannes koncentriske ringe, men ingen har hidtil kunnet lave stivelseskorn i et reagensglas. Et af vores mål er at finde ud af, hvordan stivelsesmolekylerne organiserer sig selv under dannelsen af et stivelseskorn. For at komme videre med forskningen, er det vigtigt, at der laves indsatser på tværs af videnskabelige discipliner, og at forskere med ekspertiser indenfor bioteknologi, fysik og kemi samarbejder. Stivelse laves i planten for at forsyne denne med langtidsenergi. Vi bruger også primært stivelse som energi i form af fødevarer, men sundhedsfremmende fødevareingredienser vinder også indpas. I fremtiden ventes stivelse at blive en endnu vigtigere råvare i industrien end i dag. Stivelse kan produceres i meget store mængder, og det bør i langt højere grad end nu anvendes til intelligent og bæredygtig produktion af materialer, der i dag fremstilles af fossil olie. Med peak oil i sigte og et mål om at reducere udslippet af drivhusgasser vil der være et enormt behov for velstrukturerede materialer i store mængder. Til det formål vil stivelse være en meget værdifuld råvare. Vores forskning i stivelse kan også anvendes til formål, som ikke har ret meget med selve stivelsen at gøre. De stivelsesbindende domæner, som findes i nogle planteenzymer (Faktaboks 2) kan bruges, når man ønsker at bruge planter som produktionsorganisme for bestemte proteiner, f.eks. til medicinske formål. Ved hjælp af et et transitpeptid kan proteinet transporteres ind til amyloplasten, og ved hjælp af et stivelsesbindende domæne kan proteinet lokaliseres til stivelseskornene. Oprensning af proteinet vil dermed være nemmere, end hvis det findes sammen med plantens egne proteiner, da det er meget nemt at oprense stivelseskorn. Om forfatterne Inga C. Bach er hortonom fra Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet (KU-LIFE, Tidl. Den Kgl. Veterinær og Landbohøjskole) og ph.d. i planteforædling og bioteknologi. Hun er skrivende redaktør på Planteforskning. dk og er desuden ansat som kommunikationsmedarbejder ved Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, KU-LIFE. Andreas Blennow er master i bioteknologi fra Lunds Universitet og har en ph.d.-grad i biokemi fra samme sted. Han er lektor ved Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, KU-LIFE. Andreas Blennow har forsket i stivelse siden sit ph.d.-studium, og er specialist indenfor stivelsemetabolisme og stivelsens struktur og funktion i fødevarer og materialer. 5

Referencer og videre læsning Bach IC, Blennow A, Sloth B, Christiansen J, Lærke PE, Ulvskov, P, Knuthsen P, Granby K, Poulsen ME, Kirk HG (2006) Sund delikatesse eller fedende fyld. Planteforskning.dk. Blennow, A., Engelsen, S.B., Nielsen, T.H., Baunsgaard, L., Mikkelsen, R. (2002) Starch phosphorylation - a new front line in starch research. Trends in Plant Science 7: 445-450 Borén M, Glaring MA, Ghebremedhin H, Olsson H, Blennow A, Jansson C (2008). Molecular and physiochemical characterization of the high-amylose barley mutant Amo1. Journal of Cereal Science 47:79-89. Christiansen C, Abou Hachem M, Glaring MA, Viksø- Nielsen A, Sigurskjold BW, Svensson B, Blennow A (2009). A CBM20 low-affinity starch-binding domain from glucan, water dikinase. FEBS Letters 583:1159-1163. Hansen MR, Blennow A, Pedersen S, Engelsen SB (2009). Enzyme modifcation of starch with amylomaltase result in increasing gel melting point. Carbohydrate Polymers 78:72-79. Hansen MR, Blennow A, Pedersen S, Nørgaard L, Engelsen SB (2008). Gel texture and chain structure of amylomaltase-modified starches compared to gelatin. Food Hydrocolloids 22:1551-1566. Hansen PI, Spraul M, Dvortsak P, Larsen FH, Blennow A, Motawie MS, Engelsen SB (2009). Starch phosphorylation - maltosidic restrains upon 3 - and 6 -phosphorylation investigated by chemical synthesis, molecular dynamics and NMR spectroscopy. Biopolymers 91:179-193. Larsen FH, Blennow PGA, Engelsen SB (2008). Starch granule hydration - a MAS NMR investigation. Food Biophysics 3:25-32. Lorberth, R., Ritte, G., Willmitzer, L. and Kossmann, J. (1998) Inhibition of a starch-granule-bound protein leads to modified starch and repression of cold sweetening. Nature Biotechnology 16, 473 477. Seefeldt HF, Blennow PGA, Jespersen BPM, Wollenweber B, Engelsen SB (2009). Accumulation of mixed linkage (1 3) (1 4)-β-D-glucan during grainfilling in barley: A vibrational spectroscopy study. Journal of Cereal Science. 49:24-31. Seo E, Christiansen C, Abou Hachem M, Nielsen MM, Fukuda K, Bozonnet S, Blennow PGA, Aghajari N, Haser R, Svensson B (2008). An enzyme family reunion - similarities, differences and eccentricities in actions on α-glucans. Biologia 63:967-979. Wickramasinghea HAM, Blennow PGA, Noda T (2009) Physico-chemical and degradative properties of in-planta re-structured potato starch. Carbohydrate Polymers 77:118-124. Øvelse 1. Oprensning og mikroskopi af stivelse fra kartofler Denne oprensningsmetode minder meget om den metode, som bruges i industrien. Stivelsesmængden/g tørstof i små nye kartofler og store bagekartofler kan sammenlignes. Oprensning af stivelseskorn Ca. 500 g kartofler vaskes og skæres i mindre stykker. Kartoffelstykkerne vejes og den præcise vægt noteres. Kartoffelstykkerne passeres i en juicemaskine, hvor saften og presseresten separeres. Saften indeholder primært stivelseskornene, opløselige proteiner og salte. Presseresten indeholder primært fibre fra cellevæggene og uopløselige proteiner. Saften hældes i 1 l bægerglas, hvor stivelsen sedimenteres (1-2 timer). Presseresten bredes ud på en plade til tørring i ovn eller varmeskab v. 100 grader. Stivelseskornene vil lægge sig som hvidt slam på bunden i bægerglasset med saft. Supernatanten hældes over i et andet bægerglas og stivelsen overføres til en plade med 3-4 lag køkkenrulle dækket med filtrerpapir. Når en del af væsken er trukket ned i papiret røres rundt i stivelsen, så den luftes grundigt. Stivelsen tørrer natten over. Melet vejes, og mængden af stivelse pr. kg kartoffel beregnes. Supernatanten inddampes, hvis der ønskes en præcis tørstofbestemmelse. Den tørrede presserest og den inddampede supernatant fra saften fra kartoflerne vejes. Beregn hvor stor en procentdel stivelsen udgør af friskvægt og af den samlede mængde tørstof. Fysiske egenskaber Stivelse har mange besynderlige egenskaber, som man kan udnytte i forskellige fødevarer. Rå stivelse består af små korn, og de har nogle særlige egenskaber i vand. Overfør stivelse til en flad skål og tilsæt vand så det præcis dækker stivelsen. Lad den stå i et minut og stik derefter en finger ned i suspensionen og rør meget langsomt. Prøv derefter at røre hurtigere. I en stivelsessuspension med meget stivelse synker kornene hurtigt til bunds. Prøver man at røre rundt i denne suspension tenderer de til at klumpe sig sammen og suspensionen bliver stivere, jo mere man rører rundt! Mikroskopi Rå stivelseskorn kan observeres i et almindeligt lysmikroskop ved 10-100 gange forstørrelse. Rå stivelse fra majs (Maizena) eller kartoffel opslemmes i lidt vand. En lille dråbe lægges på et objektglas og monteres med dækglas. I mikroskop ses efter vækstringe på stivelseskornene, og stivelseskornes størrelse og form observeres. Stivelseskorn fra kartoffel er som regel betydeligt større (op til 100 μm) end stivelseskorn fra majs og øvrige kornarter, som er kun halvt så store. Tilsæt en lille dråbe Lugols jodopløsning (se øvelse 2). Observer farveændring. 6

Øvelse 2. Farvning af rå og opvarmet stivelse med jod Allerede i 1814 opdagede de to forskere, Colin og Gaultier de Claubry, at jod kan binde sig til stivelse og skifte farve. Disse forskere noterede: The color is magnificent blue if the two substances are in the right proportion. The two substances var selvfølgelig stivelse og jod. Colin var ikke specielt interesseret i stivelse, men derimod i jod og forebyggelse af struma - en meget udbredt sygdom, som skyldtes jodmangel. Det er nu almindeligt at tilsætte jod til køkkensalt. Farvereaktionen, som skyldes kompleksbinding, opstår selv ved meget lav koncentration af jod, og ved hjælp af stivelse kunne Colin identificere fødevarer som indeholder jod. Farvning af stivelseholdige frugter og grønsager Vi bruger den klassiske jodkompleksering som stivelsesindikator, hvor jodmolekylerne bindes i stivelsesmolekylernes helixer (se tegning). Stivelsen skal være tilgængelig for jodmolekylerne, for at få en effektiv farvning. Tæt pakket resistent stivelse kompleksbinder ikke effektivt til jod, og ofte er det kun overfladen af de rå stivelseskorn, der farves. Med jodfarvning af stivelsesholdigt plantemateriale kan fordelingen af stivelse i vævet vurderes. Plantemateriale, f.eks. frugter og frø, på forskellige udviklingstrin kan sammenlignes, men man kan ikke bestemme koncentrationen af stivelse ud fra farveintensitet i frisk plantemateriale. Fremstil Lugols stamopløsning: 5 g krystallinsk jod (I ) og 10 g kaliumjodid (KI) opløses i 85 ml destilleret vand. Den 2 brune opløsning har en koncentration på 130 mg jod/ml. I 2 og I - vil reagere med hinanden og danne I 3-. Denne ion danner et mørkeblåt kompleks med stivelse. Opløsningen opbevares ved rumtemperatur i mørke. Før brug fortyndes stamopløsningen 1:500 med 100 mm HCl. Test fordeling af stivelse i f.eks. modne og umodne æbler, pærer, og bananer. Frugterne skæres over og snitfladen dyppes i Lugols opløsning. Hvordan kan forskel i farveintensitet i grønne og modne bananer forklares? Test fordeling af stivelse i f.eks. pastinak, jordskok og kartoffel. Hvorfor ses ingen eller kun lidt farve i jordskokker i forhold til kartoffel og pastinak? Rå eller gelatiniseret stivelse Ved jodfarvning af plantemateriale med rå stivelseskorn kan farveintensiteten ikke bruges til at estimere mængden/koncentrationen af stivelse i materialet, fordi jodmolekylerne kan ikke effektivt komme ind til det tæt pakkede stivelseskorn. Ved at gelatinisere stivelsen bliver stivelseskæderne mere tilgængelige, og kan binde store mængder jod. To 0,2 gram store portioner kartoffelmel afvejes og opslemmes i 100 ml vand. Den ene opslemning koges i vandbad under omrøring i 2 min og nedkøles.til begge rørene tilsættes 1 ml Lugols opløsning og farveintensitet sammenlignes. Øvelse 3. Vegetabilsk vingummi: Stivelse som gelé eller gummi Oftest bruges stivelse ikke rå, men koges i vand og bruges som fortykning i f. eks. ketchup. Opvarmning resulterer i såkaldt gelatinisering, hvor stivelsesmolekylerne i kornene brydes op og svulmer, så der dannes en gel. I modsætning til rå stivelse bliver disse geler tyndere ved omrøring. Det sker f.eks. når vi ryster en ketchupflaske for at få ketchuppen ud af flasken. En af grunderne til dette fænomen er, at stivelsesmolekylerne krydsbinder sig, når en stivelsesopløsning står i lang tid (ketchup eller sovs i køleskab), og disse forbindelser brydes op, når der røres rundt. Overfør cirka 2 gram tørret kartoffelstivelse til to reagensglas - 2 gram stivelse i hver. Til det ene rør tilsættes 3 ml 87% glycerol og 2 ml vand. Til det andet rør tilsættes 3 ml vand. Stivelse og glycerol/vand blandes ved at ryste rørene, og derefter inkuberes prøverne på kogende vandbad i 5 min. Suspensionerne tages op og rystes et par gange i løbet af de 5 minutter. Både glycerol og vand fungerer som blødgørere og gør, at der dannes en gummiagtig klump. Tag klumpene ud af rørene og lav to runde bolde. Dæk dem med lidt rå stivelse, så de ikke klæber. Se, om de fjedrer. Gummiklumperne observeres næste dag. Med glycerol forhindres det, at stivelsen tørrer og re-krystalliserer. Stivelsesgummi med glycerol kan derfor gemmes i længere tid. I vingummi bruger man sukker, sukrose, som sammen med vand blødgører stivelsen. Øvelse 4. Test af amylase i spyt I denne øvelse demonstreres, at enzymet amylase, som findes i spyt, kan nedbryde stivelse. Til øvelsen (30 elever i 5 grupper) bruges følgende materialer: 10 prøverør á 15 ml, 15 rene elastikker, 50 ml 2.0 M HCl fordelt i 5 drypflasker. 100 ml 1 % stivelse. 1 gram stivelse opslemmes i lidt vand og røres i kogende vand. Slutvolumen 100 ml. 50 ml fortyndet Lugol s opløsning fordelt i 5 drypflasker. Procedure: Hver gruppe laver en spytprøve (1-2 ml). For at stimulere produktionen af spyt kan man tygge på et rent elastikbånd eller lignende. Spyt uden bobler dryppes i to prøverør med 10 dråber i hvert rør. Tilsæt 10 dråber 1 % stivelse til hvert rør og 2 dråber 2 M HCl til det ene rør. Prøverne inkuberes i ca. 15 minutter. For at øge enzymaktiviteten kan rørene varmes i hånden. Efter inkubering tilsættes 1-2 dråber Lugol s opløsning til begge rør. Sort eller mørkeblå farve indikerer, at der er stivelse i prøven. Hvis prøven er gul eller brunlig, er der ikke noget stivelse tilbage i prøven. I maven er der meget HCl. Hvad sker der med amylaserne, når de kommer ned i maven? 7